CN110028544A - 11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯、衍生物、斑蝥素脂质体、制备方法和应用 - Google Patents

11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯、衍生物、斑蝥素脂质体、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种11‑脱氧甘草次酸硬脂醇酯、衍生物、斑蝥素脂质体、制备方法和应用，其中11‑脱氧甘草次酸硬脂醇酯是直接将甘草次酸硬脂醇酯加入锌汞齐进行脱氧处理，即先酯化反应再脱氧处理，11‑脱氧甘草次酸硬脂醇酯再与丁二酸酐经酰化反应得到11‑脱氧甘珀酸硬脂醇酯，与溴乙酰半乳糖苷等反应得到11‑脱氧甘草次酸硬脂醇酯‑3‑O‑半乳糖苷；11‑脱氧甘珀酸硬脂醇酯和11‑脱氧甘草次酸硬脂醇酯‑3‑O‑半乳糖苷修饰的斑蝥素脂质体具有良好的肝靶向性，能减轻其不良反应，抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡，增强药物疗效，脂质体包封率较高。

Description

11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯、衍生物、斑蝥素脂质体、制备方法 和应用
技术领域
本发明属于药物载体技术领域，具体涉及一种11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯、衍生物、斑蝥素脂质体、制备方法和应用。
背景技术
脂质体作为药物被动靶向的一种主要载体，经静脉给药后，主要被肝脏的非实质细胞所吞噬并进一步消除，极少到达肝实质细胞。而实际上，有关肝的大多数病变如肝癌、肝炎、肝硬化等多发生于实质细胞，他是肝脏的重要细胞，也是肝脏的大多数代谢场所。因此只有提高脂质体在肝实质细胞的靶向性，才有助于抗癌药物更好地发挥作用。
斑蝥素是鞘翅目芜菁科昆虫斑蝥所含抗癌有效成分，是我国开发的一种抗肿瘤药物，主要用于原发性肝癌、胃癌、乳腺癌等的治疗，具有升高白细胞、保护肝细胞，调节免疫等作用，但是由于其毒性大，目前通常用去甲斑蝥素。目前去甲斑蝥素制剂主要有片剂和注射液，片剂给药剂量大，注射液药物生物利用度差，而且对泌尿系统有较强的刺激性及胃肠道不良反应。因此，临床应用受到限制，影响了抗癌效果。现有技术中通常是采用甘草次酸及其衍生物修饰去甲斑蝥素脂质体，改变去甲斑蝥素在体内的分布情况，呈现肝靶向性，降低不良反应。如吴超等在《甘草次酸衍生物修饰去甲斑蝥素脂质体在小鼠体内肝靶向性研究》中公开了用甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷修饰去甲斑蝥素脂质体，但是甘草次酸硬脂醇酯-3-O- 半乳糖苷常伴随有假醛固酮增多症(表现为患者长期用药后出现水肿、湿疹、低血钾等现象)，限制了它在临床上的广泛应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有甘草次酸及其衍生物修饰斑蝥素脂质体具有假醛固酮副作用，提供一种11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯、衍生物、斑蝥素脂质体、制备方法和应用，斑蝥素脂质体具有良好的肝靶向性，能减轻其不良反应，增强药物疗效，脂质体包封率更高。
本发明提供了11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯，其结构式如下：
本发明还提供了一种11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯的制备方法，包括如下步骤：
将锌汞齐用二氧六环溶解后，加入甘草次酸硬脂醇酯，在10℃下滴加盐酸，然后搅拌反应，反应结束后加水，过滤，洗涤，干燥，纯化得到11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯。
所述纯化步骤为：称取柱层析硅胶于烧杯中，加入洗脱剂石油醚-乙酸乙酯(5:1)拌匀后填充于干燥的层析柱中。将粗产物用乙酸乙酯充分溶解后，滴加在硅胶中，于40-70℃水浴锅上搅拌均匀并挥干多余溶剂，干法上样于填充好的硅胶柱上，并用洗脱剂洗脱。弃去最先流出的100mL后，每8mL收集于离心管中，接至第20管。薄层硅胶板监测洗脱情况，将比移值相同的产物合并，室温下挥干溶剂。薄层监测条件：硅胶GF254板，展开剂：石油醚-乙酸乙酯(两者体积比为5:1)，显色条件：254nm紫外下检测。
本发明还提供一种衍生物，为利用11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯制备的11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯，结构式如下：
本发明还提供了11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯的制备方法，包括如下步骤：
