CN105997879B - 一种pH与温度双重敏感性的纳米囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于高分子化学和生物医学工程领域，具体公开了一种pH与温度双重敏感性的聚合物，所述聚合物由亲水段聚乙二醇段和疏水段聚(天冬氨酸‑二乙基乙二胺‑co‑组胺‑co‑二异丙基乙二胺)段构成；所述亲水段和疏水段的比例为1：10～1：12。所述pH与温度双重敏感性的聚合物可用于制备负载亲水性抗肿瘤药物或/和超声造影剂的纳米囊泡，该囊泡能用于制备肿瘤诊断药物或肿瘤治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及高分子化学和生物医学工程领域，具体地，涉及一种pH与温度双重敏感性的聚合物纳米囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
在医学领域之中，癌症作为一类复杂的疾病模型，随着研究者们对材料化学和纳米医学的探索研究，纳米载体的长期创新发展已经彻底改变了癌症的诊断与治疗的方式。这也反过来也促进了许多新型的依托于癌症的诊断与治疗的纳米载体的设计与发展。尤其是响应于肿瘤微环境的刺激敏感型的纳米载体层出不穷，由原来的单功能性纳米载体逐渐发展为双重或多重响应型纳米载体，后来多重响应型多重功能的纳米载体逐渐受到研究者们的追捧。这使得癌症的诊断与治疗更加小型化、更加方便、灵敏和准确，这在科研方面和临床方面都具有重要的研究意义。
随着纳米输送体系的发展，由于能够在特定的靶点和特定的时间释放所负载的药物，刺激响应型纳米载体用于癌症的治疗越来越受到人们的欢迎。这类纳米载体以病变部位作为靶点，响应于局部刺激释放药物，大大地增加了局部治疗药物的浓度，改善了治疗的效果。众所周知，肿瘤组织相对于正常组织来说，在实体肿瘤和炎症部位具有较低的pH值和较高的温度，同时这些组织也展现了高浓度的谷胱甘肽和区别于正常组织的特殊的各种酶的过表达等。这些局限于肿瘤组织内部的刺激因素我们称之为内在刺激。相似的，一些刺激被外部诱导促进负载药物的释放，比如局部的加热、超声或者近红外光照射，这一类的刺激被称之为外在刺激。这些内部和外部的刺激作为敏感型纳米载体的靶点，可以被用于癌症的靶向治疗。
众所周知，肿瘤组织特殊的微环境与正常组织的pH有很大差异，其中在正常组织细胞外pH为7.4，细胞内pH为7.2，血液循环过程中pH为7.4；在肿瘤组织内部细胞外pH为6.5～7.2，早期内涵体pH为6.0～6.5，晚期内涵体pH为5.0～6.0，溶酶体的pH为4.5～5.0。目前，利用肿瘤特殊的pH响应性设计应用于肿瘤治疗的敏感型纳米载体是最为常见的。基于对这一点的认识，研究者们通常利用肿瘤特殊的酸敏响应性来设计纳米载体实现肿瘤的靶向。
超声技术由于易实施、成本较低、重复使用的安全性高和同时具有成像和治疗的能力，尤其具有吸引力。然而，超声技术尽管具有以上优点且作为一种成像诊断工具被广泛应用，但是相比其他医学成像工具（例如CT和MRI），超声技术在区分正常组织和病变软组织方面具有相对较低的分辨率和灵敏度，因此在早期癌症检测中具有一定的局限性。但是超声造影剂的引入克服了这种超声波成像的内在限制。包气微泡（氟碳气体）作为最常见的超声造影剂，已经应用于临床实践，其能够增强超声波反向散射的程度，提高了较小的目标区域的成像分辨率和信噪比，在心血管疾病、组织灌注和肿瘤血管生成等常见疾病诊断中得到广泛应用。但包气微泡也存在难以克服的缺陷，比如粒径太大（通常平均直径1～10μm），很难穿过新生血管内皮细胞间隙（尺寸小于700 nm）进入靶向组织内部，故不能在靶向组织内部实施超声造影。正因为如此，包气微泡的主要作用仅限于血管内的成像和诊断，这使得研究人员不得不去探索研究新型的纳米级超声造影剂。纳米粒子通过EPR效应在肿瘤部位富集的最理想尺寸为200 nm以下，而这一尺寸对于有良好超声响应性的造影剂来说是非常大的挑战。因此，在肿瘤超声造影剂的各种设计中，粒径成为一个非常重要的考虑因素。应用于肿瘤诊疗的纳米级超声造影剂，既要能实现血液长循环并在肿瘤组织富集，又要能在肿瘤组织实施超声造影与药物控释，这是成功实现肿瘤超声诊断与治疗的关键。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种pH与温度双重敏感性的聚合物。
