CN102391517A

CN102391517A - 一种能智能释放药物的纳米胶束及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102391517A
Application number: CN2011102370828A
Authority: CN
Inventors: 帅心涛; 戴箭; 林树东
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2011-08-18
Filing date: 2011-08-18
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2031-08-18
Also published as: CN102391517B

Abstract

本发明公开了一种能智能释放药物的纳米胶束及其制备方法和应用。本发明的纳米胶束成分为聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱氨酸)-聚(天冬氨酸-二异丙基乙二胺)，其制备方法是先合成PEG-PBLA-N₃和PA-PAsp(DIP)，然后以溴化亚铜/五甲基二乙烯基三胺为催化体系，将PEG-PBLA-N₃和PA-PAsp(DIP)进行点击反应合成PEG-PBLA-PAsp(DIP)，再经过2-氨基乙硫醇进行胺解反应，得到最终聚合物PEG-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)。本发明的纳米胶束可以作为疏水性药物载体。本发明的纳米胶束对pH值变化敏感，同时中间交联层的二硫键对还原剂敏感，具有智能释放药物的特点。

Description

一种能智能释放药物的纳米胶束及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于高分子化学和生物医学工程领域，具体涉及一种新型药物载体材料——能智能释放药物的纳米胶束及其制备方法和应用。

背景技术

癌症是危害人类健康的最主要疾病之一。据国际抗癌联盟发布的数据可知，2008年，全球有1270万人得了癌症，死亡达760万人。如果不采取有效措施，预计到2030年，每年将出现2600万新增癌症病例，癌症死亡人数将达1700万。无论在世界范围内，还是在中国，癌症已成为人类第一位死因。所以，发展有效的癌症治疗手段对促进国人健康具有重大意义。

抗癌药物化疗是除手术以外最重要的癌症治疗手段。在癌症的化学疗法中，许多疗效显著的抗癌药物如阿霉素(Doxorubicin, DOX)、紫杉醇(Paclitaxel)等亲水性都很低，很难直接被肌体吸收和利用，而且直接使用对健康组织具有很强的毒副作用，循环时间太短以致不能发挥最佳的疗效，大大地限制了其应用。因此，利用聚合物胶束作为药物载体将其高效准确地传输到病灶部位，是当前的研究热点。但是，一般的纳米载药胶束也有其不足：(

)胶束粒径容易被吞噬，肌体内循环半衰期不长，不能发挥最佳疗效；(

)在生理条件下，胶束不是很稳定，容易解体，造成突释，不能长时间让药物维持在一个稳定有效的浓度；(

)胶束本身的载药量不高，这极大地限制了其作为药物载体的应用。而交联胶束是新兴的研究热点，被认为有助于克服上述缺点，提高胶束稳定性和同时提高载药率。

迄今为止，尽管纳米聚合物胶束在治疗试剂的传输，比如抗癌小分子药物，表现了极大的潜力。特别是已经报道的大部分聚合物纳米胶束都有一种典型的药物释曲线，但这些曲线对药物在肿瘤细胞内的最大优化利用没有起到作用。也就是说，在胶束形成后，通过物理包载的药物在几个小时内达到20~30%的暴释，随后是持续很多天非常慢的药物扩散。这导致了药物储存于胶束中以及胶束在血液的循环中，药物会发生没有目标性的泄漏。由于这些原因，药物不仅难以达到有效的细胞内药物浓度，而且会导致癌细胞的抗药性。因此，发展具有良好药物释放性能的传递系统有很大的作用。最有希望的策略之一是建构一种聚合物纳米胶束，这种胶束能对特殊的刺激产生敏感，比如光照，酶降解，还原，pH值的变化等。酸性触发的药物释放能在肿瘤组织(pH值6.5)或者肿瘤细胞的溶酶体(pH值5.0)中得到实现，采用从带有酸敏嵌段的共聚物组装成的纳米胶束能发生pH值敏感的亲-疏水性的转换。而且，这些酸敏感的纳米胶束在中性条件下不会发生药物泄漏，但仍然会在样品制备完成几小时后发生药物暴释。而且，在血液循环中，当聚合物胶束的浓度逐渐降低至CMC以下时，超分子纳米组装体容易解体，这是药物传输过程中药物损失的另外一个原因。尽管暴释和解体导致游离药物的损失能用药物通过共价键作用于运输载体来克服，不幸的是大多数药物没有可以发生共价作用的活性基团。对比而言，自组装纳米胶束的核或壳共价交联已经出现作为一种灵活的策略来阻止因胶束的降解而导致药物的损失，这不需要药物有任何活性基团。而且, 已经有报道在中性条件下壳交联在减少药物从交联胶束的泄漏的可能性。

