CN114276404B - 甘草次酸类甘油磷脂化合物、其分泌型磷脂酶a2敏感性脂质体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，具体公开了一种甘草次酸类甘油磷脂化合物、其分泌型磷脂酶A2敏感性脂质体及其应用。所述甘草次酸类甘油磷脂化合物中，甘草次酸的羧基与甘油磷脂的sn‑2位通过酯键连接。进一步，该甘草次酸类甘油磷脂化合物可构建得到分泌型磷脂酶A2敏感性脂质体，该脂质体在肿瘤部位超表达酶的水解作用下，能快速释放所包载的化疗药物，到达抗肿瘤的有效药物浓度，从而提高疗效，减少由于缓慢释放药物所造成的肿瘤耐药性。另一方面，甘草次酸具有抗癌作用，分泌型磷脂酶A2敏感性脂质体在肿瘤部位的EPR效应能增加甘草次酸的靶向性，另外，甘草次酸还可与被释放出来的化疗药物共同发挥抗癌疗效。

Description

甘草次酸类甘油磷脂化合物、其分泌型磷脂酶A2敏感性脂质 体及其应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种甘草次酸类甘油磷脂化合物、其分泌型磷脂酶A2(sPLA₂)敏感性脂质体及其应用。

背景技术

甘草次酸的化学结构式如下：

甘草次酸是中药甘草的主要有效成分之一，具有抗癌作用。但是甘草次酸难溶于水，口服吸收较差，在体内代谢较快，因此生物利用度较低。为了提高疗效往往需要增大给药剂量或者增加给药次数，且其对癌细胞与正常细胞缺乏选择性，由此会造成较大的毒副作用。

脂质体是由两亲性分子比如磷脂自组装形成的封闭型囊泡，囊泡内部的亲水性核心可以包载亲水性药物，疏水性磷脂双分子层可以包载亲脂性药物。脂质体的生物相容性，生物可降解性，和其可修饰性，使其成为化疗药物载体的热门研究对象。利用脂质体包载化疗药物，可通过高渗透长滞留效应(Enhanced permeability and Retention effect，EPR)被动靶向于肿瘤部位，从而减少对正常细胞的毒性，提高抗癌活性。

利用肿瘤微环境和正常组织部位的差异，体内触发药物释放，是目前应用于抗癌领域的靶向可控释药脂质体的主要研究方向之一。体内触发药物释放目前研究较多的是酶敏感性脂质体和酸敏感性脂质体，由于肿瘤部位的酸环境与正常部位的pH相差较小，所以酸敏感脂质体的设计难度较大。而处于临床II期的sPLA₂可水解脂质体LiPlaCis虽然有疗效，但由于含有较高的阴离子，即磷脂二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，导致其具有较大的系统毒性，易引起免疫排斥反应。因此，需要提供一种能高效响应sPLA₂释放药物且生物相容性高的酶敏感性脂质体，以提高药物疗效。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种甘草次酸类甘油磷脂化合物、其sPLA₂敏感性脂质体及其应用。

本发明的第一方面，提供一种甘草次酸类甘油磷脂化合物，所述甘草次酸类甘油磷脂化合物为具有如式(I)所示结构的化合物，或其药学上可接受的盐：

其中，R₁选自取代或未取代的C₁-C₂₂直链、支链或环状烷基；

R₂选自羟基，取代或未取代的C₁-C₆直链、支链烷氧基；

R₃选自胆碱、乙醇胺、丝氨酸、甘油、肌醇、氢原子、C₁-C₃烷基、乙醇胺聚乙二醇。

在本发明的一些实施方式中，所述R₁选自C₁-C₂₂的直链烷基，例如C₄-C₂₂、C₆-C₂₂、C₈-C₂₂、C₁₀-C₂₂、C₁₂-C₂₂、C₁₄-C₂₂、C₁₆-C₂₂、C₁₆-C₂₀、C₁₆-C₁₈，优选C₁₆-C₁₈。