本发明的另一目的在于提供上述pH与温度双重敏感性的聚合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供pH与温度双重敏感性的聚合物在制备负载亲水性抗肿瘤药物或/和超声造影剂的纳米囊泡中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种负载亲水性抗肿瘤药物纳米囊泡。
本发明的另一目的在于提供一种负载超声造影剂的纳米囊泡。
本发明的另一目的在于提供一种负载亲水性抗肿瘤药物和超声造影剂的纳米囊泡。
本发明的另一目的在于提供上述负载亲水性抗肿瘤药物和超声造影剂的纳米囊泡在制备肿瘤诊断药物或肿瘤治疗药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种pH与温度双重敏感性的聚合物，所述聚合物由亲水段聚乙二醇段和疏水段聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-co-组胺-co-二异丙基乙二胺)段构成；所述亲水段和疏水段的比例为1：10 ～1：12。
亲水的PEG段能够延长整个药物载体的血液循环时间，以避免被网状内皮组织系统排泄出去，疏水段PAsp(DEA-co-His-co-DIP)具有良好的链柔顺性、生物相容性和生物可降解性，疏水段具有酸敏响应性，能发生pH值敏感的亲-亲水性的转换。优选地，聚乙二醇段数均分子量为2 kD，聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-co-组胺-co-二异丙基乙二胺)段数均分子量为20～24 kD。
作为优选实施方式，上述pH与温度双重敏感性的聚合物的制备方法，具体包括如下步骤：
S1.以天冬氨酸和苯甲醇为原料制备β-天门冬氨酸苄酯；
S2.以β-天门冬氨酸苄酯为原料，缓慢加入三光气，回流制备得到苄氧羰基天冬氨酸酸酐；
S3.以mPEG-NH2作为引发剂，引发开环聚合苄氧羰基天冬氨酸酸酐得到聚合物mPEG-PBLA；
S4.mPEG-PBLA为原料，依次与二乙基乙二胺、组胺和二异丙基乙二胺进行氨解反应，合成聚合物聚乙二醇-聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-co-组胺-co-二异丙基乙二胺)。
如上所述pH与温度双重敏感性的聚合物在制备负载亲水性抗肿瘤药物或/和超声造影剂的纳米囊泡中的应用。
一种负载亲水性抗肿瘤药物的纳米囊泡，由以下方法制备得到：将如上所述的聚乙二醇-聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-co-组胺-co-二异丙基乙二胺)溶于无水氯仿中；将溶解有亲水性抗肿瘤药物的少量水在超声作用下加入上述氯仿溶液中，形成初次乳化液；将初次乳化液在同样条件下逐滴滴加到PBS中，超声后形成二次乳化液；将二次乳化液去除氯仿，透析除去未包裹的药物后即得。
本发明在制备负载亲水性抗肿瘤药物的纳米囊泡时，以聚合物和亲水性药物为材料，在pH值为10的条件下，聚合物自组装形成中间层交联的纳米囊泡，然后将pH调至7.4，形成最终包载亲水性抗肿瘤药物的载药纳米囊泡。在自组装过程中，PAsp(DEA-CO-His-CO-DIP)段自发地形成囊泡的亲水性外壳，PEG段位于该壳的外表面，其内部含有亲水性抗肿瘤药物。
一种负载超声造影剂的纳米囊泡，由以下方法制备得到：将如上所述的聚乙二醇-聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-co-组胺-co-二异丙基乙二胺)溶于无水氯仿中；将少量水在超声作用下加入上述氯仿溶液中，形成初次乳化液；将初次乳化液在同样条件下逐滴加到PBS中，超声后形成二次乳化液；将二次乳化液去除氯仿，过滤即得空纳米囊泡溶液；调节空纳米囊泡溶液的pH至6.8，加入少量异丙醇混合均匀；在上述溶液中添加超声造影剂，震荡过夜；再加入pH 6.8的PBS水溶液震荡30min，静止分层后取水层溶液，用pH 7.4 的PBS溶液透析，过滤后即得。
