CN108014349B - 一种载基因的多功能造影剂的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种载基因的多功能造影剂，包括脂质壳膜,脂质壳膜上修饰有叶酸，脂质壳膜表面带有正电荷，且携载有基因。本发明要解决的技术问题是提供一种具有在体内外的靶向能力，具有增强超声/光声显影的能力，且具有体内外在激光作用下基因转染优势的一种用于制作载基因的多功能造影剂的制备方法及其应用。

Description

一种载基因的多功能造影剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及超声影像领域，具体涉及一种载基因的多功能造影剂的制备方法及其应用。

背景技术

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，多发生于3岁以内，其恶性程度高，早期发现诊断困难。目前在中国，大多数患儿因“白瞳症”就诊时RB生长已较大，预示着已进入了严重危害视力甚至生命的时期，可能无法保住眼球，治疗仍以患眼眼球摘除为主，辅以放疗、化疗等手段。眼球摘除手术使患儿丧失了一眼视功能，永远不再有立体视觉，且严重影响患儿外观及身心健康；而放化疗均有较明显的毒副作用，放疗还可导致继发性肿瘤发生，治疗效果均不理想。

因此早期特异性诊断RB以及采取有效治疗方案，对于能否保住患儿眼球、避免视功能丧失以及远期转移显得尤为重要。目前，临床对RB的常用检查手段包括眼科常规眼底检查、眼部B超、CT成像和MRI成像，这些传统的影像学技术还远不能做到早期特异性诊断RB和实时监控肿瘤治疗效果。新兴的分子影像学借助于分子探针技术，通过靶向结合或酶学激活等原理，从分子水平或信号通路水平进行精准的分子显像。而其中超声分子显像与治疗技术因其无创、简便、靶向性好等优势有望成为肿瘤诊断与治疗的主流方式，具有潜在的广阔临床应用前景，且更加适用于婴幼儿。

超声分子成像主要通过微泡造影剂在感兴趣区靶向聚集实现靶向显影，但微泡造影剂用于分子显像存在一些致命的缺点，比如：微泡造影剂粒径为微米级，不能穿过血管内皮细胞间隙，使得研究只能局限于血管内，不能到达血管外肿瘤细胞靶标。

近年来，关于RB的自杀基因治疗引起关注，单纯疙疹病毒胸昔激酶/丙氧鸟昔系统(HSV-TK/GCV)研究最为深入，也最具有应用前景。超声靶向破坏微泡(UTMD)介导的基因治疗因其安全、无创、简便易行等优点受到广大研究者关注，尤其阳离子微泡的诞生，使得基因携载量增多，基因转染效率有所升高。但微泡粒径为微米级，难以穿过血管内皮达到组织间隙，限制了其进一步应用。以液态氟碳为内核的相变型纳米粒微球近年来备受关注，这种纳米级微球能渗透血管到达组织。液态核增强超声显影的方式为聚集显影，其超声显影效果受限，一旦液态氟碳内核被触发变为气相，其超声显影将大大增强。研究者通常采用低频治疗超声或高强度聚焦超声辐照促进液态氟碳核发生相变，也被称作声致相变(ADV)。然而，拉普拉斯压力及表面稳定剂的应用致使超声触发微球相变相对困难，因此传统诊断超声的压力及频率不足以激发微球相变，促发微球相变需要的超声压力及频率也可能会导致不良的生物效应。

目前，光致相变(ODV)的发展为我们带来了新的选择。将吸光材料(光吸收子)与液态核结合起来，通过激光辐照来诱导全氟化碳纳米粒发生液气相变。当应用相对低能量的激光辐照时，光吸收子温度升高，会发生热弹性膨胀，从而产生普通的光声信号；但当激光能量超过一定的阈值，光吸收子产生的局部温度上升足以促发微球发生液气相变，这将产生较之前者强很多的瞬时非线性光声信号，而且微球变为气相后将带来优质的超声信号对比。光声成像是一种新兴的、基于生物组织内部光学吸收差异、以超声作媒介的生物光子成像方法，结合了纯光学成像的高对比度特性和纯超声成像的高分辨率及高穿透深度特性的优点。

由此可见，激光在新型的光致相变(ODV)和光声成像中都发挥了重要的作用，以激光做为主要手段的诊疗一体化纳米材料体系是目前研究新方向。研究表明在合适的参数下，激光可有效改变细胞膜通透性，有利于基因向细胞内部转运，从而提高转染效率。由于眼部组织的特殊解剖结构(屈光介质的透明性)，目前在临床上，RB的治疗方法之一就是激光光凝治疗。结合目前对于RB早期诊断、实时监控以及精准治疗的迫切需求，我们拟制备一种包裹光吸收子的和液态氟碳，并能载基因的多功能造影剂，在激光作用下通过光致相变和光声效应实现超声/光声双模态显像，同时实现基因的转运和转染。为尽量减少对周围正常细胞的影响，有必要直接针对RB细胞进行靶向显影与治疗，以获得更好的显影与治疗效果。叶酸受体在多数上皮源性的肿瘤细胞中高度表达，在正常细胞中几乎零表达。最新研究发现，叶酸受体同样表达于RB细胞，使其成为RB靶向显影与治疗的新方向。

