CN105030730B

CN105030730B - 多重靶向抗肿瘤复合制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN105030730B
Application number: CN201510385573.5A
Authority: CN
Inventors: 杨红; 龚珠萍; 邓安平; 刘迪; 吕小燕; 王雪; 姚枫枫; 付佩; 赵成龙
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2015-07-03
Publication date: 2018-01-12
Anticipated expiration: 2035-07-03
Also published as: CN105030730A

Abstract

本发明公开了一种多重靶向抗肿瘤复合制剂及其制备方法，多重靶向抗肿瘤复合制剂由Fu泡囊混悬液、DOX‑BSA以及FA‑DOX组成。本发明为了低毒高效治疗肿瘤，综合免疫治疗、主动靶向化疗药物分子、被动靶向给药系统等多种治疗手段，制备的泡囊给药系统可明显缓释Fu可有效遏制肿瘤发展，但对荷瘤机体影响小；新合成的免疫原可获得灵敏度较高的抗体，为免疫治疗所需免疫复合物大分子的形成奠定了基础；小分子化合物FA‑DOX可在免疫治疗中起分子桥连接作用，促进免疫复合物大分子形成；本发明复合制剂的疗效明显优于单纯微粒给药化学治疗或单纯免疫治疗，明显具有毒性低，可提高抗肿瘤效果的特点，是一种具有广阔研究与应用前景的抗癌复合制剂。

Description

多重靶向抗肿瘤复合制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种多重靶向抗肿瘤复合制剂及其制备方法，该复合制剂能启动自身免疫，提高抗肿瘤效果。

背景技术

目前治疗肿瘤的方法主要有手术治疗、放射治疗、化学治疗以及生物治疗等，因其各有优缺点，而在肿瘤治疗中各有其地位和作用。化学治疗，利用化学药物的细胞毒性来杀死肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的生长。但小分子化疗药物往往缺乏可识别肿瘤细胞的特定基团而导致其在非肿瘤组织的大量分布，提高给药剂量在增加疗效时往往得不偿失地给机体带来更强烈的毒副作用。临床上通常给予次优剂量以降低严重的副作用，但此种做法往往会影响肿瘤组织药物浓度从而降低治疗效果。

为克服这些缺陷，逐步发展出如脂质体递送、聚合物微粒包载以及聚合物/抗体-药物结合物等多种方法。这些方法通过改善化疗药物的溶解度或延长血液循环时间来降低化疗的毒副作用，最终通过EPR效应增加药物在肿瘤部位的蓄积。除了能改善传统化疗药物的抗肿瘤效果和毒性之外，药物包载后往往还能够在某种程度上克服临床普遍存在的多药耐药问题。但是，病变细胞复杂的内环境迫切需要发展一种替代疗法来取代或补充现存的抗肿瘤药物递送策略。靶向给药系统具有使药物靶向到肿瘤组织定点释放的优势，逐渐成为国内外肿瘤研究的一大热点。特别是在纳米给药系统应用到肿瘤化疗以后，越来越多的纳米系统显示出良好的抗癌活性和较低的细胞或组织毒副作用。临床常见的另一种方法是联合给药，不同作用机理的化疗药物联合使用，不仅可以降低单药给药剂量从而减少毒副作用，而且还能改善药物体内分布，增加药物对靶标的作用效应，从而延长患者的生存期。

尽管如此，在大多数情况下，单一的化学治疗仍仅能延长患者的生存期而难以达到治愈的目的，即使肿瘤消失其复发的可能性仍旧极大。且近期研究还发现，药物治疗可造成肿瘤的适应性进化，该发现发表在今年3月的Nature杂志上。

免疫治疗主要是给予机体免疫相关物质以激发或调动免疫系统，增强内环境中对肿瘤细胞的识别能力，从而杀伤肿瘤细胞。上世纪50年代，随着免疫逃逸学说的发现使免疫治疗逐渐兴起。与化疗药物的细胞毒作用不同，免疫系统自身在不损伤正常组织的前提下能够特异性识别并杀灭肿瘤，而且可以产生长久记忆来防止肿瘤复发，因此疗效持久且温和甚至有望根治肿瘤。Nature杂志甚至发文认为，未来10年60%的肿瘤患者将主要接受免疫治疗。

然而，肿瘤并非局部发生的静态疾病，不同个体、不同组织的肿瘤抗原性并不相同，相互之间可能亦无交叉反应；其次，个体的免疫功能千差万别；还存在其他因素，导致肿瘤免疫反应各异，让肿瘤的免疫治疗举步维艰，此外，缺乏预测指标、有效性不可预测且仅限于少数患者等问题也逐见端倪，成为研发抗癌免疫治疗的瓶颈。

免疫治疗虽有对机体温和甚至可防止肿瘤复发等优势，但周期相对较长且只能清除少量残留肿瘤细胞而对发展后期的实体瘤效果不理想，若不在肿瘤发展初期对其进行遏制，在肿瘤负荷较大的情况下则难以达到满意的抑瘤效果。

因此，需要研发新型的抗肿瘤复合制剂，切实增加药物抗肿瘤效果；同时，对于抗肿瘤制剂，还需要具有体内长循环能力、可有效浓集于肿瘤部位。

发明内容

本发明的目的是提供一种多重靶向抗肿瘤复合制剂及其制备方法。

本发明研发的多重靶向抗肿瘤复合制剂由Fu泡囊、DOX-BSA和FA-DOX制成，基于载药微粒的EPR效应、配体-受体和抗原-抗体特异性靶向作用，联合被动靶向给药系统和免疫治疗，并辅助主动靶向分子治疗，实现更加高效地治疗癌症的目的。在免疫治疗前期介入Fu泡囊给药系统抑制肿瘤的发展进程，防止肿瘤过度发展，提高治疗效果，克服了现有肿瘤疫苗开发成本高昂且肿瘤细胞有免疫逃逸特性的缺陷。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案是，

一种多重靶向抗肿瘤复合制剂，由Fu泡囊混悬液、DOX-BSA以及FA-DOX组成；

所述Fu泡囊混悬液中，Fu泡囊的粒径为220～250nm，包封率为30～35%，表面固有水化层厚度为1.8～1.9nm，载药率为12～15%，Zeta电位为-65～-70mV；

所述Fu泡囊的囊壁由普朗尼克-胆固醇化合物，失水山梨醇棕榈酸单酯（Span40）、失水山梨醇硬脂酸单酯（Span60）及胆固醇（Chol）在缓冲液中自组装聚集而成；囊芯为氟尿嘧啶；

所述DOX-BSA的结构式为：

所述FA-DOX的结构式为：

。

上述技术方案中，所述普朗尼克-胆固醇化合物的结构式为：

、

。

上述技术方案中，所述Fu泡囊混悬液中，Fu含量为4.0 mg·ml^-1。

本发明的Fu泡囊的囊壁由普朗尼克-胆固醇化合物、失水山梨醇棕榈酸单酯（Span40）、失水山梨醇硬脂酸单酯（Span60）及胆固醇（Chol）在缓冲液中自组装聚集而成；普朗尼克-胆固醇、2种Span都是表面活性剂（两亲性），与亲脂性的胆固醇，制成有机溶剂的溶液，遇水后疏水部分自动聚集，亲水链舒张于水中，混在有机相的药物在各成分的疏水作用作有序排列时被包载双分子夹层中，其中的胆固醇可提高双层膜的性质，普朗尼克-胆固醇是用亲脂性的胆固醇对原来亲水性的表面活性剂普朗尼克性质的调整，提高了其亲脂性，从而有利于与亲脂性的表面活性剂Span、亲脂性物质胆固醇在自组装时因疏水作用而聚集形成泡囊。Fu泡囊混悬液为有机相加入PBS中，最后挥发有机溶剂制得，包括磷酸盐缓冲液与Fu泡囊。