研究发现许多静脉注射的负载氟碳气体的超声造影剂，由于体内肺部换气和血压改变等原因，在血液循环过程中非常不稳定，容易造成超声造影剂的粒径变大甚至外壳的破裂，致使所负载的药物泄漏渗透到正常组织造成毒性，这也限制了其在临床应用的潜力。正因为如此，负载氟碳液体的超声造影剂深受研究者们喜爱。由于负载在载体内部的氟碳液体非常稳定，在血液循环时不会对纳米载体结构造成影响。但当温度达到氟碳液体的沸点时，液体发生气化，致使载体纳米粒子发生膨胀，此时在靶向部位施加超声辐照，载体内部压力增大，胀破载体外壳产生“空化效应”，这不仅能够用于超声成像而且还能实现药物控释的目的。这种采用相变模式（液体转变为气体）设计的超声造影剂已然受到越来越多的关注。但是，现有技术均是使用双乳化自组装的方法将液体氟碳包裹在空腔内，而本发明是使用液体置换法将液体氟碳负载在纳米囊泡中。
一种负载亲水性抗肿瘤药物和超声造影剂的纳米囊泡，由以下方法制备得到：将如上所述的聚乙二醇-聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-co-组胺-co-二异丙基乙二胺)溶于无水氯仿中；将溶解有亲水性抗肿瘤药物的少量水在超声作用下加入上述氯仿溶液中，形成初次乳化液；将初次乳化液在同样条件下逐滴滴加到PBS中，超声后形成二次乳化液；将二次乳化液去除氯仿，透析除去未包裹的药物后即得负载亲水性抗肿瘤药物的纳米囊泡溶液； 调节负载亲水性抗肿瘤药物的纳米囊泡溶液的pH至6.8，加入少量异丙醇混合均匀；在上述溶液中添加超声造影剂，震荡过夜；再加入pH 6.8的PBS水溶液震荡30min，静止分层后取水层溶液，用pH 7.4 的PBS溶液透析，过滤后即得。
优选地，所述超声造影剂为全氟戊烷(PFP)或五氟丁烷（PFB）。
优选地，所述亲水性抗肿瘤药物为阿霉素。
如上所述的负载亲水性抗肿瘤药物和超声造影剂的纳米囊泡在制备肿瘤诊断药物和/或肿瘤治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种pH与温度双重敏感性的聚合物，所述聚合物用于制备负载亲水性抗肿瘤药物或/和超声造影剂的纳米囊泡，所述纳米囊泡平均粒径为175 nm，该纳米囊泡由聚乙二醇与聚天冬氨酸的两亲性共聚物制成，PEG作为亲水段能够延长载药囊泡的血液循环时间，而聚天冬氨酸作为疏水段则具有合适的链柔顺度和优良的生物活性，有利于在体内的血液循环和肿瘤组织渗透。该纳米囊泡具有肿瘤微环境特殊的酸敏性，能够在pH6.8时囊泡粒径发生膨胀，增大到具有很好超声响应性的尺寸。该纳米囊泡由于负载了液体氟碳，当升温达到氟碳的沸点时，氟碳发生气化也使囊泡膨胀粒径增大到具有很好超声响应性的尺寸。由于上述纳米囊泡具有酸敏性和负载液体氟碳，可使纳米囊泡粒径处在很好超声响应性的尺寸，此时施加超声辐照会检测到良好的超声成像信号，同时可以释放出负载的药物用于肿瘤的治疗，低频超声还可以增加药物的深层组织渗透，在肿瘤深处发挥治疗作用。
附图说明
图1. 聚合物PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)的核磁谱图。
图2. 负载阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)囊泡在pH 7.4条件下的动态光散射柱状图。
图3. 负载阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)囊泡在pH 6.8条件下的动态光散射柱状图。
图4. 负载阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)囊泡在pH 7.4 + 45 °C条件下的动态光散射柱状图。
图5. 负载阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)囊泡在pH 6.8 + 45 °C条件下的动态光散射柱状图。
图6. 负载阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)囊泡热失重分析图；
图7. 负载阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)囊泡阿霉素的荧光敏感释放曲线。
图8. 负载阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)囊泡阿霉素的体外释放曲线。
图9. 负载阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)囊泡血清稳定性图。
图10. 负载阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)囊泡体外能量多普勒图像。