在各种途径中，二硫键可逆交联的利用对用于药物控制释放的壳交联胶束的制备特别重要。二硫键是可还原的，因此能通过交换反应被GSH（一种含巯基的多肽）打开。实际上，用含二硫键作为交联剂的壳交联交束已经表现很大的潜力使药物在细胞里的表现特殊的释放。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术的上述不足，提供一种具有药物智能释放，能够先暴释后缓释，提高药物利用效率和治疗效果的药物载体材料——可智能释放药物的纳米胶束。

本发明的另一目的是提供上述纳米胶束的制备方法。

本发明的又一目的是提供上述纳米胶束在作为药物载体中的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种能智能释放药物的纳米胶束，其成分为聚乙二醇-聚（天冬氨酸-半胱氨酸）-聚（天冬氨酸-二异丙基乙二胺），英文简写为PEG-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)。该纳米胶束的疏水段具有酸敏响应性，能发生pH值敏感的亲-疏水性的转换；同时，交联中间层带有二硫键，对还原试剂具有敏感性。

两亲性聚合物PEG-PAsp(MEA)-PAsp(DIP) 中间层带有可交联巯基，该两亲性聚合物的结构中聚乙二醇段的数均分子量为0.2~10KD，聚(天冬氨酸-半胱胺酸)段的数均分子量为0.2~10KD，聚(天冬氨酸-二异丙基乙二胺) 的数均分子量为0.2~10KD。

上述PEG-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)的制备方法步骤如下：用PEG-NH₂为引发剂，引发BLA-NCA合成聚合物PEG-PBLA，然后PEG-PBLA进行溴化反应，合成PEG-PBLA-COCH₂Br，PEG-PBLA-COCH₂Br继续进行叠氮化反应，合成PEG-PBLA-N₃，同时，用丙炔胺作为引发剂引发BLA-NCA合成PA-PBLA，PA-PBLA再与N,N-二异丙基乙二胺进行胺解反应，合成PA-PAsp(DIP)，然后在溴化亚铜/五甲基二乙烯基三胺为催化剂的催化下，将PEG-PBLA-N₃和PA-PAsp(DIP)进行点击反应，合成PEG-PBLA-PAsp(DIP)，将PEG-PBLA-PAsp(DIP)用2-氨基乙硫醇进行胺解反应，合成两亲性聚合物PEG- PAsp(MEA)-PAsp(DIP)。

上述步骤中溴化亚铜/五甲基二乙烯基三胺是溴化亚铜和1,1,4,7,7-五甲基二乙烯基三胺以摩尔比为1:1组成的混合物。

一种负载纳米金的纳米胶束，是通过原位还原法在聚乙二醇-聚（天冬氨酸-半胱氨酸）-聚（天冬氨酸-二异丙基乙二胺）上负载纳米金得到的产物。原位还原法可按本领域常规操作进行。

上述纳米胶束或负载纳米金的纳米胶束可作为疏水性药物的载体，尤其是疏水性抗肿瘤药物，如阿霉素等。

本发明的聚合物PEG-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)纳米胶束由亲水段聚乙二醇（Polyethyeneglycol，可简写为PEG）、中间层聚(天冬氨酸-半胱胺酸) [简写为PAsp(MEA)]的交联层和疏水段聚(天冬氨酸-二异丙基乙二胺) [简写为PAsp(DIP)]构成。其中疏水段PAsp(DIP)具有良好的链柔顺性、生物相容性和生物可降解性；亲水的PEG段能够延长整个药物载体的血液循环时间，以避免被网状内皮组织系统排泄出去。在自组装过程中，PAsp(DIP)段自发地形成胶束的疏水性外壳，PEG段位于该壳的外表面，中间层是二硫键的交联层，其内部含有疏水性抗肿瘤药物（如脱质子化阿霉素，hydrophobic doxorubicin，可简写为DOX）。

