CN104083779B - 近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂,制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类新型的近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂，涉及这类造影剂的合成方法，以及其在作为肿瘤引流淋巴结示踪方面的用途。近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂的结构式如图所示。本发明所述的近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂其特点是将亲淋巴结特异性配体和波长较长(750‑900nm)的近红外荧光染料组装到超声造影剂中，使造影剂能够选择性结合于肿瘤相关淋巴结，从而使淋巴结组织得到特异性的“标记”。其不仅实现了近红外光/超声双模式显像，并且取长补短，提供了一种深浅兼顾的示踪肿瘤引流淋巴结的新方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一类新型的近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂的制备方法，以及其在作为肿瘤引流淋巴结示踪方面的用途。
技术背景
淋巴结的无创性检查一直备受关注。在恶性肿瘤的诊断和治疗中，评价肿瘤引流区域内的淋巴结非常重要，直接关系到手术术式及治疗方案的选择。
目前临床常用的寻找肿瘤引流淋巴结的方法包括淋巴闪烁造影以及使用活性蓝染料配合外科解剖。然而前者的空间分辨率较低，且存在放射性污染，故限制了其在临床的广泛应用；后者不仅是有创性检查，并且只能显示视野表面的染色淋巴结，对较深在的淋巴结无法显示，因此也存在较大的局限性。
近年来，超声微泡类造影剂及其靶向技术已经在分子显像与靶向治疗领域取得了诸多研究成果。携带淋巴结特异性配体的超声造影剂经皮下注射后能够被淋巴结中的巨噬细胞选择性吞噬，从而使造影剂在引流淋巴结内停留足够长时间(sonazoid，GE公司)，有利于术中超声扫描识别前哨淋巴结，并且能够显示充盈缺损的微小转移灶。虽然淋巴结靶向超声造影剂有着较高的敏感性，但是很多研究也指出其在寻找淋巴结时需要依据解剖特点行大范围扫查，从而增加了定位的难度；而且对于极表浅的如位于皮下的淋巴结或进入胸腔的淋巴结则因为超声技术的限制无法显像(J Ultrasound Med.2005；24：953-965)。
荧光成像是分子生物学和医学研究极为重要的手段。其中近红外区域(波长600～900nm)生物分子的光吸收最低，而自发荧光最弱，大量的红外光可 以穿过组织和皮肤而被检测到。因此，其波长范围被认为是光学成像的“诊断窗”。其独特优势为：①敏感性高；②可通过不同荧光探针的设计实现各种肿瘤的靶向性成像；③可提供实时动态的肿瘤活体成像。近几年经皮下注射近红外荧光染料吲哚氰绿行活体荧光成像寻找前哨淋巴结在国内外已有应用，因其使用方便、成像快速且持续时间长而受到外科医生的重视。但是近红外染料受限于成像深度(不超过1cm)，从而影响了在显示深部淋巴结中的应用(AnnThoracSurg.2013Jan；95(1)：312-318)。
综上所述单一成像模式的造影剂已经不能满足临床诊断的需要。基于以上考虑，我们开发出了一种新型的近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂，其特点是将亲淋巴结特异性配体和波长较长(750-900nm)的近红外荧光染料组装到超声造影剂表面，使造影剂能够选择性结合于肿瘤相关淋巴结，从而使淋巴结组织得到特异性的“标记”。其不仅实现了近红外光/超声双模式显像，并且取长补短，提供了一种深浅兼顾的示踪肿瘤引流淋巴结的新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一类近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂。
本发明的另一目的是提供上述近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂的制备方法。
本发明的目的还在于提供一种上述近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂的用途，该类物质可用于肿瘤引流淋巴结的示踪。
本发明所述的近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂的结构如图1所示。
本发明的技术方案是采用超声乳化法结合冷冻干燥技术，该造影剂包括在近红外光区域具有强吸收的染料、氟碳类化合物以及对前哨淋巴结组织具有特 异亲和性的物质；该微泡的壳层是由表面活性剂单分子层构成，微泡内包载氟碳类化合物，近红外染料包埋在微泡膜内或共价键连于微泡表面。