图11. 负载阿霉素和PFP的PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)囊泡在老鼠体内对肿瘤的治疗效果的实验结果分析。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规分子生物学方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1 聚合物PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)的制备
1、β-天门冬氨酸苄酯的合成，反应机理及反应过程如下：
首先准备单口烧瓶（500 mL），添加100 mL无水乙醚后，再缓慢滴加10 mL浓H2SO4(98%)，边滴加边剧烈搅拌，等冷却至室温后，加入100 mL苯甲醇，充分搅拌后，用旋转蒸发仪旋蒸掉乙醚。然后分3次加天冬氨酸共13.3 g至反应瓶中。室温均匀搅拌反应24 h，再加入200 mL 95%乙醇，并用滴液漏斗逐滴加入50 mL吡啶，边滴边剧烈搅拌。然后经冰箱冷冻过夜，抽虑后的固体，80℃下搅拌溶解后，热过滤，滤液冷藏过夜。抽虑，按上述步骤重结晶2次，冻干后得到纯净的β-天门冬氨酸苄酯（。
2、苄氧羰基天冬氨酸酸酐（BLA-NCA）的合成，反应机理及反应过程如下：
首先将500 mL的两口瓶抽真空通氩气来除水除氧，然后添加4.5 g的天冬氨酸苄酯，在氩气环境中加入300 mL 新蒸的无水乙酸乙酯，90℃下回流30 min。然后用恒压滴液漏斗将60 mL溶有2.7 g三光气的新蒸乙酸乙酯缓慢滴加入，90℃继续回流直到溶液变澄清。溶液变清后，利用冰盐浴将反应溶液快速冷却（30 min），然后用冷的饱和碳酸氢钠溶液快速洗涤3次，接着萃取液用冷的饱和氯化钠溶液快速洗涤2次，再萃取分液，最后将乙酸乙酯溶液用适量无水硫酸镁室温干燥30 min。过滤，滤液经浓缩后，用新蒸的无水石油醚沉淀。冷冻抽滤所得白色沉淀，用乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行重结晶，最终得到白色针状晶体。
3、聚合物PEG-PBLA的合成，反应机理及反应过程如下：
首先取50 mL的反应瓶加入0.6 g的mPEG-NH2，在70℃油浴下抽真空干燥6 h后，待冷却至室温后加入30 mL无水CH2Cl2搅拌溶解均匀。然后加入5mL溶有4.5g BLA-NCA的无水DMF溶液至上述反应瓶中，在磁力搅拌下35℃反应72 h。反应完后CH2Cl2溶液经浓缩后缓慢滴加至大量冷的无水乙醚中沉淀，冷冻后抽滤，干燥得浅黄色固体。
4、聚合物mPEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)的合成，反应机理及反应过程如下：
为了合成最终聚合物mPEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)，取3 g mPEG-PBLA和378mg DEA溶解在盛有15 mL无水DMSO的反应瓶中进行氨解反应，这一反应在35℃的氮气环境下反应24 h。然后将15 mL溶有181 mg 组胺的无水DMSO溶液加入反应瓶，继续反应24 h。最后将2.35 g DIP加入上述反应瓶中，氨解反应继续进行24h后，用甲醇进行透析除杂72 h，经旋转蒸发后得到最终的聚合物mPEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)(产率为66.6%)。
5、聚合物mPEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)的1H-NMR表征：
利用1H-NMR 300MHz仪器检测上述各步反应产物的核磁峰，核磁溶剂均用DMSO- d6 。由于嵌段聚合物本身具有pH敏感响应性，将聚合物mPEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)溶于D2O中，利用氘代DCl调节pH，测试三种pH值下氢化学位移的变化。聚合物PEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)的核磁谱图如图1，3.5 ppm为PEG中的（-OCH 2CH2-），0.95 ppm为DIP上的末端甲基（-CH 3-），1.05 ppm为侧链上DEA的末端甲基峰（-CH 3），6.8 ppm和7.5 ppm分别为侧链上组胺环上（-CHN-和-NHCHN-），这些峰的位置与研究文献报道的一致。通过计算PEG中的亚甲基峰与上述特征峰的积分面积之比，得出聚合物mPEG-PAsp(DEA-CO-His-CO-DIP)中DIP、DEA和His的重复单元数分别为50、20、5。