综上所述，本研究拟制备一种能够穿过肿瘤新生血管内皮间隙，进而靶向视网膜母细胞瘤细胞，并能携载基因的靶向阳离子相变型液态氟碳纳米造影剂，当其通过静脉注射以后，能够主动靶向聚集于视网膜母细胞瘤，在一定能量的激光作用下，纳米粒内的液态氟碳发生液气相变，产生微泡而增强光声/超声成像，同时在激光作用下促发基因转染，实现靶向基因治疗；达到靶向显像及治疗的目的，同时减轻全身毒副作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有体内外的靶向能力，具有增强超声/光声显影的能力，且体内外具有在激光作用下基因转染优势的一种载基因的多功能造影剂的制备方法及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种载基因的多功能造影剂，包括脂质壳膜,脂质壳膜上修饰有叶酸，脂质壳膜表面带有正电荷，且携载有基因。

进一步，所述的脂质壳膜内部包裹有液态氟碳和吲哚菁绿。

进一步，其粒径为380.1±5.9，粒径多分散指数PDI为0.149。

进一步，其ZETA电位为13.4±1.4mV。

进一步，其吲哚菁绿包封率为92.1±1.3％。

采用本发明的一种载基因的多功能造影剂，Malvern仪器测得本发明的纳米粒粒径约380.1±5.9，本发明的纳米粒能够穿过肿瘤毛细血管内皮间隙(100nm-780nm),所以能够满足本发明对其粒径的要求；Malvern仪测得其Zeta电位为13.4±1.4mV，能够保证纳米粒的相对稳定性而不致快速沉淀。透射电镜观察单个FCNPI/pDNA纳米造影剂呈黑色球形结构，形态规则，经检测结果，纳米粒稳定性良好，未见明显聚集或沉淀，其粒径和电位在48小时内均无明显变化，这些特性都将有利于纳米粒顺利穿过肿瘤毛细血管内皮间隙而到达肿瘤细胞周围。流式细胞学检测到纳米粒造影剂表面修饰有叶酸，这为后续的靶向显影和精准治疗奠定了基础。激光共聚焦显微镜和凝胶电泳均证实本发明表面携载有基因。此外，当激光参数为808nm、1W/cm²、2min时，FCNPI/pDNA纳米造影剂发生了相变，显微镜下见相变后产生大量气泡，这为超声成像提供了保障。紫外分光光度计测得吲哚菁绿ICG包封率为92.1±1.3％，保证了光致相变及光声成像的发生。

本发明FCNPI/pDNA纳米造影剂所使用的磷脂成分与生物有机体的细胞膜磷脂成分相同，对生物体无任何毒副作用。液态氟碳因具有良好的携氧能力，可用作血液替代品，而且液态氟碳能弥散溶解于血液通过呼气排出体外，而不参与体内的生物化学降解，生物稳定性良好。吲哚菁绿(ICG)是一种三碳菁染料，最大吸收波长805nm，常被用于眼底脉络膜血管造影，以及眼科术中对晶状体囊膜和视网膜内界膜染色，是美国联邦药物管理局批准的唯一人体可用的在近红外范围吸光能力强的染料，是发展临床可用的光声探针的最佳选择。细胞毒性检测结果也进一步印证了本发明的生物安全性。

激光在透明介质中具有良好的穿透性，在眼病治疗中应用广泛，具有绝对的优势。液态氟碳PFP具有良好的光致相变特性，而ICG具有光声显像的特性，把PFP和ICG同时装载于一个纳米载体内，再结合脂质壳上修饰有叶酸，表面携载有治疗基因，此造影剂在激光激发作用下，将有望达到光声/超声双模态及基因转染治疗的要求，成为极具潜力的多功能造影剂。

本发明还提供另一个技术方案，一种用于制作载基因的多功能造影剂的制备方法，采用旋转蒸发-超声法制备。

进一步，旋转蒸发-超声法的操作步骤如下：

1)、溶解：先将二棕榈酰磷脂酰胆碱、叶酸修饰的聚乙二醇-(2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和Dc-胆固醇用有机溶剂溶解；

2)、旋转蒸发：于旋转蒸发仪进行减压旋转蒸发除去有机溶剂；

3)、超声清洗：再置于超声波清洗剂中清洗振荡；

4)、乳化：在冰浴条件下，经过两次乳化；

5)、离心分离：离心分离后置4℃冰箱，得到乳化液；

6)、质粒连接：与所需要携载的基因质粒与离心分离后的乳化液在冰浴条件下孵育，24h后再离心分离，得到样品。

进一步，步骤4)的两次乳化的第一次乳化时，加入液态氟碳和吲哚菁绿。

进一步，所述步骤1)中的溶解温度为50℃；

所述步骤2)中的旋转蒸发仪的转速为80rpm，时间为2小时；

所述步骤4)中乳化采用声振仪乳化，全程冰浴，且功率为100w，时间为6min；

所述步骤5)中离心分离的温度为4℃，转速为8000rpm，时间为5min,共离心三次。

进一步，步骤4)中声振仪采用间断声振的方式。

本发明采用旋转蒸发-超声法，将液态氟碳和吲哚菁绿包裹进由多种磷脂成分及胆固醇组成的脂质外壳内，来研制FA-CN-PFP-ICG/pDNA纳米粒，简称FCNPI/pDNA纳米造影剂。首先将二棕榈酰磷脂酰胆碱、叶酸修饰的聚乙二醇-(2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和Dc-胆固醇溶解于有机溶剂(可以用三氯甲烷溶剂)中，溶解必须保证充足的时间，或使用加热或声振促溶的方式，使得溶质充分溶解，否则难以形成均匀稳定的纳米粒。加入液态氟碳和吲哚菁绿并声振的过程全程冰浴，否则声振过程中形成的大量热量容易促使PFP相变，采取的是间断声振的方式(on:5s,off:5s)，以便声振产生的热量能在off期及时消散。

