CN111407743A - 一种多巴胺组装体药物递送系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多巴胺组装体药物递送系统及其制备方法，首先采用共价组装的方法，将多巴胺与醛基交联剂共组装，得到多巴胺与醛基交联剂纳米组装体材料；并在纳米组装体材料制备过程中加入化疗药物和光动力疗法光敏剂，利用纳米材料的适应性封装特性同时负载两种药物分子，得到具有pH响应性的纳米复合物药物递送系统。本发明制备方法操作简便、高度可控，所制备的多巴胺组装体药物递送系统具有组成、尺寸和形貌可控等特征，能够同时发挥抗肿瘤化疗和光动力疗法的疗效，具有广阔的应用前景。

Description

一种多巴胺组装体药物递送系统及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药材料技术领域，具体涉及一种新型多巴胺组装体药物递送系统及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤的特征之一是高度异质性。这种异质性导致了临床治疗的许多问题，如多药耐药、药物泄露、治疗窗口狭窄等。面对这些问题，纳米医学被作为一个新的诊疗平台应用于恶性肿瘤的诊断、检测与治疗。利用纳米药物递送系统可以将现有的治疗方法结合起来，有效克服单一疗法的局限性，实现协同治疗癌症的效果。纳米技术辅助的联合治疗不仅可以控制药物释放，而且可以选择性地针对病变组织，以及对外部或内部刺激做出反应。根据肿瘤组织与正常组织之间的环境差异性，研究人员已经开发了许多基于pH响应性、温度响应性、酶响应性、氧化还原响应性等智能纳米药物递送系统。这些纳米载体在受到肿瘤微环境(如低pH、还原性、高H2O2、乏氧等)或者外部的刺激(如光、超声、磁场等)后，能够改变自身的特性释放药物分子或者启动药物分子的功能，从而提高药物抗肿瘤效果，同时降低毒副作用。
在光动力治疗领域，卟啉及其衍生物作为一种高效光敏剂已经取得了巨大的研究进展，但卟啉的强疏水性使其在生理条件下具有很强的自聚集倾向，导致其生物利用度降低、光吸收率受限、1O2产率低、肿瘤积累差等问题。由于体内环境复杂、个体差异等不可控的因素，很难准确控制卟啉的释放，尤其是在实际的临床应用中。利用纳米技术可以明显缓解光敏剂的上述问题，纳米载体将光敏剂负载之后，能够有效提高光敏剂的溶解性，其独特的增强渗透和滞留效应还能够提高光敏剂在肿瘤部位的累积，从而增强光动力疗法的特异性和高效性。
多巴胺基纳米材料具有制备简便、可修饰性强、理化性质独特、多功能性等特点。基于此，研究人员已经开发了丰富的多巴胺基纳米载体，如纳米粒子、微胶囊、薄膜、纤维、胶束等。这些材料被广泛应用于生物医药领域，如药物输送、联合治疗、组织工程、抗菌等。其中，较为常见的是以聚多巴胺为基础制备的多巴胺基纳米材料，进而构建了丰富的纳米诊疗平台，包括化疗与光热治疗联合、光动力治疗与光热治疗联合、光热治疗与免疫治疗联合等。但是关于多巴胺与其他分子共组装制备多巴胺基纳米材料并应用于肿瘤治疗方面，国内外却鲜有报道。
上述分析结果表明，发展一种操作简便、高度可控的方法制备特定组成、尺寸和形貌的纳米组装体药物递送系统一直是科学和工业界的研究热点。新颖的多巴胺基纳米材料的发展为纳米药物递送系统的制备带来新的发展机遇。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤弱酸性微环境响应性的多巴胺组装体药物递送系统，以及该药物递送系统的制备方法。
为了达到上述目的，本发明多巴胺组装体药物递送系统由下述方法制备得到：
1、将多巴胺盐酸盐溶解于缓冲溶液中，配制成1～10mM的多巴胺盐酸盐溶液；将醛基交联剂溶解于缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.01％～6％的醛基交联剂溶液；然后按照多巴胺盐酸盐与醛基交联剂的物质的量比为10:1～1:10，将多巴胺盐酸盐与醛基交联剂溶液混合均匀，并调节混合溶液pH至弱碱性，室温陈化2～12小时，得到多巴胺与醛基交联剂组装体溶液。