6、聚合物mPEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)的FITR表征：
先将聚合物通过研钵碾压成超细粉末，再加入少量超细的KBr粉末，两者混合均匀后压片，进行红外扫描。红外光谱分析仪的型号为Nicolet/Nexus 670，背景为空白的KBr。3064 cm-1是仲酰胺N-H对称伸缩振动吸收峰，3282 cm-1是N-H不对称伸缩振动吸收峰；1650cm-1是酰胺键中C=O的伸缩振动吸收峰，1730 cm-1酯键中C=O的伸缩振动吸收峰；746 cm-1和695 cm-1是单取代苯的特征峰，是=C-H面外弯曲振动吸收峰，这些特征说明了氨解反应的成功进行，聚合物mPEG-PAsp(DEA-CO-His-CO-DIP)的成功合成。
实施例2 载药纳米囊泡mPEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)的制备
一种负载亲水性抗肿瘤药物的纳米囊泡，由以下方法制备得到：取实施例1制备的聚合物mPEG-PAsp(DEA-CO-His-CO-DIP)20 mg，用2 mL的无水CHCl3溶解后，在冰浴环境下利用超声将溶解有阿霉素的0.2 mL水逐滴滴入氯仿中，形成第一次乳化液。然后将第一次乳化液在同样条件下逐滴滴加到10 mL PBS (pH 7.4, 0.05 mol/L)中，超声5分钟后形成二次乳化液。然后利用旋蒸除去氯仿，再利用14 KDa的透析袋在pH 7.4的PBS中透析，以除去未包裹的阿霉素。最终囊泡溶液用450 nm的滤头过滤，即得负载阿霉素的纳米囊泡（简称DOX-PPEHD囊泡）。
一种负载超声造影剂的纳米囊泡，由以下方法制备得到：取实施例1制备的聚合物mPEG-PAsp(DEA-CO-His-CO-DIP)20 mg，用2 mL的无水CHCl3溶解后，在冰浴环境下利用超声将0.2 mL水逐滴滴入氯仿中，形成第一次乳化液。然后将第一次乳化液在同样条件下逐滴滴加到10 mL PBS (pH 7.4, 0.05 mol/L)中，超声5分钟后形成二次乳化液。然后利用旋蒸除去氯仿，用450 nm的滤头过滤得空纳米囊泡；
取空纳米囊泡溶液，调节pH至6.8，然后添加到少量异丙醇中混合均匀，在上述溶液基础上添加全氟戊烷（PFP），震荡过夜。再加入10～15 ml、pH 6.8的PBS水溶液继续震荡30min，后静止分层，取水层溶液，在pH 7.4 的PBS溶液透析，过滤后的溶液即为负载全氟戊烷的纳米囊泡（简称PFP-PPEHD囊泡）。
一种负载亲水性抗肿瘤药物和超声造影剂的纳米囊泡，由以下方法制备得到：
取实施例1制备的聚合物mPEG-PAsp(DEA-CO-His-CO-DIP)20 mg，用2 mL的无水CHCl3溶解后，在冰浴环境下利用超声将溶解有阿霉素的0.2 mL水逐滴滴入氯仿中，形成第一次乳化液。然后将第一次乳化液在同样条件下逐滴滴加到10 mL PBS (pH 7.4, 0.05mol/L)中，超声5分钟后形成二次乳化液。然后利用旋蒸除去氯仿，再利用14 KDa的透析袋在pH 7.4的PBS中透析，以除去未包裹的阿霉素。最终囊泡溶液用450 nm的滤头过滤，即得负载阿霉素的纳米囊泡；
取负载阿霉素的纳米囊泡溶液，调节pH至6.8，然后添加到少量异丙醇中混合均匀，在上述溶液基础上添加全氟戊烷，震荡过夜。再加入10～15 ml、pH 6.8的PBS水溶液继续震荡30min，后静止分层，取水层溶液，在pH 7.4 的PBS溶液透析，过滤后的溶液即为同时负载全氟戊烷和阿霉素的纳米囊泡（简称PFP/DOX-PPEHD囊泡）。
PFP/DOX-PPEHD囊泡的特点如下：
所得囊泡的粒径大小采用动态光散射系统进行测量。从动态光散射柱状图可以看出，负载阿霉素和PFP的纳米囊泡的粒径为175 nm，测试结果分别见图2。
如果将囊泡PBS(pH 7.4)溶液的pH值用HCl溶液调至6.8，囊泡会发生膨胀，平均粒径增大至400 nm，采用动态光散射系统进行测量的粒径见图3；如果此时施加低频超声时，囊泡破裂解体，平均粒径为80 nm，采用动态光散射系统进行测量的粒径。
