CN106267198B - 靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种靶向光热疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂及其制备方法与应用，由Cypate脂质体、阿霉素‑牛血清白蛋白（ADM‑BSA）以及透明质酸‑阿霉素（HA‑ADM）组成。Cypate由脂质体包载后化学稳定性明显优于游离Cypate，体外升温效果更强，具有良好的肿瘤靶向性和光热治疗效果。Cypate脂质体的靶向性好，具有较强的光热治疗效果，结合ADM‑BSA和HA‑ADM构成免疫治疗及主动靶向化疗的双重靶向透明质酸‑半抗原免疫制剂，对于深部残余以及转移的肿瘤细胞治疗效果好，可以避免各自治疗上的缺陷，达到协同治疗的目的。

Description

靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂及其制备方法与应用。
背景技术
癌症对于人类的威胁与日俱增，且癌症的复发和转移仍是传统治疗手段仍需面对的问题，因此，寻找更新、更加全面的治疗手段是十分必要的。传统的手术治疗、放射疗法和化学疗法存在可能损伤机体正常组织及其他副作用的缺点，从而限制了其对癌症的治疗效果。近年来，以利用近红外光热转换的光热治疗（photothermal therapy, PTT）迅速发展为继传统化疗、放疗、手术治疗之后又一新型肿瘤治疗技术。光热治疗的基本原理是利用在肿瘤部位聚集的光热材料，通过激光照射，光热转换产生的高热量，可使肿瘤局部温度升高（42℃以上），从而造成肿瘤细胞损伤，甚至热消融消除肿瘤细胞，达到治疗癌症的目的。由于，光热治疗是基于将光热材料靶向传输到肿瘤部位，然后选择性对肿瘤部位进行激光照射，从而极大地降低了对机体其他正常组织毒副作用使得全身系统毒性极大降低，因此，光热治疗是一种极具发展情景的肿瘤治疗技术。其中，光热材料能否成功靶向肿瘤部位且在肿瘤部位细胞位点上有较强近红外光吸收，并能高效率的实现光热转换是成功实施PTT的关键。
目前，被广泛研究的光热材料主要包括无机材料和有机材料。其中，包括主要集中于以金、银、钯等为基础的新型金属纳米粒、以铜为基础的半导体纳米粒材料以及以碳为基础的石墨烯、碳管的无机材料运用于光热治疗时存在很多不可忽略的问题，如金属纳米离子的生物代谢差、在机体内不易消除而可能还存在长期毒性以及碳纳米材料的生物毒性等。而与其相比，含有发色团并且在经红外区域有较强的光吸收的有机光热分子因其良好的生物相容性、光学稳定性、较高的光热转换效率等优势而备受研究者关注。但是，单纯的有机小分子应用于光热治疗仍然存在着一些不可避免的问题，比如化学稳定性差、易发生光漂白以及在体内靶向性差，不能在肿瘤部位较长时间滞留，通过静脉给药后药物很快被代谢清除，不能达到有效的PTT浓度。因此，研究发现将有机光热小分子与其他高分子通过聚集体的形式形成胶束或者泡囊时，可以有效地提高有机小分子的稳定性，以及对肿瘤部位的靶向性。
属于碳菁类染料一类的吲哚菁绿（ICG）是由美国食品和药物管理局批准可以用于临床近红外成像的有机光热分子，但由于ICG水溶性差，且稳定性较差，亦会在血中与蛋白结合而降低进入癌细胞的量，从而限制了ICG在光热治疗中的应用。针对ICG的这些缺陷，有研究者设计了一种采用非共价键形成的磷脂聚乙二醇-吲哚菁绿的胶束，可延长吲哚菁绿在肿瘤局部滞留时间，使吲哚菁绿在肿瘤内的富集量明显提高，从而使光热效果更加显著（X Zheng，D Xing，F Zhou et al.Mol.Pharm,2011,8:447~456）。此外，有报道一种由卟啉-磷脂双分子层自组装形成的纳米颗粒（Porphysome），这种纳米颗粒具有广泛可调性吸光系数、结构依赖性的荧光自淬灭特性和独特的光热及光声特性。研究人员利用该纳米粒实现了对淋巴系统的感光成像，并生成了低背景的荧光图像。通过静脉给药的方式在小鼠体内该纳米颗粒具有极好的酶生物降解性，急性毒性极低，有好的生物安全性。进一步的动物试验也表明这种纳米颗粒具有良好的肿瘤靶向性，在激光照射诱导下，可使小鼠的肿瘤因产生光热效应而被清除。
Cypate分子中拥有两个羧基，可以同时连接多肽两端形成对酶稳定的环状结构，因此，可有效避免光热试剂在到达靶位之前脱落，提高了稳定性，而且Cypate在近红外区能产生荧光并具有光热效应，故在研究中受到重视。但Cypate的疏水性强，靶向性差，在肿瘤部位滞留时间短，易在体内清除。因此，开发生物相容性好、靶向性好、光热转换效率高的包载光热试剂Cypate脂质体在肿瘤光热治疗上更具应用价值。
此外，免疫治疗是近年来备受关注的另一种新型治疗手段。与其他治疗手段不同，免疫治疗的原理是通过激发机体的免疫功能，增强对肿瘤细胞的免疫识别功能来从根本上清除肿瘤细胞。尽管许多研究表明机体中的细胞免疫和体液免疫均对肿瘤细胞产生免疫应答，但由于免疫治疗发挥作用周期长，需要花时间等待才能启动对肿瘤细胞的生长抑制作用，故抑制恶性肿瘤生长和发展的效果不理想。因此，免疫治疗需要联合其他治疗手段来达到抗肿瘤的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂的制备、表征以及联合应用。该复合制剂能利用光热效应治疗实体瘤，并通过启动自身免疫，进一步清除残余的肿瘤细胞，提高抗肿瘤效果，达到预防肿瘤复发和转移的效果。
本发明主要是一方面通过包载光热材料的脂质体，通过EPR效应，以被动靶向作用传输到肿瘤部位，在近红外光的照射下产生的光热效应，对肿瘤产生实质性损伤，另一方面利用免疫原阿霉素-牛血清白蛋白（ADM-BSA）非特异地激活机体的免疫功能，产生抗ADM多克隆抗体，再应用分子桥透明质酸-阿霉素（HA-ADM），由于HA可特异性地于肿瘤细胞表面的特异性受体结合，可形成“肿瘤细胞—HA-ADM—抗ADM多克隆抗体”复合物，从而增强免疫系统对肿瘤细胞的免疫识别能力，同时未结合的HA-ADM还可以发挥主动靶向化疗作用，从而达到更好的抗肿瘤效果。故本发明基于EPR效应、配体-受体、抗原-抗体特异性靶向作用，具有被动靶向、主动靶向和免疫治疗的三重靶向治疗作用的特点，肿瘤复发抑制率从低浓度的20%，提高至高浓度的60%，能够更为高效地治疗癌症。
为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂，由Cypate脂质体、ADM-BSA以及HA-ADM组成；Cypate脂质体是一种具有良好近红外光热效应和光热治疗效果的包载光热试剂的脂质体，利用脂质成分形成稳定的类似细胞膜的脂质体结构，包载疏水性有机光热材料Cypate于脂质双分子层中，其粒径为80～200nm，优选100～120nm，包封率高且化学稳定性好，具有良好的光热效应。脂质体可以为磷脂、胆固醇自组装产物形成的给药系统，与Cypate协同性好，能有效提高被包裹药物的稳定性及其靶向性，改善药物的溶解度或延长血液循环时间，通过EPR效应，发挥被动靶向作用，增加药物在肿瘤部位的蓄积，降低对正常组织毒副作用。