本发明的新型泡囊给药系统，首次以普朗尼克F127-胆固醇与失水山梨醇棕榈酸单酯（Span40）、失水山梨醇硬脂酸单酯（Span60）及胆固醇（Chol）包载水溶性药物5-氟尿嘧啶(Fu)，化学稳定性优于脂质体，得到的Fu泡囊粒径降低至220～250nm，包封率为30～35%，表面固有水化层厚度为1.8～1.9nm（现有技术最大<1.5nm），载药率为12～15%，Zeta电位为-65～70mV；其粒径小、表面水化层厚且包封率相对较高，可规避机体内皮网状系统拦截而不伤害正常组织，实现血中长循环，并通过EPR效应对肿瘤组织产生被动靶向作用；Fu经泡囊包载后，可以减缓药物的代谢，延长半衰期，通过确切的靶向作用提高疗效，从而可降低给药剂量，减少毒副作用，为疗效确切的Fu解决了半衰期短、作用缺乏靶向性的缺陷。

本发明还公开了上述多重靶向抗肿瘤复合制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1) 将普朗尼克F127、乙酸酐和二甲亚砜混合，反应得到反应混合物；然后将反应混合物滴入无水乙醚中；再加入二氯甲烷，振摇，再加入乙醚，静置，然后抽滤，滤饼为普朗尼克F127-醛；将普朗尼克F127-醛、胆固醇、浓盐酸加入无水乙醇中，回流反应；然后反应液经抽滤，得到蜡状固体；然后将蜡状固体置于NaOH溶液中浸泡后抽滤，滤饼为普朗尼克F127-胆固醇；将普朗尼克F127-胆固醇、失水山梨醇棕榈酸单酯、失水山梨醇硬脂酸单酯及胆固醇加入无水乙醇和乙酸乙酯中，加盖密闭，搅拌溶液至澄清；然后开盖加入Fu，盖上密闭，搅拌分散或溶解；然后开盖加入预热的磷酸盐缓冲液，上盖密闭乳化，最后在搅拌下挥发去除有机溶剂，得到Fu泡囊混悬液；乳化时的搅拌速度为1200～1300 r·min^-1；挥发去除溶剂时的搅拌速度为700～800 r·min^-1；

(2) 将BSA加入PBS溶液中，得到BSA溶液；将DOX^.HCl溶解于DMF中，得到DOX溶液；混合BSA溶液与DOX溶液，然后以3～5滴/min的滴速滴加戊二醛溶液，室温下避光反应；反应完成后于4℃下离心处理，取上清，于4℃下，用PBS溶液透析；透析完成后，转出透析袋中的溶液，冻干即为DOX-BSA；

所述PBS溶液的浓度为0.1 mol/L；所述戊二醛溶液中戊二醛的质量浓度为22～28%；所述BSA、DOX^.HCl、戊二醛的质量比为1∶（50～90）∶（6～8）；

(3) 将 DMF加入盛有FA的容器中，得到FA溶液；将NHS和DCC分别溶解于DMF中，得到NHS溶液以及DCC溶液；混合FA溶液、NHS溶液以及DCC溶液，避光反应10～16小时；反应液离心处理后收取上清液；取DOX^.HCl溶解于DMF中得到DOX溶液；将DOX溶液滴加入所述上清液中，室温下避光反应5～8小时；反应完成后，离心处理反应液，取上清；上清经无水甲醇/乙醚混合液沉淀；收取沉淀，冻干即为FA-DOX；所述FA、NHS、DCC、DOX^.HCl的摩尔比为1∶（4～6）∶（4～6）∶（1.2～1.5）；所述无水甲醇/乙醚混合液中无水甲醇、乙醚的质量比为30∶70；

所述Fu泡囊混悬液、DOX-BSA以及FA-DOX组成多重靶向抗肿瘤复合制剂。

上述技术方案中，步骤(1)中，普朗尼克F127-胆固醇加入无水乙醇和乙酸乙酯前经过纯化处理，具体为滤饼用氯仿溶解后装入截留分子量为3500的透析袋中，依次以80 %的甲醇溶液、50 %的甲醇溶液、30 %的甲醇溶液、蒸馏水分别透析；最后将透析袋内的溶液转出，冷冻干燥得到纯化的普朗尼克F127-胆固醇；失水山梨醇棕榈酸单酯、失水山梨醇硬脂酸单酯加入无水乙醇和乙酸乙酯前分别经过纯化处理，具体为失水山梨醇棕榈酸单酯、失水山梨醇硬脂酸单酯分别用氯仿溶解后分别装入截留分子量为3500的透析袋中，依次以80%的甲醇溶液、50%的甲醇溶液、30%的甲醇溶液、蒸馏水分别透析，最后将透析袋内的溶液转出，冷冻干燥得到纯化的失水山梨醇棕榈酸单酯、纯化的失水山梨醇硬脂酸单酯；加入Fu，密闭后拌匀的具体方式为。

上述技术方案中，步骤(1)具体为将普朗尼克F127、乙酸酐和二甲亚砜混合，室温反应30 h得到反应混合物；然后将反应混合物滴入无水乙醚中，有沉淀析出；再加入二氯甲烷，充分振摇使溶液均相，再加入乙醚，4℃静置12～24小时；然后抽滤混合物，滤饼真空干燥得到普朗尼克F127-醛；将普朗尼克F127-醛、胆固醇、浓盐酸加入无水乙醇中，回流反应2.5小时；然后反应液经抽滤，水洗除酸，得到蜡状固体；然后将蜡状固体置于浓度为0.1M的NaOH溶液中浸泡后抽滤，滤饼为载体材料普朗尼克F127-胆固醇；将普朗尼克F127-胆固醇、失水山梨醇棕榈酸单酯（Span40）、失水山梨醇硬脂酸单酯（Span60）及胆固醇（Chol）加入无水乙醇和乙酸乙酯中，密闭，于60℃下搅拌溶液至澄清；然后迅速加入5-氟尿嘧啶，密闭，先搅拌再超声处理；然后加入60℃预热的磷酸盐缓冲液，密闭，37℃下乳化20分钟，最后开盖在搅拌下挥发去除溶剂，得到Fu泡囊混悬液。

上述技术方案中，所述抽滤全部为减压抽滤。可加快过滤速度，减少F127-醛暴露在空气中的时间，否则产率大大下降；避免常压过滤速度十分缓慢且干燥度较差。

上述技术方案中，步骤(1)中，乳化时的搅拌速度为1250 r·min^-1；挥发去除溶剂时的搅拌速度为750 r·min^-1。

上述技术方案中，步骤(2)中，所述戊二醛溶液中戊二醛的质量浓度为25%；以4滴/min的滴速滴加戊二醛溶液；室温下避光反应时间为6小时；4℃下离心处理时的转速为3000rpm，时间为10分钟；用PBS溶液透析时，当透析外液呈现微红色时更换新的透析液，透析至用紫外分光光度法检测透析外液在480 nm处吸收峰消失即完成透析。戊二醛的稀释度和滴加速度和搅拌速率尤为重要，稀释度过小、滴加过快以及搅拌过快均会导致大量沉淀产生。