附图说明

图1为本发明一种载基因的多功能造影剂的结构示意图；

其中，DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱、PFP：液态氟碳、ICG：吲哚菁绿、Dc-Chol：Dc-胆固醇、pDNA：TK-GFP基因、DSPE-PEG-Folate：叶酸修饰的聚乙二醇-(2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

图2为本发明一种载基因的多功能造影剂在透射电镜观察单个纳米粒电镜图。

图3为本发明一种载基因的多功能造影剂的FCNPI/pDNA纳米造影剂体外超声显影中的增强模式下不同浓度的FCNPI/pDNA纳米造影剂的超声信号变化图。

图4为本发明一种载基因的多功能造影剂的FCNPI/pDNA造影剂体外光声显影中的不同浓度的FCNPI/pDNA纳米造影剂的光声信号变化图。

图5为本发明一种载基因的多功能造影剂在激光辐照FCNPI/pDNA体内基因治疗RB的不同处理后各组裸鼠生长曲线图。

具体实施方式

一、本发明一种载基因的多功能造影剂(FA-CN-PFP-ICG/pDNA,简称FCNPI/pDNA)，其具体的制备方法为：

1)、溶解：

将DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱，美国Avanti公司)、DSPE-(PEG2000)-Folate(叶酸修饰的聚乙二醇-(2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，美国Avanti公司)、Dc-cholesterol(Dc-胆固醇，美国Avanti公司)按照质量比5:2:2共称取共10mg加入圆底烧瓶，同时量取6ml三氯甲烷加入圆底烧瓶，封闭圆底烧瓶口，置入50℃水中加热至充分溶解。

2)、旋转蒸发：溶解20min后将圆底烧瓶固定于旋转蒸发仪上(温度：50℃)进行减压旋转蒸发以除去有机溶剂，转速：80rpm，时间：2小时，形成一层均匀的白色薄膜。

3)、超声清洗：蒸发结束后取下圆底烧瓶，加入6ml PBS振荡、水合，然后将圆瓶置于超声波清洗机中清洗振荡，直至圆底烧瓶内壁白色薄膜脱落得到白色混悬液，即为脂膜水化液，将其转移至10ml离心管中以备用。

4)、一次乳化：在全程冰浴条件下，量取100μl PFP(液态氟碳)和100μl ICG(吲哚菁绿，10mg/ml)加入EP管中，采用声振仪对EP管内混悬液进行乳化，乳化过程中声振仪功率：100w，时间：2min(on:5s,off:5s)。

二次乳化：在全程冰浴条件下，将4)中制得的PFP/ICG混悬液加入3)所备用的脂膜水化液中，再次采用声振仪对EP管内混悬液进行乳化，乳化过程中声振仪功率：125w，时间：5min(on:5s,off:5s)。

5)、离心分离：将经第二次乳化后制得的乳状液体置于高速冷冻离心机内离心分离，温度：4℃，转速：8000rpm，时间：5min,共离心三次，最后一次离心后用双蒸水定量为4ml，置于4℃冰箱备用。

6)、质粒连接：从6)离心所得乳化液中量取200μl，与40μg重组单纯疱疹病毒胸苷激酶质粒(TK-GFP)在冰浴条件下进行孵育，24小时后再置于高速冷冻离心机内离心分离，温度：4℃，转速：10000rpm，时间：5min,离心三次，所得样品置4℃冰箱备用。

所制得的本发明一种载基因的多功能造影剂(以下简称FCNPI/pDNA纳米造影剂或纳米粒)如图1所示，包括脂质壳膜,脂质壳膜内部包裹有液态氟碳和吲哚菁绿，脂质壳膜上修饰有叶酸，脂质壳膜表面带有正电荷，且携载有基因。

二、一种载基因的多功能造影剂的特性及性能

1、一种载基因的多功能造影剂的特性

(1)以PBS溶解后，FCNPI/pDNA纳米造影剂外观呈绿色，静置无明显分层。光镜下观察，FCNPI/pDNA呈球形，分布均匀，大小均一。荧光显微镜及激光共聚焦显微镜下观察，FCNPI/pDNA呈球形或点状，分布均匀，大小较均一。

(2)如图2所示，透射电镜观察单个FCNPI/pDNA纳米造影剂呈黑色球形结构，形态规则。

(3)Malvern激光粒径仪检测出FCNPI/pDNA纳米造影剂粒径为380.1±5.9nm，粒径多分散指数(PDI)为0.149，Zeta电位为13.4±1.4mV。

2、FCNPI/pDNA纳米造影剂的质粒携载情况检测

(1)激光共聚焦显微镜下用488nm波长的激光激发后观察，可见FCNPI/pDNA纳米粒表面呈现红色荧光，即为所携载的重组单纯疱疹病毒胸苷激酶质粒的TK-GFP基因。