如果将囊泡PBS(pH 7.4)溶液的温度升高至45 °C时，囊泡会发生膨胀，平均粒径也增大至400 nm，采用动态光散射系统进行测量的粒径见图4；如果将囊泡PBS(pH 7.4)溶液的pH值用HCl溶液调至6.8，同时温度升高至45 °C时，囊泡会发生大的膨胀，平均粒径也增大至500 nm，采用动态光散射系统进行测量的粒径见图5；如果此时施加低频超声时，囊泡破裂解体，平均粒径为80 nm，采用动态光散射系统进行测量的粒径。
实施例3载药纳米囊泡mPEG-PAsp(DEA-co-His-co-DIP)的热失重分析
PFP/DOX-PPEHD囊泡经处理后，通过热分析系统Pyrisis-1 (PerkineElmer,USA)，检测囊泡的热失重。我们利用TGA来测定PFP/DOX-PPEHD囊泡的热稳定性，同时我们选取不包载PFP的DOX-PPEHD囊泡作为对照组。如图6所示，PFP/DOX-PPEHD囊泡在40 °C到80 °C之间经历了第一次失重，而DOX-PPEHD囊泡在这一温度段并无此失重发生，这一失重产生的原因是PFP/DOX-PPEHD囊泡中所包载的PFP在此温度段达到了沸点变为气体，逐渐胀破囊泡释放出来。由失重率我们可以计算得出PFP的负载率为3.24 %。在图中我们发现PFP/DOX-PPEHD囊泡和DOX-PPEHD囊泡均有一段从220 °C到300 °C左右之间急剧失重的现象，产生这一现象的原因是两聚合物的PEHD嵌段发生自身的热分解。同时我们通过DLS测量在不同温度下囊泡粒径的变化规律发现当囊泡溶液温度在大于40 °C时，囊泡粒径开始发生变化，随着温度的升高囊泡的粒径逐渐增大，但是当温度升高到50 °C以上粒径增大到一定值时，囊泡粒径不增反降，说明PFP/DOX-PPEHD囊泡所能承受的粒径变化具有一定限度。
实施例4载药纳米囊泡的敏感性荧光释放实验
囊泡溶液在下面九个条件下处理2 h：pH 7.4, pH 6.8, pH 7.4 + 45 ℃, pH6.8 + 45°C, pH 7.4 + LFUS, pH 6.8 + LFUS, pH 7.4 + 45 °C + LFUS, pH 6.8 + 45℃+ LFUS 和 pH 5.0。然后用相同pH的水溶液稀释至5 mL。然后用PerkinElmer PE-LS55(Waltham, USA) 荧光光度计测其每个条件下的阿霉素的荧光光谱。选用485 nm作为激发光，发射光谱选择500 nm-750 nm。随后，我们验证了LFUS时间对释放量的影响实验。LFUS的时间分别采用5 min，10 min，15 min，LFUS过后选用485 nm作为激发光，发射光谱选择500nm-750 nm测量溶液中阿霉素的荧光强度。经过上述TEM和DLS测试验证了PFP/DOX-PPEHD囊泡的温度、pH和超声敏感性之后，我们进一步通过水溶性阿霉素的体外敏感释放实验加以验证，通过测量在各种刺激条件下囊泡水溶液中阿霉素的荧光光谱。正如图7所示，pH 7.4时，由于阿霉素在囊泡内腔聚集产生的荧光淬灭效应，溶液中阿霉素的荧光强度是非常低的。当pH被下调到6.8时，由于囊泡膨胀使粒径增大并未破裂解体，所以溶液中阿霉素的荧光强度虽略有增大但增大幅度很小。而当在这两个pH值下分别添加低频超声（LFUS）辐照时，溶液中阿霉素的荧光强度均有增加；但是LFUS的效果与纳米粒子的粒径关系密切，所以pH 6.8时囊泡粒径增大到400nm以上，超声辐照后囊泡破裂水溶性阿霉素得以释放，故溶液中阿霉素的荧光强度增大幅度非常大，几乎和pH 5.0囊泡完全解体时溶液中阿霉素的荧光强度接近。而pH 7.4的囊泡溶液中施加LFUS所产生的效果很小，所以阿霉素荧光强度增幅较小。从上述结果可以看出，囊泡粒径越大，所以释放量也越大。随后，我们进行了低频超声辐照时间对于阿霉素释放量的影响实验，发现在pH 6.8的溶液中超声时间分别为5 min与15 min时，阿霉素荧光强度无明显差别，说明5 min的LFUS辐照时间足以使PFP/DOX-PPEHD囊泡破裂解体。
实施例5 载药纳米囊泡的药物体外释放