上述技术方案中，步骤(3)中，混合FA溶液、NHS溶液以及DCC溶液，避光反应12～14小时；反应液离心处理后收取上清液操作中，离心处理的转速为8000rpm；将DOX溶液以20～40滴/min的滴速滴加入所述上清液中，室温下避光反应6小时；离心处理反应液操作中，离心处理的转速为8000rpm。FA的活化时间很重要，其影响FA活化物的活性程度和目标产物的量。

本发明的多重靶向抗肿瘤复合制剂中，以DOX-BSA为抗原，在免疫动物产生抗阿霉素抗体的过程中，首次采用由F127-Chlo制备的Fu泡囊给药系统有效遏制肿瘤发展进程，当抗体产生后注入FA-DOX连接桥，在肿瘤细胞表面形成FR-FA-DOX-抗体复合物大分子，启动机体自身免疫系统识别肿瘤细胞，将其杀灭；并且游离FA-DOX可产生主动靶向化疗作用，经体内外细胞试验证实，该复合制剂能显著提高肿瘤治疗效果。因此，本发明还公开了上述多重靶向抗肿瘤复合制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

肿瘤为血癌、骨癌、淋巴癌、肠癌、肝癌、胃癌、盆腔癌、肺癌、脑癌、神经癌、宫颈癌、乳腺癌、食道癌或肾癌。

载药泡囊的制备是精密控制过程，制备过程严重影响最终产品的性质，特别是粒径、囊壁对囊芯的包覆程度以及泡囊表面的性质会最终影响载药泡囊在体内发挥作用的效果，甚至决定载药泡囊能否发挥作用；本发明创造性的将制备囊壁的材料与辅料混合后，再加入药物，而不采用常规的先将囊壁材料与药物混合的做法，很好地避免了辅料溶解不完全对囊壁包覆带来自组装效果不好的问题；在水相与有机相混合的过程中，为了能使有机相在水相中有效分散同时自组装形成粒径较小的乳滴，一般采用至少高于2000r•min^-1高速搅拌，否则形成的泡囊粒径较大；本发明首先合成并纯化了亲水性表面活性材料F127-Chlo，以此为囊壁材料，先与辅料混合，再加入Fu以及预热的缓冲液，创造性的采用1250 r•min^-1乳化、750 r•min^-1挥发有机溶剂的搅拌手段，得到的Fu囊泡粒径为220～250nm，平均为240nm，可明显缓释药物且可通过EPR效应实现体内长循环效果；同时避免了现有2000r•min^-1高速搅拌碎片较多、粒径及规整度差的缺陷；取得了意想不到的技术效果。

在目前常采用的联合治疗中，多采用相同的治疗手段联合不同化疗药，或化疗联合热疗等不同手段治疗方法联合，关于免疫疗法、主动药物靶向治疗与被动靶向药物治疗联用的联合治疗研究未见报道，其对所制备的复合制剂各个组分的要求高，不仅需要分别在治疗中的各个阶段发挥作用，而且要求低毒，要针对肿瘤病体在发生免疫反应的体质情况，靶向作用于肿瘤细胞并将其杀死，但对正常组织细胞损害小，才能最终取得了很好的联合治疗效果。荷瘤病体体质差，而免疫原刺激产生免疫反应时，对机体影响大，如果不能有效降低药物的毒性，可导致病体器官严重损伤甚至死亡，故要求本专利多种靶向制剂的三个组分的毒性低而效果好；另外，目前免疫动物的有关报道较多的是，对健康动物免疫后抽取抗体进行免疫分析方法的研究，还未见免疫患癌动物体结合微粒给药系统再进行免疫治疗的报道。本发明采用现代制剂学手段，创造性的开发了多重靶向抗肿瘤复合制剂，有效降低化疗药的毒性，提高了免疫原的免疫原性和效果，在免疫荷瘤动物等待抗体产生期间，以新型给药系统控制肿瘤发展，对免疫反应中动物的体质损伤小。

本发明创造性的由F127-Chlo等制得小粒径、表面亲水的氟尿嘧啶隐形泡囊，高效低毒，可有效遏制肿瘤生长、改善了荷瘤鼠的生存状态和生存期，为保证免疫治疗及分子桥的主动靶向化疗发挥作用，赢得所需的时间，为抗体的产生争取时间；以新的投料比制备得到新的免疫原，免疫原性好，所产生的抗体效价好，为免疫治疗奠定了基础；保证以分子桥FA-DOX引导抗体在癌细胞表面形成抗体复合物并启动免疫治疗。本发明的复合制剂产生显著的抗癌作用，抑瘤率高，且有效延长了荷瘤病体的生存期；根据实施例，利用本发明的复合制剂联合治疗后的荷瘤鼠生存期27天，远超过了现有技术报道的天数；而且抑瘤率达到75.15%，充分体现了本发明Fu泡囊、DOX-BSA和FA-DOX复合制剂联合应用的优势，实现治疗肿瘤疗效显著的目的，取得了意想不到的技术效果。

由于上述方案运用，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1．本发明首次采用复合制剂的思路，设计了主动靶向化学药物、免疫制剂和被动靶向给药系统联合应用方案，制备了多重靶向抗肿瘤复合制剂并将其用于抗肿瘤的研究；不仅产生显著的抗癌作用，抑瘤率高，且有效延长了荷瘤动物的生存期；根据实施例，荷瘤鼠从免疫治疗辅以主动靶向分子化疗的生存期10天，提高到联合被动靶向泡囊治疗后的生存期27天，而且抑瘤率达到75.15%，有效避免了被动靶向药物与免疫疗法联用会导致器官损伤甚至死亡的难题，显示了本申请公开的复合制剂在低毒高效方面取得了意想不到的技术效果。

2．本发明公开的包载Fu的泡囊可减缓Fu的释放，与游离药物相比，在正常细胞pH7.4环境下释放t_1/2减缓3.93倍，在肿瘤细胞pH5.0环境下释放t_1/2减缓2.28倍；并且泡囊中的药物Fu在肿瘤细胞pH 5.0环境条件下，比在正常体液中释放加快72.26%；说明本发明泡囊的缓释作用强，且泡囊中的药物在正常体液中相对稳定，易于在肿瘤细胞中释放，有利于Fu在pH较低的靶细胞内发挥作用。

3．本发明公开的包载Fu的泡囊显著提高药物的细胞毒性，对人源宫颈癌Hela细胞和鼠源乳腺癌4T1细胞24 h的IC₅₀降低81.6%～90.9%（p<0.05）；空白泡囊组细胞存活率始终＞80%，说明本发明的泡囊对癌细胞的杀伤力强，而载体的安全性高；细胞毒性试验显示本发明制备的Fu泡囊，粒径小而有利于入胞，且其表面水化层厚度大，在体内长循环能力强，有利于药物发挥作用。

4. 本发明以新的投料比制备得到新的免疫原，免疫原性好，所产生的抗体效价好，为免疫治疗奠定了基础，保证以分子桥FA-DOX引导抗体在癌细胞表面形成抗体复合物并启动免疫治疗；与毒性低的Fu泡囊联用，具有协同效应，不会相互阻碍，对肿瘤杀伤力强，特别对病体的正常组织细胞损害小，最终取得了很好的联合治疗效果。