本发明的纳米胶束或负载纳米金的纳米胶束作为药物载体与疏水性药物的重量份数比为5~1000:1组成载药纳米胶束。如纳米胶束或负载纳米金的纳米胶束与疏水性抗肿瘤药物可以按照重量份数比为5~1000:1的比例制成载药纳米捆绑凝胶。优选比例为5~20:1。

上述载药纳米胶束的制备方法，步骤如下：

以纳米胶束或负载纳米金的纳米胶束作为药物载体，同疏水性抗肿瘤药物共同作为原料，在pH值为10的条件下自组装形成中间层交联的纳米胶束，然后将pH调至7.4，形成最终包载疏水性抗肿瘤药物的载药纳米胶束。

作为一种优选方案，上述制备方法的步骤为：以5~1000重量份纳米胶束或负载纳米金的纳米胶束和1重量份的疏水性抗肿瘤药物为原料，溶于四氢呋喃（THF）和二甲基亚砜（DMSO）按1:1体积比组成的有机溶剂中，同时加入还原剂，打开交联的二硫键，超声作用下将上述溶液滴加至pH值为10的碳酸盐缓冲溶液中，然后通氧气，这时巯基交联成二硫键，再经过透析除去未包裹的抗肿瘤药物及有机溶剂，然后将溶液pH值调至7.4，即得到最终载药纳米胶束。

上述步骤中，所述还原剂为二硫苏糖醇（简写为DTT）或谷胱甘肽(简写为GSH)等。

上述步骤中，所述有机溶剂体积为原料重量的5~1000倍，还原剂加入量为聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱胺酸)-聚(天冬氨酸-二异丙基乙二胺)的1~1000倍。

本发明中用到的缓冲溶液配方如下：

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH5.0）配制方法: 将浓度为0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液103mL和浓度为0.1mol/L柠檬酸溶液97mL混合，即得。

PBS（磷酸盐缓冲液，pH7.4）的配制方法：称取氯化钠80克，氯化钾2克，十二水合磷酸氢二钠23.13克，磷酸二氢钾2克于1000ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至1000ml，摇均。将所得溶液稀释10倍后使用。

碳酸盐缓冲液（pH 10）配制方法：称取无水碳酸钠63.6克及碳酸氢钠33.6克溶于蒸馏水中稀释至1000ml。

本发明中英文简写的中文全称对应如下：

PEG-NH₂：单甲基醚氨基聚乙二醇；

BLA-NCA：β-天门冬氨酸苄酯N-羧酸酐；

PEG-PBLA：单甲基醚聚乙二醇-聚(天冬氨酸)；

PEG-PBLA-COCH₂Br：端溴代乙酰基单甲基醚聚乙二醇-聚(天冬氨酸)；

PEG-PBLA-N₃：端（乙酰基-叠氮基）单甲基醚聚乙二醇-聚(天冬氨酸)；

PA-PBLA：端丙炔基聚(天冬氨酸)；

PA-PAsp(DIP)：端丙炔基聚(天冬氨酸-二异丙基乙二胺)；

PEG-PBLA-PAsp(DIP)：聚乙二醇-聚(天冬氨酸)-聚(天冬氨酸-二异丙基乙二胺)；

PEG-PBLA(MEA)-PAsp(DIP)：聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱氨酸)-聚(天冬氨酸-二异丙基乙二胺)；

PAsp(DIP)：聚（天冬氨酸-二异丙基乙二胺）；

PAsp(MEA)：聚（天冬氨酸-半胱胺酸）；

PEG-PBLA-COCH₂N₃：与PEG-PBLA-N₃是同一种物质，端（乙酰基-叠氮基）单甲基醚聚乙二醇-聚(天冬氨酸)）

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）该纳米胶束由聚乙二醇与聚天冬氨酸的两亲性共聚物制成，PEG作为亲水段能够延长载药胶束的血液循环时间，而聚天冬氨酸作为疏水段则具有合适的链柔顺度和优良的生物活性。

（2）该纳米胶束的平均粒径仅为59.4nm，有利于在人体内的细胞吸收。

（3）该纳米胶束中间层是一层可逆的二硫键交联层，该交联层能稳定疏水段的作用；交联的巯基（二硫键）能通过还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或者谷胱甘肽(GSH)等打开，即该纳米胶束具有还原敏感性。