在本发明的一些实施方式中，所述R₂选自羟基。

在本发明的一些实施方式中，所述R₃选自胆碱。

在本发明的一些实施方式中，所述甘草次酸类甘油磷脂化合物为具有如式(II)所示结构的化合物，或其药学上可接受的盐：

本发明制得的甘草次酸类甘油磷脂化合物，至少具备如下有益效果：

(1)甘草次酸的水溶性差，通过将其制备成甘草次酸类甘油磷脂化合物，再与其他磷脂相连接后形成脂质体，能够改善甘草次酸的溶解性；另外，所得脂质体通过EPR效应可以被动靶向于肿瘤部位，进而提高甘草次酸的靶向性；

(2)由甘草次酸类甘油磷脂化合物构建得到的sPLA₂敏感性脂质体还可负载抗癌药物，在sPLA₂酶水解作用下，甘草次酸甘油磷脂的水解产物甘草次酸可以和游离的负载药物共同抑制癌细胞；且水解产物甘草次酸作为强表面活性分子，能与其它磷脂的酶水解产物溶血磷脂和硬脂酸共同增强膜的渗透性，使更多的负载药物被释放出来，进一步增加抗癌疗效。

在本发明的一些实施方式中，所述甘草次酸类甘油磷脂化合物的制备方法包括如下步骤：将甘草次酸类化合物、甘油磷脂与催化剂在溶剂存在下反应。

在本发明的一些实施方式中，所述催化剂为1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶。

在本发明的一些实施方式中，所述溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯、甲醇、乙醇和乙腈中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述甘油磷脂与所述甘草次酸类化合物的摩尔比为1：(0.5-2.5)，例如1：(0.5-2)、1：(1-2.5)、1：(1-2)。

在本发明的一些实施方式中，所述催化剂加入所述溶剂中的温度为0-10℃。

在本发明的一些实施方式中，所述反应的温度为20-25℃。

在本发明的一些实施方式中，所述反应的时间为1-5d。

本发明的第二方面，提供一种药用组合物，包括上述甘草次酸类甘油磷脂化合物。

在本发明的一些实施方式中，所述药用组合物还包括其他磷脂类化合物。

在本发明的一些实施方式中，所述甘草次酸类甘油磷脂化合物与所述其他磷脂类化合物的摩尔比为1：9-19，优选1：15-19，更优选1：19。

在本发明的一些实施方式中，所述其他磷脂类化合物包括磷脂和/或聚乙二醇化磷脂。

在本发明的一些实施方式中，所述磷脂包括蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬酯酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱中的至少一种。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述磷脂为DPPC。

在本发明的一些实施方式中，所述聚乙二醇化磷脂为聚乙二醇修饰的磷脂，包括二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3350、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇6000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇8000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇10000中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述聚乙二醇化磷脂为DSPE-PEG2000。

在本发明的一些实施方式中，当所述其他磷脂类化合物为磷脂和聚乙二醇化磷脂时，所述磷脂与聚乙二醇化磷脂的摩尔比为8-18：1，例如10-18：1、12-18：1、14-18：1、16-18：1、18：1。

本发明的第三方面，提供一种sPLA₂敏感性脂质体，包括上述的药用组合物。

在本发明的一些实施方式中，所述sPLA₂敏感性脂质体的粒径为100-150nm。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述sPLA₂敏感性脂质体的粒径为100-130nm。

在本发明的一些实施方式中，所述sPLA₂敏感性脂质体由冻融法制得。

在本发明的一些实施方式中，所述冻融法包括如下步骤：

将所述甘草次酸类甘油磷脂化合物溶于有机溶剂中，涂膜，干燥，加水溶解，冻融循环，加压挤出。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、乙腈、四氢呋喃中的至少一种。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述冻融循环中，冻结过程采用液氮冻结。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述冻融循环中，解冻过程的温度范围为高于相变温度15℃。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述冻融循环的次数是4-8次，优选6次。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述挤出是通过80-120nm孔径的膜，优选100nm孔径的膜。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述挤出是在加热条件下进行。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述加热的温度为40-70℃，例如40-65℃、40-60℃、40-55℃、45-70℃、45-65℃、45-60℃、45-55℃、50-70℃、50-65℃、50-60℃、50-55℃。