体外实验分为九种条件处理：pH 7.4, pH 6.8, pH 7.4 + 45 ℃, pH 6.8 + 45℃, pH 7.4 + LFUS, pH 6.8 + LFUS, pH 7.4 + 45 °C + LFUS, pH 6.8 + 45℃+ LFUS和 pH 5.0。具体如下，每组5 mL 包含20 mg PFP/DOX-PPEHD囊泡的溶液用1M的HCl调节pH至6.8，根据实验分组需要施加5 min的LFUS后，转移进14 KDa的透析袋在37 °C的摇床内用30 mL相同pH的PBS透析。在一定的时间点，取5 mL透析袋外的溶液，同时补充同样体积的PBS溶液。取出的溶液用紫外分光光度计测量阿霉素在485 nm的吸收强度从而计算溶液中阿霉素的含量。利用预先建立的标准曲线计算出药物释放的累积量，然后根据囊泡中释放药物的百分比与时间绘制释放曲线。从图8可以看出，囊泡粒径越大，所以释放量也越大，这一结果与PFP/DOX-PPEHD 囊泡中阿霉素的敏感荧光释放实验结果相一致。
实施例6 载药纳米囊泡的血清稳定性分析
对于纳米粒子来说，在动物体内应用的前提条件是其本身的血清稳定性要非常好，所以在进行具体的体内实验之前，我们先进行了体外血清稳定性验证实验。如图9所示，PFP/DOX-PPEHD囊泡具有很好的血清稳定性，在含有10% FBS的PBS溶液中PFP/DOX-PPEHD囊泡在96 h的长时间检测中粒径几乎没有发生大的变化，这说明了PFP/DOX-PPEHD囊泡具有很好的血清稳定性，为进一步的体内生物实验提供了可靠的依据。
实施例7 载药纳米囊泡在体外能量多普勒成像
为研究PFP/DOX-PPEHD 囊泡的体内/体外超声显像能力，分别在临床超声扫描仪(Acuson Sequoia 512, Siemens, USA），选择power Doppler 模式（参数：频率10 MHz；增益15 dB；聚焦在模型孔中央；选择模具水平横切面成像）下观察pH 7.4和pH 6.8+45℃条件下超声成像效果。选取浓度5 mg/mL 的PFP/DOX-PPEHD囊泡和对照组DOX-PPEHD囊泡和非酸性敏感PEG-PDLLA囊泡负载PFP与DOX (PFP/DOX-PPDLLA囊泡）分别加入到2% (w/v)琼脂糖凝胶模型中，在相同条件下观察超声成像。体外超声成像使用15L8-w高频线性探头。从图10可以看出，为了验证所设计的 DOX/PFP-PPEHD 囊泡的超声显像能力，我们选择在体外pH7.4和pH 6.8+45℃条件下进行能量多普勒成像的检测。pH 7.4时，PFP/DOX-PPEHD囊泡在能量多普勒模式激发下，只能看到微弱的信号，说明超声成像效果较差；而当pH 下调至6.8时，囊泡的粒径增大，我们在此基础上进一步升温至45°C时会发现能量多普勒成像信号又显著增强，这一结果很好的验证了PFP/DOX-PPEHD囊泡的酸性敏感性和温度敏感性，并且在这些刺激下粒径增大至具有很好超声响应性的尺寸范围。随后我们进行了非酸性敏感囊泡负载PFP（PFP/DOX-PPDLLA组）在两个pH下能量多普勒成像对照试验，由于PFP/DOX-PPDLLA囊泡在两个pH下并且升温45℃未出现效果增强的现象。对照组未负载PFP 的DOX-PPEHD囊泡组几乎检测不到能量多普勒信号，且没有随pH 和温度的改变有信号增强的迹象。
实施例8 载药纳米囊泡在体内对肿瘤的治疗效果考察
取得了良好的体内体外超声成像效果之后，由于PFP/DOX-PPEHD囊泡内包裹了水溶性阿霉素，为研究PFP/DOX-PPEHD囊泡联合LFUS辐照的抗癌疗效，选用C6皮下移植瘤裸鼠模型（开始治疗时肿瘤体积约为50 mm3），并分成5组（各组n=6）：PFP/DOX-PPEHD+LFUS组，PFP/DOX-PPEHD组，DOX-PPEHD+LFUS组， DOX-PPEHD组，以及PBS对照组。五组样品每三天静脉注射一次，DOX剂量为2.5 mg DOX/kg体重，载体溶液体积为100μL，共治疗5次。需要超声辐照协同治疗组注射样品后LFUS(参数如前所述)辐照5 min。PBS对照组小鼠在相同时间点每次注射100 μL的PBS。肿瘤体积隔三天测量一次，计算公式为：体积=0.5×L×W2 (L代表肿瘤长径，W代表肿瘤宽径)。应用Kaplan-Meier 法计算动物生存率。
治疗效果如图11所示，PFP/DOX-PPEHD囊泡施加LFUS组肿瘤体积抑制效果最明显，肿瘤增长缓慢。第30天肿瘤体积为190 ± 60 mm3，较对照组明显更小（PFP/DOX-PPEHD囊泡未施加LFUS组为630 ± 50 mm3，DOX–PPEHD囊泡施加LFUS组为810 ± 50 mm3，DOX–PPEHD囊泡未施加LFUS组为850 ± 45 mm3，PBS对照组为1240 ± 40 mm3，p均小于<0.05）。动物生存率结果也与肿瘤生长抑制结果一致：在第33天，PBS对照组动物已死；而PFP/DOX-PPEHD囊泡加LFUS组生存率最高，在40天以后仍达到87.5%存活。这一结果体现了我们所设计的PFP/DOX-PPEHD囊泡在LFUS的配合下具有良好的肿瘤治疗效果。