（4）该纳米胶树疏水段具有酸敏性，能发生pH值敏感的亲-疏水性的转换。

（5）该纳米胶束能通过原位还原法负载纳米金，得到胶束外层是纳米金修饰的纳米胶束，纳米金能使胶束在细胞中起定位作用。

附图说明

图1. 实施例1中空白纳米胶束的动态光散射抛物线图；

图2. 实施例2中载药纳米胶束的动态光散射抛物线图；

图3. 实施例3中纳米金修饰的纳米胶束的动态光散射抛物线图；

图4. 实施例1中pH5.0条件下膨胀后的胶束动态光散射抛物线图；

图5. 实施例1中pH7.4加DTT打开二硫键后纳米凝胶胶束的动态光散射抛物线图；

图6. 实施例1中空白纳米胶束的透射电子显微镜图片；

图7. 实施例3中纳米金修饰的纳米胶束的透射电子显微镜图片；

图8. 实施例1中pH 5.0条件下膨胀后的胶束的透射电子显微镜图片；

图9. 实施例1中pH 7.4加DTT打开二硫键后纳米凝胶的透射电子显微镜图片；

图10. 实施例1中纳米胶束解体后的透射电子显微镜图片；

图11. 实施例4中DOX的标准曲线；

图12. 实施例5中各种L–半胱氨酸的浓度和相对应的TNB吸光度对应的标准曲线；

图13. 实施例5中各种L–半胱氨酸的浓度和相对应的TNB吸光度对应的拉曼光谱图；

图14. 实施例6载药纳米胶束的药物体外释放曲线；

图15. 实施例7中载药纳米胶束的细胞毒性分析；

图16. 实施例7中空胶束的细胞毒性分析；

图17. 实施例8载药纳米胶束在老鼠体内对肿瘤的治疗效果的实验结果分析。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，实施例中除特殊说明外均为本领域常规步骤。

本发明基于两亲性共聚物PEG-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)的纳米胶束被用于传输疏水性抗肿瘤药物，所得纳米胶束的大小、形状、酸敏粒径、酸敏荧光等基本性能分别采用动态光散射、透射电子显微镜和荧光光度仪等来测定，其对疏水性抗肿瘤药物包负能力的大小则采用紫外可见分光光度计来进行测定，并通过体外吸收试验来检测载药纳米胶束体系的治疗效果。

此外，该载药纳米胶束还通过细胞实验和动物实验来评价这一潜在的传输抗肿瘤药物到肿瘤细胞的体系，即采用人肝癌细胞株（human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells，可简写为Bel-7402）来进行体外的细胞毒性实验，以分别测定空白纳米胶束和负载抗癌药物的纳米胶束（如包附DOX，可简写为DOX-micelles）的细胞毒性。同时，在皮下种有Bel-7402肿瘤细胞的BALB/C 裸鼠上进行载药纳米胶束对肿瘤生长遏制的实验，药物通过静脉注射进入老鼠体内，然后观察随着时间的变化肿瘤体积的变化。

以下实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规实验试剂和操作步骤。实施例中缓冲液以pH值表示，如pH5.0的缓冲液是指磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH7.4的缓冲液为磷酸盐缓冲液PBS，pH 10的缓冲液指碳酸盐缓冲液。

实施例1 纳米胶束PEG-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)的制备

1. 聚合物PEG-PBLA的制备：

该聚合物以PEG-NH₂为引发剂，通过BLA-NCA的开环聚合反应得到。将0.8 g PEG-NH₂（0.4mmol，2000 g/mol）加至100 mL反应瓶中，用50mL无水二氯甲烷溶解。称取1.0 g BLA–NCA（4 mmol，249.22g/mol），加5 mL无水DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解。将溶解的BLA–NCA溶液转入装PEG-NH₂的反应瓶中，于35℃下搅拌反应72h。反应结束后，将反应液滴入过量的冷乙醚（如500ml）中沉淀，经抽滤和无水乙醚的反复洗涤，真空干燥得到最终产物。

2. 聚合物PEG-PBLA-COCH₂Br的制备：

称取0.9 g PEG-PBLA(3025 g/mol，0.3 mmol)于25 mL反应瓶中，用15 mL CHCl₃进行溶解，然后加入0.22 mL三乙胺（101.19 g/mol，0.70 g/mL，1.5 mmol，~5eq）和78 μL溴代乙酰溴（201.86 g/mol，2.317 g/mL，0.9 mmol，~3eq），密封，室温搅拌反应24 h。反应完毕，将反应液在冷乙醚中沉淀，抽滤，真空抽干，得到最终产物。