(2)凝胶电泳检测结果为：FCNPI/pDNA纳米造影剂跑出的条带与单纯的TK-GFP基因跑出的条带在同一水平位置。

3、紫外分光光度计检测FCNPI/pDNA纳米造影剂中ICG的包封率

检测结果为：吲哚菁绿ICG标准曲线方程为：Y＝0.1478X-0.085，R²＝0.9979，表明ICG在0-5μg/ml浓度范围内与峰面积线性关系良好，由此计算出ICG包封率为92.1±1.3％。

4、光镜下观察FCNPI/pDNA纳米造影剂激光致相变

检测结果为：激光(808nm,1W/cm²)辐照前，纳米粒基本保持稳定，光镜下纳米粒粒径较均一，未见明显相变；激光辐照后，纳米粒发生液气相变，体积逐渐增大，并发生融合，当辐照至2min时，相变纳米粒明显增多，体积增大，也有部分变大的气泡发生破裂。

5、FCNPI/pDNA纳米造影剂脂质壳上叶酸含量的检测

(1)纳米粒造影剂经荧光染料DiI染色后，在激光共聚焦显微镜下呈红色，经与抗叶酸一抗和FITC二抗孵育后，在激光共聚焦显微镜下呈绿色。

(2)流式细胞学检测纳米粒造影剂表面叶酸含量结果为97.6±1.5％。

6、FCNPI/pDNA纳米造影剂的稳定性检测

检测结果为：在4℃条件下，纳米粒稳定性良好，未见明显聚集或沉淀，其粒径和电位在48小时内均无明显变化。

7、FCNPI/pDNA纳米造影剂的细胞毒性检测

使用视网膜母细胞瘤Y79细胞株，采用CCK-8试剂进行检测，检测结果为：当FCNPI/pDNA纳米造影剂浓度为0.2-1.0mg/ml，随着造影剂浓度的增大，Y79细胞的活性轻微下降，当造影剂浓度为1.0mg/ml时，Y79细胞活力仍高于85％。

综上，Malvern仪器测得本发明的纳米粒粒径约380.1±5.9，本发明的纳米粒能够穿过肿瘤毛细血管内皮间隙(100nm-780nm),所以能够满足本发明对其粒径的要求；Malvern仪测得其Zeta电位为13.4±1.4mV，能够保证纳米粒的相对稳定性而不致快速沉淀。透射电镜观察单个FCNPI/pDNA纳米造影剂呈黑色球形结构，形态规则，经检测结果，纳米粒稳定性良好，未见明显聚集或沉淀，其粒径和电位在48小时内均无明显变化，这些特性都将有利于纳米粒顺利穿过肿瘤毛细血管内皮间隙而到达肿瘤细胞周围。流式细胞学检测到纳米粒造影剂表面修饰有叶酸，这为后续的靶向显影和精准治疗奠定了基础。激光共聚焦显微镜和凝胶电泳均证实本发明表面携载有基因。此外，当激光参数为808nm、1W/cm²、2min时，FCNPI/pDNA纳米造影剂发生了相变，显微镜下见相变后产生大量气泡，这为超声成像提供了保障。紫外分光光度计测得ICG包封率为92.1±1.3％，保证了光致相变及光声成像的发生。

三、FCNPI/pDNA纳米造影剂的靶向性实验

使用视网膜母细胞瘤Y79细胞株，采用荷瘤裸鼠模型观察纳米粒体内靶向情况，分为叶酸靶向组FCNPI/pDNA(本发明)，非靶向组(CN-PFP-ICG/pDNA,CNPI/pDNA)和拮抗组。

实验结果为：

1、纳米造影剂体外寻靶实验研究

经荧光染料DAPI染色后，细胞核在激光共聚焦显微镜下呈蓝色；经荧光染料DiO染色后，细胞膜在激光共聚焦显微镜下呈绿色；经荧光染料DiI染色后，纳米粒在激光共聚焦显微镜下呈红色。在叶酸受体靶向组，可见较多的代表靶向纳米粒的红色荧光聚集在细胞膜周围，而在非靶向组和拮抗组，细胞膜周围未见明显红色荧光聚集。

说明本发明的纳米造影剂在体外可顺利靶向在细胞膜附近。靶向组Y79细胞周围及细胞内部可见较多纳米粒聚集，而非靶向组细胞周围基本无纳米粒聚集，充分说明了叶酸具备高效连接其受体的能力。拮抗组在加入游离叶酸后，Y79细胞的叶酸受体被游离叶酸占据，阻断了纳米粒与细胞的结合，故而细胞周围未见明显纳米粒荧光聚集，也从侧面反映了叶酸与细胞结合的特异性。

2、纳米粒体内寻靶实验研究

结果表明：叶酸靶向组裸鼠在注射靶向纳米乳液30min后，肿瘤局部可见代表靶向纳米粒的红色荧光，1h时红色荧光范围增大，至2h达到最大，到6h和12h荧光范围逐渐缩小，24h时仅见点状荧光。而非靶向组肿瘤局部于整个观察时间内均未见明显红色荧光聚集。注射纳米粒24h后离体荧光实验显示，靶向组瘤块显示明显红色荧光而非靶向组瘤块未显示红色荧光，靶向组肿瘤的荧光强度绝对值明显高于非靶向组。注射纳米粒2h后，靶向组肿瘤区域荧光强度/非肿瘤区域荧光强度之比值明显高于非靶向组，差异有统计学意义(p＜0.001)。