将11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯溶于吡啶中，加入丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶，在106℃下加热回流反应，反应结束后将反应后的溶液倒入蒸馏水中，过滤，干燥，纯化得到11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯。
所述纯化步骤为：称取柱层析硅胶于烧杯中，加入洗脱剂石油醚-乙酸乙酯(1:1-3)拌匀后填充于干燥的层析柱中，排除气泡。将粗产物用乙酸乙酯充分溶解后，滴加在硅胶中，于 40-80℃水浴锅上搅拌均匀并挥干多余溶剂，干法上样于填充好的硅胶柱上，并用洗脱剂洗脱。弃去最先流出的100mL后，每8mL收集于离心管中，接至第20管后，再接400ml。薄层硅胶板监测洗脱情况，将比移值相同的产物合并，室温下挥干溶剂。薄层监测条件：硅胶G板展开剂：甲醇-二氯甲烷(两者体积比1:15)，显色条件：喷以5％香草醛硫酸溶液后，105℃烘箱显色。
优选的，所述11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的质量比为30-100:150-350:1。
本发明还提供一种衍生物，由11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯制备的11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷，其结构式如下：
本发明还提供一种11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷的制备方法，步骤如下：
1)将11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯、溴乙酰半乳糖苷、氧化银、燥石膏、碘和氯仿置于反应容器中，充分混合，于15℃下磁力搅拌反应，反应结束后将反应液过滤，滤渣用三氯甲烷洗涤，收集滤液和洗涤液蒸干，纯化即得11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-溴乙酰半乳糖苷；所述纯化步骤为：取11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷粗品0.8g，经硅胶柱色谱，以乙酸乙酯-石油醚(1:5)洗脱，每8ml为一个流份，共50份。以薄层硅胶G色谱检视，合并比移值 (Rf)相同组份，于水浴锅上(60℃)蒸干，备用。
2)将11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-溴乙酰半乳糖苷加入甲醇-甲醇钠溶液中，在30℃下磁力搅拌反应，调节pH成中性，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，干燥即得11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷。
优选的，步骤1)所述11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯、溴乙酰半乳糖苷、氧化银、燥石膏和碘的质量比为1:0.3-2:0.5-2:1-3。
本发明提供一种斑蝥素脂质体，所述斑蝥素脂质体被11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯或者11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷所修饰。
本发明还提供一种斑蝥素脂质体的制备方法，步骤如下：
1、取磷脂、导向分子、胆固醇、斑蝥素以及三氯甲烷有机溶剂，混合，除去有机溶剂，得到脂质膜，导向分子为11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯或11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷；所述磷脂、导向分子、胆固醇与斑蝥素的重量配比为(8-12):(0.5-1):(0.5-1):(0.5-1)。
2、脂质膜加入磷酸盐缓冲液和海藻糖(重量优选为磷脂重量的4-6倍)，混合，超声分散，过滤(滤膜孔径优选为0.22-0.45μm)，得脂质体溶液；
3、将脂质体溶液、甘露醇和海藻糖混合，将混合物放入-56～-48℃温度下保温，然后干燥，得斑蝥素脂质体。
本发明提供斑蝥素脂质体在制备肝靶向性药物方面的用途。
本发明还提供11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯修饰的斑蝥素脂质体的制备方法，步骤如下：
1)精密称取磷脂，11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯；精密量取3-6mg/ml胆固醇溶液，1-4mg/ml 的斑蝥素溶液，置于茄形瓶中，加三氯甲烷进行溶解，45-60℃减压旋干蒸发除去有机溶剂，形成均匀脂质膜；