5. 本发明自制囊壁材料并纯化后用以包载Fu，创造性的得到了规避RES吞噬系统吞噬、长循环效果的Fu泡囊，与其他药物组合为复合制剂，对抗肿瘤具有显著效果；因此，本发明公开的复合制剂可以用作高效可控释放药物体系、持久免疫治疗体系以及靶向化疗体系，在抗肿瘤药物领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为Fu泡囊混悬液的粒径分布图以及TEM图；

图2为Fu泡囊体外累计释放曲线图；

图3为Fu泡囊对4T1、Hela细胞的24h细胞毒性抑制图；

图4为BSA-DOX、BSA和DOX的紫外-可见分光光谱图；

图5为鼠抗DOX多抗ELISA测定DOX的抑制曲线图；

图6为FA-DOX在癌细胞表面连接抗体的紫外吸光图；

图7为癌细胞在不同时间对药物摄取的荧光图；

图8为不同浓度FA-DOX、DOX分别对4T1细胞的24h细胞毒性图；

图9为荷瘤鼠肿瘤生长抑制曲线图；

图10为小鼠瘤块组织切片图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一

将普朗尼克F127、乙酸酐和二甲亚砜混合，室温反应30 h得到反应混合物；然后将反应混合物滴入无水乙醚中，有沉淀析出；再加入二氯甲烷，充分振摇使DMSO与乙醚形成均相溶液，利于普朗尼克F127-醛产物充分沉淀，再加入不良溶剂乙醚，使产物形成沉淀而与其他物质分离；4℃静置15小时；然后抽滤混合物，滤饼真空干燥得到普朗尼克F127-醛；将普朗尼克F127-醛、胆固醇、浓盐酸加入无水乙醇中，回流反应2.5小时；然后反应液经抽滤，水洗至中性得到蜡状固体；然后将蜡状固体置于浓度为0.1M的NaOH溶液中浸泡后抽滤，滤饼为新型载体材料普朗尼克F127-胆固醇（F127-chol）。

所述普朗尼克F127--胆固醇化合物的结构式为：

、

¹HNMR图谱的特征峰有：δ（ppm）：1.03（CH₃in F127-Chol of F127），2.28（C=CHCHin F127-Chol of Chol），3.52（m，-OH in F127-Chol of Chol），5.35（s，CHC=CH in F127-Chol of Chol）。上述特征峰说明F127-Chol合成成功，且根据F127上CH₃和Chol 上C=CHCH的质子的峰面积，分别为2.76，1.65，可知每个普朗尼克F127分子上平均大概连接上了1.67个胆固醇分子。

可见，所得F127-chol为混合物，一部分是1个普朗尼克分子上连接1个胆固醇分子，稍多的另一部分是1个普朗尼克分子上连接2个胆固醇分子。在形成泡囊时，因胆固醇的疏水作用，在水相中的是连单个胆固醇的线状F127链，或者在水相中的是连2个胆固醇的半环状F127链（此时亲水链长度为线状分子的一半），因此由F127-chol和Span等制备泡囊自组装时，在乳化阶段搅拌充分的条件下，同时存在的长链、短链可交叉排列，形成更加稳定的泡囊结构。

将处方量的各种载体材料F127-chol、Span40、Span60及Chol置于西林瓶中加入无水乙醇和乙酸乙酯，加瓶盖密闭，60 ℃水浴1250 r·min^-1搅拌溶解至澄清，保证囊材完全溶解。开瓶盖迅速加入处方量Fu后迅速盖上密闭，减少有机溶剂挥发保证自组装完成（若有机相损失过大，囊材会在水中析出，严重影响泡囊质量），搅拌4 min，超声1 min（Fu用药剂量大，为使药物尽量溶解或充分混悬）。快速将在60 ℃水浴中预热的缓冲液A加入，密闭，37℃水浴1250 r/min搅拌20 min乳化彻底后，开盖以750 r/min搅拌过夜，彻底挥发溶剂，即得Fu泡囊混悬液（简称泡囊液，Fu含量为4.0 mg/ml）。

图1为上述Fu泡囊混悬液的粒径分布图(A)以及TEM图(B)，可见泡囊粒径均较小，制得的泡囊为较规整球形，平均粒径240.4 nm；根据古依-查普曼扩散双电层模型，由带电微粒的Zeta电位（ζ）计算其表面固有水化层厚度（FALT，简称L）的公式为：ln（ζ）= lnA－κL（A为常数A；κ 为Debye-Hückel参数，k = C1/2/0.3；C为电解质溶液的摩尔浓度）。将Fu泡囊混悬液1 ml用0、5、10、20、100 mmol·L-1的NaCl溶液4 ml分散，测得Zeta电位Zeta电位(-68.37±1.35) mV（n =3），FALT为（1.83±0.31）nm（n = 3）；包封率(30.27±2.23) %，载药率为12～15%。

采用透析法对Fu从泡囊的释放情况进行考察并与对照泡囊进行对比研究，事先将透析膜在纯净水中浸泡过夜或沸水中煮2h进行活化并除去添加剂成分。将泡囊液（Fu泡囊混悬液）、Fu溶液、空白泡囊液+Fu溶液各1 ml分别置于透析袋中，37 ℃，在60 ml缓冲液A或缓冲液B中100 r·min-1搅拌透析，先后于5min、10min、15min、0.5、1.0、2.0、3.0、6.0 h各时间点取透析外液4 ml，同时补加4 ml缓冲液A，继续透析。测定透析外液吸光度值，计算药物累积释放量；透析内液以溶剂1充分溶解后超声10min至泡囊完全破裂，定容至10 ml，测定内液吸光度值并换算成相应药物含量。对取样时间（Q %-t）作图释放曲线见图2，体外释放符合Weibull模型，在模拟正常体液的环境中释放药物明显减缓（t1/2为游离Fu的3.93倍）。在模拟正常细胞内环境（pH 7.4）、中间酸度值（pH 6.4）和模拟癌细胞内环境（pH 5.0）条件下，游离Fu和空白泡囊+Fu的释放t1/2几乎一样，而泡囊的t1/2分别为游离Fu的3.93、2.80及2.28倍，说明泡囊中药物的释放受pH影响，且随着环境酸度的增大而释药速率加快，有利于Fu在pH较低的靶细胞内发挥作用。加之游离Fu与空白泡囊+Fu的释放规律相同、释药t1/2几乎一致，说明泡囊释药特性的显著改变源自药物的包载。

用鼠源性的4T1细胞原代培养后接种，构建小鼠肿瘤模型后，与Fu对照，考察泡囊的体内抗癌作用效果。结果表明，以用F127-Chlo制成的包载Fu小粒径泡囊，体内抗癌活性显著提高，抑瘤率由游离药物的19.58%增加至48.45%，提高了247.1%。