所述药用组合物可用于制备控释制剂，如片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、丸剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、散剂、口服溶液、吸入剂、混悬剂、干悬剂、贴剂、洗剂。

本发明的第四方面，提供上述的甘草次酸类甘油磷脂化合物、上述的药用组合物、或上述的sPLA₂敏感性脂质体在制备治疗癌症药物中的应用。

本发明所述癌症为超表达sPLA₂的癌症，包括结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肝癌。

根据本发明实施方式的sPLA₂敏感性脂质体，至少具备如下有益效果：

(1)本发明的sPLA₂敏感性脂质体通过EPR效应可以被动靶向于肿瘤部位，被肿瘤部位超表达的sPLA₂酶特异性水解后，甘草次酸类甘油磷脂化合物中磷脂sn-2位的酯键断裂，sPLA₂敏感性脂质体发生变形，使包载的药物快速释放出来，发挥抗癌疗效；较传统脂质体DPPC或者长循环脂质体DPPC：DSPE-PEG2000而言，本发明构建的sPLA₂敏感性脂质体具有更优异的药物释放效果；

(2)sPLA₂敏感性脂质体中具有抗癌作用的甘草次酸被水解释出后，可以与脂质体负载的药物起协同作用；另外，甘草次酸类甘油磷脂化合物的水解产物甘草次酸和其它磷脂的水解产物溶血磷脂作为膜渗透增强因子，能进一步促进脂质体释放药物；

(3)本发明的sPLA₂敏感性脂质体为抗癌药物的递送提供了更多的选择，在癌症的化疗中，具有良好的应用前景。

本申请中术语：

“EPR效应”是指癌症部位的血管上皮细胞之间空隙比正常组织部位的血管上皮细胞之间空隙大，脂质体选择性被动靶向于肿瘤部位，又因为肿瘤部位没有淋巴回流阻滞，脂质体会积聚于肿瘤部位。

按照本领域的惯例，“取代”是指基团上一个或多个氢原子被卤素原子、羟基、烷氧基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、氨基、羧基、酯基、氰基或硝基取代。

术语“卤素原子”是指氟、氯、溴或碘，优选氟、氯或溴，更优选氟或氯。

术语“烷氧基”是指R_aO-基团，其中R_a是指烷基，优选低级烷基。本发明的烷氧基具体包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、异戊氧基、叔戊氧基、新戊氧基、己氧基、异己氧基、叔己氧基、新己氧基，优选未取代的甲氧基或乙氧基。

术语“环烷基”是指含有三至六个碳原子的饱和单环烃环。环烷基的实例为环丙基、环丁基、环戊基、环己基及环庚基，优选环丙基、环丁基及环戊基，更优选环丙基。

术语“烯基”是指至少含有一个碳-碳双键的不饱和烃基，优选C₂-C₆烯基，具体而言，本发明的烯基的实例包括：乙烯基、丙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、戊烯基、己烯基。

术语“炔基”是指至少含有一个碳-碳三键的不饱和烃基，优选C₂-C₆炔基，具体而言，本发明的炔基的实例包括：乙炔基、正丙炔基、炔丙基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、戊炔基、己炔基。

术语“芳基”是指苯基、萘基、蒽基、菲基，优选苯基。本发明所述芳基为未经取代或明确定义经取代。

术语“杂芳基”是指含有一个至最多四个杂原子(各自独立地选自氧、氮及硫)的5至10元单环或双环芳环。此类杂芳基的实例为5元杂芳基：如呋喃基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基；6元杂芳基：如吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基；以及8至10元双环杂芳基：如吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并三唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、噻吩并吡啶基、喹啉基、异喹啉基、萘啶基、噌啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、酞嗪基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、吡唑并嘧啶基、吡唑并吡嗪基、咪唑并吡啶基、咪唑并哒嗪基、咪唑并噻唑基。本发明所述杂芳基为未经取代或明确定义经取代。