其中所述近红外染料首选具有生物相容性和生物安全性的吲哚菁绿及其衍生物。其结合方式包括：物理结合如通过吸附(如：静电、弱作用力等)、混合、相嵌、填入、包覆、包埋、相嵌、粘附等；化学结合如配位、键合等。如将吲哚菁绿及其衍生物包埋于造影剂的表面壳层中，同时将磷脂酰丝氨酸等靶向分子组装到该壳层中。所述的超声造影剂由成膜材料包裹气体、液体或者固体所构成，所述微泡造影剂的粒径范围为300nm-7um。所述的成膜材料为具有良好生物安全性、生物相容性和生物可降解性的成膜材料；所述成膜材料包裹的材料包括气体、液体或纳米级生物相容性固体。
为了实现上述目的，本发明所述的一种用于淋巴结靶向近红外光/超声双模式微泡造影剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将表面活性剂、乳化剂和特异性靶向材料溶于氯仿溶液中，并加入0％-5％的棕榈酸和0.5％-10％近红外荧光染料，旋干溶剂形成薄膜；
2)往上述体系中加入5-10mmol的半乳糖或者蔗糖，用30ml PBS缓冲液溶解，置于40-60°水浴超声仪中超声30-50分钟；
3)将上述步骤2中所得混悬液转移至烧杯中，再往其中加入特定量的内包材料，使用超声波细胞破碎仪的1/2”探头以最大输出功率连续处理3-5min；
4)将上述步骤3中所得混悬液收集于分液漏斗中，分离提纯后得到近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂。
在步骤1)中，所述的表面活性剂选自单月桂酸酯(Tween20，Tween21，Span20)、单棕榈酸酯(Tween40，span40)、单硬脂酸酯(Tween60，Tween61， Span60)、三硬脂酸酯(Tween65，span65)、单油酸酯(Tween80，Tween81，Span80)和三油酸酯(Tween85，Span85)。所述乳化剂为Span80或Span60或聚乙二醇40s。所述的特异性靶向材料选自抗体/受体、磷脂酰丝氨酸、蛋白质、多肽、氨基酸、适配子、寡核昔酸、维生素B、叶酸、甘草酸等。
在步骤3)中，所述的内包材料所采用的气体选自空气、氮气、二氧化碳、氟碳烃气体，所述的内包材料所采用的液体选自C5-C12氟碳烃。
本发明由于能够综合荧光和超声两种成像模式而产生的积极效果是：使用时将本发明的造影剂通过局部或静脉系统给药，该造影剂能特异靶向前哨淋巴结组织，可同时增强靶组织的超声和光学成像效果，提高造影剂检测的灵敏度和准确度，具有广阔的实际应用前景。
附图说明
图1是本发明所描述的造影剂的结构图，其中1代表内包材料，2代表表面活性剂壳层，3代表特异性靶向基团；图2是具体实施例1合成的化合物水溶液的粒径分布图；图3是具体实施例5体外实验的超声造影图像；图4是具体实施例6动物体内腘窝淋巴结超声造影图像；图5是具体实施例7动物体内近红外荧光成像图像。
具体实施方式
通过以下具体实施方式将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例1
将2mmol磷脂酰丝氨酸、1mmol聚乙二醇40s和9mmol山梨醇酐单硬脂酸酯溶于氯仿溶液中，并加入0.1％的棕榈酸和0.5％吲哚菁绿，旋干溶剂，再加入5-10mmol的半乳糖，用30ml PBS缓冲液溶解，置于60°水浴超声仪中 超声30分钟；将上述混悬液转移至烧杯中，以恒定速度通入全氟丙烷、全氟丁烷气体、空气、氮气等，使用超声波细胞破碎仪的1/2”探头以最大输出功率连续处理3min；所得混悬液收集于分液漏斗中，分离提纯后得到近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂。具体粒径如附图2所示。
实施例2
将2mmol磷脂酰丝氨酸、1mmol聚乙二醇40s和9mmol山梨醇酐单硬脂酸酯溶于氯仿溶液中，并加入0.1％的棕榈酸和0.5％吲哚菁绿，旋干溶剂，再加入5-10mmol的化合物蔗糖，用30ml PBS缓冲液溶解，置于60°水浴超声仪中超声30分钟；将上述混悬液转移至烧杯中，以恒定速度通入全氟丙烷、全氟丁烷气体、空气、氮气等，使用超声波细胞破碎仪的1/2”探头以最大输出功率连续处理3min；所得混悬液收集于分液漏斗中，分离提纯后得到近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂。
实施例3
将一定量的磷脂酰丝氨酸溶于氯仿溶液中，并加入0.1％的棕榈酸和0.5％吲哚菁绿，旋干溶剂后加入半乳糖，保证半乳糖和磷脂酰丝氨酸的摩尔比为3～2∶1，使用30ml PBS缓冲液溶解，置于60°水浴超声仪中30分钟；将上述混悬液转移至烧杯中，以恒定速度通入全氟丙烷、全氟丁烷气体、空气、氮气等，使用超声波细胞破碎仪的1/2”探头以最大输出功率连续处理3min；所得混悬液收集于分液漏斗中，分离提纯后得到近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂。