上述技术方案中，所述ADM-BSA的结构式为：
所述HA-ADM的结构式为：
。
上述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1) 将磷脂、胆固醇和Cypate置于反应器中，加入有机溶剂，密闭搅拌，得到混合物；水浴下，混合物在搅拌后，超声处理；然后在搅拌条件下加入纯化水，继续水浴搅拌3～8min后，超声处理；再继续搅拌10～20min；然后去除有机溶剂，即得Cypate脂质体；
(2) 将PBS溶液加入BSA中，得到BSA溶液；将ADM.HCl溶解于PBS和DMF混合溶液中，得到ADM溶液；混合BSA溶液与ADM溶液，然后以3～5滴/min的滴速滴加戊二醛溶液，室温下避光反应；反应完成后于4℃下离心处理，取上清，于4℃下，透析；透析完成后，取出透析袋内液，冻干即为ADM-BSA；
(3)将HA加入纯水中，然后加入EDC与NHS，搅拌下，室温避光反应7.5～8.5小时，然后离心处理得到上清；将ADM.HCl溶解于纯化水得到ADM溶液；然后将ADM溶液滴加入上清中，搅拌下，避光反应10～14小时，然后离心处理，取上清进行纯水透析；透析完成后，取出透析袋内液，冻干即为HA-ADM；
所述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂由Cypate脂质体、ADM-BSA以及HA-ADM组成。
上述技术方案中，将磷脂、胆固醇和Cypate置于反应器中，加入无水乙醇和乙酸乙酯，密闭搅拌，得到混合物；水浴加热，混合物在搅拌溶解后超声处理；然后在搅拌条件下，开盖加入纯化水，迅速密闭，继续水浴搅拌3～8 min乳化后，超声处理；再继续搅拌10～20min至彻底乳化；然后开盖，水浴继续搅拌去除有机溶剂，即得Cypate脂质体；所述Cypate脂质体为颗粒物，粒径为80～200nm，优选100～120 nm；所述Cypate脂质体中，Cypate位于脂质体双分子层中。
上述技术方案中，将脂质成分及Cypate按质量比25:2加入有机溶剂中。密闭搅拌，待全部溶解后，水浴搅拌下，加入纯化水，仍密闭搅拌，超声乳化后，开盖继续搅拌挥发有机溶剂至直至挥发完全。磷脂可以是大豆磷脂，也可以是其他脂质比如卵磷脂。Cypate能高效的被包裹在脂质体双分子中，且脂质成分在水相中维持在一定的浓度，使得形成的脂质体较为稳定。
本发明公开的Cypate脂质体的制备方法中，加入的有机溶剂可以是无水乙醇和乙酸乙酯，也可以是其他单一有机溶剂或混合溶剂，选择溶剂为能溶解脂质和Cypate且挥发性较好的有机试剂。
优选的，处方和工艺制备去除有机溶剂，然后进行超滤处理即得光热试剂Cypate脂质体；超滤处理时截留分子量为100 kD，转速为4000~6000，反复超滤3次以上，对上述Cypate脂质体进行浓缩。
上述技术方案中，步骤（1）中，磷脂、胆固醇的质量和与疏水性有机光热材料的质量比为25∶2；有机溶剂为无水乙醇和乙酸乙酯混合液等；所述混合物中，磷脂的浓度为2mg/mL，胆固醇的浓度为0.5mg/mL，采用挥发的方式或纯化水透析的方式去除有机溶剂，水浴的温度为45℃～50℃，搅拌转速为1250 r·min-1；步骤（2）中，PBS和DMF混合溶液中，PBS与DMF等体积；所述戊二醛溶液中戊二醛的质量浓度为22～28%；所述BSA、ADM.HCl、戊二醛的质量比为1∶（50～90）∶（6～8）；透析至紫外检测至透析外液在480 nm处吸收峰消失即完成透析；步骤（3）中，HA、EDC、NHS的摩尔比为1∶20∶20；搅拌速率为120 r·min-1；离心处理工艺为8000 r·min-1离心10 min，纯水透析至接收液在480nm处无紫外吸收后即完成透析。
优选的，步骤(1)中，磷脂、胆固醇和疏水性有机光热材料的质量比为4∶1∶0.4；无水乙醇和乙酸乙酯混合液中，无水乙醇和乙酸乙酯的体积比为3∶1；磷脂、胆固醇和疏水性有机光热材料的质量和与纯化水的质量比为3∶100；于37℃下，在750 r·min-1的搅拌速度下采用挥发的方式去除有机溶剂；超声处理时间为1分钟；步骤(2)中，所述戊二醛溶液中戊二醛的质量浓度为25%；以4滴/min的滴速滴加戊二醛溶液；室温下避光反应时间为6小时；4℃下离心处理时的转速为3000 r·min-1，时间为10 min；步骤(3)中，将HA加入纯水中，然后加入EDC与NHS，搅拌下，室温避光反应8小时，然后离心处理得到上清；纯水透析时，24小时换一次接收液。
上述技术方案中，步骤(2)中，戊二醛的稀释度和滴加速度和搅拌速率尤为重要，稀释度过小、滴加过快以及搅拌过快均会导致大量沉淀产生；步骤(3)中HA的活化时间和反应温度对HA-ADM产率影响较大，在本发明公开的活化时间以及反应温度下，HA-ADM产率最高，重复单元根据透明质酸而定。
上述技术方案中，制备光热试剂时，乳化时水浴温度为45℃～50℃，挥发有机溶剂时水浴温度为37℃；乳化时，搅拌速度为1250 r·min-1，挥发去除溶剂时的搅拌速度为750r·min-1。制备工艺较为简单且可控，将脂质成分与药物Cypate溶解于少量有机溶剂中，然后按3:100比例加入水相，通过搅拌（转速为1250 r·min-1），超声的方式进行乳化，使得制得脂质体的批间差异小，重复性好；乳化时水浴温度可增加脂质在有机相中的溶解度，但温度过高则可能引起脂质氧化和光热试剂Cypate变性；反应温度以及搅拌速率的不同对于脂质体的形成以及包裹的稳定性有影响，本发明方法使Cypate经脂质体包裹后化学稳定性良好，在pH 5.0、pH 7.4、细胞培养基及血清中，Cypate在48 h内紫外吸收变化均小于10 %，明显改善了游离Cypate的化学稳定性。以Cypate为计，浓度在1.0～25.0 μg·mL-1范围内，相同浓度下，Cypate脂质体在1.5 W/cm2激光照射（785 nm）下，5分钟内升温效果明显优于游离Cypate，如在2.0 μg·mL-1时，Cypate脂质体比游离Cypate升温更好，可增加升温15℃，光热转换效率明显提高；取得了意想不到的技术效果。