体内靶向性实验中，靶向组裸鼠肿瘤局部可见代表靶向纳米粒的红色荧光区域，并且荧光强度和范围随着时间发生变化，而非靶向组裸鼠其肿瘤处始终未见明显荧光，这说明了叶酸靶向纳米粒在活体对富含叶酸的Y79肿瘤具有很好的靶向性。本发明制作的纳米粒粒径300nm-400nm，而肿瘤毛细血管内皮间隙约100nm-780nm,所以纳米粒可以顺利穿过毛细血管内皮间隙达到血管外，即EPR(Enhanced Permeation and Retention effect)效应。在靶向组和非靶向组，纳米粒均可通过EPR效应穿过肿瘤血管内皮间隙达到肿瘤细胞周围(被动靶向)，而在靶向组，纳米粒除了被动靶向，还可通过叶酸的靶向作用而主动结合与细胞表面并进而被吞噬，即主动靶向。该实验证明，通过主动靶向和被动靶向两种方式而沉积到肿瘤细胞周围的纳米粒数量远多于单纯经被动靶向而沉积的纳米粒。实验结果显示，30分钟时肿瘤处荧光范围较小，1小时后肿瘤处荧光的强度和范围逐渐增大，2小时达到最大，说明2小时肿瘤局部沉积的纳米粒远多于之前的时间。而从6小时开始，随着血液循环内的纳米粒的减少和肿瘤局部纳米粒的不断代谢消耗，致使局部荧光强度和范围不断减小。

四、FCNPI/pDNA纳米造影剂体内外超声/光声双模态显像研究

光致相变(ODV)是一种触使液态氟碳纳米粒发生液气相变的新方法。将吸光物质(光吸收子)与液态氟碳形成的核结合起来制成光致相变型液态氟碳纳米粒，通过激光辐照来诱导纳米粒发生液气相变，而且纳米粒相变为微泡后增强超声的谐波显影将大大增强。本发明中造影剂内部包裹的吲哚菁绿ICG就是一种光吸收子，具有很好的光学稳定性，安全性高、眼科应用毒副作用小，是美国联邦药物管理局批准的唯一人体可用的在近红外范围吸光能力强的染料。

本实验中，体外成像采用凝胶模型，体内成像采用荷瘤裸鼠模型，分为叶酸靶向组FCNPI/pDNA(本发明)，非靶向组CNPI/pDNA和生理盐水组(Saline)观察显像情况。

1、FCNPI/pDNA纳米造影剂体外超声显影研究

将倍增浓度的FCNPI/pDNA(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mg/ml)置入用凝胶(2％)制成的孔洞模型中。以808nm激光仪辐照(1W/cm²,2min)，采用Esaote MyLab90超声诊断仪，使用普通模式和增强模式进行观察，并用DFY软件对增强模式下的回声强度进行测量和分析。

检测结果为：

体外超声实验显示，在激光激发后，随着浓度递增，FCNPI/pDNA在普通模式和增强模式下超声信号均逐渐增强。如图3、表1所示，增强模式下的回声强度随浓度递增呈线性上升。

表1不同浓度FCNPI/pDNA体外增强超声信号值

2、FCNPI/pDNA造影剂体外光声显影研究

将倍增浓度的FCNPI/pDNA(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mg/ml)置入用凝胶(2％)制成的孔洞模型中，利用光声成像仪，以波长为800nm的近红外激光激发，获取上述样品的光声最大范围投射梯度图像(MAP)，并对其光声信号强度进行定量分析。

检测结果为：

如图4、表2所示，在光声仪激光激发，凝胶模块的光声信号随着FCNPI/pDNA浓度的升高呈线性上升。

表2不同浓度FCNPI/pDNA的光声信号值

浓度(mg/ml)	信号强度(a.u)
		0.1	0.40±0.08
0.2	0.60±0.09
		0.3	0.80±0.07
0.4	0.97±0.08
		0.5	1.10±0.08

3、FCNPI/pDNA造影剂体内超声显影研究

取建模成功的15只裸鼠，随机分为3组，每组5只，以1％戊巴比妥钠0.06ml腹腔注射麻醉，然后分别于各组尾静脉注射Saline，CNPI/pDNA，以及FCNPI/pDNA各200ul。在尾静脉注射2小时后，以808nm激光仪辐照(2W/cm²,2min)，采用Esaote MyLab90超声诊断仪，使用灰阶模式和造影模式进行观察，并用DFY软件测量激光激发前后肿瘤区域的回声强度值，比较回声强度的差别。

检测结果为：

如表3，在B-mode显影模式下，Saline组在激光激发前后，肿瘤区域的回声强度未见明显差别，而CNPI/pDNA组和FCNPI/pDNA组具有显著差异。

如表4在增强显影模式下，激发前后，Saline组仍未见显著差别，但CNPI/pDNA和FCNPI/pDNA组回声强度均明显增强。

表3B-mode模式下各组激光辐照前后的回声强度

	辐照前(dB)	辐照后(dB)
			Saline	10.3±2.5	10.7±5.2<sup>#</sup>
CNPI/pDNA	11.0±2.6	23.7±3.1**
			FCNPI/pDNA	10.7±2.5	42.3±3.2**