3. 聚合物PEG-PBLA-N₃的制备：

称取0.9g PEG-PBLA-COCH₂Br(3136 g/mol，0.29 mmol)于25 mL反应瓶中，加入10 mL DMF进行溶解，再往反应瓶中加入0.094 g NaN₃（65.01 g/mol，14.5 mmol，~10eq），室温搅拌反应24 h。反应完毕，反应液用1000 Da透析袋在超纯水中透析。透析完毕，冻干，得到终产物。

4. 聚合物PA-PBLA的制备：

将55μL丙炔胺（0.8mmol，55.08g/mol，0.803/mL）加至100 mL反应瓶中，再加入50mL干燥的CH₂Cl₂，摇匀。用50mL烧杯称取5 g BLA-NCA，加入5mL DMF溶解。然后将DMF溶液滴加到CH₂Cl₂溶液中，然后置于35 ℃下搅拌反应72 h。反应结束后，将混合液滴入过量的冷乙醚（如500mL）中沉淀，经抽滤和无水乙醚的反复洗涤，真空干燥得到最终产物。

5. 聚合物PA-PAsp(DIP)的制备：

称取2.92 g PA-PBLA（2305 g/mol，1.26 mmol）于25 mL的反应管中，加入8 mL 反应级DMF进行溶解。溶解完毕，加入1.1 mL N,N-二异丙基乙二胺（144.26 g/mol，0.83 g/mL，6.33 mmol，~5eq）后，于35 ℃下搅拌反应24 h。反应完毕，反应液装在透析袋(MWCO: 1000 Da)中于无水甲醇中透析除去杂质，得到终产物。

6. 聚合物PEG-PBLA-PAsp(DIP)的制备：

以溴化亚铜/五甲基二乙烯基三胺为催化体系，在40℃下进行PEG-PBLA-COCH₂N₃与PA-PAsp(DIP)的点击反应（click反应）。

称取0.9g PEG-PBLA-COCH₂N₃(3098 g/mol，0.3 mmol)和0.94g PA-PAsp(DIP) (2629 g/mol，0.36 mmol)于25 mL反应管中，加入10 mL DMF溶解，然后再加入1,1,4,7,7-五甲基二乙烯基三胺(0.36 mmol)和溴化亚铜(0.36 mmol)，反应液于40 ℃下搅拌反应48 h。反应完毕，将反应液沉淀于无水冷乙醚中，抽滤，真空抽干，得到终产物。

7. 聚合物PEG-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)的制备：

称取0.8 PEG-PBLA-PAsp(DIP) (5059g/mol，0.16mmol)于10ml反应管，用4 mL DMSO溶解，再加入半胱胺盐酸盐0.036g(113.61g/mol，~2 eq.)和乙三胺(~4 eq.)，于35℃下充分搅拌反应12 h。将反应物在无水甲醇中透析除去杂质。透析完毕，旋干，真空抽干，既得到终产物空白纳米胶束。

8. 胶束PEG-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)的制备：

将10mg 聚合物PEG-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)溶于2ml DMSO中，在超声下滴至20ml PBS(pH7.4)中，将该溶液通氧气2h后，在PBS(pH7.4)中透析2d，得到胶束溶液。

所得胶束的粒径大小采用动态光散射系统进行测量，其形态则通过透射电子显微镜来观察确定，测试结果分别见图1和图6。从透射电子显微镜图片可以明显地看出两亲性聚合物在水溶液中自组装成“实心球”；从动态光散射抛物线图可以看出，空白纳米胶束的粒径为30~100nm，平均粒径为59.4nm。

如果将胶束PBS(pH7.4)溶液的pH值用HCl溶液调至5.0，胶束会发生膨胀，平均粒径增大至269.6nm，采用动态光散射系统进行测量的粒径见图4，其形态则通过透射电子显微镜来观察，结果见图8。因为通过透射电子显微镜测试前，要将胶束溶液滴在铜网上干燥，所以胶束发生脱水，粒径稍微变小，但在图8中可以看到缩小前的水纹。

如果往胶束PBS(pH7.4)溶液中加入10mM的DTT（10倍于聚合物中的巯基）,交联酸敏胶束的交联层中的二硫键打开，胶束的平均粒径增大至544nm, 采用动态光散射系统进行测量的粒径见图5，其形态则通过透射电子显微镜来观察，结果见图9。