本发明的Cypate脂质体有良好的化学稳定性、生物相容性、肿瘤被动靶向性，可对荷瘤小鼠进行高效光热治疗，产生显著的肿瘤细胞消除效果；本发明研发了生物相容性好，化学稳定性良好的纳米级微粒给药系统脂质体，将Cypate包载在脂质双分子层中，从而能够被动靶向肿瘤部位，并在近红外光激发下产生显著光热效应，从而抑制肿瘤细胞生长，甚至达到消除肿瘤细胞的治疗效果。因此本发明还公开了光热试剂Cypate脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明公开的包载疏水性有机光热材料的脂质体均一性好，其粒径为80～200nm，化学稳定性好，有良好生物相容性，且在体内具有良好肿瘤被动靶向性；比如Cypate脂质体可采用785nm激光器激发产生光热效应明显强于相同浓度下游离组Cypate产生的光热效应，其原因可能是由于疏水性有机光热小分子能在脂质双分子层中有序排列，而不同于游离Cypate（水溶性不好）在水溶液中的聚集状态；Cypate经脂质体包载后化学稳定性良好，尤其改善了游离Cypate在微酸性环境下的稳定性，亦即改善了Cypate在肿瘤局部微环境下的稳定性，有利于发挥PTT作用，达到抗肿瘤效果；脂质体是一种研究较为成熟且安全性高的纳米微粒给药系统，从而使得Cypate脂质体具有广泛运用于临床的潜力；Cypate脂质体粒径<200 nm，具有显著的EPR效应，从而有良好的肿瘤被动靶向性，并能在近红外光激发下高效发挥光热效应治疗肿瘤，在静脉注射（5mg·kg-1）后24 h进行光热治疗（785 nm,1.5W·cm-2, 3 min），产生的光热效应可完全热消融肿瘤细胞，且无复发现象。
本发明的多靶向抗肿瘤复合制剂基于EPR效应、配体-受体、抗原-抗体特异性靶向作用，具有被动靶向、主动靶向和免疫治疗的三重靶向治疗作用特点，能够更为高效地治疗癌症。其中制备Cypate脂质体具有良好的抗肿瘤优势；并且，阿霉素作为半抗原，用牛血清白蛋白你 阿霉素-牛血清白蛋白具有免疫原性，可促使癌症机体产生抗阿霉素多抗；透明质酸-阿霉素同时具有以下两方面的作用：A.免疫治疗的连接桥作用，特异性地作用于癌细胞表面的CD44受体，在癌细胞表面形成“CD44受体—透明质酸-阿霉素—抗阿霉素抗体”复合物；B.主动靶向化疗作用，未形成复合物的HA-ADM，可利用CD44受体受体介导，使抗癌药阿霉素进入癌细胞，并发挥抗癌作用。Cypate脂质体介入并光照，以光热效应明显遏制小鼠肿瘤的生长，为抗体的产生及分子桥的作用发挥争取时间；此外光热治疗也能够协同增强机体的非特异免疫能力，可提高免疫治疗的效果。
本发明首先利用光热治疗高效地抑制实体瘤生长，进一步利用小分子免疫原非特异地激发机体的免疫系统，并介入基于配体-受体、抗原-抗体的相互作用的分子桥，将免疫细胞靶向肿瘤细胞，从而达到光热治疗协同联合免疫治疗有效抗肿瘤的目的。首次公开的Cypate脂质体、ADM-BSA和HA-ADM组成的被动靶向光热治疗、主动靶向化疗和免疫治疗的三效合一的抗癌制剂，实现了在免疫治疗发挥作用的前期引入光热治疗，不仅遏制了肿瘤的增长、改善了小鼠生存状态，而且保证了免疫治疗及分子桥的主动靶向化疗发挥作用所需的时间，并协同增强了免疫治疗效果，发挥显著的治疗作用；取得意想不到的技术效果。
由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比具有以下优点：
（1）本发明公开的免疫治疗制剂中的小分子化疗药物阿霉素ADM偶联大分子牛血清蛋白BSA为免疫原(ADM-BSA)，可刺激机体产生抗ADM抗体；同时将透明质酸HA通过EDC、NHS将羧基活化后与阿霉素ADM相连合成的分子桥HA-ADM，将机体的免疫效应靶向肿瘤细胞，得到一种可增强肿瘤细胞免疫原性的廉价复合物大分子，达到长期自身清除肿瘤细胞的目的。
（2）与游离光热分子Cypate相比，本发明设计的Cypate脂质体，其显著的优势在于化学稳定性高、生物相容性良好、光热转换效率高、体内肿瘤靶向性优异，由于疏水性有机光热小分子能在脂质双分子层中有序排列，用激光器在785nm波长激发下产生的光热效应明显强于同浓度游离组Cypate产生的光热效应，为高效的肿瘤光热治疗的成功实施奠定了基础。
（3）Cypate经脂质体包载后化学稳定性良好，尤其改善了游离Cypate在酸性环境下的稳定性，从而能进一步改善Cypate在肿瘤局部微环境下的稳定性，发挥PTT效果，得到的Cypate脂质体是一种安全性高的纳米微粒给药系统；Cypate脂质体粒径<200 nm，具有显著的EPR效应，从而有良好的肿瘤被动靶向性，并能在近红外光激发下高效发挥肿瘤光热治疗效果，在静脉注射（5mg·kg-1）后24 h进行光热治疗（785 nm, 1.5W·cm-2, 3 min），产生的光热效应可完全热消融肿瘤细胞，且在考察的21天内无复发现象；从而使得Cypate脂质体具有广泛运用于临床的潜力。
（4）本发明中，以小分子化疗药物阿霉素ADM偶联大分子牛血清蛋白BSA得到的免疫原(ADM-BSA)，可刺激机体产生抗ADM抗体；将透明质酸HA通过EDC、NHS将羧基活化后与阿霉素ADM相连合成的分子桥HA-ADM，将机体的免疫效应靶向肿瘤细胞，得到一种可增强肿瘤细胞免疫原性的廉价复合物大分子，达到长期清除肿瘤细胞的目的；特别是Cypate脂质体结合HA-ADM+ADM-BSA组成复合制剂，对于深部残余以及转移的肿瘤细胞治疗效果好，整合了光热治疗和免疫治疗的优势，避免它们各自治疗上的缺陷，同时，光热治疗也可非特异地激活机体的免疫功能，达到协同治疗的目的；取得了意想不到的技术效果。
附图说明
图1为实施例一中Cypate脂质体透射电镜图；
图2为实施例一中Cypate脂质体化学稳定性图，A、游离Cypate，B、Cypate脂质体；
图3为实施例一中Cypate脂质体升温曲线图，A、游离Cypate，B、Cypate脂质体；
图4为实施例一中Cypate脂质体的细胞毒性试验图，A、非激光照射，B、激光照射；
图5为实施例一中Cypate脂质体的细胞摄取试验图；
图6为实施例一中Cypate脂质体的细胞亚定位试验图，A、非激光照射，B、激光照射；
图7为实施例一中Cypate脂质体的近红外活体成像试验图，A为小动物成像照片，B为数据图；
图8为实施例一中Cypate脂质体的组织分布结果图，A为组织成像照片，B为数据图；
图9为实施例一中Cypate脂质体的抑瘤曲线（A）和肿瘤组织（B）图；
图10为实施例二中免疫原ADM-BSA的紫外吸收图（A）和红外图谱（B）；
图11为实施例二中免疫原ADM-BSA在正常小鼠和荷瘤小鼠ELISA结果图；
图12为实施例三中HA-ADM的核磁鉴定图；
图13为实施例三中HA-ADM以及HA+ADM的DSC鉴定图；
图14为实施例三中连接桥在癌细胞表面连接抗体的紫外吸光图；
图15为实施例三中细胞流式结果图；
图16为实施例三中体外细胞毒性试验结果图；
图17为实施例四中联合治疗的肿瘤生长曲线（A）和肿瘤组织（B）图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不限于本发明的范围。本发明实施例从Cypate脂质体的制备及表征、Cypate脂质体体内外药效学评价、ADM-BSA的制备及其在荷瘤鼠体内产生抗阿霉素多克隆抗体、HA-ADM的制备及连接桥作用印证以及产生多抗的荷瘤鼠使用联合治疗方法治疗等方面详述本发明技术方案带来的意想不到的技术效果。
实施例一 Cypate脂质体的制备及理化性质的考察