^#与激光辐照前相比，P>0.05

**与激光辐照前相比，P<0.01

表4增强显影模式下各组激光辐照前后的回声强度

	辐照前(dB)	辐照后(dB)
			Saline	0.6±0.4	0.7±0.3<sup>#</sup>
CNPI/pDNA	0.9±0.5	12.0±1.0**
			FCNPI/pDNA	2.0±0.8	16.2±1.2**

^#与激光辐照前相比，P>0.05

**与激光辐照前相比，P<0.01

4、FCNPI/pDNA纳米造影剂体内光声显影研究

取建模成功的15只裸鼠，随机分为3组，每组5只，以1％戊巴比妥钠0.06ml腹腔注射麻醉，然后分别于各组尾静脉注射Saline，CNPI/pDNA，以及FCNPI/pDNA各200ul。利用光声成像仪，以波长为800nm的近红外激光激发，获取激光辐照前，注射后1h，2h，6h及12h肿瘤区域的Bscan光声图像。

检测结果为：

如表5，对于Saline组，激光辐照前后，光声信号未见明显变化。在注射后的2h内，非靶向组CNPI/pDNA和靶向组FCNPI/pDNA的光声信号都呈现出上升的趋势，2h后开始下降，但各个时间点靶向组的光声信号均比非靶向组更强。

表5各组激光辐照前和辐照后1h，2h，6h和12h的光声信号。

本实验主要对造影剂双模态显像能力进行检测。体外显像实验中，通过对FCNPI/pDNA设置不同的浓度梯度，结果证实了造影剂的聚集效应，随着浓度的升高，均获得更高的超声或光声信号。在体内实验中，通过设置生理盐水组和非靶向组作为对照，结果发现靶向组(本发明)在体内双模态成像中具有绝对的优势，靶向组呈现出最强的超声/光声信号，其次是非靶向组，生理盐水组未见明显信号。此外，在体外及体内超声实验中，应用目前的激光能量分别在体外及体内成功实现PFP相变。值得注意的是，因体内增加的光学吸收及散射，在体内激发PFP相变的能量要求比体外高，尽管如此，整个能量水平仍然非常低(与光热治疗要求的能量水平相比)，同时，也符合美国国立标准协会(ANSI)设立的激光安全的标准。

载基因的靶向纳米造影剂FCNPI/pDNA在体内外均能实现超声/光声双模态显影，具有成为多功能造影剂的潜能。

五、FCNPI/pDNA纳米造影剂在激光作用下基因转染治疗视网膜母细胞瘤的研究

目前RB大多采用手术治疗和化学治疗，但治疗效果均不是很理想。近年来，关于RB的基因治疗成为研究热点，研究表明单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes simplex virusthymidine kinase,HSV-tk)通过基因转染对RB有较好的疗效。激光在透明介质中具有良好的穿透性，在眼病治疗中应用广泛，同时也被证实在合适的参数下，可有效改变细胞膜通透性，从而实现基因转染。本发明将多功能造影剂作为载体，以激光作为促发转染的技术手段，达到治疗的目的。

1、激光辐照FCNPI/pDNA体外基因转染的研究

基于激光的基因转染技术其主要机制是通过显微注射，激光诱导的应力波(LISWs)，和选择性的靶向光吸收颗粒。本发明所制备的靶向纳米造影剂在激光作用下可明显改变细胞膜通透性，提高基因转染效率。由于此过程中涉及因素多，不同条件参数可能对细胞增殖活性产生影响。因此，本实验首先对我们所设置的参数下细胞膜通透性和增殖活性进行观察，再对基因转染效率进行检测，并探讨对细胞周期，细胞凋亡以及对其他蛋白的影响。

本实验使用视网膜母细胞瘤Y79细胞株，分为空白组，单纯质粒组，激光+质粒组，CNPI/pDNA+激光组和FCNPI/pDNA+激光组(本发明+激光组)进行观察。激光参数均为：808nm，2W/cm²，2min。

试验结果为：

(1)不同处理方式对Y79细胞膜通透性及增值活性的影响

1)各组细胞膜通透性的测定

经上述不同处理后，采用PI/FDA法进行检测，显微镜下进行观察，绿色荧光代表细胞活性没有受到影响，细胞为活细胞；红色荧光代表PI染色阳性，一般情况下只有死亡细胞PI染色为阳性，而在此次实验中，由于细胞经激光处理后细胞膜通透性打开，细胞核可呈现出PI染色阳性，故本实验中红色荧光代表死亡细胞或细胞膜通透性打开细胞；黄色荧光代表绿色荧光和红色荧光重叠，即细胞膜通透性打开而细胞活性没有受到影响的细胞FCNPI/pDNA+激光组可见最多显黄色荧光的细胞，其次是CNPI/pDNA+激光组，激光+质粒组也可见到少量显黄色荧光细胞，而空白组和单纯质粒组只有红色荧光与绿色荧光，二者之间几乎没有重叠。

