CN108030921A - 一种白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒的制备方法及其应用。本发明以卟啉、金属盐以及白蛋白为原料,并采用去溶剂法制备白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒,方法简单、易操作、重复性好、制备的白蛋白载纳米颗粒解决了金属基配合物药物的水溶性问题和靶向性问题;同时在超声波作用下,本发明白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒具有超声杀伤肿瘤细胞的作用,证实了金属基配合物负载于白蛋白分子后具有广阔的抗肿瘤应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物领域,具体而言,涉及一种白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒的制备方法及其应用。
背景技术
上世纪60年代,顺铂抗癌活性的发现,开辟了金属配合物抗癌药物研究的新领域。金属离子与医学、生命科学、环境科学等领域有着密不可分的联系。在生物体内,如:铁、钴、镍、铜、锌等金属离子广泛参与生命过程,它们是维持生命活动所必需的元素,也是人类健康和生命活动中不可缺少的部分。金属最大的特征就是能够失去电子成为带正电荷的离子,进而与生物分子产生各种键合作用,形成酶、激素、维生素等,从而发挥重要的生理功能。随着金属基药物的作用机理研究的不断深入,新的效果显著、副作用小的金属配合物药物相继被合成出来。
然而,传统的金属配合物给药方式缺乏靶向性,且在体内不具备选择性,在杀伤肿瘤细胞的同时不可避免的损害了正常细胞,因此,会造成较大的毒副作用,病人在接受治疗期间生活质量也会有所下降。此外,这些小分子化疗药物还存在水溶性差、生物稳定性差等的缺点,药物在达到肿瘤组织之前会被代谢、分解,只有少部分的药物到达肿瘤病灶,药物的利用率较低。此外,低剂量的重复给药容易产生耐药性。这些因素成为限制金属配合物药物用量和疗效发挥的重要原因。
近些年的研究发现,以纳米技术为核心的载药系统在肿瘤治疗研究领域具有独特的优势。主要表现在以下几个方面:1)粒径在200nm以下的颗粒可通过实体瘤血管的高通透和淋巴回流的滞留性(EPR效应)被动靶向到肿瘤组织;2)利用纳米技术可提高难溶性药物在水溶液中的溶解性,达到增溶的目的;3)药物经过长循环的纳米颗粒包载后,降低了跟血液接触的机会,使得药物在血液循环中的半衰期得以提高。因此,纳米载体负载药物在抗肿瘤研究中取得了良好的应用前景,特别是在传递水难溶性药物中展示了独特的优势。
组成纳米颗粒的各种物质对最终制剂的性质有很大影响,因此,制备纳米制剂时应考虑所用的单体、聚合物及赋形剂的生物相容性、毒性等问题,最好使用毒性低、内源性或可被生物降解成具有良好生理相容性的材料。白蛋白是人或动物血浆中的一种重要组成成分,具有很高的生物利用度、生物相容性、生物降解能力。结合纳米颗粒的载药功能和白蛋白的内源性两方面优势,白蛋白纳米载药系统近年来受到广泛关注,成为药物递送系统的研究热点。目前,紫杉醇白蛋白纳米颗粒注射液已于2005年1月获得美国FDA的批准上市,显示了人血清白蛋白作为静脉应用载体的广阔前景及临床应用价值。
尽管金属配合物药物引起了药物化学家的极大兴趣,近年来,各种金属中心的卟啉金属配合物应用于抗菌、抗肿瘤的研究被大量报道。如,金 (III)卟啉配合物在治疗鼻咽癌方面具有比铂类药物更好的活性;锌卟啉配合物被作为血红素加氧酶的抑制剂,抑制肿瘤细胞的生长;锰卟啉作为声敏剂应用于声动力抗肿瘤具有特殊的MRI成像和抗肿瘤的综合作用等。但金属卟啉配合物的溶解性差、循环周期短等缺点限制了其向临床应用的转化。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒的制备方法,所述制备方法中,通过白蛋白与金属卟啉配合物自组装复合,从而能够有效提高卟啉配合物的水溶性以及生物相容性。
本发明的第二目的在于提供一种由本发明制备方法所得到的白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒。
本发明的第三目的在于提供一种所述的白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒的应用。