2、向步骤1得到的多巴胺与醛基交联剂组装体溶液中加入0.5～10mg/mL的化疗药物水溶液和0.5～10mg/mL的光动力疗法光敏剂溶液，室温振荡下反应12～72小时，将所得悬浊液离心、水洗，得到多巴胺组装体药物递送系统。
上述步骤1中，优选将多巴胺盐酸盐溶解于缓冲溶液中，配制成2～6mM的多巴胺盐酸盐溶液；将醛基交联剂溶解于缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.03％～3％的醛基交联剂溶液；然后按照多巴胺盐酸盐与醛基交联剂的物质的量比为3:1～1:3，将多巴胺盐酸盐溶液与醛基交联剂溶液混合均匀，并调节混合溶液pH至弱碱性，室温陈化4～8小时。
上述的醛基交联剂为戊二醛、氧化海藻酸钠、氧化淀粉、氧化肝素、氧化右旋糖酐的任意一种或两种以上，优选戊二醛或氧化海藻酸钠。
上述的缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液、PBS缓冲溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液、硼砂-氢氧化钠缓冲溶液中的任意一种，缓冲溶液的pH为6.5～10。
上述步骤2中，优选所述的化疗药物水溶液和光动力疗法光敏剂溶液的总体积与多巴胺与醛基交联剂组装体溶液的体积比分别为1:10～1:40，进一步优选所述的化疗药物水溶液的浓度为2～8mg/mL，光动力疗法光敏剂溶液的浓度为2～8mg/mL。
上述的化疗药物为阿霉素、硼替佐米、紫杉醇、顺铂、5-氟尿嘧啶中的任意一种，光动力疗法光敏剂为二氢卟酚e6、竹红菌素、艾拉、卟啉、酞菁中的任意一种。
上述步骤2中，优选室温振荡下反应24～48小时。
本发明的有益效果如下：
1、本发明采用共价组装的方法制备多巴胺与醛基交联剂组装体，进而通过一步法制备出负载化疗药物和光敏剂两种药物的纳米复合物药物递送系统，该方法操作简便、高度可控，并且通过改变醛基交联剂的种类，多巴胺与醛基交联剂的比例、浓度，反应时间，缓冲溶液的种类等条件和参数可以调控药物递送系统的组成、形貌和尺寸。
2、本发明所制备的多巴胺与醛基交联剂组装体，二者之间所形成的席夫碱键具有在弱酸性环境中可逆断裂的性质，能够在肿瘤弱酸性微环境中响应性释放所负载的药物分子。
3、本发明采用多巴胺与醛基交联剂组装体负载两种药物分子，可以同时实现癌症化疗和光动力疗法的抗肿瘤协同治疗，并且通过改变化疗药物、光敏剂的种类和负载量调控抗肿瘤的治疗效果，实现最优化的治疗效果。
附图说明
图1是实施例1制备的多巴胺与醛基交联剂组装体的扫描电镜照片。
图2是实施例1制备的负载阿霉素和二氢卟酚e6的药物递送系统的紫外-可见吸收光谱。
图3是实施例1制备的药物递送系统及不同参照条件对HeLa细胞的杀伤作用。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、将多巴胺盐酸盐溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成浓度为3mM的多巴胺盐酸盐溶液；将戊二醛溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.06％的戊二醛溶液；然后按照多巴胺盐酸盐与戊二醛的物质的量比为1:2，将0.5mL 3mM的多巴胺盐酸盐溶液与0.5mL质量浓度为0.06％的戊二醛溶液振荡混合均匀，并用盐酸和氢氧化钠水溶液调节混合溶液的pH至6.7，室温陈化2小时，得到多巴胺与戊二醛组装体溶液。
2、向步骤1得到的得到多巴胺与戊二醛组装体溶液中加入50μL 1mg/mL的阿霉素水溶液和50μL 1mg/mL的二氢卟酚e6溶液(由10mg/mL的二氢卟酚e6DMSO溶液用去离子水稀释得到)，室温振荡下反应22小时，使用离心机10000rpm离心收集产物，水洗3次，得到负载阿霉素和二氢卟酚e6的药物递送系统。