2)脂质膜加入pH 6-7的磷酸盐缓冲液和海藻糖，45-60℃水合0.6-1.5h，水合后将脂质体混悬液转移至烧杯中，于超声波细胞粉碎机下超声，过0.22μm的微孔滤膜，即得脂质体溶液；
3)精密量取脂质体溶液，然后加入质量百分浓度为15-25％的甘露醇和海藻糖，甘露醇和海藻糖的质量比1:1-1.5，在冷阱降温至-56～-48℃后放入样品，固定预冻时间为10-14h，预冻温度为-56～-48℃，预冻结束后，打开真空泵，减压冷冻干燥，即得11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯修饰的斑蝥素脂质体冻干粉。
上述步骤1)中所述磷脂可以是大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。
本发明还提供了11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷修饰的斑蝥素脂质体的制备方法，步骤如下：
1)精密称取大豆卵磷脂，11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷；精密量取3-6mg/ml 胆固醇溶液，1-4mg/ml的斑蝥素溶液，置于茄形瓶中，加三氯甲烷进行溶解，45-60℃减压旋干蒸发除去有机溶剂，形成均匀脂质膜；
2)脂质膜加入pH 6-7的磷酸盐缓冲液和海藻糖，45-60℃水合0.6-1.5h，水合后将脂质体混悬液转移至烧杯中，于超声波细胞粉碎机下超声，过0.22μm的微孔滤膜，即得脂质体溶液；
3)精密量取脂质体溶液，然后加入质量百分浓度为15-25％的甘露醇和海藻糖，甘露醇和海藻糖的质量比1:1-1.5，在冷阱降温至-56～-48℃后放入样品，固定预冻时间为10-14h，预冻温度为-56～-48℃，预冻结束后，打开真空泵，减压冷冻干燥，即得11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷修饰的斑蝥素脂质体冻干粉。
本发明所述锌汞齐的制备方法为：在HgCl2中加入摩尔浓度为1.2mol/L的盐酸溶液，充分振摇溶解，再加入研磨均匀的锌粉，所述HgCl2、盐酸溶液和锌粉的质量比为1:30-35:6-12，充分振摇后移除水相，用二氧六环清洗两次，即得。
优选的，所述锌汞齐和甘草次酸硬脂醇酯的质量比为1:1.4-1.8。
优选的，所述盐酸的摩尔浓度为12mol/L。
本发明所述的11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯或11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷修饰的斑蝥素脂质体的具体制备方法为：精密称取45-70mg大豆卵磷脂，4.5-8mg11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯或11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷；精密量取3-6mg/ml胆固醇溶液1-2ml， 1-4mg/ml斑蝥素溶液2-5ml，置于250ml茄形瓶中，加三氯甲烷10-15ml进行溶解，50-60℃减压旋转干蒸发除去有机溶剂，形成均匀脂质膜，脂质膜加入8-12ml pH6-7的磷酸盐缓冲液和250-330g海藻糖，45-60℃水合0.6-1.5h，水合后将脂质体混悬液转移至25ml烧杯中，于超声波细胞粉碎机下超声30min(超声2s，间隔2s)，过0.22μm的微孔滤膜，即得脂质体；精密量取脂质体2ml加入15-25％甘露醇：海藻糖(1:1-1.5)，在冷阱降温至-56～-48℃后放入样品，固定预冻时间为10-14h，预冻温度为-56～-48℃，预冻结束后，打开真空泵，减压冷冻干燥33-40h，即得11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯或11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷修饰的斑蝥素脂质体冻干粉。
目前，为了降低去甲斑蝥素脂质体的不良反应，常采用甘草次酸及其衍生物对其进行修饰，如甘草次酸、甘草次酸硬脂醇酯、甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷修饰去甲斑蝥素脂质体(吴超等在《甘草次酸衍生物修饰去甲斑蝥素脂质体在小鼠体内肝靶向性研究》中公开了用甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷修饰去甲斑蝥素脂质体；专利申请号201710939391.7公布一种斑蝥素肝靶向脂质体的制备及其冻干制剂的应用，其中用甘草次酸硬脂醇酯修饰去甲斑蝥素脂质体)；目前没有将脱氧的甘珀酸硬脂醇酯或者脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷用于修饰脂质体，更没有将甘珀酸硬脂醇酯或者脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷用于修饰斑蝥素脂质体。中山大学的苑丽红在其硕士学位论文《去甲斑蝥素类衍生物的合成》中前言部分的第2页中指出斑蝥素和去甲斑蝥素都具有抗病毒、升高白细胞、抗真菌、充当雌激素样等作用，但是斑蝥素属剧毒药，毒副作用较大，可能会引起肝肾功能不全，对胃肠道造成损伤。而去甲斑蝥素的毒性大大降低，因此目前主要是对去甲斑蝥素脂质体进行修饰。