术语“酯基”是指R_bCOO-基团，其中R_b是指烷基，优选低级烷基；所述酯基优选乙酯基。

术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的物质。

术语“药学上可接受的盐”是指具有本发明甘草次酸类甘油磷脂化合物所需活性的盐，包括酸加成盐，由无机酸或有机酸形成，所述无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、硼酸，所述有机酸包括但不限于乙酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、枸橼酸、苯甲酸、肉桂酸、甲磺酸、苯磺酸、葡糖酸、谷氨酸、水杨酸。

根据本发明，所述脂质体可以负载各种不同的物质，它们适用于各种不同的应用，包括但不限于：药学、营养学、美容学和诊断领域。示例性物质包括但不限于：二膦酸盐、碳铂、顺铂、奥沙利铂、卡莫司汀、喜树碱、环丙沙星、氯甲烷、环磷酰胺、环杷明、阿糖胞苷、达卡巴嗪、视黄酸、去氧氟尿苷、氟代乳清酸、格尔德霉素、吉西他滨、棉酚、异磷酰胺、羟基他莫昔芬、伊立替康、植酸、蛋白激酶抑制剂、紫杉醇、白藜芦醇、紫杉烷、甲基硒代-半胱氨酸、氨甲蝶呤、6-硫鸟嘌呤、酪氨酸磷酸化抑制剂、汉黄芩(黄)素、依托泊苷、反义寡核苷酸、siRNA、化学修饰的RNA、柠檬酸盐、1,2,3,4-丁烷四羧酸、八硫酸蔗糖、多磷酸盐、环丙沙星、吗啡、羟吗啡酮、丁丙诺啡、美沙酮。这些试剂可以单独包封或与另一试剂包封在同一脂质体中(例如，一种或多种试剂，两种或更多种试剂)，从而提供协同作用。

特别感兴趣的脂质体负载的物质包括但不限于：抗癌症化疗剂、抗生素、镇痛剂、麻醉剂、抗痤疮剂、生物分子、抗原性物质、抗-血液凝结剂、治疗神经再生性疾病的化合物、麻醉剂、镇痛剂、能用于梯度法制备脂质体的分子、多胺。示例性物质包括但不限于：阿霉素、柔红霉素、喜树碱、顺铂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂、核酸(例如RNA、DNA、siRNA)、多肽(例如肽，包括重组多肽和肽，包括天然或化学修饰的多肽和肽、抗体)、疫苗、苯佐卡因、氯普鲁卡因、可卡因、普鲁卡因、丁卡因、布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、芬太尼、三甲卡因、双氯芬酸、硫酸铵、硫酸三乙胺、八硫酸蔗糖的三乙胺盐、三乙胺多磷酸盐、植酸的铵盐、乙酸的钠、三乙胺或铵盐、草酸的钠、三乙胺或铵盐、丙酸的钠、三乙胺或铵盐、琥珀酸的钠、三乙胺或铵盐、1,2,3,4-丁烷四羧酸的钠、三乙胺或铵盐、吡啶-2,3,5,6-四羧酸的钠、三乙胺或铵盐、1,2,4,5-苯四羧酸的钠、三乙胺或铵盐、1,2,4,5-环己烷四羧酸的钠、三乙胺或铵盐、1,3,5-苯三羧酸的钠、三乙胺或铵盐、精胺的乙酸盐、亚精胺的乙酸盐、三氨基乙胺的乙酸盐。

还可利用美容剂(例如，黄酮类化合物、抗氧化剂，例如γ-亚麻酸、β胡萝卜素、花青素、β-谷固醇)和饮食添加剂(例如，维生素)作为本发明脂质体化合物中的负载药物。

本发明可用作负载的示例性美容剂包括但不限于：水合试剂、蛋白质(例如，胶原)、维生素、植物化学品、酶、抗氧化剂、精油、UV保护剂(例如，羟苯甲酮)、清洁剂、色素、芳香剂。