称取10g磷脂，2.5g胆固醇及0.5gCypate置于西林瓶中加入3.75mL无水乙醇和1.25mL乙酸乙酯，密闭，50℃水浴1250 r·min-1搅拌5min并超声1 min，使其充分溶解。在搅拌条件下快速均匀加入430g纯化水，50℃水浴1250 r·min-1搅拌5min乳化后，超声1min,再继续搅拌15min使其乳化完全，开盖以37℃水浴750 r·min-1搅拌5小时，彻底挥发有机溶剂，即得Cypate脂质体混悬液。
制得的Cypate脂质体均一性较好，形状为规整球形，用透射电镜（TEM）观察Cypate脂质体表观形态为球形，且分布均匀，见图1，用激光粒度仪测得Cypate脂质体的平均粒径为（111.9±5.94）nm（n=3）。取1.0 mLCypate脂质体溶液置于超滤管（截留分子量100000）中，4℃5000 r·min-1离心15 min分离液相后，加入1.0 mL水于超滤管中洗涤，重复上述操作3次，合并超滤管内液，用甲醇破坏脂质体并定容，至吸光度为0.3-1.0之间，测定并计算药物含量A；另取同体积Cypate脂质体溶液，加入甲醇破坏脂质体并定容后测定，算得相应药物含量A0，计算包封率（%）=（A0-A）/A0×100%；结果泡囊包封率为（98.11 ± 1.13）%（n=3）。
对上述Cypate脂质体体外化学稳定性分别进行考察。实验分为Cypate脂质体和游离Cypate两组，分别在pH 5.0、pH 7.4、细胞培养基（medium）及血清（serum）中考察它们的稳定性。以Cypate浓度计算，用以上介质分别配制Cypate脂质体和游离Cypate的5μg·mL-1的溶液（n=3），确定在0、2、4、8、24、48 h6个时间点测定Cypate的紫外吸收光谱。图2结果显示，游离Cypate仅在血清中具有较好的稳定性，在pH 7.4和培养基中稳定性较差，在pH5.0环境下极不稳定，48h后紫外吸收下降了60%左右。然而，Cypate脂质体的Cypate在pH 5.0、pH 7.4及血清中均能较稳定存在，且在pH5.0环境下48h后紫外吸收的下降＜5%，表明Cypate经脂质体包载后化学稳定性明显提高，为后期的光热治疗奠定基础。
对上述Cypate脂质体体外升温效应进行考察，以Cypate浓度计算，配制1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0μg·mL-1的水溶液，采用785 nm激发的激光，1.5 W·cm-2 条件下照射5min，每隔25s对溶液温度进行记录。图3表明，785nm激光照射下纯水的几乎没有升温效果，游离Cypate及脂质体的光热效应均显示浓度依赖性，而且相同浓度下，制备的Cypate脂质体（Cy-Liposome）比游离Cypate（Free Cypate）表现出更强的升温效果，当浓度为5 μg·mL-1时，Cy-Liposome温度可升高37.6 ℃，而Free Cypate则仅升高15.3 ℃，两者相差22.3℃，表明与Free Cypate相比，Cy-Liposome具有良好的升温效应，其原因可能由于疏水性的Cypate经脂质体包载后可均匀分布在脂质双分子中，减少了Cypate的聚集，从而在激光照射下增强非辐射跃迁，从而能产生更多热量，说明有利于后期的PTT治疗。对上述Cypate脂质体进行细胞毒性考察。取对数生长期4T1细胞，以5000个细胞每孔接种于96孔细胞板，在37℃、5％CO2孵箱中培养24 h使其贴壁后，用完全培养基分别配制不同浓度的Cypate脂质体溶液和游离Cypate溶液（以Cypate计算，浓度分别为1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 μg·mL-1）每个浓度4个复孔。培养24 h弃去培养基，PBS洗涤3次后，更换培养基，非光照组放入培养箱中继续培养24 h，光照组用785nm激光器对每孔进行激光照射（1.5 W·cm-2，3 min）后，放入培养箱中继续培养24 h，每孔加入5 mg·mL-1 MTT溶液10 μL和完全培养基100 μL，继续培养4 h后弃去液体，每孔加入100 μL DMSO，避光震荡10 min，用酶标仪于490 nm测定吸光度，计算得到细胞生长存活率。结果，从图4A中可以看出，Cypate脂质体和游离Cypate溶液在非光照条件下，25μg·mL-1以内均没有表现出明显的细胞毒性，而从图4B中可以看出，在激光照射条件下Cypate脂质体组和游离Cypate均对肿瘤细胞的生长均有抑制作用，且Cypate脂质体的IC50为5.03 μg·mL-1，而游离Cypate在浓度25.0 μg·mL-1以内未表现出明显的细胞毒性，细胞致死量＜50%，显示脂质体比游离组拥有更加有效的PTT治疗作用，其原因可能是由于脂质体用较好的细胞相容性，使得细胞对其的摄取量增加，且具有更强的光热效果。而作为对照的非光照组细胞生长状态良好，提示Cy-Liposome作为光热治疗制剂在后续光热治疗中将体现对治疗部位的针对性和可控性。
对上述Cypate脂质体传输药物进入细胞的能力进行细胞摄取试验。取对数生长期的4T1细胞铺6孔板，接种密度为1×105/mL，每孔3 mL，放入细胞培养箱恒温培养12 h，细胞贴壁后，弃去培养液。以Cypate计，分别加入10 μgmL-1用培养基配制好的游离Cypate溶液和Cypate脂质体溶液，每孔1 mL，每组3个复孔。分别在给药后培养6 h、24 h，弃去培养液，PBS洗2次，每孔加入500 μL 胰酶消化液，消化5 min后，再用500 μL培养基终止消化，然后用500 μL的PBS清洗合并转移至1.5 mL离心管，1200 rmin-1离心10 min，用1mL PBS重新溶解，吹散均匀后，用细胞计数板对细胞进行计数。然后将细胞混悬液用细胞粉碎机粉碎，强度为200 W，1秒/次，间隔1秒，超声25次粉碎细胞，往1.0mL细胞粉碎液中加入3 mL甲醇，紫外分光光光度计测定吸光度，并通过细胞个数换算106个细胞对Cypate的摄取量。结果，从图5可知，4T1细胞对Cypate经脂质体包载后的摄取量明显高于游离Cypate，且随着时间的延长差距加大。在6 h时，Cypate脂质体中的Cypate摄取量是游离组的3.17倍，24 h时则增加到5.89倍；而游离组Cypate的摄取量随时间变化改变不大，从6 h到24 h，摄取量只增加了19%。因此，可见Cypate脂质体的光热治疗效果好，与其具有良好的细胞相容性，促使包载的Cypate更多地进入细胞有关。