实施例4
将一定量的磷脂酰丝氨酸溶于氯仿溶液中，并加入0.1％的棕榈酸和0.5％ 吲哚菁绿，旋干溶剂后加入蔗糖，保证半乳糖和磷脂酰丝氨酸的摩尔比为3～2∶1，使用30mlPBS缓冲液溶解，置于60°水浴超声仪中30分钟；将上述混悬液转移至烧杯中，以恒定速度通入全氟丙烷、全氟丁烷气体、空气、氮气等气体，使用超声波细胞破碎仪的1/2”探头以最大输出功率连续处理3min；所得混悬液收集于分液漏斗中，分离提纯后得到近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂。
实施例5
将2mmol磷脂酰丝氨酸、1mmol聚乙二醇40s和9mmol山梨醇酐单硬脂酸酯溶于氯仿溶液中，并加入0.5％吲哚菁绿，旋干溶剂后用30ml PBS缓冲液溶解，置于60°水浴超声仪中超声30分钟；将上述混悬液转移至烧杯中，以恒定速度通入全氟丙烷、全氟丁烷气体、空气、氮气等气体，使用超声波细胞破碎仪的1/2”探头以最大输出功率连续处理3min；所得混悬液收集于分液漏斗中，分离提纯后得到近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂。
实施例6
将实施例1-5中获得的近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂与生理盐水按体积比1∶2配置后注入乳胶管中，在水槽中放入500ml超声脱气水，将上述乳胶管置于液体中部，使用超声诊断仪PIH模式(反向脉冲谐波成像)，MI：0.06(机械指数)，探头频率：5-12MHZ，观察微泡体外超声造影效果。体外超声造影图像见附图3所示。
实施例7
正常新西兰大白兔以乌拉坦(4ml/kg)经耳缘静脉麻醉后备皮(自足底至腹股沟)，在足垫处注射0.25ml上述实施例1-5中获得的近红外光/超声双模式 淋巴结靶向造影剂，使用频率9-12MHZ探头观察腘窝淋巴结及流入淋巴管的显影情况，储存动态图像并测量大小。体内超声造影图像见附图4示。
实施例8
正常新西兰大白兔以乌拉坦(4ml/kg)经耳缘静脉麻醉后备皮(自足底至腹股沟)，在足垫处注射0.25ml上述实施例1-5中获得的近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂，使用近红外活体荧光仪(激发波长700nm以上，吸收波长700nm以上)观察，范围自足底至腘窝，储存图像并记录淋巴管及淋巴结数量。体内活体荧光成像图像如附图5示。
Claims (5)
1.一种用于淋巴结靶向近红外光/超声双模式微泡造影剂，其特征在于该造影剂是：包括在近红外光区域具有强吸收的染料、各类惰性物质以及对淋巴结组织具有特异亲和性的物质；该微泡的壳层是由脂质单分子层构成，微泡内包载惰性气体，近红外染料包埋在微泡膜内或共价键连于微泡表面；
所述近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂由包括以下步骤的制备方法制备：
l)将表面活性剂、乳化剂和特异性靶向材料溶于氯仿溶液中，并加入0％-5％的棕榈酸和0.5％-10％近红外荧光染料，旋干溶剂形成薄膜；
2)往上述体系中加入5-10mmol的半乳糖或者蔗糖，用30ml PBS缓冲液溶解，置于40-60℃水浴超声仪中超声30-50分钟；
3)将上述混悬液转移至烧杯中，再往其中加入特定量的内包材料，使用超声波细胞破碎仪的1/2探头以最大输出功率连续处理3-5min；
4)所得混悬液收集于分液漏斗中，分离提纯后得到近红外光/超声双模式淋巴结靶向造影剂；
所述特异性靶向材料为磷脂酰丝氨酸、抗体/受体、磷脂酰丝氨酸、蛋白质、多肽、氨基酸、适配子、寡核苷酸、维生素B、叶酸或甘草酸；
所述的表面活性剂选自单月桂酸酯、单棕榈酸酯、三硬脂酸酯、单油酸酯和三油酸酯；
所述乳化剂为Span80或Span60或聚乙二醇40s。
2.根据权利要求1所述的一种用于淋巴结靶向近红外光/超声双模式微泡造影剂，其特征在于所述近红外染料首选具有生物相容性和生物安全性的吲哚菁绿及其衍生物，所述的染料与微泡造影剂的结合方式包括：物理结合和化学 结合。
3.根据权利要求1所述的一种用于淋巴结靶向近红外光/超声双模式微泡造影剂，其特征在于所述的超声造影剂由成膜材料包裹气体、液体或者固体所构成，所述微泡造影剂的粒径范围为300nm-7um。
4.根据权利要求3所述的一种用于淋巴结靶向近红外光/超声双模式微泡造影剂，其特征在于所述的成膜材料为具有良好生物安全性、生物相容性和生物可降解性的成膜材料；所述成膜材料包裹的材料包括气体、液体或纳米级生物相容性固体。
5.根据权利要求1所述的一种用于淋巴结靶向近红外光/超声双模式微泡造影剂，其特征在于步骤3)中所述的内包材料所采用的气体选自空气、氮气、二氧化碳、氟碳烃气体，所述的内包材料所采用的液体选自C5-C12氟碳烃。
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