诊断剂包括可检测标记物，其可以是放射性标记物、荧光团、发光团、核磁共振造影剂，例如钆、正电子发射断层摄影术标记物。脂质体本身可用作诊断剂，例如在超声诊断中用作微泡。

特别感兴趣的是脂质体还可负载毒性药物(例如，各种癌症化疗剂，阿霉素、柔红霉素、喜树碱)和/或水溶性差的药物(例如，两性霉素B、视黄酸)和/或储存稳定性差的疫苗。

可将本发明中的甘草次酸类甘油磷脂化合物或者药用组合物冻干，也可储存在溶液中，或配制成药剂用于各种不同给药途径，包括胃肠外、肠道、鼻部和肺部给药，并可包含一种或多种赋形剂。示范性制剂包括局部、经皮、可注射(例如，静脉内、肌肉内、皮下)、气溶胶和口服制剂，可配制成药物制品、美容制品、营养制品。可接受剂型包括但不限于：水性溶液、悬液、分散液、润肤露、洗液、乳膏、药膏、香膏和软膏。还可制成片剂或胶囊(例如，溶解于消化道中)以及栓剂，还可在器件，例如贴片、绷带中提供本发明中的甘草次酸类甘油磷脂化合物或者药用组合物。

除了本发明的甘草次酸类甘油磷脂化合物和所需的负载物质外，局部制剂可包含适合施加于动物的皮肤或粘膜的药学上可接受的局部运载体。可用各种合适的剂型提供局部制剂，包括但不一定限于洗液、凝胶、药膏、乳膏、香膏、软膏等。这些组合物可以是水性溶液或乳液的形式，例如油和水乳液(例如，水包油乳液或油包水乳液)。如果需要，局部制剂可包含渗透增强剂或帮助经皮肤递送的其它试剂。

通常可利用生理上可接受的运载体、赋形剂、稳定剂等配制本发明考虑的剂型，这些剂型可以是缓释或定时释放剂型。治疗应用的可接受的运载体、赋形剂和稀释剂是药学领域熟知的，描述于，例如Remington′sPharmaceuticalScience(雷明顿药物科学)(A.R.Gennaro编，马克出版公司(MackPublishingCo.)。这些物质在所用剂量和浓度下对于接受者是无毒的，其包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸盐；抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(低于约10个残基)肽，例如聚精氨酸；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸；单糖；二糖和其它碳水化合物，包括纤维素及其衍生物，葡萄糖、甘露糖和糊精；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；糖醇，例如甘露醇和山梨醇；在局部制剂中包含阳离子型和非离子型表面活性剂，例如吐温、普朗尼克和聚乙二醇(PEG)。

用于治疗给药的制剂必须无菌。经无菌膜过滤，或通过其它常规方法，例如辐射或用气体、加热或高压处理不难实现无菌。本发明制剂的pH通常是3-11，更优选5-9。可给予需要用本发明制剂治疗的对象(通常是哺乳动物)将提供最佳疗效的剂量。给药的剂量和方法可依对象而有所不同，取决于诸如所治疗宿主的类型等因素，以动物为例，包括其性别、体重、饮食、目前的治疗、总体临床情况、所用的特定疏水性化合物、这些化合物的具体用途和本领域技术人员知道的其它因素。本领域技术人员能测定有效剂量水平，即，获得所需结果的剂量水平。

可将制剂制备成能在适于保留任何有效负载的活性以及维持本发明甘草次酸类甘油磷脂化合物和可能存在的其它脂质体的完整性的条件下储存。根据本发明，脂质体可在4℃稳定1年或更长时间，因此4℃储存适于长期维持本发明所述的脂质体。

本发明中的甘草次酸类甘油磷脂化合物或者药用组合物可用于各种不同的药学、美容、诊断和生物医学领域。示范性的应用如下所示。

例如，药学、营养学和美容应用通常包括将含有本本发明中的甘草次酸类甘油磷脂化合物或者药用组合物给予动物对象，通常可经由任何合适的途径(例如，胃肠外、肠道、鼻部、肺部等)使其与动物接触来实现给药。就这些应用而言，所述动物是需要治疗的对象，因为该对象需要治疗或可从这种治疗获益。就治疗方法而言，本文所用的“动物对象”通常指需要治疗的对象，和/或就诊断方法而言，指怀疑患有可通过该诊断方法检测的疾病的对象。对象包括动物，包括哺乳动物，例如人、牲畜、宠物等。