为了实现本发明的中述目的,特采用以下技术方案:
一种白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:
(a)卟啉/卟啉衍生物与金属盐反应,得到金属卟啉配合物;
(b)将步骤(a)所得金属卟啉配合物溶解,然后加入到白蛋白溶液中,超声处理,得到纳米复合体系;
向所得纳米复合体系中加入缓冲溶液中,再次超声处理,得到纳米颗粒水溶液,分离后得到白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒;
其中,优选的,所述缓冲溶液为碳酸钠和/或碳酸氢钠缓冲溶液。
优选的,本发明所述的制备方法中,所述金属盐为过渡金属盐;更优选的,所述金属盐为锰、锌、钛、铜或者钴盐。
优选的,本发明所述的制备方法中,所述卟啉/卟啉衍生物结构如下:
式(I)中,R1-R4分别独立的为氢、C1-C30的直链或支链烷基、C5-C30 的芳基,或者C3-C30的杂芳基;
其中,R1-R4中任意的氢原子可以被C1-C20的直链或支链烷基、C3-C24 的环烷基、C1-C20的烷氧基、C5-C30的芳基、C3-C30的杂芳基、卤素、羟基、羧基,或者氨基取代或非取代。
优选的,本发明所述的制备方法中,式(I)中,R1-R4分别独立的为氢、C1-C12的直链或支链烷基,或者C5-C20的芳基,其中,R1-R4中任意的氢原子可以被C1-C20的直链或支链烷基、C5-C30的芳基、卤素、羟基、羧基,或者氨基取代或非取代;
更优选的,R1-R4分别独立的为C1-C6的直链或支链烷基,或者C6-C12 的芳基,其中,R1-R4中任意的氢原子可以被C1-C6的直链或支链烷基、 C6-C12的芳基、卤素、羟基、羧基,或者氨基取代或非取代。
优选的,本发明所述的制备方法中,所述式(I)化合物结构如下:
其中,式(II)中,R5-R8分别独立的为氢、C1-C6的直链或支链烷基、 C6-C12的芳基、卤素、羟基、羧基,或者氨基;
其中,m、n、p、q分别独立的为0-5的整数。
优选的,本发明所述的制备方法中,步骤(a)包括如下步骤:将卟啉/卟啉衍生物溶解后,加入金属盐,然后在气体保护条件下加热反应;反应停止后,加入冰水并冷藏后纯化,得到金属卟啉配合物;更优选的,所述纯化为柱层析纯化;
进一步优选的,所述纯化为二次柱层析纯化;其中,第一次纯化是以甲醇为流动相进行柱层析纯化,第二次纯化是将第一次纯化产物以氯仿和甲醇为流动相进行柱层析纯化。
优选的,本发明所述的制备方法步骤(b)中,所述白蛋白为卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麦白蛋白,或者豆白蛋白中的一种或几种的混合物;
更优选的,所述白蛋白为人血清白蛋白。
优选的,本发明所述的制备方法步骤(b)中,金属卟啉配合物与白蛋白的质量比为1:(10~100);更优选的,金属卟啉配合物与白蛋白的质量比为1:(10~50);进一步优选的,金属卟啉配合物与白蛋白的质量比为1:(20~50)。
同时,本发明也提供了由本发明所述的制备方法得到的白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒。
进一步的,本发明还提供了所述的白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒在制备肿瘤治疗试剂中的应用;和/或,所述的白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒具有良好的溶解性和靶向性,能够用于肿瘤治疗,特别是用于肿瘤的声动力治疗,并对于深层肿瘤具有良好的治疗效果作用;
同时,顺磁性的中心金属能够实现MRI成像功能,进而实现肿瘤诊疗的一体化;
(2)本发明白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒合成过程中,将白蛋白与金属卟啉配合物通过超声即能够实现二者的自组装,反应过程中无需使用偶联剂等化学连接剂,相较于传统的白蛋白负载药物而言,本发明制备方法更为简单、便捷,而且还能够避免化学试剂残留所带来的危害。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒制备流程图;