本发明以斑蝥素作为模型药物开展肝靶向脂质体制剂研究，通过11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯或11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷对斑蝥素脂质体进行修饰，可实现增效减毒的作用，对于有毒中药的开发有重要的临床意义。
本领域技术人员知道未脱氧的甘草次酸或其衍生物相对于脱氧的甘草次酸或其衍生物，具有醛固酮副作用，在临床上的表现为水肿、湿疹、低血钾等现象，限制了它在临床上的广泛应用。因此能够想到将甘草次酸及其衍生物进行脱氧处理，但是目前脱氧处理得到的脱氧甘草次酸及其衍生物主要用于直接合成具有抗肿瘤的药物，并没有将其用于修饰脂质体。
本申请的试验结果证实脱氧甘珀酸硬脂醇酯的肝靶向效率是普通脂质体的1.54倍，而甘珀酸硬脂醇酯的肝靶向效率是普通脂质体的1.44倍，相比于未经修饰的普通脂质体而言，经导向分子修饰后脂质体的靶向性有所提高。脱氧后的甘草次酸及衍生物与未脱氧的甘草次酸及衍生物相比不仅不会降低斑蝥素脂质体的靶向效果，还能够增加其靶向效果，超出了预期。 11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷与未经修饰的普通脂质体相比，其肝靶向性提高了 1.53倍，其能与肝脏细胞膜表面的去唾液酸受体及甘草次酸受体结合，具有单配基双靶点的特点，表现出较强的肝靶向性。
本发明中的11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯是直接将甘草次酸硬脂醇酯加入锌汞齐进行脱氧处理，即先酯化反应再脱氧处理；而现有技术中先对甘草次酸脱氧再酯化反应(如建平等发表的《甘草次酸/11-脱氧甘草次酸甲酯的合成》；彭宇等发表的《11-脱氧甘草次酸衍生物的合成》中都是先将甘草次酸进行脱氧，再酯化反应生成相应的脱氧甘草次酸酯类物质。
本发明得到的11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯再与丁二酸酐经酰化反应得到11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯，与溴乙酰半乳糖苷等反应，再经去乙酰基反应得到11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O- 半乳糖苷；得到的11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯和11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷对斑蝥素脂质体进行修饰，使其具有良好的肝靶向性，能减轻其不良反应，并且能很好的与肝细胞表面的甘草次酸受体及去唾液酸糖蛋白受体结合，使得脂质体内的药物靶向传递至肝脏肿瘤细胞，从而抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡，增强药物疗效，特别是经11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯修饰后的斑蝥素脂质体其靶向效果更佳。
并且本发明采用冻干工艺制备脱氧甘草次酸及其衍生物修饰的斑蝥素脂质体，以海藻糖和甘露醇1:1-3作为冻干保护剂，在-54℃下进行冷冻，冷冻温度远远低于专利申请号 201710939391.7中公布的-20℃的温度，采用此种工艺制备脂质体并与上述制备方法制备的脱氧甘草次酸衍生物相结合得到的11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯和11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷修饰的斑蝥素脂质体，便于贮存。
本发明的有益效果是：本发明的11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯是直接将甘草次酸硬脂醇酯加入锌汞齐进行脱氧处理，即先酯化反应再脱氧处理，11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯再与丁二酸酐经酰化反应得到11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯，与溴乙酰半乳糖苷等反应得到11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O半乳糖苷。