考察上述Cypate脂质体在激光照射后在细胞中的定位情况，进行亚细胞定位试验。为取对数生长期4T1细胞接种于玻璃底培养皿中，接种密度为2×105个·mL -1，加入1mL，在37℃、5％CO2孵箱中培养24 h使其贴壁后，进行以下实验：1）非光照组，加入用完全培养基配制的Cypate脂质体溶液，以Cypate计算30.0 μg·mL-1，培养2 h后，吸出培养基，并用PBS清洗3遍，在避光条件下染色：加入Lysotracker Green DND 26（100.0 nM）100 μL染溶酶体，在37℃培养箱中染色3 min，然后吸出染液，用PBS清洗3遍后，再加入Hochest 33342（1.0 μM）100 μL染细胞核，在37℃培养箱中染色15 min后，再用PBS清洗3遍，加入4%多聚甲醛对细胞固定20 min；2）光照组，在给药（30.0 μg·mL-1）培养2h后，吸出培养基并用PBS清洗3遍等操作相同。但在染色前，加入新鲜完全培养基，785 nm,1.5 W/cm2条件下，光照1min后，放入继续培养30 min后照射，其余同非光照组相同步骤进行染色并固定细胞。将光照与非光照组通过激光共聚焦显微镜（LSM 710）进行拍摄。图6A显示，非激光照射组，Cypate标记的红色荧光与溶酶体的绿色荧光发生重叠而产生了橘黄色荧光，结果表明Cypate脂质体在进入细胞后主要定位于溶酶体中。但经过激光照射后，由于产生的PTT作用及PDT作用使得原来定位的溶酶体被破坏，所以由Lysotracker Green DND 26染色的溶酶体荧光强度较弱（图6B）。
为考察本发明Cypate脂质体在体内对肿瘤部位的靶向性，构建4T1皮下肿瘤模型裸鼠，进行近红外荧光活体成像试验。将50 μL含有2×106个4T1细胞混悬液皮下注射接种于裸鼠的右后肢，待肿瘤体积长至60-100 mm3时 (肿瘤体积公式：肿瘤体积=长×宽2/2)，进行实验：以Cypate计算浓度为5 mg·kg-1，分别从尾静脉注射Cypate脂质体溶液和游离Cypate。配制4%的水合氯醛溶液，腹腔注射麻醉裸鼠后，用小动物活体成像系统扫描成像，分别记录给药后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h的小动物成像照片和数据。图7A显示，对照组游离Cypate组给药后24 h，Cypate荧光信号主要分布于肝脏部位，信号强、面积大，且代谢快，而肿瘤部位荧光弱；但实验组Cypate脂质体的肝区药物分布量的强度和面积均显著降低，ROI圈出的富集在肿瘤部位的荧光信号强度和持续时间显著提高，在96 h仍有较强滞留，肿瘤部位成像效果明显，如图7B，表明Cypate脂质体在体内具有良好的被动靶向性。
对上述Cypate脂质体在体内组织分布进行考察。
（1）培养4T1肿瘤细胞，将其消化制备成2×107个/mL细胞混悬液，保证细胞分散均匀，在小鼠右后肢近腹部上侧种瘤，每只小鼠皮下注射500 μL，待肿瘤体积长至60-100 mm3时（肿瘤体积公式：肿瘤体积=长×宽2/2）继续以下实验。
（2）以Cypate计算浓度为7.5mg·kg-1，分别由尾静脉注射Cypate脂质体溶液和游离Cypate。28 h后，颈椎脱臼处死小白鼠取出心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织，置于小动物成像系统进行荧光成像，记录成像图。并通过软件ROI圈出各组织的Cypate荧光信号强度（n=3）。图8A是游离Cypate在各组织的近红外荧光成像图，可见在肿瘤部位荧光弱，而在肝脏部位荧光较强；而Cypate经脂质体包载后，在肿瘤部位的荧光极大增强，在肝脏组织荧光明显减弱。图8B是通过软件ROI圈出各组织的Cypate荧光信号强度，结果Cypate脂质体的肿瘤部位荧光信号强度是游离Cypate的1.58倍，而在肝脏组织的荧光信号强度下降了77.9%，因此，Cypate脂质体具有良好的被动靶向性，且降低了肝脏的蓄积，可降低肝毒性。
对上述Cypate脂质体体内抑瘤效果进行考察。采用上述建立肿瘤模型的方法构建小白鼠荷瘤模型，待肿瘤体积至70 mm3时，设计以下6组（每组5只鼠）给药：PBS组2组、游离Cypate2组、Cypate脂质体组2组（以Cypate计算浓度为5.0 mg·kg-1），分为一类用激光照射，另一类未照激光，并且，以第0天给药，第1天用激光照射，光热治疗（785 nm，1.5W/cm2，3分钟）。分别在第0、1、2、4、5、7、9、11、13、15、17、19、21天测量小鼠的体重和肿瘤体积。以第0天的肿瘤体积作为对照，得到肿瘤的生长曲线图9，可知，注射PBS组，光照或未光照对肿瘤的生长均无影响，说明单独光照不能对肿瘤产生抑制效果。而在相同浓度下，游离Cypate组及Cypate脂质体组，未光照均不影响肿瘤生长。游离Cypate组光照对肿瘤的生长有一定抑制，但Cypate脂质体组（Cypate浓度大于等于3.0 mg·kg-1）光照可在肿瘤部位迅速产生热损伤作用使肿瘤消融，且在观察的21天时间内未出现复发现象，说明脂质体的包载，使得Cypate在激光照射条件下能对肿瘤产生很好的PTT效果，其脂质体是一种具有良好发展前景的光热治疗纳米给药系统。
实施例二 免疫原BSA-ADM的合成和抗体的制备
阿霉素是小分子，只有免疫反应性而无免疫原性，不能直接免疫动物产生抗体，需要与异体蛋白（多用牛血清白蛋白，BSA）偶联制备免疫原。另外，在酶联免疫吸附分析(ELISA)方法中，将抗体结合在酶标板上的包被抗原，常将阿霉素与另一异体蛋白（多用卵清蛋白，OVA）结合。
通过戊二醛交联法制备合成免疫原ADM-BSA和包被原ADM-OVA。制备过程如下：称取100 mg BSA于25 mL圆底烧瓶中，加入5 mL 0.1 mol.L-1 PBS溶液，充分溶解，搅拌速率为10 r.min-1，另取40.0 mg ADM.HCl溶解于3.0 mL DMF和 PBS混合溶液中(DME:PBS=1:1)，将ADM逐滴加入BSA溶液中，待ADM与BSA充分混匀后，逐滴加入稀释25倍的戊二醛3.68 mL，滴速为3滴/min，室温下避光反应6 h，于4 ℃、3000 r.min-1离心10 min取上清，用0.01 mol.L-1 PBS溶液 4 ℃连续透析4天，根据透析外液透析出来红色（未结合的ADM）的颜色情况不时更换透析液。透析完成后，取出透析袋内液体，冻干得橙红色固体粉末，于-40 ℃保存备用。
包被原的合成过程与免疫原ADM-BSA的类似，保持蛋白质OVA与阿霉素的摩尔比为1:90；阿霉素与戊二醛的摩尔比为1:4，其余实验条件均不变。
免疫原在冻干过称中，另取相同体积的透析介质，同样经冻干并称量，将冻干的免疫原的质量减去冻干的盐成分的质量，即为所需的免疫原的质量。实验中发现，冻干所得产物中盐含量高达70%左右。