Claims (8)
1.一种pH与温度双重敏感性的聚合物，其特征在于，所述聚合物由亲水段聚乙二醇段和疏水段聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-co-组胺-co-二异丙基乙二胺)段构成；所述亲水段和疏水段的比例为1：10 ～1：12；
聚乙二醇段数均分子量为2 kD，聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-co-组胺-co-二异丙基乙二胺)段数均分子量为20～24 kD。
2.权利要求1所述的pH与温度双重敏感性的聚合物的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1.以天冬氨酸和苯甲醇为原料制备β-天门冬氨酸苄酯；
S2.以β-天门冬氨酸苄酯为原料，缓慢加入三光气，回流制备得到苄氧羰基天冬氨酸酸酐；
S3.以mPEG-NH2作为引发剂，引发开环聚合苄氧羰基天冬氨酸酸酐得到聚合物mPEG-PBLA；
S4.mPEG-PBLA为原料，依次与二乙基乙二胺、组胺和二异丙基乙二胺进行氨解反应，合成聚合物聚乙二醇-聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-co-组胺-co-二异丙基乙二胺)。
3.权利要求1所述pH与温度双重敏感性的聚合物在制备负载亲水性抗肿瘤药物或/和超声造影剂的纳米囊泡中的应用。
4.一种负载亲水性抗肿瘤药物的纳米囊泡，其特征在于，由以下方法制备得到：将权利要求1所述的聚合物聚乙二醇-聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-co-组胺-co-二异丙基乙二胺)溶于无水氯仿中；将溶解有亲水性抗肿瘤药物的少量水在超声作用下加入上述氯仿溶液中，形成初次乳化液；将初次乳化液在同样条件下逐滴滴加到PBS中，超声后形成二次乳化液；将二次乳化液去除氯仿，透析除去未包裹的药物后即得；在制备负载亲水性抗肿瘤药物的纳米囊泡时，以聚合物和亲水性抗肿瘤药物为材料，在pH值为10的条件下，聚合物自组装形成中间层交联的纳米囊泡，然后将pH调至7.4，形成最终包载亲水性抗肿瘤药物的载药纳米囊泡。
5.一种负载超声造影剂的纳米囊泡，其特征在于，由以下方法制备得到：
将权利要求1所述的聚乙二醇-聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-co-组胺-co-二异丙基乙二胺)溶于无水氯仿中；将少量水在超声作用下加入上述氯仿溶液中，形成初次乳化液；将初次乳化液在同样条件下逐滴加到PBS中，超声后形成二次乳化液；将二次乳化液去除氯仿，过滤即得空纳米囊泡溶液；
调节空纳米囊泡溶液的pH至6.8，加入少量异丙醇混合均匀；在上述溶液中添加超声造影剂，震荡过夜；再加入pH 6.8的PBS水溶液震荡30min，静止分层后取水层溶液，用pH 7.4的PBS溶液透析，过滤后即得。
6.一种负载亲水性抗肿瘤药物和超声造影剂的纳米囊泡，其特征在于，由以下方法制备得到：
将权利要求1所述的聚乙二醇-聚(天冬氨酸-二乙基乙二胺-co-组胺-co-二异丙基乙二胺)溶于无水氯仿中；将溶解有亲水性抗肿瘤药物的少量水在超声作用下加入上述氯仿溶液中，形成初次乳化液；将初次乳化液在同样条件下逐滴滴加到PBS中，超声后形成二次乳化液；将二次乳化液去除氯仿，透析除去未包裹的药物后即得负载亲水性抗肿瘤药物的纳米囊泡溶液；
调节负载亲水性抗肿瘤药物的纳米囊泡溶液的pH至6.8，加入少量异丙醇混合均匀；在上述溶液中添加超声造影剂，震荡过夜；再加入pH 6.8的PBS水溶液震荡30min，静止分层后取水层溶液，用pH 7.4的PBS溶液透析，过滤后即得。
7.根据权利要求5或6所述的纳米囊泡，其特征在于，所述超声造影剂为全氟戊烷或五氟丁烷。
8.权利要求6所述的纳米囊泡在制备肿瘤诊断药物和/或肿瘤治疗药物中的应用。
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