图2为在超声激发下,MnTTP-HSA在水溶液中产生的ROS强度曲线图;
图3为在超声激发下,MnTTP-HSA配合物纳米颗粒在乳腺癌细胞MCF-7 中产生的ROS的定量曲线图;
图4为白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒对MCF-7细胞的杀伤活性评价结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
有鉴于卟啉化合物由于其平面大分子结构使电子而容易发生跃迁,因而具有特殊的光、电性质,并在作为抗肿瘤药物、光敏剂和声敏剂方面具有潜在应用价值,然而由于水溶性和生物相容性差等缺点,严重限制了其在生物学领域的应用等卟啉实际应用技术问题,本发明特提供了一种新型蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒,并通过金属与卟啉的配位以及卟啉与白蛋白的复合,从而提高卟啉/卟啉配合物的水溶性和生物相容性,进而使其能够应用于人体肿瘤诊疗中。
具体的,本发明所提供的新型蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒是以金属盐化合物、卟啉/卟啉衍生物以及白蛋白为原料所制备的,其制备方法可参考如下:
(a)将如下式(I)化合物溶解;
其中,式(I)化合物结构如下:
式(I)中,R1-R4分别独立的为氢、C1-C30的直链或支链烷基、C5-C30 的芳基,或者C3-C30的杂芳基;
其中,当R1-R4中任意的R基不为氢时,该不为氢的R基上任意的氢原子可以被C1-C20的直链或支链烷基、C3-C24的环烷基、C1-C20的烷氧基、C5-C30的芳基、C3-C30的杂芳基、卤素、羟基、羧基,或者氨基取代或非取代;即形成带有或不带有取代基的C5-C30的芳基,或者C3-C30 的杂芳基;
优选的,如上式(I)中,R1-R4分别独立的为氢、C1-C12的直链或支链烷基,或者C5-C20的芳基;
其中,当R1-R4中任意的R基不为氢时,该不为氢的R基上任意的氢原子可以被C1-C20的直链或支链烷基、C5-C30的芳基、卤素、羟基、羧基,或者氨基取代或非取代;即形成带有或不带有取代基的C1-C12的直链或支链烷基,或者C5-C20的芳基;
更优选的,如上式(I)中,R1-R4分别独立的为C1-C6的直链或支链烷基,或者C6-C12的芳基;
其中,R1-R4中任意的氢原子可以被C1-C6的直链或支链烷基、C6-C12 的芳基、卤素、羟基、羧基,或者氨基取代或非取代;即形成带有或不带有取代基的C1-C6的直链或支链烷基,或者C6-C12的芳基;
进一步优选的,如上式(I)所示化合物结构如下:
式(II)中,R5-R8分别独立的为氢,C1-C6的直链或支链烷基,例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、1-甲基-丙基、2-甲基丙基、戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基等;C6-C12的芳基,例如苯、萘、联苯等;卤素,例如氟、氯、溴、碘;羟基、羧基,或者氨基;
其中,m、n、p、q分别独立的为0-5的整数,例如m、n、p、q分别独立的为0、1、2、3、4,或者5;
更进一步优选的,如上式(II)所示化合物结构如下:
式(III)中,R5-R8分别独立的为氢,C1-C6的直链或支链烷基,例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、1-甲基-丙基、2-甲基丙基、戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基等;C6-C12的芳基,例如苯、萘、联苯等;卤素,例如氟、氯、溴、碘;羟基、羧基,或者氨基;
而如上式(I)化合物的溶解可以通过将式(I)化合物加入DMF、THF、二氯甲烷或者甲醇中的一种或几种的溶剂中进行;
优选的,式(I)化合物是以DMF进行溶解,或者以四氢呋喃、二氯甲烷、甲醇及任意两种的混合物为溶剂进行溶解;
然后,向式(I)化合物溶液中加入金属盐,金属盐和式(I)化合物的摩尔比优选的为(1~3):1;