实施例2
1、将多巴胺盐酸盐溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成浓度为6mM的多巴胺盐酸盐溶液；将氧化海藻酸钠溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.06％的氧化海藻酸钠溶液；然后按照多巴胺盐酸盐与氧化海藻酸钠的物质的量比为10:1，将6mM的多巴胺盐酸盐溶液与质量浓度为0.06％的氧化海藻酸钠溶液振荡混合均匀，总体积为1mL，并用盐酸和氢氧化钠水溶液调节混合溶液的pH至7.4，室温陈化4小时，得到多巴胺与氧化海藻酸钠组装体溶液。
2、向步骤1得到的得到多巴胺与氧化海藻酸钠组装体溶液中加入50μL 1mg/mL的阿霉素水溶液和50μL 1mg/mL的二氢卟酚e6溶液(由10mg/mL的二氢卟酚e6 DMSO溶液用去离子水稀释得到)，室温振荡下反应20小时，使用离心机10000rpm离心收集产物，水洗3次，得到负载阿霉素和二氢卟酚e6的药物递送系统。
实施例3
1、将多巴胺盐酸盐溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成浓度为8mM的多巴胺盐酸盐溶液；将戊二醛溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.2％的戊二醛溶液；然后按照多巴胺盐酸盐与戊二醛的物质的量比为2:5，将0.5mL 8mM的多巴胺盐酸盐溶液与0.5mL质量浓度为0.2％的戊二醛溶液振荡混合均匀，并用盐酸和氢氧化钠水溶液调节混合溶液的pH至6.7，室温陈化4小时，得到多巴胺与戊二醛组装体溶液。
2、向步骤1得到的得到多巴胺与戊二醛组装体溶液中加入50μL 1mg/mL的硼替佐米水溶液和50μL 1mg/mL的酞菁水溶液，室温振荡下反应20小时，使用离心机10000rpm离心收集产物，水洗3次，得到负载硼替佐米和酞菁的药物递送系统。
实施例4
1、将多巴胺盐酸盐溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成浓度为3mM的多巴胺盐酸盐溶液；将戊二醛溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.06％的戊二醛溶液；然后按照多巴胺盐酸盐与戊二醛的物质的量比为1:2，将0.5mL 3mM的多巴胺盐酸盐溶液与0.5mL质量浓度为0.06％的戊二醛溶液振荡混合均匀，并用盐酸和氢氧化钠水溶液调节混合溶液的pH至7.4，室温陈化4小时，得到多巴胺与戊二醛组装体溶液。
2、向步骤1得到的得到多巴胺与戊二醛组装体溶液中加入50μL 5mg/mL的阿霉素水溶液和50μL 5mg/mL的二氢卟酚e6溶液(由10mg/mL的二氢卟酚e6DMSO溶液用去离子水稀释得到)，室温振荡下反应20小时，使用离心机10000rpm离心收集产物，水洗3次，得到负载阿霉素和二氢卟酚e6的药物递送系统。
实施例5
1、将多巴胺盐酸盐溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成浓度为6mM的多巴胺盐酸盐溶液；将戊二醛溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.1％的戊二醛溶液；然后按照多巴胺盐酸盐与戊二醛的物质的量比为3:5，将0.5mL 6mM的多巴胺盐酸盐溶液与0.5mL质量浓度为0.1％的戊二醛溶液振荡混合均匀，并用盐酸和氢氧化钠水溶液调节混合溶液的pH至6.7，室温陈化4小时，得到多巴胺与戊二醛组装体溶液。
2、向步骤1得到的得到多巴胺与戊二醛组装体溶液中加入50μL 1mg/mL的5-氟尿嘧啶水溶液和50μL 1mg/mL的艾拉水溶液，室温振荡下反应20小时，使用离心机10000rpm离心收集产物，水洗3次，得到负载5-氟尿嘧啶和艾拉的药物递送系统。
实施例6