取对数生长期的4T1细胞，制成5×10³个·ml^-1细胞的混悬液，每孔100 μl接种于96孔板，在37℃、5%CO₂孵箱中培养24h使其贴壁后，分别加入用完全培养基配制的样品溶液：1）Fu泡囊混悬液；2）对照空泡囊溶液；3）空白泡囊加药物的溶液；4）Fu原药溶液。使各样品液的Fu终浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、200 μg·ml^-1，空白泡囊组加入相应体积空白泡囊液（与泡囊浓度仍一致）。分别培养24h、48h和72h，PBS洗涤3次后每孔加入5 mg·ml^- ¹MTT溶液10 μl和完全培养基100 μl，继续培养4 h后弃去液体，每孔加入100 μl DMSO，避光震荡20 min，用酶标仪于490 nm测定吸光度，计算得到细胞生长存活率。不同药物浓度作用不同时间的细胞存活率，根据以上数据，可得到各时间点Fu各剂型对4T1细胞的半抑制浓度（IC₅₀），结果见图3。体外细胞试验考察药效结果为，在24 h时，泡囊对4T1癌细胞的生长抑制率显著强于各对照组，原药与空白泡囊+Fu对4T1的生长抑制相似，空白泡囊仅在低浓度有抑制率变化，但在较低浓度即达到恒定，不随浓度增加而改变。Fu泡囊对4T1的细胞生长抑制IC₅₀为38.02 μg/ml，比原药降低81.64%，比空白泡囊+Fu降低80.41%，说明药物经包载后细胞毒性显著提高（均为p<0.01）；空白泡囊组细胞存活率始终＞80%，说明本文中的泡囊载体安全性较高。泡囊与对照泡囊之间虽在理化性质及释放规律上相似，但细胞毒性试验中却表现出明显的差异（p<0.05），可见本发明自制材料制备的Fu泡囊，粒径小而有利于入胞，且加上其表面水化层厚度大，其长循环能力将在抗肿瘤中发挥作用。

取对数生长期的Hela细胞进行生长抑制试验。取5×10⁴个·ml^-1Hela细胞的混悬液，每孔100μl接种于96孔细胞板，在37℃、5%CO₂孵箱中培养24 h使其贴壁后，分别加入用完全培养基配制的泡囊溶液、Fu原药溶液。使各个样品液的Fu终浓度分别为2.5、5、10、20、40 μg·ml^-1，培养24或48h，PBS洗涤3次后每孔加入5 mg·ml^-1MTT溶液10 μl和完全培养基100 μl，继续培养4 h后弃去液体，每孔加入100 μl DMSO，避光震荡20 min，用酶标仪于490nm测定吸光度，计算得到细胞生长存活率。泡囊及原药对癌细胞的存活率影响结果见图3。

由图3可知，Fu泡囊和游离Fu对Hela细胞、4T1细胞的生长抑制作用都表现出明显的浓度依赖性，而且Fu泡囊对2种癌细胞的生长抑制作用均远远比游离药物显著。

泡囊24 h的IC₅₀降低显著，Fu泡囊对Hela的细胞生长抑制IC₅₀为14.57μg/ml对Hela细胞仅为游离药物的9.1%，降低90.9%；对4T1细胞仅为游离药物的18.4%，降低81.6%，充分说明药物经泡囊包载后对不同的癌细胞的杀伤作用均显著增强（p<0.01）。

Fu泡囊对人源宫颈癌细胞Hela和鼠源乳腺癌细胞4T1的细胞毒性结果说明，Fu经泡囊包载后显著增强了药物对癌细胞的杀伤作用，泡囊24 h的IC₅₀降低81.6%～90.9%（p<0.05）。并且小粒径泡囊对Hela细胞24h的IC₅₀低至14.57 μg·ml^-1，说明在投药量与包封率相似的情况下，减小粒径有利于泡囊被吞噬入胞进而提高疗效，亦提示动物试验可能将呈现良好的抑瘤效果。

实施例二

称取335 mg BSA（牛血清蛋白）于25 ml圆底烧瓶中，加入10 ml 0.1 mol/L PBS溶液，充分溶解，搅拌速率为10 r/min ，另取25.0 mg DOX·HCl（阿霉素盐酸盐）溶解于1.5ml DMF中，待BSA与DOX充分混匀后，逐滴加入稀释20倍的戊二醛3.68 ml，滴速为4滴/min，室温下避光反应6 h， 4 ℃、3000 rpm离心10 min取上清，用0.01 mol/L PBS溶液 4 ℃透析4天，根据透析外液颜色不时更换透析液。透析完成后，取出透析液，冻干，为DOX-BSA，-40℃保存备用。PBS的浓度决定溶液离子强度，会影响BSA和产物DOX-BSA的性质；增大DOX·HCl的投料可减少BSA-BSA的产生，有利于DOX·HCl与BSA更充分交联；戊二醛的稀释度和滴加速度和搅拌速率尤为重要，稀释度过小、滴加过快以及搅拌过快均会导致大量沉淀产生。

为确定冻干产物中免疫原的量，另取一定体积透析介质，冻干，称量其冻干前后重量差异，计算固定体积中盐的含量，结果冻干所得产物中能透析除去的小分子物质的含量为50%左右。

所述DOX-BSA的结构式为：

采用紫外-可见分光光度法，与BSA和DOX对照（因为是戊二醛同时与BSA和DOX反应，故用原料作对照品），对DOX-BSA进行鉴别，结果见图4。由紫外可见图谱可知：DOX在265nm及500 nm处有特征吸收；BSA的特征吸收峰则约在285 nm处；产物在260-300 nm 左右出现了明显的肩峰，而在500 nm 处出现了DOX的特征吸收峰。因此，可推测目标产物合成成功。

利用重复实验考察自制抗原DOX-BSA的免疫原性。

用健康Balb/c鼠（由昭衍（苏州）新药研究中心有限公司提供，动物合格证号：SCXK（苏）20130003）制备多克隆抗体，考察自制抗原DOX-BSA的免疫原性，共免疫3次（首次免疫和2次加强免疫）。首次免疫：称取1～4 mg DOX-BSA溶于0.5～2 ml的生理盐水中，加入0.5～2 ml福氏完全佐剂，混合成油包水的乳浊液，在四肢腋下多点注射乳浊液0.05～0.2 ml/只；b.加强免疫：在首次免疫2周后进行二免，用福氏不完全佐剂，其余与首次免疫相同；二免后隔2周进行三免疫，并且在二免后5～7天眼眶取0.05～0.1 ml血，监测抗体产生情况，三免后5～7天摘眼球取全血，将血液在4 ℃冰箱中放置过夜，吸取上层清液，分装，于-40℃低温冰箱中储存，备用。

抗体的检测采用酶联免疫吸附分析方法（ELISA），结果见图5A。用0.1mol/L PBS（pH7.4）稀释10倍的溶液，将小鼠三免后抗血清1:2000稀释后，结果制备的抗体对DOX竞争抑制曲线的IC₅₀为7.65 ng/ml（远低于现有技术报道的167ng/mL），检出限低，灵敏度高，表明制备抗体的免疫原性好，进一步说明DOX-BSA的合成成功。本发明以335ngBSA与25mgDOX·HCl制备的DOX-BSA的免疫原性更强，说明产生同样的免疫效应，仅需要较少的免疫原，对机体损伤小，有利于联合治疗。

用4T1肿瘤细胞（鼠乳腺癌）接种于Balb/c鼠（由昭衍（苏州）新药研究中心有限公司提供，动物合格证号：SCXK（苏）20130003），荷瘤后小鼠机体会产生诸多改变。用荷瘤鼠考察自制免疫原DOX-BSA的免疫原性，共免疫两次（首次免疫和加强免疫），首次免疫：称取1～4 mg DOX-BSA溶于0.5～2 ml的生理盐水中，加入0.5～2 ml福氏完全佐剂，混合成油包水的乳浊液，在小鼠背部皮下多点注射乳浊液0.05～0.2 ml/只；加强免疫：在首次免疫2周后进行二免，用福氏不完全佐剂，其余与首次免疫相同。二免后5～7天眼眶取0.05～0.1 ml血，监测抗体产生情况，将血液在4 ℃冰箱中放置过夜，吸取上层清液，分装，于-40 ℃低温冰箱中储存，备用。