如果将胶束PBS(pH7.4)溶液的pH值用HCl溶液调至5.0后，再加入10mM的DTT（10倍于聚合物中的巯基）,胶束会发生解体，其形态则通过透射电子显微镜来观察，结果见图10。

实施例2 载药纳米胶束的制备

5mg PEG-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)聚合物和1mg DOX共溶于THF和DMSO (1mL, v/v=1/1)的混合溶剂中，加入三乙胺调节溶液pH 值到10，同时加入DTT (10 eq 于聚合物) 还原聚合物中存在的二硫键，持续30min。在超声条件下，上述溶液慢慢滴至PBS（pH 7.4）溶液中，所得混合液通氧气2h后，装于透析袋(MWCO: 1000 Da)中，在PBS（pH7.4）溶液中边通氧气边透析2 d，得到载药纳米胶束。

所得载药纳米胶束的粒径大小采用动态光散射系统进行测量，测试结果见图2。从动态光散射抛物线图可以看出，由于疏水性DOX的负载增大了胶束疏水核，载药纳米胶束的平均粒径为83 nm。

实施例3 负载纳米金纳米捆绑凝胶的制备

取1mL实施例1制备的纳米胶束溶液（0.4mg/mL，pH7.4），加入20μL的HauCl₄(1mg/mL)，将pH值调节并维持在7.4，搅拌15min，然后加入20μL羟胺（50wt%），继续搅拌15min，即得。

所得负载纳米金的纳米胶束的粒径大小采用动态光散射系统进行测量，其形态则通过透射电子显微镜来观察确定，测试结果见图3和图7。从动态光散射抛物线图可以看出，纳米金修饰的纳米胶束平均粒径为103.6nm。

实施例4 纳米捆绑凝胶的载药率和包封率的测定

配制一系列DOX浓度的溶液，分别是1、2、5、10、20、50、100μg/mL。通过紫外测量及分析得到DOX的标准曲线，如图11。将冻干的负载样品，溶解在pH值为7.4的PBS缓冲液中，采用紫外可见分光光度计测定该样品溶液在482.5nm处的吸光度。将吸光度值代入标准曲线方程计算得到DOX浓度，由此得出样品中DOX的含量，根据冻干样品容器和冻干后样品的总质量得到干品质量，从而算出载药率与包封率，计算公式如下：

载药率=胶束中DOX的含量/纳米捆绑凝胶的质量×100%

包封率=胶束中DOX的含量/DOX投料量×100%

按照实例2的方法制备交联载药纳米胶束，测得载药纳米胶束的载药率为10.50%，包封率为32.72%。

实施例5 纳米胶束的交联度测定

测量巯基含量的具体操作方法如下：在氩气保护下，配制具有一系列浓度的L–半胱氨酸（HSCH₂CH(NH₂)COOH）的PBS（pH7.4）溶液各2.4 mL，浓度分别为0、2.5、5、10、20 μg/mL。将0.6 ml（0.5mg/ml）Ellman’s 试剂加入到上述各溶液中，室温搅拌下反应15 min，以生成TNB。然后马上用紫外分光光度计测量反应生成物在412 nm波长处的吸光度，用各种浓度和相对应的TNB吸光度，制作标准曲线（见图12），建立吸光度-L–半胱氨酸浓度的拟合方程（Y=0.079X -0.0117， R²=0.999）。

在氩气保护下，称取2 mg 聚合物PEG-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)，溶解于10 ml PBS（pH7.4）溶液中，加入过量（10eq）的还原剂硼氢化钠进行处理，将二硫键还原打开，过量的NaBH₄用超滤管(MWCO: 100kDa)除掉。然后将0.6 mL（0.5mg/mL）Ellman’s 试剂加入到上述样品溶液中，室温搅拌下25 ℃反应15 min后，马上用紫外分光光度计测量样品在412 nm波长处的吸光度。通过该吸光度和吸光度-L–半胱氨酸浓度的拟合方程，可以计算出纳米捆绑凝胶的交联度。