本发明的11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯和11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O半乳糖苷修饰的斑蝥素脂质体具有良好的肝靶向性，能消除其不良反应，抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡，增强药物疗效；且大大提高了脂质体的包封率。
附图说明
图1为11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯的核磁共振碳谱图；
图2为11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯的核磁共振碳谱图；
图3为11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-溴乙酰半乳糖苷的核磁共振碳谱图；
图4为11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷的核磁共振碳谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案等更加清楚，以下结合实施例，对本发明进一步详细说明。
如图1-4所示，分别为11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯、11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯、11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O溴乙酰半乳糖苷和11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O半乳糖苷的核磁共振碳谱图。
实施例1
11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯的合成：取0.45g HgCl2，加入15mL浓度为1.2mol/L的盐酸溶液，充分振摇溶解，再加入研磨均匀的锌粉4.5g，充分振摇5min后移除水相，用5mL二氧六环清洗两次，即得，备用；取0.45g制备好的锌汞齐于50mL圆底烧瓶中，加入0.72g甘草次酸硬脂醇酯和13.5mL二氧六环使其充分溶解，用冰水浴控制温度10℃左右，于30min内加入1.5mL浓度为12mol/L的盐酸，加完后保持10℃搅拌继续反应5h，TLC指示终点，将反应液倒入约100mL蒸馏水中使析出白色沉淀，抽滤，干燥，纯化即得。
实施例2
11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯的合成：称取0.70g实施例1得到的脱氧甘草次酸硬脂醇酯，丁二酸酐2.1g及DMAP(4-二甲氨基吡啶)0.01g于圆底烧瓶中，加入20mL无水重蒸馏吡啶， 106℃加热回流，TLC检测反应过程，反应结束后将反应液倒入200mL蒸馏水中，产生棕色沉淀后过滤，干燥纯化即得。
实施例3
11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷的合成：称取实施例1得到的脱氧甘草次酸硬脂醇酯4g、溴乙酰半乳糖苷3.3g、氧化银3.8g、燥石膏8.7g、碘0.4g、氯仿20ml置于50ml圆底烧瓶中，充分混合，于15℃条件下磁力搅拌5h。反应期间每隔1h用TLC检测反应过程(展开剂：乙酸乙酯-石油醚＝1:5；薄层板：硅胶G板；显色剂：碘)，直至反应结束。将反应液过滤，滤渣用三氯甲烷20ml冲洗两遍，收集滤液于60℃水浴锅上蒸干，纯化，即得11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-溴乙酰半乳糖苷；取11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷纯品 0.5g，加入5mg/ml甲醇-甲醇钠溶液60ml，于30℃条件下磁力搅拌12h。反应停止后，加水，调节pH至中性，待出现白色絮状物，采用乙酸乙酯萃取2次，取乙酸乙酯层，于旋转蒸发仪上减压浓缩干燥，即得11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷。
实施例4
各种导向分子修饰的斑蝥素脂质体，制备方法为：精密称取65mg大豆卵磷脂，6.5mg 各导向分子；精密量取4mg/ml胆固醇溶液1.5ml，2mg/ml斑蝥素溶液3ml，置于250ml茄形瓶中，加三氯甲烷10.5ml进行溶解，55℃减压旋干蒸发除去有机溶剂，形成均匀脂质膜，脂质膜加入10ml pH6.4的磷酸盐缓冲液和300g海藻糖，55℃水合1h，水合后将脂质体混悬液转移至25ml烧杯中，于超声波细胞粉碎机下超声30min(超声2s，间隔2s)，过0.22μm的微孔滤膜，即得脂质体；精密量取脂质2ml加入20％甘露醇：海藻糖(1：1)，在冷阱降温至 -54℃后放入样品，固定预冻时间为12h，预冻温度为-54℃，预冻结束后，打开真空泵，减压冷冻干燥36h，即得各导向分子修饰的斑蝥素脂质体。