将抗血清1:200稀释后，用酶联免疫吸附分析方法（ELISA）法测定，结果二免后DOX-BSA在Balb/c鼠体内产生的抗DOX多抗，对DOX竞争抑制曲线的IC₅₀为75.77 ng/ml，结果见图5B。结果表明DOX-BSA在荷瘤鼠体内仅免疫2次即可有效产生抗体，完全能满足在给药状态下抗体识别分子桥的需要，也说明荷瘤鼠的机体仍然可以发生免疫反应，本发明设计的免疫治疗具有可行性。

实施例三

叶酸的活化：称取50.87 mg FA（叶酸）于10 ml圆底烧瓶中，加入1.0 ml DMF溶液，充分溶解，搅拌速率为120 r/min，另取69.0 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和116.5 mg 二环己基碳二亚胺(DCC)分别溶解于0.7和1.0 ml DMF中，避光条件下反应过夜，8000 r/m离心10 min后收取上清液（a，叶酸活化物）；FA-DOX的合成：另取50.0 mg DOX^.HCl溶解于1.3 mlDMF，将溶解的DOX溶液逐滴加入上述叶酸活化物上清液中，室温，120 r/min，避光反应6 h。8000 r/m离心10 min，取上清（b），分别用纯净水、无水甲醇、无水乙醇、乙醚、乙腈以及其中两种或多种成分的混合溶剂，沉淀溶液中的FA-DOX产物，发现其在30%无水甲醇/70%乙醚中沉淀最为彻底，因此选用此混合体系作为沉淀溶剂，加入上清b中充分沉淀后，收取沉淀，冻干，冻干品为FA-DOX，-40 ℃避光保存，备用。FA活化时间及与DOX^.HCl的反应时间对产率影响较大，FA的活化时间最为重要，超过16 h将无FA活化物存在。

所述FA-DOX的结构式为：

¹H-NMR谱表征：用Bruker AMX-400 核磁共振仪测试FA-DOX的核磁谱，以氘代二甲亚枫为溶剂，内标为TMS；

1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): 1.26 (t, J= 7.2 Hz, 3H, CH₃), 1.66 (s, 1H,CH-H), 2.00 (s, 1H, CH-H), 2.37 (s, 1H, CH-H), 2.53 (s, 1H, CH-H), 2.994-3.01(m, 2H, CH₂,), 3.13 (s, 1H, CH) , 4.82-4.88 (m, 2H, CH+OH), 6.04 (s, 1H, NH),6.48 (d, J= 8.0 Hz, 2H, ArH), 6.86(d, J= 8.0 Hz, 2H, ArH), 6.94 (d, J= 7.2Hz, 2H, ArH), 7.31 (d, J=7.31 Hz, 2H, ArH), 8.51 (s, 2H, NH₂)。

HRMS表征：高分辨率质谱仪测试FA-DOX的分子量。测定值，m/z：967.4 (M+1)，与FA-DOX分子量的理论值m/z：967.6 (M+1)几乎完全一致。

以上两种方法均证实FA-DOX合成成功。

为考察FR-FA-DOX-抗DOX抗体复合物的形成，采用细胞酶联免疫吸附分析法来验证该复合物的产生。细胞酶联免疫吸附分析法（细胞 ELISA）与酶联免疫吸附分析法（ELISA）原理一致，仅在操作上略有不同，其基本过程如下：

1）使用无叶酸完全培养基（上海杰美基因医药科技有限公司，RPMI 1640完全培养液（含有10 %胎牛血清、100 U·ml^-1青霉素、100 μg·ml^-1链霉素和 2 mmol·L^-1谷氨酰胺，简称完全培养基）分别配制底物溶液：FA-DOX+抗阿霉素血清；FA-DOX+阴性血清；FA-DOX+PBS；FA+DOX+血清；PBS，使各样品中DOX的浓度均为5.0 μg/ml，血清及阴性血清的稀释倍数均为200倍；37 ℃条件下恒温震荡30 min；

2）取对数生长期的4T1细胞，制成1×10⁵个/ml细胞的混悬液，每孔100 μl接种于96孔板，在37℃、5％ CO₂孵箱中用无叶酸完全培养基培养24 h使其贴壁；PBS洗涤3次，每次100 μl，分别加入上述溶液各100 μl（n=9），细胞培养箱恒温孵育1 h；PBST洗涤，每次100 μl，共3次；加入PBS稀释的山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶（GaRIgG-HRP），每孔100 μl，37℃恒温孵育1 h；

3）细胞板以PBST洗涤，每次100 μl，共3次；每孔加入100 μl底物溶液（现用现配），室温避光条件下，在微量振荡器上震摇20 min左右；加入5% H₂SO₄溶液，每孔 40 μl，终止显色反应；用酶标仪测定吸光度（B），细胞酶联免疫吸附分析法的结果见图6(a为p <0.01，b为p <0.05)。

由图6可知，FA-DOX+抗阿霉素血清组的吸光度结果显著高出，分别为：FA-DOX +阴性血清组的1.76倍；FA+DOX+血清组的2.13倍；PBS组的2.45倍；FA-DOX +PBS组的2.87倍（均为p <0.05），吸光度值越大说明DOX摄入量越多，证明FA-DOX使癌细胞表面形成了“FR-FA-DOX-抗DOX抗体”复合物，为刺激机体自身免疫，对癌细胞发起免疫杀伤作用的奠定了基础。

荧光显微镜观察细胞对FA-DOX的摄取情况。

取对数生长期的4T1细胞，制成10⁶个/ml细胞的混悬液，每孔1 ml 接种于6孔板，在37 ℃、5% CO₂孵箱中培养24 h使其贴壁后，分别加入用完全培养基配制的溶液1 ml：1）FA-DOX溶液； 2）FA+FA-DOX溶液；3）DOX溶液，使各组溶液的DOX终浓度均为5 μg/ml。培养2h或6 h后，PBS洗涤3次，避光用荧光显微镜荧光条件下检测，结果见图7A；对仪器自带软件统计的数据进行分析，结果见图7B。

由图7可知，各组荧光强度均随时间延长而增强，即随着时间延长药物的摄取量增加。2 h，各组摄取均较少，组间差异并未明显体现出来。4 h，FA-DOX组的摄取量分别为DOX组的2.09倍和FA+FA-DOX组的1.71倍，显著高于DOX组和FA+FA-DOX组；FA+FA-DOX组为DOX组的1.22倍。说明FA-DOX进入细胞是通过FA介导的FA-FR途径，且受游离FA的竞争性抑制。6 h的结果与4 h类似，可得出相同结论。其中，FA-DOX组的摄取量分别为DOX组的2.06倍和FA+FA-DOX组的1.76倍；FA+FA-DOX组为DOX组的1.19倍。