本文通常利用术语“治疗”等表示获得所需药理学和/或生理学作用。就完全或部分防止疾病或其症状而言，该作用可以是预防性的，和/或就部位或完全稳定或治愈某疾病和/或逆转该疾病所致不利作用而言，该作用可以是治疗性的。本文所用的“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人中疾病的任何治疗，包括：(a)防止倾向于产生疾病或症状但尚未诊断到具有疾病或症状的对象中疾病或症状的发生；(b)抑制疾病症状，即，使其发展停滞；或(c)缓解疾病症状，即，导致疾病或症状消退。

本发明中的甘草次酸类甘油磷脂化合物或者药用组合物还可用于诊断方法。此类方法包括通过检测动物对象的生物学样品中的分析物来诊断病症。

本文所用的“诊断”通常包括测定对象对疾病或病症的敏感性，测定目前对象是否受疾病或病症影响，预后受疾病或病症影响的对象，和治疗剂的使用效果(例如，监测对象的情况以提供给予治疗作用或效力的信息)。术语“生物学样品”包括从生物体获得的各种样品类型，其可用于诊断或监测试验。该术语包括生物来源的血液和其它液体样品、实体组织样品，例如活检样本或组织培养物或源于其的细胞及其后代。该术语包括获得后以各种方式操作的样品，例如用试剂处理、溶解或富集某些组分。该术语包括临床样品，还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解液、血清、血浆、生物流体和组织样品。

利用本发明药用组合物的诊断方法通常包括检测流体中分析物存在与否，该方法包括使得该液体与含有本发明的药用组合物接触，检测药用组合物中的变化，其中药用组合物的变化表示分析物的存在与否乃至含量变化情况。其中，脂质体中的变化包括颜色改变(例如，由于所包封荧光团的发射波长改变)，尺寸或完整性变化。因此，可通过评估脂质体的特性，例如光学特性(如，反射率)、相转变等来检测脂质体中的变化。

本发明的药用组合物在与治疗或诊断不直接相关的领域中也有各种应用。例如，将有效负载(例如，核酸、多肽)体递送至细胞。在该方法中，培养的动物细胞(例如，培养的哺乳动物细胞，如人细胞)与含有有效负载的药用组合物接触，从而有助于将该有效负载递送至该细胞。可采用此类方法引入不易穿过动物细胞膜的核酸、多肽或其它化合物。

本发明的甘草次酸类甘油磷脂化合物还可用作人工双层，因此可用于诸如生物传感器等装置中。涉及利用人工双层的生物传感器是本领域熟知的。它们尤其适用于脂质表面与血液、血浆、血清或含细胞、蛋白质或脂质的其它体液直接接触的情况。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明的甘草次酸甘油磷脂的合成路线图。

图2为本发明的甘草次酸甘油磷脂的质谱图。

图3为本发明的甘草次酸甘油磷脂的氢谱图。

图4为本发明的sPLA₂敏感性脂质体的粒径分布图，其中，A为sPLA₂敏感性脂质体(DPPC:GA-PC 90:10)的粒径分布图；B为sPLA₂敏感性脂质体(DPPC:GA-PC:DSPE-PEG200090:5:5)的粒径分布图；GA-PC为本发明的甘草次酸甘油磷脂。

图5为sPLA₂敏感性脂质体的荧光素释放率，其中，A为DPPC加入10％ GA-PC的sPLA₂敏感性脂质体在蜂毒型sPLA₂作用下的荧光素释放率图；B为DPPC:DSPE-PEG2000(95:5)加入5％ GA-PC的隐形sPLA₂敏感性脂质体在蜂毒型sPLA₂作用下的荧光素释放率图；GA-PC为本发明的甘草次酸甘油磷脂。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例