同时,优选的,所述金属盐为过渡金属盐,例如过渡金属氯化物、过渡金属硫酸盐、过渡金属硝酸盐,过渡金属磷酸盐,或者过渡金属醋酸盐等;
更优选的,所述金属盐为锰、锌、钛、铜或者钴盐;
更进一步优选的,所述金属盐为Mn(II)、Zn(II)、Ti(IV)、Cu(II) 或者Co(II)盐,例如氯化锰(II)、硫酸锰(II)、硝酸锰(II)、醋酸锰(II);氯化锌(II)、硫酸锌(II)、硝酸锌(II)、醋酸锌;四氯化钛 (II);氯化铜(II)、硫酸铜(II)、硝酸铜(II)、醋酸铜(II);氯化钴(II)、硫酸钴(II)、硝酸钴(II)、醋酸钴(II)等;
加入金属盐后,优选的在氮气保护条件下进行反应,具体的,可以优选的先通入氮气,将体系中的氧气去除,然后再在氮气保护条件下,进行加热反应,加热反应的温度优选的为150~165℃,反应的时间优选的为 0.5~3h;
加热反应结束后加入冰水并冷藏过夜,然后进行纯化,优选的所述纯化包括如下步骤:
将冷藏过夜体系过滤分离,并将分离所得固体以甲醇为流动相进行柱层析纯化,旋转蒸发后得到一次纯化产物;然后将一次纯化产物以氯仿和甲醇为流动相进行二次柱层析纯化,旋转蒸发后得到二次纯化产物,即为目标金属卟啉配合物;
优选的,可以采用干法或者湿法进行柱层析上样;
优选的,一次纯化所用流动相中,氯仿与乙醇的体积比为(6:1)~ (2:1),例如可以为,但不限于6:1、5:1、4:1、3:1,或者2:1等;
(b)
(i)将步骤(a)所得金属卟啉配合物溶解,优选的,可以以氯仿为溶剂进行金属卟啉配合物的溶解,并优选的使得所得溶液中金属卟啉配合物的质量浓度为0.5~2mg/ml;
(ii)将白蛋白溶于水中,并优选的轻摇至白蛋白完全溶解;
其中优选的,原料金属卟啉配合物与原料白蛋白的质量比控制在1: (10~100);更优选的,金属卟啉配合物与白蛋白的质量比为1:(10~ 50);进一步优选的,考虑到原料反应的实际情况,金属卟啉配合物与白蛋白的质量比控制在1:(20~50),特别是1:20~1:40的比例范围内;
(iii)将所得金属卟啉溶液加入白蛋白溶液中;
(iv)将步骤(iii)所得混合溶液超声处理,优选的采用间歇式超声,超声的时间控制在2-10min,例如可以为,但不限于3、4、5、6、7、 8,或者9min等;更优选的,超声的时间控制在5~8min;
通过超声处理,从而将体系中的有机溶剂除去,同时得到纳米复合体系;
(v)向所得纳米复合体系中加入缓冲溶液;然后再次进行超声处理,并优选的在超声清洗波中超声处理2~15min,得到透明澄清的纳米颗粒水溶液;
所用缓冲溶液可以为碳酸钠溶液,或者碳酸氢钠溶液,又或者是碳酸钠与碳酸氢钠的混合缓冲溶液;
(vi)将所得纳米颗粒水溶液采用超滤和/或透析的方法除去体系中的小分子;
(vii)将步骤(vi)所得溶液优选的以过滤筛进行过滤,所用过滤筛的孔径优选的为0.22μm,过滤得到白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒;
所得产物经透射电镜和粒度仪检测纳米颗粒的形状和尺寸大小后,优选的采用避光的方式进行保存。
而由本发明如上的制备方法也可以明显得知的是,本发明在白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒合成过程中,无需额外加入化学连接剂,只需要将金属卟啉配合物与白蛋白混合超声即可,二者通过共价键作用实现自主装,从而形成负载型复合结构;相较于传统的白蛋白负载药物的制备方法而言,本发明方法在操作上也更为简便;
通过向卟啉/卟啉衍生物中引入配位的中心金属,从而可以实现卟啉溶解性的改善;同时,由于配位后的金属离子对卟啉环大π键的吸引作用,可提高卟啉环上π电子的跃迁性能,使得所制备的配合物在光、声动力条件下具有杀伤肿瘤的作用;
同时,通过白蛋白的引入,可以进一步改善金属卟啉配合物的溶解性以及生物相容性,进而使其具有更加优异的肿瘤靶向性,进而用于肿瘤的靶向治疗。
进一步的,还可以将本发明白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒用于制备肿瘤治疗试剂,特别是肿瘤声动力治疗制剂,并配合超声实现肿瘤的靶向治疗;
同样的,所引入的Mn等具有顺磁性的中心金属,也使本发明白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒具有MRI成像功能,因而可以在配合肿瘤治疗的同时,实现肿瘤诊断功能,进而实现肿瘤治疗的一体化。