体外细胞毒性试验，考察FA-DOX主动靶向抗癌作用。

采用MTT法，通过对鼠乳腺癌（4T1）细胞的细胞毒性，考察FA-DOX主动靶向抗癌作用。

通过4T1细胞生长抑制试验FA-DOX、FA+FA-DOX、DOX的细胞毒性。取对数生长期的4T1细胞，制成5×10³个/ml细胞的混悬液，每孔100 μl 接种于96孔板，在37 ℃、5％ CO₂孵箱中培养24 h使其贴壁后，分别加入用无叶酸的完全培养基配制的溶液：①FA-DOX溶液；②FA+FA-DOX溶液；③DOX溶液。使各样品溶液的DOX终浓度分别为0.1、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/ml。培养24h，PBS洗涤3次后每孔加入5 mg/mlMTT溶液10 μl和完全培养基100 μl，继续培养4 h后弃去液体，每孔加入100 μl DMSO，避光震荡20 min，用酶标仪于490 nm测定吸光度，计算得到细胞生长存活率。不同药物浓度作用不同时间的细胞存活率。

计算公式为：存活率=（A_药物-A_调零孔/A_对照-A_调零孔）×100%）。分别以浓度（各组DOX浓度一致）为横坐标，存活率为纵坐标，得到不同浓度药物对癌细胞作用24h后的生长抑制曲线，并计算半数致死量IC₅₀值。结果见图8。

由图8可知，24 h、DOX浓度一致时，FA-DOX、FA+FA-DOX、DOX对4T1的细胞生长抑制IC₅₀（μg/ml）依次为：0.99、1.37和1.88，分子桥对肿瘤细胞的杀伤作用较FA+FA-DOX（p<0.05）和DOX（p<0.01）大，即分子桥对肿瘤细胞具有更强的细胞毒性。

实施例四

实施例一制备的Fu泡囊混悬液、实施例二制备的DOX-BSA、实施例三制备的FA-DOX组成的多重靶向抗肿瘤复合制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

在荷瘤鼠体内未产生抗体前使用氟尿嘧啶隐形泡囊进行被动靶向化疗，待体内产生抗DOX多抗后，停止化疗，用分子桥FA-DOX进行肿瘤治疗。

实验动物分组：1）实验组：免疫+FA-DOX+Fu泡囊（分子桥促进免疫治疗+主动靶向分子化疗+被动靶向给药系统化疗）；2）化疗药对照组：免疫+FA-DOX+ Fu（分子桥促进免疫治疗+主动靶向分子化疗+普通化疗）；3）单纯免疫治疗组：免疫+FA-DOX+生理盐水（分子桥促进免疫治疗+主动靶向分子化疗）；4）分子桥功能验证组：免疫+ FA+DOX+Fu泡囊（体内有抗体，普通化疗+被动靶向给药系统化疗）；5）阴性对照组：免疫+生理盐水（体内有抗体，不治疗）；6）化疗方法联合对照组：FA-DOX+Fu泡囊（体内无抗体，主动靶向分子化疗+被动靶向给药系统化疗）。

取4T1细胞，5000个^.只^-1；4-5周龄雌性balb/c小鼠，每组6只，接种肿瘤的位置为左腰侧皮下。分别在免疫使鼠产生抗体（二免后一周）的第1、2、3、5、7、10天，分别对小鼠尾静脉注射FA-DOX、DOX、生理盐水，并于给药后的双数日记录肿瘤体积，以给药后的天数为横坐标，肿瘤相对生长率为纵坐标绘制肿瘤生长曲线，结果见图9。各组小鼠抑瘤率依次为：阴性对照组（基准）；实验组为75.15%；化疗药对照组为58.29%；单纯免疫治疗组为47.48%；分子桥功能验证组为48.89%；化疗方法联合对照组为63.93%。说明抗体的存在，形成了对小鼠肿瘤抑制起重要作用，证明了免疫复合大分子的存在；分子桥FA-DOX的连接桥作用可启动免疫治疗但是抑瘤效果受限；Fu泡囊给药系统包载药物对于控制肿瘤发展，提高免疫治疗效果是必要的，且效果依次为Fu泡囊优于空白泡囊优于游离药物，说明泡囊的包载有利于增强Fu的药效且并未对免疫治疗的效果产生干扰；第23-27天各组均不给予任何治疗，说明免疫组呈现较缓慢的增长趋势，由此可期待免疫治疗可长期抑制肿瘤生长。

肿瘤相对生长率的计算公式为：相对生长率= (V_t-V₀)/V₀

抑瘤率（%）=（1-治疗组体积瘤体积/生理盐水组平均瘤体积）×100%

其中，V_t-t天时肿瘤体积；V₀-给药前肿瘤体积；V_{（肿瘤体积）}= a*b²/2；a-肿瘤长度； b-肿瘤宽度。

化疗给药后第27天，实验组小鼠依然存活，且进食、活动性等生存状态良好，但其余各对照组显著的状况差，且已开始死亡。为获得适合用于组织切片的组织，将小鼠全部处死，取出瘤块组织。将组织浸泡于10%的甲醛-水溶液中，石蜡切片，H&E染色，得到相应的组织切片图，见图10。瘤块的组织切片的细胞损伤程度依次为：实验组>化疗药对照组>单纯免疫治疗组≈化疗方法联合对照组>分子桥功能验证组>阴性对照组。

以上结果说明，与各对照组相比，本发明提供的复合制剂能显著杀伤肿瘤细胞；并且，从比较免疫治疗和化学治疗效果的角度观察，组织切片显示了免疫+ FA-DOX +生理盐水及免疫+ FA-DOX + 生理盐水对肿瘤细胞的损伤程度，不差于甚至更强于FA-DOX+泡囊（但该2种化疗组的进食等生存状况非常差）。说明本申请公开的免疫治疗和化疗的多重靶向制剂对肿瘤组织的杀伤力均较强，联合二者优势治疗肿瘤是很有意义的，而且，本发明以自制F127-Chlo所获得的Fu泡囊给药系统对于免疫反应中的荷瘤鼠毒性低，实现了降低化疗药对机体伤害，疗效好，有效地控制了肿瘤的发展，为后期免疫治疗奠定了基础；以新配方制得的DOX-BSA免疫原性好，可降低免疫原用量而使荷瘤鼠产生优质的抗体，对机体的损害小。分子桥在抗体产生后注入，启动免疫治疗，对肿瘤的抑制作用显著，同样也对机体的损害小。

综上，本发明从癌症机体的特点出发，将免疫治疗与靶向化疗结合，设计多重靶向抗肿瘤复合制剂，以优质DOX-BSA为抗原，在免疫小鼠产生抗阿霉素抗体的过程中，以自制优质载体材料等制备Fu泡囊给药系统遏制肿瘤发展进程，当抗体产生后注入FA-DOX连接桥，在肿瘤细胞表面形成FR-FA-DOX-抗体复合物大分子，启动机体自身免疫系统识别肿瘤细胞，将其杀灭；并且游离FA-DOX可产生主动靶向化疗作用，与Fu泡囊共同成为复方制剂并联合应用，经动物体内外试验证实，该复合制剂能显著提高肿瘤治疗效果；本发明的复合制剂三组分之间协同效应好，在初期控制肿瘤生长，后期抑制肿瘤发展，快速性与持久性的抗癌作用兼备，有效杀伤肿瘤细胞；特别是本发明的复合制剂首次应用于体质差的荷瘤小鼠，在明显抑制肿瘤的情况下，小鼠存活期长，说明本发明的复合制剂药效好，对正常组织、细胞的毒性小，开创了免疫治疗、化疗复合疗法的新局面，避免了目前肿瘤治疗严重损伤病体的难题，取得了意想不到的技术效果。