合成的免疫原主要通过紫外-可见分光光度法和傅里叶转换红外法表征结果如图10。图10-A为ADM、BSA、ADM+BSA及ADM-BSA水溶液通过紫外-可见光分光光度计，在200 nm~900 nm进行扫描测得相应的紫外-可见图谱。由图可知， BSA的紫外特征峰在280 nm左右处；ADM则在233 nm、253 nm、290 nm、485 nm处有不同吸收强度的吸收峰，产物ADM-BSA在485 nm左右出现了ADM的特征峰，并且在255 nm左右出现一个肩峰，推断是ADM的吸收峰与BSA吸收峰加和的结果，推断ADM与BSA交联成功，得到了阿霉素-牛血清白蛋白偶联物（ADM-BSA）。而图10-B为ADM、BSA、ADM+BSA混合物、产物ADM-BSA在500~4000 cm-1的红外吸收图谱；ADM-BSA在1500-1700 cm-1 左右出现了BSA上的酰胺I带吸收峰，以及亚胺的吸收峰（1635cm-1）。2800-3500 cm-1左右的强峰归属于BSA上游离的-COOH和-NH2以及ADM上的同类基团叠加，推断目标产物合成成功。
分别选取健康Balb/c雌性小鼠（3-5周龄）和荷瘤小鼠（对数生长期4T1细胞，用完全培养基配制成2×105个细胞/mL，每只小鼠皮下注射50 μL，构建皮下瘤小鼠模型）作为模型动物,考察免疫原ADM-BSA产生多克隆抗体的情况。共免疫3次（首次免疫和第2、3次加强免疫）。首次免疫时，先称取1～2mg免疫原ADM-BSA粉末（扣除其中盐成分），将其溶解在1 mL的生理盐水中，加入1～1.5 mL福氏完全佐剂，充分混合成W/O型乳浊液，在小鼠上肢腋窝或腹股沟（淋巴结较丰富区）进行皮下注射0.1 mL/只。在首次免疫2周后，进行加强免疫二免，仅需要将福氏完全佐剂替换为福氏不完全佐剂，其余与首次免疫相同。并且分别在二免5～7天后眼眶取血0.1～0.5 mL，于-4 ℃放置过夜，吸取上层清液（抗血清），备用。
通过酶联免疫吸附分析方法（ELISA）间接竞争法检测分别检测正常小鼠和荷瘤小鼠血清中抗ADM抗体活性，将抗血清用0.1mol/L PBS（pH7.4）稀释10倍的溶液，得到的抗血清1:500稀释液，基本实验流程如下：
（1）以一定比例稀释包被抗原（ADM-OVA）, 按200 μL/孔加入于96孔酶标板中， 4℃包被酶标板12～24 h；
（2）通过洗板机用PBST 缓冲液清洗3次；
（3）按 280 μL/孔，加入0.01 mg. mL-1酪蛋白溶液，室温放置1 h，封阻酶标板上空余处；
（4）同（2）相同操作；
（5）在酶标板的每孔中依次分别加入 100 μL 标准阿霉素溶液和 100 μL 一定稀释度的抗血清，室温低速振摇 1 h；
（6）同（2）相同操作；
（7）按200 μL/孔加入稀释的山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶（GaRIgG-HRP）（1:5000），室温放置1 h；
（8）同（2）相同操作；
（9）按200 μL /孔加入底物溶液（醋酸钠缓冲液+TMB+H2O2），室温避光条件下在微量振荡器上振摇约 20~30 min,进行显色；
（10）当深蓝色出现，可按80 μL/孔加入5 % H2SO4溶液终止反应，转为黄色；
（11）用酶标仪测定其490 nm处吸光度。
如图11，可知，正常小鼠二免血清中当抗ADM多克隆抗体稀释500倍时，PBS组的吸光度值（0.802）为标准溶液组（0.113）的7.10倍；而荷瘤小鼠二免血清稀释500倍时，PBS组的吸光度值（0.763）为标准溶液组（0.311）的2.45倍。结果表明，合成的免疫原ADM-BSA在正常小鼠和荷瘤小鼠中具有较好的免疫原性，虽然小鼠荷瘤后免疫系统功能较低，但仍然能产生特异性多克隆抗体。
实施例三 HA-ADM的合成
合成路线如下：
（1）透明质酸的活化：称取42.07 mg 透明质酸（HA）于10 mL圆底烧瓶中，加入2.0mL 纯化水，充分溶解后，搅拌速率为120 r·min-1，另取38.3 mg EDC和22.9mg NHS依次加入，避光条件下反应8h，8000 r·min-1离心10 min后收取上清液，即为活化HA溶液。
（2）HA-ADM的合成：取10.8 mg ADM.HCl溶解于1.3 mL纯化水后，逐滴加入到上述活化HA溶液中，120 r·min-1，25 ℃避光反应12 h。8000 r·min-1离心10 min取上清，与分子截留量为8000-14000透析袋中，以1000 mL纯化水作为接收液，透析，每隔24h更换一次接收液，透析完全后（接收液在480nm处无紫外吸收），透析袋内溶液经冷冻干燥得红色粉末，-20 ℃避光保存，即为HA-ADM，备用。
HA-ADM的结构表征
（1）1H-NMR谱表征：图12为从分子桥HA-ADM和HA在重水中的核磁图谱，由图的1HNMR可以看出，其HA-ADM特征峰有：δ（ppm）：1.94（s,CH3 in HA），而3.76~3.26（m，- CH3 in HA），5.35（s，CH3 in ADM）。但由于重水的活泼氢交换作用的影响，不能观察到明显的酰胺峰。故根据上述核磁图谱特征峰可以看出HA-ADM合成成功。
（2）DSC表征：图13为DSC鉴定图，上图为自制HA-ADM测定结果；下图为HA与ADM的混合物测定结果，由图13可以看出，合成产物HA-ADM在224.7℃出现吸热峰；而HA和ADM的混合物则无明显的吸热峰。由于产物和原料的物理混合物，曲线显著不同，表明产物是新生成的物质，证明分子桥HA-ADM可成功合成。
故，以上两种方法均证实HA-ADM合成成功。
HA-ADM连接桥作用考察
考察分子桥HA-ADM，既能与抗ADM抗体结合，又能与肿瘤细胞表面过度表达受体结合，通过形成“CD44-HA-ADM-抗ADM抗体”复合物，即通过考察：CD44受体-透明质酸-阿霉素-抗阿霉素抗体的形成，证实HA-ADM具有将抗体靶向到肿瘤细胞的能力。采用细胞酶联免疫吸附分析法来进行验证，其原理与细酶联免疫吸附分析法（ELISA）原理一致，只是用细胞板中贴壁生长的细胞代替了在酶标板上包被抗原，在操作上略有不同，其基本过程如下：
（1）分别取对数生长期4T1细胞接种于96孔细胞板，接种密度为1×105个·mL-1，每孔100 μL，在37 ℃、5％CO2孵箱中培养24 h使其贴壁；
（2）每孔加入100 μL PBS，洗涤3次；
（3）分别加入以下样品溶液各100μL（n=6），细胞培养箱恒温孵育1 h。样品溶液使用完全培养基分别配制：1）抗血清+HA-ADM溶液（即：antiserum+HA-ADM）；2）抗血清+ADM溶液(即：antiserum+ ADM）；3）正常血清+ HA-ADM溶液（即：normal serum+HA-ADM）；4）PBS+HA-ADM溶液（即：PBS+HA-ADM）。以 ADM为计，浓度均为5.0 μg·mL-1，抗血清及阴性血清的稀释倍数均为200倍；37 ℃条件下恒温震荡30 min；
（4）每孔加入100 μL PBST，洗涤3次，然后每孔100 μL加入PBS稀释的山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶（GaRIgG-HRP，标记二抗），37 ℃恒温孵育1 h；