实施案例1
(1)Zn-TTP配合物制备
将67mg的TTP(即式(III)中R5=R6=R7=R8=甲基)溶解于15mL四氢呋喃溶液中,将溶有36mg醋酸锌的5ml甲醇溶液加入到上述溶液中;
通入氮气将体系中的空气排除,然后在氮气球保护下,65℃加热搅拌, UV监测反应进行情况,1.5h后停止反应。向反应体系中加入50mL的冰水,冷藏过夜后,抽滤得到89mg的棕红色固体粉末;
将所得固体产物溶于氯仿中,以凝胶柱层析进行分离纯化,所用流动相为甲醇,得到一次纯化产物;然后将一次纯化产物以氯仿溶解后,将沉淀溶于氯仿中,硅胶柱层析进行分离(展开剂氯仿:甲醇=5:1),得到59mg 产物。
(2)白蛋白负载锌卟啉配合物纳米颗粒
称取配合物1mg溶解在200uL分析纯的氯仿中;称取白蛋白40mg于4ml H2O中,轻摇至全溶;将配合物的氯仿溶液加入到白蛋白溶液中;超声破碎 5分钟,去除有机溶剂,同时得到纳米体系;加入0.1M的碳酸钠水溶液60 微升,超声清洗波中超声5分钟,得到透明澄清纳米颗粒水溶液;超滤去除纳米体系中游离小分子;用0.22um的过滤筛过滤,得到白蛋白负载锌卟啉配合物纳米颗粒,避光保存备用。
实施例1的制备流程可参考图1。
实施案例2
(1)Mn-TPP配合物制备
将67mg的TTP(即式(III)中R5=R6=R7=R8=甲基)溶解于15mLN,N’-二甲基甲酰胺溶液中,然后将48mg醋酸锰加入到上述溶液中;
通入氮气将体系中的空气排除,然后在氮气球保护下,155℃加热搅拌,UV监测反应进行情况,2h后停止反应。向反应体系中加入50mL的冰水,冷藏过夜后,抽滤得到85mg的草绿色固体粉末;
将草绿色沉淀溶于氯仿中,以凝胶柱层析进行分离纯化,所用流动相为甲醇,得到一次纯化产物;然后将一次纯化产物以氯仿溶解后,以硅胶柱层析进行分离(展开剂氯仿:甲醇=5:1),得到71mg产物。
(2)白蛋白负载锰卟啉配合物纳米颗粒制备
称取配合物1mg溶解在200uL分析纯的氯仿中;称取白蛋白40mg于4ml H2O中,轻摇至全溶;将配合物的氯仿溶液加入到白蛋白溶液中;超声破碎 5分钟,去除有机溶剂,同时得到纳米体系;加入0.1M的碳酸钠水溶液60 微升,超声清洗波中超声5分钟,得到透明澄清纳米颗粒水溶液;透析去除纳米体系中游离小分子;用0.22um的过滤筛过滤,得到白蛋白负载锰卟啉配合物纳米颗粒,避光保存备用。
实施案例3
(1)Cu-卟啉配合物制备
将70mg的四-(对氯)苯基卟啉(即式(III)中R5=R6=R7=R8=氯)溶解于15mL二氯甲烷溶液中,然后将42mg氯化铜加入到上述溶液中;
通入氮气将体系中的空气排除,然后在氮气球保护下,155℃加热搅拌, UV监测反应进行情况,2h后停止反应。向反应体系中加入50mL的冰水,冷藏过夜,将抽滤所得固体产物溶于氯仿中,以凝胶柱层析进行分离纯化,所用流动相为甲醇,得到一次纯化产物;然后将一次纯化产物以氯仿溶解后,以硅胶柱层析进行分离(展开剂氯仿:甲醇=5:1),得到55mg的产物。
(2)白蛋白负载铜卟啉配合物纳米颗粒制备
称取配合物1mg溶解在200uL分析纯的氯仿中;称取白蛋白40mg于4ml H2O中,轻摇至全溶;将配合物的氯仿溶液加入到白蛋白溶液中;超声破碎 5分钟,去除有机溶剂,同时得到纳米体系;加入0.1M的碳酸钠水溶液60 微升,超声清洗波中超声5分钟,得到透明澄清纳米颗粒水溶液;超滤去除纳米体系中游离小分子;用0.22um的过滤筛过滤,得到白蛋白负载铜卟啉配合物纳米颗粒,避光保存备用。
实施案例4
(1)Co-卟啉配合物制备
将75mg的四-(对羧基)苯基卟啉(即式(III)中R5=R6=R7=R8=羧基) 溶解于15mLN,N’-二甲基甲酰胺溶液中,然后将70mg醋酸钴加入到上述溶液中;
通入氮气将体系中的空气排除,然后在氮气球保护下,155℃加热搅拌, UV监测反应进行情况,2h后停止反应。向反应体系中加入50mL的冰水,冷藏过夜,将抽滤所得固体产物沉淀溶于氯仿中,以凝胶柱层析进行分离纯化,所用流动相为甲醇,得到一次纯化产物;然后将一次纯化产物以氯仿溶解后,以硅胶柱层析进行分离(展开剂氯仿:甲醇=5:1),得到77mg的产物。
(2)白蛋白负载钴卟啉配合物纳米颗粒制备