Claims

1.一种多重靶向抗肿瘤复合制剂，其特征在于：所述多重靶向抗肿瘤复合制剂由Fu泡囊混悬液、DOX-BSA以及FA-DOX组成；

所述Fu泡囊的囊壁由普朗尼克-胆固醇化合物，失水山梨醇棕榈酸单酯、失水山梨醇硬脂酸单酯及胆固醇自组装聚集得到；囊芯为氟尿嘧啶；

将普朗尼克F127、乙酸酐和二甲亚砜混合，反应得到反应混合物；然后将反应混合物滴入无水乙醚中；再加入二氯甲烷，振摇，再加入乙醚，静置，然后抽滤，滤饼为普朗尼克F127-醛；将普朗尼克F127-醛、胆固醇、浓盐酸加入无水乙醇中，回流反应；然后反应液经抽滤，得到蜡状固体；然后将蜡状固体置于NaOH溶液中浸泡后抽滤，滤饼为普朗尼克F127-胆固醇；将普朗尼克F127-胆固醇、失水山梨醇棕榈酸单酯、失水山梨醇硬脂酸单酯及胆固醇加入无水乙醇和乙酸乙酯中，密闭，搅拌溶液至澄清；然后加入Fu，密闭，拌匀；然后加入预热的磷酸盐缓冲液，密闭搅拌乳化，最后在搅拌下挥发去除有机溶剂，得到Fu泡囊混悬液；乳化时的搅拌速度为1200～1300 r·min^-1；挥发去除溶剂时的搅拌速度为700～800 r·min^-1；

将 DMF加入FA中，得到FA溶液；将NHS和DCC分别溶解于DMF中，得到NHS溶液以及DCC溶液；混合FA溶液、NHS溶液以及DCC溶液，避光反应10～16小时；反应液离心处理后收取上清液；取DOX^.HCl溶解于DMF中得到DOX溶液；将DOX溶液滴加入所述上清液中，室温下避光反应5～8小时；反应完成后，离心处理反应液，取上清；上清经无水甲醇/乙醚混合液沉淀；收取沉淀，冻干即为FA-DOX；所述FA、NHS、DCC、DOX^.HCl的摩尔比为1∶（4～6）∶（4～6）∶（1.2～1.5）；所述无水甲醇/乙醚混合液中无水甲醇、乙醚的质量比为30∶70；

所述DOX-BSA的结构式为：

所述FA-DOX的结构式为：

。

2.根据权利要求1所述多重靶向抗肿瘤复合制剂，其特征在于：所述普朗尼克-胆固醇化合物的结构式为：

、

。

3. 根据权利要求1所述多重靶向抗肿瘤复合制剂，其特征在于：所述Fu泡囊混悬液中，Fu含量为4.0 mg·mL^-1。

4.权利要求1所述多重靶向抗肿瘤复合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 将普朗尼克F127、乙酸酐和二甲亚砜混合，反应得到反应混合物；然后将反应混合物滴入无水乙醚中；再加入二氯甲烷，振摇，再加入乙醚，静置，然后抽滤，滤饼为普朗尼克F127-醛；将普朗尼克F127-醛、胆固醇、浓盐酸加入无水乙醇中，回流反应；然后反应液经抽滤，得到蜡状固体；然后将蜡状固体置于NaOH溶液中浸泡后抽滤，滤饼为普朗尼克F127-胆固醇；将普朗尼克F127-胆固醇、失水山梨醇棕榈酸单酯、失水山梨醇硬脂酸单酯及胆固醇加入无水乙醇和乙酸乙酯中，密闭，搅拌溶液至澄清；然后加入Fu，密闭，拌匀；然后加入预热的磷酸盐缓冲液，密闭搅拌乳化，最后在搅拌下挥发去除有机溶剂，得到Fu泡囊混悬液；乳化时的搅拌速度为1200～1300 r·min^-1；挥发去除溶剂时的搅拌速度为700～800 r·min^-1；

(3) 将 DMF加入FA中，得到FA溶液；将NHS和DCC分别溶解于DMF中，得到NHS溶液以及DCC溶液；混合FA溶液、NHS溶液以及DCC溶液，避光反应10～16小时；反应液离心处理后收取上清液；取DOX^.HCl溶解于DMF中得到DOX溶液；将DOX溶液滴加入所述上清液中，室温下避光反应5～8小时；反应完成后，离心处理反应液，取上清；上清经无水甲醇/乙醚混合液沉淀；收取沉淀，冻干即为FA-DOX；所述FA、NHS、DCC、DOX^.HCl的摩尔比为1∶（4～6）∶（4～6）∶（1.2～1.5）；所述无水甲醇/乙醚混合液中无水甲醇、乙醚的质量比为30∶70；

5.根据权利要求4所述多重靶向抗肿瘤复合制剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，普朗尼克F127与乙酸酐的质量比为（12～13）∶1；普朗尼克F127-醛与胆固醇的质量比为（1.2～1.5）∶1。

6.根据权利要求4所述多重靶向抗肿瘤复合制剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，普朗尼克F127-胆固醇加入无水乙醇和乙酸乙酯前经过纯化处理，具体为滤饼用氯仿溶解后装入截留分子量为3500的透析袋中，依次以80%的甲醇溶液、50%的甲醇溶液、30%的甲醇溶液、蒸馏水分别透析，最后将透析袋内的溶液转出，冷冻干燥得到纯化的普朗尼克F127-胆固醇；失水山梨醇棕榈酸单酯、失水山梨醇硬脂酸单酯加入无水乙醇和乙酸乙酯前分别经过纯化处理，具体为失水山梨醇棕榈酸单酯、失水山梨醇硬脂酸单酯分别用氯仿溶解后分别装入截留分子量为3500的透析袋中，依次以80%的甲醇溶液、50%的甲醇溶液、30%的甲醇溶液、蒸馏水分别透析，最后将透析袋内的溶液转出，冷冻干燥得到纯化的失水山梨醇棕榈酸单酯、纯化的失水山梨醇硬脂酸单酯；加入Fu，密闭后拌匀的具体方式为先搅拌再超声处理。

7. 根据权利要求4所述多重靶向抗肿瘤复合制剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，室温反应30 h得到混合物；所述静置为4℃静置12～24小时；所述回流反应时间为2.5小时；所述NaOH溶液的浓度为0.1M；于60℃下搅拌溶液至澄清；所述乳化时的温度为37℃，乳化时间为20分钟，乳化时的搅拌速度为1250 r·min^-1；去除有机溶剂时的搅拌速度为750r·min^-1；所述预热的磷酸盐缓冲液为60℃预热的磷酸盐缓冲液；所述抽滤全部为减压抽滤。

8. 根据权利要求4所述多重靶向抗肿瘤复合制剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述戊二醛溶液中戊二醛的质量浓度为25%；以4滴/min的滴速滴加戊二醛溶液；室温下避光反应时间为6小时；4℃下离心处理时的转速为3000rpm，时间为10分钟；用PBS溶液透析时，当透析外液呈微红色时更换新的透析液，透析至用紫外分光光度法检测透析外液在480nm处吸收峰消失即完成透析。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，混合FA溶液、NHS溶液以及DCC溶液，避光反应12～14小时；反应液离心处理后收取上清液操作中，离心处理的转速为8000rpm；将DOX溶液以20～40滴/min的滴速滴加入所述上清液中，室温下避光反应6小时；离心处理反应液操作中，离心处理的转速为8000rpm。

10.权利要求1～3所述的任意一种多重靶向抗肿瘤复合制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。