2)各组细胞增殖活力的检测

经激光辐照后，FCNPI/pDNA+激光组增殖活力下降最为明显，但仍在85％以上；其次是CNPI/pDNA+激光组，与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)。激光+质粒组和单纯质粒组的细胞增殖活力与空白组相比未见明显差别。

(2)不同处理方式下基因转染效率的测定

转染后24h细胞中即可见绿色荧光蛋白(GFP)表达，证明TK-GFP转染成功，激光共聚焦显微镜下显绿色荧光。空白组，单纯质粒组和激光+质粒组均未见明显的荧光，CNPI/pDNA+激光组可见较多GFP表达，而FCNPI/pDNA+激光组GFP表达最多。而对各组而言，转染后24h和48h检测所得转染效率未见明显差异。结果如表6。

表6经不同处理后各组转染率

***与空白组相比，P<0.001

^#与激光辐照前相比，P>0.05

(3)不同处理方式对Y79细胞周期和凋亡的影响

1)对细胞周期的影响

处理前后各时期Y79细胞周期G1期(如表7)和S期(如表8)所示。转染后24h，48h和72h，FCNPI/pDNA+激光组中被抑制在G1期的Y79细胞最多，而处于S期的Y79细胞最少。

表7不同时间段各组Y79 cells细胞周期(G1)变化

**与空白组相比，P<0.01

***与空白组相比，P<0.001

表8不同时间段各组Y79 cells细胞周期(S)变化

**与空白组相比，P<0.01

***与空白组相比，P<0.001

2)对细胞凋亡的影响

经各组处理后，FCNPI/pDNA+激光组细胞发生早期凋亡的细胞百分比最多，其次是CNPI/pDNA+激光组，其差异具有统计学意义。单纯质粒组和激光+质粒组的细胞发生早期凋亡的比例和空白对照组相比，未见明显差别。

(4)PCR和蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测结果

PCR结果显示转染后48h，FCNPI/pDNA+激光组TK mRNA表达最高，其次是CNPI/pDNA+激光组，其余三组未见明显差别。且随着TK表达增加，PCNA mRNA表达降低，而caspase-3mRNA增高，证明了TK的表达可以抑制PCNA的表达，而对于caspase-3表达却是促进作用。WB从蛋白水平加以验证，也得到了相似的结论。

本发明中采用的实验参数均来自前期预实验以及实验室长期从事纳米材生物材料研发的经验。本实验中首先证实激光可以改变细胞膜的通透性，FCNPI/pDNA+激光组可见最多细胞膜通透性打开的细胞，其次是CNPI/pDNA+激光组，再次验证本发明所制备的造影剂体外靶向性良好。细胞增殖实验结果表明细胞膜通透性打开越多的细胞，其增殖活性相对较低，但仍高于85％，满足实验要求。后续实验相继表明，转染率越高，抑制在G1期的细胞也越多，发生早期凋亡的细胞也越多，这说明TK-GFP基因对肿瘤细胞的杀伤作用可能是通过诱导早期凋亡来实现的。最后再从RNA和蛋白的层面，进一步证实靶向组(本发明)目标基因TK表达最多，且该基因的表达会抑制PCNA的表达，促进caspase-3的表达，以此实验对肿瘤的治疗效应。本节实验对体内治疗实验奠定了可靠的基础。

2、激光辐照FCNPI/pDNA体内基因治疗RB的研究

本实验采用荷瘤裸鼠模型，每组5只。分为空白组，CNPI/pDNA组，FCNPI/pDNA组，空白+激光组，CNPI/pDNA+激光组，FCNPI/pDNA+激光组观察治疗效应，最后评估整个诊疗系统的安全性。

(1)肿瘤的治疗效果

经不同处理的裸鼠，观察14天后绘制生长曲线如图5所示，FCNPI/pDNA+激光组裸鼠肿瘤抑制率最高，其次是CNPI/pDNA+激光组。空白组，CNPI/pDNA组，FCNPI/pDNA组和空白+激光组均无明显的控制肿瘤生长的作用。

(2)免疫组织化学检查结果

1)细胞增殖及增殖指数：PCNA结果显示，六组裸鼠肿瘤于显微镜下均可见细胞核内黄色颗粒，计算阳性率从而得到增殖指数PI，结果显示FCNPI/pDNA+激光组的增殖指数最低，其次是CNPI/pDNA+激光组。其余四组未见明显差别。

2)细胞凋亡和凋亡指数：TUNEL结果显示，各组肿瘤于显微镜下均可见棕黄色颗粒，计算阳性率得到凋亡指数AI，结果显示FCNPI/pDNA+激光组的凋亡指数最高，其次是CNPI/pDNA+激光组。其余四组未见明显差别。

(3)PCR和WB检测结果

PCR结果显示转染后48h，FCNPI/pDNA+激光组TK mRNA表达最高，其次是CNPI/pDNA+激光组，其余四组未见明显差别。且随着TK表达增加，PCNA mRNA表达降低，而caspase-3mRNA增高，证明了TK的表达可以抑制PCNA的表达，而对于caspase-3表达却是促进作用。WB从蛋白水平加以验证，也得到了相似的结论。