其中导向分子为：实施例2得到的11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯、实施例3得到的11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷、甘珀酸硬脂醇酯、硬脂醇-3-O-半乳糖以及11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯与硬脂醇-3-O-半乳糖苷两者的混合物。
未经导向分子修饰的斑蝥素脂质体的制备方法与上述经导向分子修饰的斑蝥素脂质体的制备方法相似，只是不加入导向分子。
采用SephadexG-50法测定斑蝥素脂质体流出曲线：称取SephadexG-50适量，加入纯化水浸泡24h，搅拌均匀装于玻璃层析柱内(1.5cm×25cm)。精密吸取0.5mL脂质体加至凝胶柱中，纯化水洗脱，收集洗脱液，每2mL一管。从每管洗脱液中精密吸取1mL置于带盖EP 管中，加入0.3mL十八烷内标溶液(0.1520mg/mL)，另加入破乳剂(甲醇:乙腈＝1:1)3.7mL，超声破乳30min，过0.22μm微孔滤膜，GC-MS进样分析，绘制流出曲线。
采用SephadexG-50法测定斑蝥素脂质体包封率：精密量取斑蝥素脂质体0.5mL，采用葡聚糖凝胶柱色谱法分离脂质体和游离药物，按上述流出曲线所得结果收集脂质体溶液。将过柱后样品浓缩至1mL，转移至容量瓶内，加破乳剂(甲醇：乙腈＝1:1)定容至10倍量，即得。包封率(EE)计算公式如下：EE％＝(脂质体中包封的药物/脂质体中药物总量)×100％。
表1斑蝥素脂质体的粒径和包封率
其中，11-DGA-Suc-CTD-lip为11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯修饰的斑蝥素脂质体， 11-DGA-3-O-Gal-CTD-lip为11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷修饰的斑蝥素脂质体，18-GA-Suc-CTD-lip为甘珀酸硬脂醇酯修饰的斑蝥素脂质体，SA-Gal-CTD-lip为硬脂醇-3-O-半乳糖修饰的斑蝥素脂质体，(11-DGA-Suc+SA-Gal)-CTD-lip为11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯与硬脂醇-3-O- 半乳糖苷共同修饰的斑蝥素脂质体，CTD-lip为未修饰的斑蝥素脂质体。
从上表中的数据可知，采用本申请的制备方法得到的斑蝥素脂质体的包封率达到了88％以上，现有脂质体中规定其包封率达到80％以上就可以，说明本申请得到的斑蝥素脂质体都满足要求。而现有技术中去甲斑蝥素脂质体的包封率只达到60％左右，说明本申请选用大豆磷脂、控制大豆磷脂和胆固醇的配比以及采用薄膜分散法-冻干工艺制备的脂质体的包封率大大提高。另外本申请冻干后得到的斑蝥素脂质体的粒径较冻干前的粒径增大，但是其包封率下降的幅度并不大，都达到了88％以上，最终对肝癌肿瘤细胞的靶向效果较好，得到了一种稳定、运输方便、包封率高的斑蝥素冻干脂质体。其中冻干前包封率最高的是11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷修饰的斑蝥素脂质体，冻干后的脂质体包封率达到了96.74％，高于未经修饰的斑蝥素脂质体的包封率。
本领域技术人员通常会认为经修饰后脂质体从外观、粒径、包封率等指标而言，都会比未修饰脂质体有所下降，这是由于导向分子的加入造成的，脂质体在水合过程时加入磷酸盐缓冲溶液，而导向分子多是不能溶于此溶液，而造成脂质体溶液外观不够澄清，粒径增大，包封率下降；但是本申请的11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷修饰的斑蝥素脂质体相对于未修饰的斑蝥素脂质体，包封率反而更高。11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷修饰的斑蝥素脂质体冻干后的包封率达到了96.74％，相对于不经修饰的脂质体包封率提高了5.59％，说明本发明得到的11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷修饰斑蝥素脂质体能提高脂质体的包封率。
实施例5
不同导向分子修饰斑蝥素脂质体在大鼠体内分布的研究
靶向制剂是指药物借助载体的作用，通过局部给药、胃肠道或全身血液循环选择性地浓集定位于病灶的制剂。脂质体靶向治疗主要分为主动靶向、被动靶向及物理化学靶向。本实施例通过对比大鼠各脏器组织中的斑蝥素分布情况，计算出各组肝靶向效率、相对摄取率及峰浓度比，比较各组参数差异，对各导向分子修饰斑蝥素脂质体的肝靶向性进行初步评价。