本发明涉及的英文缩略词的中文全称如下：

DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱；

DSPE-PEG2000：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇；

18:0Lyso PC：1-硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰胆碱；

GA-PC：本发明的甘草次酸甘油磷脂。

本发明实施例中所使用的DPPC，DSPE-PEG2000，18:0Lyso PC购自Avanti PolarLipids,Inc.；磷酸标准液和荧光素购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司；甘草次酸，曲拉通X-100(98％)，葡聚糖凝胶G-75中等颗粒，购自百灵威科技有限公司；三(羟甲基)氨基甲烷(>99％)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；蜂毒型sPLA₂-IIA酶购自Cayman代理商，深圳欣博盛生物科技有限公司。

实施例1甘草次酸甘油磷脂的合成

反应条件如图1所示，取233mg甘草次酸(0.497mmol)溶于无水氯仿中，在冰浴下加入190mg的1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI,0.993mmol)，反应1h后，冰浴下加入60mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP,0.497mmol)，反应10min后，冰浴下加入156mg的18:0Lyso PC(0.331mmol)，反应温度自然升到室温，反应72h后，旋干反应液。粗产品用凝胶柱Sephadex LH-20纯化(凝胶高度80cm，二氯甲烷：甲醇＝1:1)，除去催化剂和原料甘草次酸，原料18:0Lyso PC通过硅胶柱除去(200～300目硅胶，二氯甲烷：甲醇＝5:1，二氯甲烷：甲醇：水＝100:25:4)，得终产物甘草次酸-磷脂胆碱(40mg,12％)。TLC点板条件为二氯甲烷:甲醇＝7：1，R_f值为0.46。

甘草次酸-磷脂胆碱质谱数据如图2所示，HR-MS(ESI⁺):C₅₆H₉₈NO₁₀PNa⁺for[M+Na]⁺calculated 998.68206,found 998.68256。氢谱数据如图3所示，¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ(ppm):5.59(s,1H,H-12),5.27(s,1H,OCH),4.54-3.97(m,8H,CH₂PO₄CH₂CH₂N,COOCH₂CH),3.36(s,1H,H-3),3.31(s,9H,N(CH₃)₃),2.75(s,1H,OH),1.39(s,3H,H-27),1.27(s,30H,(CH₂)₁₅),1.19(s,3H,H-25),1.12(s,3H,H-28),1.01(s,3H,H-26),0.90(s,3H,H-29),0.82(s,6H,H-23,H-24)。

实施例2荧光素脂质体的制备

本实施例制备DPPC脂质体的方法为薄膜冻融挤出法。取10μmol DPPC的氯仿溶液，放到10mL圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪减压旋蒸除去氯仿，膜干燥后，真空干燥过夜除去痕量有机溶剂。加入1mL 6-CF荧光素溶液(125mmol/L)，55℃下水浴半小时至固体完全消失。水化完成后，液氮下冻结2min，55℃下溶解2min，冻融循环6次。使用10mL罐体挤出器(TBX001)在氮气加压下挤压过100nm孔径的聚碳酸酯膜(waters)，重复过膜5次，以获得均匀的粒度分布，挤出过程保持55℃的温度。未包封的CF荧光素通过Sephadex G-75凝胶除去，洗脱剂为Tris-HCl缓冲液(pH7.4)。纯化好的脂质体储存在4℃中。脂质体的磷脂浓度分析使用的方法为磷酸盐分析法。

荧光素脂质体DPPC:DSPE-PEG2000(95:5)，DPPC:GA-PC(90:10)，DPPC:GA-PC:DSPE-PEG2000(90:5:5)的制备也如上所述。

实施例3脂质体粒径分布测定

脂质体粒径分布通过基于动态光散射技术的纳米粒度及zeta电位仪Nanotracwave II(麦奇客有限公司，美国)。

具体操作：纯化好的脂质体需要使用Tris-HCl缓冲液稀释一倍，软件操作里面的粒径分布选择体积模式；每个样品独立测试三次。相关脂质体的粒径测试结果如表1，图4所示。数据表示为平均值±标准差，每个样品独立测试三次。