按照实施例2的方法制备交联载药纳米胶束，测得该胶束的交联度为88.45%。

上面方法是定量的测试，同时，通过拉曼光谱可定性测定到二硫键的存在（见图13）。

实施例6 载药纳米胶束的药物体外释放

按照实施例2制备得到的包载DOX胶束溶液（1mg/mL），定容后，平均分成12份，取其中三份转移至三个透析袋(Mw cut-off: 14000Da)中，分别放入三个装有45mL的相同的pH值为7.4的PBS缓冲溶液的试剂瓶中；三份放在上述同样的透析袋中，分别放入装有45mLDTT溶液（10mM）的试剂瓶中；三份放在上述同样的透析袋中，分别放入装有45mL 醋酸盐缓冲溶液(pH 5.0)试剂瓶中。另外三份冻干后，用于测定负载率。释放实验是在37℃恒温水浴培养摇床中进行。在选择的时间间隔内，采集透析袋外面的5mL溶液进行紫外测量并加入5mL新鲜醋酸盐缓冲液。用波长扫描法测定DOX在482.5nm处的紫外吸收强度，根据DOX标准曲线计算胶束中DOX的含量。在分析DOX释放行为中，以时间对DOX累积释放量作图进行分析研究。自由DOX在透析袋中的释放作为对照实验。其中，所得结果为三组平行测试实验的平均值。实验结果见图14。

可以看出，在pH值为7.4缓冲溶液中，药物DOX的释放量基本为零，说明在pH值为7.4时载药纳米胶束是个稳定的致密的载药体系。当在pH值为5.0缓冲溶液中，载药纳米胶束有少量药物的释放，这说明载药纳米胶束在酸性条件下发生膨胀，部分药物发生渗漏。在pH值为7.4缓冲溶液中加入10mM的DTT，DOX快速地从胶束中释放出来，而且比在pH值为5.0的条件下要快得多，这是因为二硫键被打开后，疏水段发生大幅度的膨胀，远远超过在pH值5.0条件下膨胀的程度。当在pH值为5.0缓冲溶液加入10mM的DTT，载药纳米胶束发生解体，大部分DOX快速释放出来，5h内已经释放了接近65%的药物，但随后的药物慢慢释放出来。这说明了该交联酸敏胶束能随着环境的变化，智能地控制药物的释放，先发生暴释，接着是保持缓释，这明显提高了药物利用率和药物的治疗效果。

实施例7 载药纳米胶束的MTT细胞毒性分析

实验对象为实施例2制备的载药纳米胶束。细胞增长的抑制率即细胞毒性通过经典的MTT进行分析。人类肝癌细胞Bel 7402在每孔0.3×10⁴数量级的96孔板中进行种植培养。在对数级增长阶段进行收割，并最终用含有10% FBS的RPMI-1640培养基调整成170μL。24h之后，在每孔板中使用含有预先设定浓度的自由DOX，负载DOX交联胶束以及负载DOX非酸敏胶束（PEG-PCL，其中PEG分子量2000，PCL分子量3000）的培养基进行培养。在经过72h培养后，在每孔板中加入10μL浓度为5mg/mL的MTT盐溶液(0.9% NaCl saline)继续在37℃培养箱中培养4h以允许活性细胞经过还原反应把黄色MTT转化为深兰色formazan晶体，然后这种晶体溶解于100μLDMSO中，通过酶标仪在540nm及655nm对每个板孔进行检测。

载药纳米胶束的细胞毒性分析和空胶束的细胞毒性分析见图15、16。由图15可见，载药酸敏胶束的细胞毒性处于自由DOX和非酸敏载药胶束之间，自由DOX毒性最大，非酸敏载药胶束毒性最小，这说明将药物包载于纳米胶束中，能降低药物的毒性。同时，载药纳米胶束在细胞内能智能释放药物，而非酸敏载药胶束没有这个功能，所以载药纳米胶束表现的细胞毒性要比非酸敏载药胶束的要大。由图16可见，空载体纳米捆绑凝胶作用于Bel7402细胞，发现其在所检测的浓度下细胞存活率很高，在用量70μg/mL时，细胞存活率仍达到88%以上，说明该纳米胶束具有毒性低的特点。

实施例8 载药纳米胶束在体内对肿瘤的治疗效果考察

在皮下种有Bel-7402 t肿瘤细胞的BALB/C 裸鼠上进行载药纳米胶束对肿瘤生长遏制的实验，药物通过静脉注射进入老鼠体内，然后观察随着时间的变化肿瘤体积的变化。载药纳米胶束用实施例2方法制备。