实验动物为SD大鼠(体重180-220g，雌雄各半)，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，均为SPF级，合格证号：SCXK(湘)2016-0002。饲养条件为：恒温25±2℃、恒湿60 ±5％，并保持12h的日夜交替，自由摄食饮水，前适应性饲养3d，实验前12h禁食不禁水。
1、组织生物样品的处理
称定各器官组织置于离心管中，加入等量生理盐水进行匀浆，精密量取匀浆液500μL，加入3倍量甲醇，漩涡振荡3min，4000r/min离心20min。吸取3mL上清液于5mL离心管内，精密加入内标物十八烷溶液(0.5μg/mL)250μL，氮气吹干样品，加入1mL甲醇复溶，超声5min，涡旋3min，12000r/min离心20min，吸取上清液置于内衬管中，即得。
2、斑蝥素在大鼠体内的组织分布研究
SD大鼠288只(雌雄各半，220±20g)，随机分成6组，每组48只(各时间点重复6只，8*6＝48只)，给药前禁食12h，自由饮水。分别按3mg/kg斑蝥素剂量尾静脉注射CTD-lip、SA-Gal-CTD-lip、18-GA-Suc-CTD-lip、11-DGA-Suc-CTD-lip、11-DGA-3-O-Gal-CTD-lip、(11-DGA-Suc+SA-Gal)-CTD-lip、生理盐水组。分别于给药后5、15、30、45、60、90、120、150min处死大鼠，立即解剖采集心、肝、脾、肺、肾。用生理盐水洗净，滤纸吸干，称定重量按上述方法处理样品并测定分析，计算每克组织中的斑蝥素含量，结果见下表2-7。
表2静脉注射CTD-lip在大鼠体内各组织分布(n＝6)
表3静脉注射SA-Gal-CTD-lip在大鼠体内各组织分布(n＝6)
表4静脉注射11-DGA-Suc-CTD-lip在大鼠体内各组织分布(n＝6)
表5静脉注射11-DGA-3-O-Gal-CTD-lip在大鼠体内各组织分布(n＝6)
表6静脉注射(11-DGA-Suc+SA-Gal)-CTD-lip在大鼠体内各组织分布(n＝6)
表7静脉注射18-GA-Suc-CTD-lip在大鼠体内各组织分布(n＝6)
2.1通过比较药物在大鼠体内各脏器每克组织中的含量，各导向分子修饰CTD脂质体在不同时刻单位重量肝脏中斑蝥素的含量是最高的，且明显高于其它脏器，与其它组织比较有显著性差异(P＜0.05)。
2.2为了比较同一时刻不同脏器中各斑蝥素脂质体的含量，本申请比较了尾静脉注射CTD 脂质体在大鼠体内不同时刻的药物含量结果显示，给药后5min～60min，各导向分子修饰脂质体组大鼠肝脏中斑蝥素浓度与CTD-lip组存在显著性差异(P＜0.05)。尾静脉注射30min后，药物在肝脏中的含量最大，随时间延长，肝脏中的量逐渐降低，而肾脏中药物含量亦随之降低。各导向分子修饰脂质体在肝脏的摄取明显高于其他脏器。
2.3本申请比较了尾静脉注射各斑蝥素脂质体在大鼠肝脏的药物含量分布，结果显示 11-DGA-Suc-CTD-lip组中药物含量明显高于其他脂质体组，且各修饰脂质体在大鼠肝脏中的药物含量与CTD-lip组相比均存在显著性差异(P＜0.05)，初步证实经导向分子修饰后脂质体提高了其作用于肝脏的药物含量。
3、肝靶向性初步评价
采用DPS v17.10计算出大鼠各组织的药动学参数生物利用度(AUC)和最大浓度(Cmax) 结果见表8-9。根据AUC和Cmax数据计算得到各CTD脂质体(修饰或未修饰的斑蝥素脂质体)经大鼠尾静脉注射后组织中的靶向参数，利用靶向参数评价各CTD脂质体在大鼠组织(心、肝、脾、肺、肾)中的分布情况，公式如下：
结果如表8-9所示。
表8 CTD脂质体在大鼠组织中的药动学参数AUC和Cmax(n＝6)
表9 CTD脂质体在大鼠组织中的靶向参数(n＝6)
4、总结
(1)靶向效率(Te)表示药物制剂对靶器官的选择性。CTD-lip在肝脏和肾脏的Te分别为(26.93±2.65)％、(29.98±2.43)％，SA-Gal-CTD-lip、11-DGA-Suc-CTD-lip、 11-DGA-3-O-Gal-CTD-lip、(11-DGA-Suc+SA-Gal)-CTD-lip在肝脏的Te分别为(37.57±4.52)％、 (41.57±2.32)％、(41.15±3.28)％、(36.45±3.87)％。与CTD-lip相比，经导向分子修饰后提高了脂质体对肝脏的选择性，对肝脏表现出主动靶向作用。当11-DGA-Suc导向分子修饰 CTD-lip后，对肝脏靶向选择显著提高，Te达到(41.57±2.32)％，表明11-DGA-Suc-CTD-lip 经尾静脉注射给药后，11-DGA-Suc被大鼠肝脏表面的甘草次酸受体所特异性识别，增强了对肝脏的靶向性。
(2)相对靶向效率(RTe)严格上来说是靶向制剂与非靶向制剂的比较，由于斑蝥素毒性大且难溶于水，无法设立非靶向制剂组(斑蝥素溶液组)，故再次对RTe定义为经导向分子修饰后脂质体与CTD-lip的比较，反应经导向分子修饰后脂质体对器官靶向性的提高倍数。结果显示，SA-Gal-CTD-lip、11-DGA-Suc-CTD-lip、11-DGA-3-O-Gal-CTD-lip、 (11-DGA-Suc+SA-Gal)-CTD-lip相比于CTD-lip对肝脏靶向性分别提高了1.40、1.54、1.53、1.35倍，均表现出显著的肝脏靶向性。