称取配合物1mg溶解在200uL分析纯的氯仿中;称取白蛋白40mg于4ml H2O中,轻摇至全溶;将配合物的氯仿溶液加入到白蛋白溶液中;超声破碎 5分钟,去除有机溶剂,同时得到纳米体系;加入0.1M的碳酸钠水溶液60 微升,超声清洗波中超声5分钟,得到透明澄清纳米颗粒水溶液;超滤去除纳米体系中游离小分子;用0.22um的过滤筛过滤,得到白蛋白负载钴卟啉配合物纳米颗粒,避光保存备用。
实施案例5
(1)Mn-卟啉配合物制备
将79mg的四-(对氨基)苯基卟啉(即式(III)中R5=R6=R7=R8=氨基) 溶解于15mLN,N’-二甲基甲酰胺溶液中,然后将48mg醋酸锰加入到上述溶液中;
通入氮气将体系中的空气排除,然后在氮气球保护下,155℃加热搅拌, UV监测反应进行情况,2h后停止反应。向反应体系中加入50mL的冰水,冷藏过夜后,抽滤得到85mg的绿色固体粉末;
将绿色沉淀溶于氯仿中,以凝胶柱层析进行分离纯化,所用流动相为甲醇,得到一次纯化产物;然后将一次纯化产物以氯仿溶解后,以硅胶柱层析进行分离(展开剂氯仿:甲醇=5:1),得到68mg的产物。
(2)白蛋白负载锰卟啉配合物纳米颗粒制备
称取配合物1mg溶解在200uL分析纯的氯仿中;称取白蛋白40mg于4ml H2O中,轻摇至全溶;将配合物的氯仿溶液加入到白蛋白溶液中;超声破碎 5分钟,去除有机溶剂,同时得到纳米体系;加入0.1M的碳酸钠水溶液60 微升,超声清洗波中超声5分钟,得到透明澄清纳米颗粒水溶液;超滤去除纳米体系中游离小分子;用0.22um的过滤筛过滤,得到白蛋白负载锰卟啉配合物纳米颗粒,避光保存备用。
实验例1
以实施例2所制备的白蛋白负载锰卟啉配合物纳米颗粒(记为MnTTP-HSA)为纳米颗粒材料,进行如下实验:
(1)超声激发下,白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒在水溶液中产生ROS的检测:
将一定浓度的MnTTP-HSA置于细胞培养板中,在暗光条件下,加入2,7- 二氯荧光素(DCFH-DA)活性氧探针,并超声1-10分钟,将超声后的溶液稀释一定倍数后,在近红外小动物成像仪下定性检测活性氧产生情况;同时,将稀释后的溶液用多功能酶标仪检测活性氧的荧光强度,检测结果如图2所示;
由图2检测结果可知,在不同超声时间条件下,MnTTP-HSA均能够在波长530nm左右处产生高浓度的ROS。
由此可见,本发明白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒具有优异的声敏特性。
(2)白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒对乳腺癌细胞MCF-7体外暗活性评价:
将处于对数生长期的MCF-7细胞,以5×104个/孔接种于96孔板中,每孔加入1ml细胞悬液,于37℃培养箱中(含5%CO2)孵育12小时后,将 MnTTP-HSA以培养基稀释到一定浓度后加入到细胞中,同时设置对照组(培养细胞不加药或无超声),继续孵育24小时后,加入cck8,1小时后在多功能酶标仪检测od(450)值,进而计算颗粒的安全性,检测结果如图3所示:由图3可知,金属配合物在一定浓度范围内具有生物安全性。
(3)在超声激发下,白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒对MCF-7细胞的杀伤活性评价:
方法同暗活性检测,区别在于:在生物安全范围内,将MnTTP-HSA加入到细胞后,继续孵育3小时。加入DCFH-DA探针30min后,将96孔板中需要超声处理的孔置于平面超声探头下,超声激发(2MHz,2W)2min后,立刻用多功能酶标仪检测ROS产生情况。
由图4的检测结果可知,在超声激发条件下,将MnTTP-HSA与MCF-7 细胞孵育所产生的ROS的量(即图4中MnTTP-HSA+U.S组)明显强于其他对照组,由此可见,本发明白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒具有声动力抗肿瘤效果,可用作肿瘤治疗的声动力学治疗中的声敏剂。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明,然而应意识到,在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此,这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