1、将多巴胺盐酸盐溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成浓度为3mM的多巴胺盐酸盐溶液；将氧化肝素溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.06％的氧化肝素溶液；然后按照多巴胺盐酸盐与氧化肝素的物质的量比为5:1，将3mM的多巴胺盐酸盐溶液与质量浓度为0.06％的氧化肝素溶液振荡混合均匀，总体积为1mL，并用盐酸和氢氧化钠水溶液调节混合溶液的pH至6.7，室温陈化8小时，得到多巴胺与氧化肝素组装体溶液。
2、向步骤1得到的得到多巴胺与氧化肝素组装体溶液中加入50μL2mg/mL的阿霉素水溶液和50μL 2mg/mL的二氢卟酚e6溶液，室温振荡下反应64小时，使用离心机10000rpm离心收集产物，水洗3次，得到负载阿霉素和二氢卟酚e6的药物递送系统。
为了证明本发明的技术效果，发明人进行了如下试验：
将多巴胺盐酸盐溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成浓度为3mM的多巴胺盐酸盐溶液；将戊二醛溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.06％的戊二醛溶液；然后将0.5mL 3mM的多巴胺盐酸盐溶液与0.5mL质量浓度为0.06％的戊二醛溶液振荡混合均匀，并用盐酸和氢氧化钠水溶液调节混合溶液的pH至6.7，室温陈化，随着反应的进行，溶液初始为淡黄色，然后出现浅黄色浑浊，陈化24小时后，完全变为黄色悬浊液，使用离心机10000rpm离心收集产物，水洗3次，得到多巴胺与戊二醛组装体。从图1中可以看到，多巴胺与戊二醛通过共组装得到了规整的球状结构纳米材料，其尺寸约为180nm。
利用UV光谱对实施例1得到的负载阿霉素和二氢卟酚e6的药物递送系统进行分析，如图2所示，与阿霉素和二氢卟酚e6的紫外吸收相比较，所得样品在485nm处的吸收峰增强，665nm出现了新的吸收峰，证明了化疗药物阿霉素和二氢卟酚e6的成功负载。
分别采用pH 7.2和pH 5.2的PBS缓冲溶液模拟正常组织和肿瘤组织的微环境，对实施例1得到的负载阿霉素和二氢卟酚e6的药物递送系统的化疗药物响应性释放能力进行测试。将药物递送系统分散在不同pH的PBS缓冲溶液中，每隔一段时间测量上清液中阿霉素的浓度，根据标准曲线计算药物释放量。在pH 7.2的中性溶液中，阿霉素释放量较小；而在pH 5.2的酸性溶液中，阿霉素在初始的1小时内出现突然释放，此后缓慢释放。经过14小时的释放研究，阿霉素的累积释放量结果表明，pH 7.2的环境下阿霉素只释放了21％，而在pH5.2环境下阿霉素几乎实现了完全释放。这一结果表明，多巴胺与戊二醛组装体具有pH响应性的药物释放性能。
采用CCK-8细胞活性实验测试实施例1得到的负载阿霉素和二氢卟酚e6的药物递送系统(记为DGNPs@DOX/Ce6)的细胞增殖抑制效果。将HeLa细胞接种到96孔细胞培养板上，细胞密度为1×104个/孔，每孔加入100μL培养液，24小时后移去培养液，PBS清洗两遍后分别加入100μL含有DGNPs@DOX/Ce6、二氢卟酚e6(Ce6)、阿霉素(DOX)、多巴胺与戊二醛组装体(DGNPs)的培养液分别与细胞共培养。一组用660nm的激光(500mW/cm2)照射5min，一组黑暗条件下作为对照，继续培养24小时后检测其细胞毒性。从图3可以看出，对比DGNPs、DOX、Ce6、DGNPs@DOX/Ce6分别与HeLa细胞共培养的结果，DGNPs对肿瘤细胞基本没有伤害，说明DGNPs纳米载体具有很好的生物相容性。DGNPs@DOX/Ce6在黑暗条件下对肿瘤细胞有43％的抑制率，并且具有和单独DOX相当的杀伤效果，这是因为纳米载体在肿瘤微酸环境下将化疗药物DOX进行释放，对肿瘤细胞造成损伤。Ce6在不进行光照的情况下不产生对肿瘤有杀伤作用的活性氧，单独的Ce6在光照条件下能够杀伤46％的细胞，而DGNPs@DOX/Ce6在光照条件对肿瘤细胞的杀伤率达到了73％，说明在化疗药物DOX杀伤细胞的基础上，DGNPs负载的光敏剂Ce6在光照条件下产生了具有细胞毒性的活性氧，进一步对肿瘤细胞造成了杀伤，二者具有良好的协同抗肿瘤效果。