(3)相对摄取率(Re)是经导向分子修饰后脂质体与CTD-lip的组织AUC比较，Re大于1时表示经导向分子修饰后脂质体在该器官或组织的靶向性强于CTD-lip。SA-Gal-CTD-lip、 11-DGA-Suc-CTD-lip、11-DGA-3-O-Gal-CTD-lip、(11-DGA-Suc+SA-Gal)-CTD-lip在肝脏的相对摄取率分别为1.49、1.89、1.69、1.32。
(4)峰浓度比(Ce)表明药物制剂改变药物分布的效果，Ce值愈大，表明药物分布的效果愈明显。11-DGA-Suc-CTD-lip在肝脏的Ce值最大(3.39)，进一步证实了11-DGA-Suc-CTD-lip 的肝脏靶向性。
(5)本申请研究了CTD脂质体(CTD-lip、SA-Gal-CTD-lip、11-DGA-Suc-CTD-lip、11-DGA-3-O-Gal-CTD-lip、(11-DGA-Suc+SA-Gal)-CTD-lip)在大鼠组织中的斑蝥素药物分布特征，结果表明经导向分子修饰后，脂质体对肝脏的选择性明显增强。其中11-DGA-Suc-CTD-lip对肝脏靶向性强于11-DGA-Suc和SA-Gal两种配基共修饰的脂质体，这可能是由于双配基间存在竞争关系，使得(11-DGA-Suc+SA-Gal)-CTD-lip难以牢固的与肝细胞膜上的甘草次酸受体或去唾液酸糖蛋白受体结合，反而降低了其肝靶向性。
(6)通过分析表9的数据，我们比较了11-DGA-Suc-CTD-lip和18-GA-Suc-CTD-lip的数据，我们发现在靶向效率(Te)、相对靶向效率(RTe)、相对摄取率(Re)、峰浓度比(Ce) 方面，在肝脏中，前者比后者的数据更大，在其他脏器方面，前者比后者的数据更小。说明 11-DGA-Suc-CTD-lip相对于18-GA-Suc-CTD-lip，肝靶向性更好。

Claims (10)

1.一种11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯，其特征在于，结构式如下：
2.一种如权利要求1所述11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将锌汞齐用二氧六环溶解后，加入甘草次酸硬脂醇酯，在10℃下滴加盐酸，然后搅拌反应，反应结束后加水，过滤，洗涤，干燥，纯化得到11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯。
3.一种如权利要求1所述的11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯的衍生物，其特征在于，为11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯，结构式如下：
4.一种如权利要求1所述的11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯的衍生物，其特征在于，为11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷，结构式如下：
5.一种斑蝥素脂质体，其特征是，所述斑蝥素脂质体被11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯或者11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷所修饰。
6.一种如权利要求5所述斑蝥素脂质体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)取磷脂、导向分子、胆固醇、斑蝥素以及三氯甲烷有机溶剂，混合，除去有机溶剂，得到脂质膜，导向分子为11-脱氧甘珀酸硬脂醇酯或11-脱氧甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷；
2)脂质膜加入磷酸盐缓冲液和海藻糖，混合，超声分散，过滤，得脂质体溶液；
3)将脂质体溶液、甘露醇和海藻糖混合，将混合物放入-56～-48℃温度下保温，然后干燥，得斑蝥素脂质体。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述磷脂、导向分子、胆固醇与斑蝥素的重量配比为(8-12):(0.5-1):(0.5-1):(0.5-1)。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2中的过滤的滤膜孔径为0.22-0.45μm。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2中的海藻糖的重量为磷脂重量的4-6倍。
10.一种如权利要求5所述的斑蝥素脂质体在制备肝靶向性药物方面的用途。
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