(a)卟啉/卟啉衍生物与金属盐反应,得到金属卟啉配合物;
(b)将步骤(a)所得金属卟啉配合物溶解,然后加入到白蛋白溶液中,超声处理,得到纳米复合体系;
向所得纳米复合体系中加入缓冲溶液,再次超声处理,得到纳米颗粒水溶液,分离后得到白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒;
其中,优选的,所述缓冲溶液为碳酸钠和/或碳酸氢钠缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述金属盐为过渡金属盐;
优选的,所述金属盐为锰、锌、钛、铜或者钴盐。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述卟啉/卟啉衍生物结构如下:
式(I)中,R1-R4分别独立的为氢、C1-C30的直链或支链烷基、C5-C30的芳基,或者C3-C30的杂芳基;
其中,R1-R4中任意的氢原子可以被C1-C20的直链或支链烷基、C3-C24的环烷基、C1-C20的烷氧基、C5-C30的芳基、C3-C30的杂芳基、卤素、羟基、羧基,或者氨基取代或非取代。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,式(I)中,R1-R4分别独立的为氢、C1-C12的直链或支链烷基,或者C5-C20的芳基;
其中,R1-R4中任意的氢原子可以被C1-C20的直链或支链烷基、C5-C30的芳基、卤素、羟基、羧基,或者氨基取代或非取代;
优选的,R1-R4分别独立的为C1-C6的直链或支链烷基,或者C6-C12的芳基;
其中,R1-R4中任意的氢原子可以被C1-C6的直链或支链烷基、C6-C12的芳基、卤素、羟基、羧基,或者氨基取代或非取代。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述式(I)化合物结构如下:
其中,式(II)中,R5-R8分别独立的为氢、C1-C6的直链或支链烷基、C6-C12的芳基、卤素、羟基、羧基,或者氨基;
其中,m、n、p、q分别独立的为0-5的整数。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(a)包括如下步骤:
将卟啉/卟啉衍生物溶解后,加入金属盐,然后在气体保护条件下加热反应;
反应停止后,加入冰水并冷藏后纯化,得到金属卟啉配合物;
优选的,所述纯化为柱层析纯化;
更优选的,所述纯化为二次柱层析纯化;
其中,第一次纯化是以甲醇为流动相进行柱层析纯化,第二次纯化是将第一次纯化产物以氯仿和甲醇为流动相进行柱层析纯化。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(b)中,所述白蛋白为卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麦白蛋白,或者豆白蛋白中的一种或几种的混合物;
优选的,所述白蛋白为人血清白蛋白。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(b)中,金属卟啉配合物与白蛋白的质量比为1:(10~100);
优选的,金属卟啉配合物与白蛋白的质量比为1:(10~50);
更优选的,金属卟啉配合物与白蛋白的质量比为1:(20~50)。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法得到的白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒。
10.权利要求9所述的白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒在制备肿瘤治疗试剂中的应用;
和/或,权利要求9所述的白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
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