表1脂质体粒径分布

实施例4脂质体在蜂毒型(Bee venom，Bv)sPLA₂作用下的释放率

对照实验为不加sPLA₂的组，实验组为加sPLA₂的组。对照组只加入脂质体和CaCl₂，实验组另外加入来源于蜜蜂蜂毒的Bv sPLA₂，最后加入Tris-HCl缓冲液使磷脂，CaCl₂和sPLA₂的浓度为50nmol/mL，1mmol/L和100ng/mL。反应液在室温下(25℃)避光反应，在不同时间点取200μL溶液进入96孔板，酶标仪读取光吸收强度I_t，激发波长为480nm，发射波长为510nm中，加入10μL 10％的曲拉通破坏磷脂膜，检测总的光吸收值量I_tol。脂质体的CF荧光素释放率计算公式：荧光素释放率＝[(I_t-I₀)/(I_tol-I₀)]*100，I₀为反应时间点0h的荧光素强度。脂质体荧光素释放率如图5所示。数据表示为平均值±标准差，每个样品独立测试三次。

数据结果表明，没加入DSPE-PEG2000的脂质体配方中，含有甘草次酸甘油磷脂的脂质体在sPLA₂酶作用下，释放速率显著提高，释放率差异最大能达到7倍。加入DSPE-PEG2000的脂质体配方中，含有甘草次酸甘油磷脂的脂质体在sPLA₂酶作用下，释放速率更是显著提高了12倍，且在2h内荧光素几乎全部释放完。该数据表明加入甘草次酸甘油磷脂的脂质体，在sPLA₂酶的作用下，能实现可控释药，并且甘草次酸的酯键水解离去能显著加快脂质体的释药速率，DSPE-PEG2000的添加也能进一步提高脂质体的释药速率。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (12)

1.一种甘草次酸类甘油磷脂化合物，其特征在于，所述甘草次酸类甘油磷脂化合物为具有如式（I）所示结构的化合物，或其药学上可接受的盐：

式（I）;

其中，R₁为C₁₂-C₂₂的直链烷基；

R₂为羟基。

2.根据权利要求1所述的甘草次酸类甘油磷脂化合物，其特征在于，所述甘草次酸类甘油磷脂化合物为具有如式（II）所示结构的化合物，或其药学上可接受的盐：

式（II）。

3.一种药用组合物，其特征在于，包括权利要求1或2所述的甘草次酸类甘油磷脂化合物；进一步，所述药用组合物还包括其他磷脂类化合物。

4.根据权利要求3所述的药用组合物，其特征在于，所述甘草次酸类甘油磷脂化合物与所述其他磷脂类化合物的摩尔比为1：9-19。

5.根据权利要求3所述的药用组合物，其特征在于，所述其他磷脂类化合物为磷脂和/或聚乙二醇化磷脂。

6.根据权利要求5所述的药用组合物，其特征在于，所述磷脂为蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬酯酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的药用组合物，其特征在于，所述磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱。

8.根据权利要求5所述的药用组合物，其特征在于，所述聚乙二醇化磷脂为聚乙二醇修饰的磷脂，为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3350、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇6000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇8000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇10000中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的药用组合物，其特征在于，所述聚乙二醇化磷脂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。

10.一种分泌型磷脂酶A2敏感性脂质体，其特征在于，包括权利要求3-9中任一项所述的药用组合物。

11.根据权利要求10所述的分泌型磷脂酶A2敏感性脂质体，其特征在于，所述分泌型磷脂酶A2敏感性脂质体由所述药用组合物经冻融法制得。

12.权利要求1或2所述的甘草次酸类甘油磷脂化合物、权利要求3-9中任一项所述的药用组合物、或权利要求10或11所述的分泌型磷脂酶A2敏感性脂质体在制备治疗癌症药物中的应用，所述癌症为超表达分泌型磷脂酶A2的癌症。