(4)安全性测定

整个治疗过程中以红外成像仪测量裸鼠的皮温变化，同时观察激光辐照的皮肤是否发生灼烧。可见：经激光辐照的各组裸鼠皮肤均完整，未见明显灼烧或坏死。红外检测各组皮温均有所升高，FCNPI/pDNA+激光组裸鼠表面皮温升高最为显著，但最高温度仍未超过41℃，不足以产生光热治疗效应，也不会对组织造成损伤。转染治疗结束后，取出裸鼠体内的心，肝，脾，肺，肾进行病理组织切片。结果显示：各组裸鼠体内的心，肝，脾，肺，肾组织结构未见明显差别。说明我们目前设置的参数条件是安全的。

本试验中，FCNPI/pDNA+激光组肿瘤生长最慢，体积最小，免疫组化显示该组肿瘤细胞增殖最少而凋亡最多，PCR和WB的结果也进一步证实TK基因的表达最为显著，对PCNA的抑制和caspase-3的促进最为明显。其次是CNPI/pDNA+激光组，此组也体现出来一定的治疗效应，但因缺乏叶酸的靶向作用，与靶向组相比明显减弱。FCNPI/pDNA组和CNPI/pDNA组因没有激光的作用，无法实现基因转染。空白+激光组也没有表现出任何治疗效应，进一步说明发挥治疗作用的是TK-GFP基因。最后的安全性检测表明在整个治疗过程中设置的激光参数既能实现有效的基因转染，也不会产生其他副作用，当前的基因转染治疗系统是安全有效的。

因此，本发明研制的一种载基因的多功能造影剂FCNPI/pDNA在激光的作用下，可通过主动及被动靶向作用到达并结合于Y79细胞周围，不仅能够实现视网膜母细胞瘤的超声/光声双模态显像，同时还有良好的基因治疗效果。

Claims (9)

1.一种载基因的多功能造影剂，包括脂质壳膜,其特征在于：脂质壳膜上修饰有叶酸，脂质壳膜表面带有正电荷，且携载有基因；所述的脂质壳膜内部包裹有液态氟碳和吲哚菁绿；所述基因为单纯疱疹病毒胸苷激酶基因；

所述多功能造影剂由如下方法制备：

1)、溶解：先将二棕榈酰磷脂酰胆碱、叶酸修饰的聚乙二醇-(2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和Dc-胆固醇按照质量比5:2:2用有机溶剂溶解；

2)、旋转蒸发：于旋转蒸发仪进行减压旋转蒸发除去有机溶剂；

3)、超声清洗：再置于超声波清洗剂中清洗振荡；

4)、乳化：在冰浴条件下，经过两次乳化；

5)、离心分离：离心分离后置4℃冰箱，得到乳化液；

6)、质粒连接：与所需要携载的基因质粒与离心分离后的乳化液在冰浴条件下孵育，24h后再离心分离，得到样品；

所述步骤4)的两次乳化的第一次乳化时，加入液态氟碳和吲哚菁绿；

所述步骤1)中的溶解温度为50℃；

所述步骤2)中的旋转蒸发仪的转速为80rpm，时间为2小时；

所述步骤4)中乳化采用声振仪乳化,全程冰浴，且功率为100w，时间为6min；声振仪采用间断声振的方式；

所述步骤5)中离心分离的温度为4℃，转速为8000rpm，时间为5min,共离心三次。

2.根据权利要求1所述的一种载基因的多功能造影剂，其特征在于：其粒径为380.1±5.9nm，粒径多分散指数PDI为0.149。

3.根据权利要求2所述的一种载基因的多功能造影剂，其特征在于：其ZETA电位为13.4±1.4mV。

4.根据权利要求3所述的一种载基因的多功能造影剂，其特征在于：其吲哚菁绿包封率为92.1±1.3％。

5.根据权利要求1所述的一种载基因的多功能造影剂的制备方法，其特征在于：采用旋转蒸发-超声法。

6.根据权利要求5所述的一种用于制作载基因的多功能造影剂的制备方法，其特征在于：旋转蒸发-超声法的操作步骤如下：

1)、溶解：先将二棕榈酰磷脂酰胆碱、叶酸修饰的聚乙二醇-(2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和Dc-胆固醇用有机溶剂溶解；

2)、旋转蒸发：于旋转蒸发仪进行减压旋转蒸发除去有机溶剂；

3)、超声清洗：再置于超声波清洗剂中清洗振荡；

4)、乳化：在冰浴条件下，经过两次乳化；

5)、离心分离：离心分离后置4℃冰箱，得到乳化液；

6)、质粒连接：与所需要携载的基因质粒与离心分离后的乳化液在冰浴条件下孵育，24h后再离心分离，得到样品。

7.根据权利要求6所述的一种用于制作载基因的多功能造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤4)的两次乳化的第一次乳化时，加入液态氟碳和吲哚菁绿。

8.根据权利要求7所述的一种用于制作载基因的多功能造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的溶解温度为50℃；

所述步骤2)中的旋转蒸发仪的转速为80rpm，时间为2小时；

所述步骤4)中乳化采用声振仪乳化,全程冰浴，且功率为100w，时间为6min；

所述步骤5)中离心分离的温度为4℃，转速为8000rpm，时间为5min,共离心三次。

9.根据权利要求8所述的一种用于制作载基因的多功能造影剂的制备方法，其特征在于：步骤4)中声振仪采用间断声振的方式。

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