（5）细胞板以PBST洗涤，每次100 μL，共3次；每孔加入100 μL底物溶液（现用现配：20mL纯水、1 mL pH 5.8的磷酸盐缓冲溶液、200 μl 1 %四甲基联苯胺（TMB）、20 μL 5 %过氧化氢），室温避光条件下，在微量振荡器上震摇20 min左右，进行显色；
（6）当细胞板上有些孔已显深蓝色时，按40 μL/孔加入5% H2SO4溶液终止显色反应；
（7）用酶标仪测定其490nm处吸光度，结果见图14。
由于HA-ADM，一端的HA可与癌细胞表面高表达的CD44结合，另一端的ADM可与小鼠抗血清（抗ADM多抗）结合，而小鼠抗血清可与标记二抗作用，最终使细胞显色，故在细胞ELISA测定结果图14中，具体吸光度大小为：抗血清+HA-ADM >抗血清+ADM >正常血清+ HA-ADM > PBS+HA-ADM组，其中，“抗血清+HA-ADM”的吸光度值最高，分别依次为各对照组的1.47、2.58、3.95倍（均为p<0.05）。可见“抗血清+HA-ADM”组的吸光度值大，它使留在细胞板上的标记二抗越多，说明多抗被引导致肿瘤细胞的效率越高，即证明分子桥HA-ADM使癌细胞表面形成了“CD44-HA-ADM-抗ADM抗体（CD44受体-透明质酸-阿霉素-抗阿霉素抗体）”复合物，为刺激机体自身免疫，对癌细胞发起免疫杀伤作用的奠定了基础。
HA-ADM主动靶向抗癌作用考察
（1）4T1细胞对HA-ADM的摄取情况
取对数生长期的4T1细胞，制成106 个/mL细胞的混悬液，每孔3 mL 接种于6孔板，在37 ℃、5％CO2孵箱中培养24 h使其贴壁后，分别加入用完全培养基配制的溶液3 mL：1）HA-ADM溶液；2）ADM溶液，使各组溶液的ADM终浓度均为10 μgmL-1。分别培养1h、4h后，PBS洗涤3次，加适量胰酶消化后在1 mL 4℃预冻的PBS溶液中重悬，1 h内进入流式细胞仪检测，结果见图15。由流式结果图15可知，在1h和4 h，HA-ADM组的摄取量分别为ADM组的2.04倍和2.44倍，说明因HA介导显著提高了摄取量，即HA-ADM具有主动靶向性。
（2）体外细胞毒性试验，考察HA-ADM主动靶向抗癌作用
采用MTT法，通过对鼠乳腺癌（4T1）细胞的细胞毒性，考察HA-ADM主动靶向抗癌作用。
通过4T1细胞生长抑制试验HA-ADM、ADM、HA-ADM+HA及HA的细胞毒性。取对数生长期的4T1细胞，制成5×103个/mL细胞的混悬液，每孔100 μL 接种于96孔板，在37 ℃、5％CO2孵箱中培养24 h使其贴壁后，分别加入用无叶酸的完全培养基配制的溶液：①HA- ADM溶液；②HA-ADM+ADM溶液; ③ADM溶液；④HA溶液。其中各样品溶液的ADM终浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μgmL-1，实验组②中每孔加入4mgmL-1游离HA。给药24h后，吸取含药培养基，用PBS洗涤3次后每孔加入5 mg·mL-1 MTT溶液10 μL和完全培养基100 μL，继续培养4 h后弃去液体，每孔加入100 μL DMSO，避光震荡20 min，用酶标仪于490 nm测定吸光度，计算得到细胞生长存活率。不同药物浓度作用不同时间的细胞存活率。
计算公式为：“存活率=（A药物-A调零孔/A对照-A调零孔）×100%）”。分别以浓度（各组ADM浓度一致）为横坐标，存活率为纵坐标，得到不同浓度药物对癌细胞作用24h后的生长抑制曲线，并计算半数致死量IC50值。结果见图16，可知，在24 h，当ADM浓度一致时，HA-ADM 、HA-ADM+HA、ADM对4T1的细胞生长抑制IC50（μg·mL-1）依次为：0.14、1.60、1.05，而HA对细胞几乎无毒性，表明分子桥对肿瘤细胞的杀伤作用较ADM（p<0.05）大，即HA-ADM分子桥对肿瘤细胞具有主动靶向性。
实施例四
将4T1细胞在37℃、5% CO2孵箱内培养。取对数生长期的细胞，用含10%胎牛血清无叶酸的1640培养基配制成5×105个细胞/mL，每只鼠皮下注射50μL（含1×104个细胞），构建皮下瘤小鼠模型（荷瘤鼠模型）。经观察，4T1荷瘤Balb/c鼠模型动物构建成功，用于Cypate脂质体靶向光热治疗联合ADM-BSA及HA-ADM免疫治疗组成的多靶向抗肿瘤复合制剂的疗效考察试验。
实验动物分组为：
实验组①：免疫+HA-ADM +PTT(1.5 mg·kg-1)（分子桥促进免疫治疗+主动靶向化疗+1.5 mg·kg-1靶向光热治疗）；
实验组②：免疫+HA-ADM + PTT(0.5 mg·kg-1)（分子桥促进免疫治疗+主动靶向化疗+0.5 mg·kg-1靶向光热治疗）；
免疫治疗联合分子桥组：免疫+HA-ADM（分子桥促进免疫治疗+主动靶向化疗）；
分子桥功能验证组：免疫+ ADM（体内有抗体，普通化疗+被动靶向化疗）；
单纯免疫治疗组：免疫+PBS（体内有抗体，但无分子桥介入）；
靶向光热治疗联合主动靶向化疗组：非免疫+HA-ADM +PTT(1.5 mg·kg-1)(体内无抗体，分子桥主动靶向化疗+1.5 mg·kg-1靶向光热治疗）；
主动靶向化疗组：非免疫+HA-ADM（体内无抗体，分子桥主动靶向化疗）；
化疗药对照组：非免疫+ ADM（体内无抗体，普通化疗）；
阴性对照组：非免疫+PBS（体内无抗体，不治疗）。
具体步骤如下：1）免疫周期：接种肿瘤第1天开始第1次免疫，免疫间隔时间及取血间隔时间与健康鼠一致，均为两周；2）光热治疗组：在第0天尾静脉注射Cypate脂质体（以Cypate为计，给药剂量为0.5或1.5 mg·kg-1），给药24 h后，采用785 nm激光器1.5 W·cm-2条件下对肿瘤部位照射3 min；3）分子桥介入：待免疫的荷瘤鼠血清检测出相应抗体后，为接种肿瘤后第22天，即光热治疗介入后第1天，尾静脉注射分子桥，并以此为起点其后的第2、3、5、7、9天给予相应药物；介入分子桥HA-ADM或ADM时，浓度以ADM为计，给药剂量均为0.33 mg·kg-1。其后，观察并测量各组小鼠肿瘤体积，以第0天测量体积V0设为初始体积，计算各组瘤体积增长倍数做为指标，测量第i天的肿瘤体积增长倍数=（Vi -V0）/ V0。治疗24天后，对照组小鼠出现死亡，将全部小鼠处死，取出其肿瘤组织，并拍摄照片。
由图17A可知，组1A（阴性对照组1，非免疫+PBS）肿瘤生长速度明显最快，组2A（阴性对照组2，单纯免疫，免疫+PBS）肿瘤生长速度则稍低于阴性对照组，而且组2B（免疫及单纯化疗，免疫+ ADM）、组2C（分子桥引导免疫治疗组，免疫+HA-ADM）、组1B(化疗药对照组，非免疫+ ADM）、组1C（主动靶向化疗组、非免疫+HA-ADM）的肿瘤生长速度，均较为接近。但是，以下各组的瘤体显著减小或不复发：组2E（实验组1，免疫/HA-ADM/PTT,1.5mg·kg-1，组2D（实验组2，免疫/HA-ADM/PTT,0.5mg·kg-1，以及组1D（阳性对照组，非免疫/HA-ADM/PTT，1.5mg·kg-1）。可见实验组1（免疫+HA-ADM +PTT，1.5 mg·kg-1）、实验组2（免疫+HA-ADM +PTT，0.5 mg·kg-1）肿瘤生长速度明显降低，且Cypate脂质体的给药浓度越高，抑瘤效果越明显，而没有免疫、体内无抗体的靶向光热治疗联合主动靶向化疗组（非免疫+HA-ADM +PTT(1.5 mg·kg-1)）的抑瘤效果也不错。