图17显示了载药纳米胶束在老鼠体内对肿瘤的治疗效果。由图可见自由DOX对肿瘤基本没有明显的治疗效果，因为自由DOX在体内迅速扩散了，到达肿瘤部位的量很少。纳米胶束对肿瘤生长有明显的遏制作用，在20d内能使肿瘤的体积减少至10%，而且治疗效果比非酸敏胶束明显好很多，这是因为酸敏胶束能在肿瘤组织发生膨胀甚至解体的行为，导致DOX的高效释放，因为肿瘤组织的pH值大约只有6.5，比正常细胞的pH值为7.4的偏酸，甚至肿瘤细胞溶酶体内的pH值为5左右，更有利于酸敏载体发生药物的智能释放。

Claims

1.一种能智能释放药物的纳米胶束，其特征在于成分为聚乙二醇-聚（天冬氨酸-半胱氨酸）-聚（天冬氨酸-二异丙基乙二胺）。

2.根据权利要求1所述能智能释放药物的纳米胶束，其特征在于所述聚乙二醇-聚（天冬氨酸-半胱氨酸）-聚（天冬氨酸-二异丙基乙二胺）结构中聚乙二醇段的数均分子量为0.2~10 KD，聚（天冬氨酸-半胱氨酸）段的数均分子量为0.2~10 KD，聚(天冬氨酸-二异丙基乙二胺的数均分子量为0.2~10 KD。

3.权利要求1或2所述能智能释放药物的纳米胶束的制备方法，其特征在于步骤如下：

用PEG-NH₂为引发剂，引发BLA-NCA合成聚合物PEG-PBLA，然后PEG-PBLA进行溴化反应，合成PEG-PBLA-COCH₂Br，PEG-PBLA-COCH₂Br继续进行叠氮化反应，合成PEG-PBLA-N₃，同时，用丙炔胺作为引发剂引发BLA-NCA合成PA-PBLA，PA-PBLA再与N,N-二异丙基乙二胺进行胺解反应，合成PA-PAsp(DIP)，然后在溴化亚铜/五甲基二乙烯基三胺的催化下，PEG-PBLA-N₃和PA-PAsp(DIP)进行点击反应，合成PEG-PBLA-PAsp(DIP)，将PEG-PBLA-PAsp(DIP)用2-氨基乙硫醇进行胺解反应，合成聚乙二醇-聚（天冬氨酸-半胱氨酸）-聚（天冬氨酸-二异丙基乙二胺）。

4.权利要求1或2所述能智能释放药物的纳米胶束在作为疏水性药物载体中的应用。

5.一种负载纳米金的纳米胶束，其特征在于通过原位还原法在聚乙二醇-聚（天冬氨酸-半胱氨酸）-聚（天冬氨酸-二异丙基乙二胺）上负载纳米金得到的产物。

6.权利要求4所述负载纳米金的纳米胶束在作为疏水性药物载体中的应用。

7.一种载药纳米胶束，其特征在于是由权利要求1或2所述可智能释放药物的纳米胶束，或者权利要求5所述负载纳米金的纳米胶束与疏水性药物按照重量份数比为5~1000:1的比例组成。

8.权利要求7所述载药纳米胶束的制备方法，其特征在于步骤为：以可智能释放药物的纳米胶束或负载纳米金的纳米胶束作为载体，与疏水性药物在pH值为10的条件下自组装形成中间层交联的纳米胶束，然后将pH调至7.4，形成最终的包载疏水性药物的载药纳米胶束。

9.根据权利要求8所述载药纳米胶束的制备方法，其特征在于步骤为：取5～1000重量份可智能释放药物的纳米胶束或负载纳米金的纳米胶束，加上1重量份的疏水性药物，作为原料，溶于四氢呋喃和二甲基亚砜按1:1体积比组成的有机溶剂中，同时加入还原剂，打开交联的二硫键，超声作用下将上述溶液滴加至pH值为10的碳酸盐缓冲溶液中，然后通氧气，再经过透析除去未包裹的药物及有机溶剂，然后，将溶液pH值调至7.4，即得到最终的载药纳米胶束。

10.根据权利要求8所述载药纳米胶束的制备方法，其特征在于所述还原剂为二硫苏糖醇或谷胱甘肽；所述有机溶剂体积为原料重量的5~1000倍；还原剂加入量为聚乙二醇-聚(天冬氨酸-半胱胺酸)-聚(天冬氨酸-二异丙基乙二胺)的1~1000倍。