Claims (10)

1.一种多巴胺组装体药物递送系统的制备方法，其特征在于所述方法由下述步骤组成：
(1)将多巴胺盐酸盐溶解于缓冲溶液中，配制成1～10mM的多巴胺盐酸盐溶液；将醛基交联剂溶解于缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.01％～6％的醛基交联剂溶液；然后按照多巴胺盐酸盐与醛基交联剂的物质的量比为10:1～1:10，将多巴胺盐酸盐与醛基交联剂溶液混合均匀，并调节混合溶液pH至弱碱性，室温陈化2～12小时，得到多巴胺与醛基交联剂组装体溶液；
上述的醛基交联剂为戊二醛、氧化海藻酸钠、氧化淀粉、氧化肝素、氧化右旋糖酐的任意一种或两种以上；
(2)向步骤(1)得到的多巴胺与醛基交联剂组装体溶液中加入0.5～10mg/mL的化疗药物水溶液和0.5～10mg/mL的光动力疗法光敏剂溶液，室温振荡下反应12～72小时，将所得悬浊液离心、水洗，得到多巴胺组装体药物递送系统。
2.根据权利要求1所述的多巴胺组装体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，将多巴胺盐酸盐溶解于缓冲溶液中，配制成2～6mM的多巴胺盐酸盐溶液；将醛基交联剂溶解于缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.03％～3％的醛基交联剂溶液；然后按照多巴胺盐酸盐与醛基交联剂的物质的量比为3:1～1:3，将多巴胺盐酸盐溶液与醛基交联剂溶液混合均匀，并调节混合溶液pH至弱碱性，室温陈化4～8小时。
3.根据权利要求1或2所述的多巴胺组装体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的醛基交联剂为戊二醛或氧化海藻酸钠。
4.根据权利要求1或2所述的多巴胺组装体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液、PBS缓冲溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液、硼砂-氢氧化钠缓冲溶液中的任意一种，缓冲溶液的pH为6.5～10。
5.根据权利要求1所述的多巴胺组装体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的化疗药物水溶液和光动力疗法光敏剂溶液的总体积与多巴胺与醛基交联剂组装体溶液的体积比分别为1:10～1:40。
6.根据权利要求5所述的多巴胺组装体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的化疗药物水溶液的浓度为2～8mg/mL，光动力疗法光敏剂溶液的浓度为2～8mg/mL。
7.根据权利要求1或5或6所述的多巴胺组装体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的化疗药物为阿霉素、硼替佐米、紫杉醇、顺铂、5-氟尿嘧啶中的任意一种。
8.根据权利要求1或5或6所述的多巴胺组装体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的光动力疗法光敏剂为二氢卟酚e6、竹红菌素、艾拉、卟啉、酞菁中的任意一种。
9.根据权利要求1所述的多巴胺组装体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，室温振荡下反应24～48小时。
10.权利要求1的方法制备得到的多巴胺组装体药物递送系统。
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