图17B为治疗24天后各组肿瘤组织照片，由图可知实验组（靶向光热治疗联合免疫治疗组）与对照组相比，以及参考实例一中单独Cypate脂质体光热治疗抗肿瘤活性的研究，发现Cypate脂质体给药浓度为0.5 mg·kg-1和1.5 mg·kg-1时，肿瘤在给药24 h后进行激光照射后，分别在第9天和13天出现复发情况。而将光热治疗结合免疫治疗后，肿瘤复发率均有所下降。实验组1（免疫+HA-ADM +PTT，Cypate脂质体1.5 mg·kg-1）、实验组2（免疫+HA-ADM + PTT，Cypate脂质体0.5 mg·kg-1），以本次实验结果统计，肿瘤复发抑制率从低浓度的20%，提高至高浓度的60%。而没有免疫、体内无抗体的靶向光热治疗联合主动靶向化疗组（非免疫+HA-ADM +PTT(1.5 mg·kg-1)）仅能达到20%的肿瘤复发抑制率。可见所设计的以Cypate脂质体经过光热治疗后，杀死实体肿瘤，而剩余少量残留的肿瘤细胞则通过免疫原ADM-BSA非特异性地激活机体的免疫功能并联合分子桥HA-ADM肿瘤靶向功能的免疫治疗而被消除或抑制，证实了主动靶向光热治疗联合主动免疫治疗可抑制肿瘤生长并一定程度地抑制肿瘤复发。
综上所述，本发明由Cypate脂质体、ADM-BSA与HA-ADM组成的复合制剂，提供了一个能方便、高效提高肿瘤特异性，并有效抑制肿瘤生长和复发的联合治疗肿瘤的方法，主要包含两个主要部分，通过近红外激光结合光热试剂对间质肿瘤照射，通过包载光热材料的脂质体产生的光热效应，对肿瘤产生实质性损伤，同时利用免疫原ADM-BSA非特异地激活机体的免疫功能，在此基础上联合应用分子桥HA-ADM，将增强免疫系统对肿瘤细胞的免疫识别能力以及一定的靶向化疗能力，从而达到更好的抗肿瘤效果。这两个组成部分均能激活机体的抗肿瘤免疫反应力。动物试验研究表明，将具有选择性光热治疗与提高免疫系统的响应性结合的联合治疗应用，不仅可以摧毁治疗原发性肿瘤，也有根除治疗远距离转移肿瘤的潜力。因此热疗联合免疫治疗复合制剂表现出了其抗肿瘤活性方面的优势，为进一步的免疫治疗联合光热治疗的研究提供实验依据和基础方法，并为开发生物相容性好、靶向性好、光热转换效率高的包载光热试剂Cypate脂质体并结合ADM-BSA、HA-ADM在肿瘤免疫治疗展示出应用前景。

Claims (5)

1.一种靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂，其特征在于：所述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂由Cypate脂质体、ADM-BSA以及HA-ADM组成；
所述Cypate脂质体的粒径为80～200nm；
所述Cypate脂质体中，脂质体为磷脂、胆固醇自组装产物；
所述Cypate脂质体中，Cypate位于脂质体双分子层中；
所述ADM-BSA的结构式为：
所述HA-ADM的结构式为：
将磷脂、胆固醇和Cypate置于反应器中，加入有机溶剂，密闭搅拌，得到混合物；水浴下，混合物在搅拌后，超声处理；然后在搅拌条件下加入纯化水，继续水浴搅拌3～8 min乳化后，超声处理；再继续搅拌10～20min；然后去除有机溶剂，即得Cypate脂质体；所述磷脂为大豆磷脂或卵磷脂；
有机溶剂为无水乙醇和乙酸乙酯混合液；无水乙醇和乙酸乙酯混合液中，无水乙醇和乙酸乙酯的体积比为3∶1；
所述混合物中，磷脂的浓度为2mg/mL，胆固醇的浓度为0.5mg/mL；
于37℃下，在750 r·min-1的搅拌速度下采用挥发的方式去除有机溶剂；
乳化时，水浴的温度为45℃～50℃，搅拌转速为1250 r·min-1；
磷脂、胆固醇和Cypate的质量比为4∶1∶0.4；磷脂、胆固醇和Cypate的质量和与纯化水的质量比为3∶100；
超声处理时间为1分钟。
2.根据权利要求1所述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂，其特征在于，所述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂的制备方法包括以下步骤：
(1) 将PBS溶液加入BSA中，得到BSA溶液；将ADM.HCl溶解于PBS和DMF混合溶液中，得到ADM溶液；混合BSA溶液与ADM溶液，然后以3～5滴/min的滴速滴加戊二醛溶液，室温下避光反应；反应完成后于4℃下离心处理，取上清，于4℃下，透析；透析完成后，取出透析液，冻干即为ADM-BSA；
(2)将HA加入纯水中，然后加入EDC与NHS，搅拌下，室温避光反应7.5～8.5小时，然后离心处理得到上清；将ADM.HCl溶解于纯化水得到ADM溶液；然后将ADM溶液滴加入上清中，搅拌下，避光反应10～14小时，然后离心处理，取上清进行纯水透析；透析完成后，取出透析液，冻干即为HA-ADM；
所述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂由Cypate脂质体、ADM-BSA以及HA-ADM组成。
3.根据权利要求2所述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂，其特征在于：步骤（1）中，PBS和DMF混合溶液中，PBS与DMF等体积；所述戊二醛溶液中戊二醛的质量浓度为22～28%；所述BSA、ADM.HCl、戊二醛的质量比为1∶（50～90）∶（6～8）；透析至紫外检测至透析外液在480 nm处吸收峰消失即完成透析；步骤（2）中，HA、EDC、NHS的摩尔比为1∶20∶20；搅拌速率为120 r/min；离心处理工艺为8000 rpm离心10 min，纯水透析至接收液在480nm处无紫外吸收后即完成透析。
4.根据权利要求3所述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂，其特征在于：步骤(2)中，将HA加入纯水中，然后加入EDC与NHS，搅拌下，室温避光反应8小时，然后离心处理得到上清；纯水透析时，24小时换一次接收液。
5.权利要求1所述靶向光热治疗联合免疫治疗抗肿瘤复合制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
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