CN113018251B - 一种具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于材料合成和生物医药领域,涉及一种具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统及其制备方法,所述双药物控释系统采用介孔二氧化硅构建,以透明质酸钠作为门控材料封堵介孔二氧化硅的孔道;所述介孔二氧化硅的介孔孔道中负载有阿糖胞苷;所述介孔二氧化硅与壳聚糖、羧甲基纤维素钠形成凝胶体系,所述凝胶体系中负载有甲氨蝶呤。本发明的有益效果是:所制备的pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统能够同时负载两种抗癌药物,并在肿瘤的微酸性和高浓度谷胱甘肽环境下实现两类药物的先后释放。该双药物控释系统制备简单、生物相容性高,可广泛应用于生物医药领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统及其制备方法,属于材料合成和生物医药领域。
背景技术
单药物控释系统是目前研究广泛的一类药物控释系统。然而,长期使用单一的一种抗癌药物,最终会增强癌细胞的耐药性,从而降低治疗效果。因此,双药物控释系统的研发引起了科学家们的广泛关注。在过去的几十年里,研究人员开发了各种各样的药物控释系统来输送不同的药物或生物活性物质。然而,以往的研究集中于单一给药系统,往往不能满足临床治疗的需求。此外,医药和生物医学领域也通常需要不同药物的多重作用。因此,多药联合治疗被认为是具有优势的一种治疗方法,在多种疾病的治疗中采用多种疗效较好的药物能够提高治疗效果。多药联合治疗的优点是药物之间会产生协同作用使单一药物的用量减少,从而降低药物的毒副作用。同时将两种不同的药物封装在单一药物载体中是一个巨大的挑战,也是智能药物控释的一个重要研究方向。大量证据表明,多药联合用药可有效提高抗肿瘤效率,并且能够减少副作用和癌细胞的多药耐药性。因此,能够封装和递送多种药物的控释系统的开发是智能药物递送的一个重要研究方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统的制备方法,能够同时负载两种抗癌药物,并在肿瘤的微酸性和高浓度谷胱甘肽环境下实现两类药物的先后释放。该双药物控释系统制备简单、生物相容性高,可广泛应用于生物医药领域。
一种具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统,所述双药物控释系统采用介孔二氧化硅构建,以透明质酸钠作为门控材料封堵介孔二氧化硅的孔道;所述介孔二氧化硅的介孔孔道中负载有阿糖胞苷;所述介孔二氧化硅与壳聚糖、羧甲基纤维素钠形成凝胶体系,所述凝胶体系中负载有甲氨蝶呤。
本发明还提供一种具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统制备方法,包括以下步骤:
将氨基化的介孔二氧化硅加入到阿糖胞苷溶液中,磁力搅拌后离心分离,得到阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅;
将阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅加入到活化后的透明质酸钠溶液中,磁力搅拌后加入胱胺,反应后冷冻干燥、充分研磨,得到阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠;
将羧甲基纤维素钠采用高碘酸钠氧化,得到氧化羧甲基纤维素钠,将氧化羧甲基纤维素钠溶解于甲氨蝶呤溶液中,再加入阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠,待其分散均匀后,加入壳聚糖和冰醋酸,冷冻干燥后得到双药物控释系统。
进一步的,氨基化的介孔二氧化硅制备过程中,以十六烷基三甲基溴化铵为模板剂。
进一步的,氨基化的介孔二氧化硅制备方法为:将十六烷基三甲基溴化铵加入到氨水、去离子水和乙醇的混合溶液中,将混合溶液机械搅拌30分钟,随后将正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷先后逐滴加入到连续搅拌的溶液中,反应6小时后,将沉淀物离心分离,并用去离子水和无水乙醇反复洗涤后干燥,将干燥后的固体放入到无水甲醇和盐酸的混合溶液中75℃下回流24h以除去模板剂十六烷基三甲基溴化铵,重复3次,将产物用无水乙醇和去离子水反复洗涤,并在50℃下干燥后研磨,即得氨基化的介孔二氧化硅。
进一步的,活化透明质酸钠溶液的步骤为:将透明质酸钠加入到一定pH的磷酸盐缓冲溶液中磁力搅拌12h后溶解,再加入1-乙基-3-二甲基氨基丙基-碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺以活化透明质酸钠,在37℃下反应15min。
进一步的,氧化羧甲基纤维素钠的制备步骤为:将羧甲基纤维素钠在超纯水中溶解12h,加入高碘酸钠,将该溶液在避光条件下连续搅拌24h,然后添加乙二醇搅拌2h后终止反应,将产物置于透析袋放到去离子水中纯化3天,在-45℃下冷冻干燥48h即得氧化羧甲基纤维素钠。
进一步的,加入壳聚糖和冰醋酸后,在-45℃下冷冻干燥48h。
进一步的,阿糖胞苷溶液的浓度是20~80μg/mL;甲氨蝶呤溶液的浓度是20~80μg/mL。
进一步的,磷酸盐缓冲溶液的pH是6.0~7.5。
进一步的,透析袋的分子截留量为3500。
本发明还提供上述具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明所述一种具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统的制备方法,包括以下步骤:
a、制备氨基化的介孔二氧化硅:称取一定量的十六烷基三甲基溴化铵,加入到氨水、去离子水和乙醇的混合溶液中,将混合溶液机械搅拌30分钟,随后将正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷先后逐滴加入到连续搅拌的溶液中,反应6小时后,将沉淀物离心分离,并用去离子水和无水乙醇反复洗涤后干燥,将干燥后的固体放入到无水甲醇和盐酸的混合溶液中75℃下回流24h以除去模板剂十六烷基三甲基溴化铵,重复3次,将产物用无水乙醇和去离子水反复洗涤,并在50℃下干燥后研磨,即得氨基化的介孔二氧化硅;
b、制备阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅:称取一定量氨基化的介孔二氧化硅,加入到50mL一定浓度的阿糖胞苷溶液中,磁力搅拌12h后离心分离,即得阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅;
c、制备阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠:称取一定量的透明质酸钠,加入到一定pH 40mL的磷酸盐缓冲溶液中磁力搅拌12h后溶解,再加入一定量的1-乙基-3-二甲基氨基丙基-碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺以活化透明质酸钠,在37℃下反应15min,将一定量步骤b制备得到的阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅加入到活化后的透明质酸钠溶液中,磁力搅拌1h后加入一定量的胱胺,反应12h后将样品冷冻干燥48h,将干燥后的样品充分研磨得到阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠;
d、制备氧化羧甲基纤维素钠:称取一定量的羧甲基纤维素钠在100mL超纯水中溶解12h,加入一定量的高碘酸钠,将该溶液在避光条件下连续搅拌24h,然后添加乙二醇搅拌2h后终止反应,将产物置于透析袋放到去离子水中纯化3天,在-45℃下冷冻干燥48h即得氧化羧甲基纤维素钠;
e、制备阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统:将步骤d制备的一定量的氧化羧甲基纤维素钠溶解于一定浓度的甲氨蝶呤溶液中,再加入一定量已制备的阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠,待其分散均匀后,加入一定量的壳聚糖和一定体积的冰醋酸,在-45℃下通过冷冻干燥48h后,制备了阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统;
f、阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统在不同的pH条件下进行甲氨蝶呤的体外释放:取2g步骤e制备的阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统,将其置于分子截留量为3500的透析袋中,并将透析袋分别置于50mL pH分别为5.0、6.8和7.4的磷酸盐缓冲溶液中,恒温37℃磁力搅拌进行药物的体外释放,在药物释放过程中每隔1h取出4mL溶液测定释放出的甲氨蝶呤的量,同时补加4mL新鲜的磷酸盐缓冲溶液。使用紫外可见分光光度计测定甲氨蝶呤在302nm处的特征吸收峰强度,计算其浓度,从而计算出在不同pH值时甲氨蝶呤在不同时刻的释药累积百分数;
g、阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统在不同谷胱甘肽浓度下进行阿糖胞苷的体外释放:将10mL浓度为1mmol/L、5mmol/L、20mmol/L的谷胱甘肽溶液分别加入到步骤f中pH为5.0时释药24h后的透析袋中,继续恒温37℃磁力搅拌进行阿糖胞苷的体外释放,在药物释放的过程中每隔1h取出4mL溶液测定释放出的阿糖胞苷的量,同时补加4mL新鲜的磷酸盐缓冲溶液。使用紫外可见分光光度计测定阿糖胞苷在272nm处的特征吸收峰强度,计算其浓度,从而计算出在不同谷胱甘肽浓度下阿糖胞苷在不同时刻的释药累积百分数。
进一步地,步骤a中十六烷基三甲基溴化铵的质量是0.3~1.0g,氨水的体积是1.0~1.5mL,去离子水的体积是80~100mL,无水乙醇的体积是40~90mL,正硅酸乙酯的体积是0.5~1.5mL,3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积0.3~0.7mL,无水甲醇的体积是80~100mL,盐酸的体积是4~6mL。
进一步地,步骤b中加入氨基化的介孔二氧化硅的质量是500~560mg,阿糖胞苷溶液的浓度是20~80μg/mL。
进一步地,步骤c中透明质酸钠的质量是0.6~1.2g,磷酸盐缓冲溶液的pH是6.0~7.5,1-乙基-3-二甲基氨基丙基-碳酰二亚胺盐酸盐的质量是0.94~1.16g,N-羟基琥珀酰亚胺的质量是0.56~0.70g,阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅的质量是400~460mg,胱胺的质量是0.6~0.7g。
进一步地,步骤d中加入羧甲基纤维素钠的质量为0.5~1.5g,加入高碘酸钠的质量为0.5~1.5g,加入乙二醇的体积是0.5~1.5mL,透析袋的分子截留量为3500。
进一步地,步骤e中氧化羧甲基纤维素钠的质量为0.5~1.5g,甲氨蝶呤溶液的浓度是20~80μg/mL,阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠的质量为500~650mg,壳聚糖的质量为0.8~1.5g,冰醋酸的体积是1~3mL。
有益效果
因其具有大的比表面积和孔道体积,常被用于构建刺激响应型的药物控释系统。尽管介孔二氧化硅已被用于药物控释领域,但是也存在着药物的泄漏或者突释的缺点,因此我们在本发明中选择透明质酸钠来改善上述缺点。由于透明质酸钠是细胞外基质的重要组成部分,并且具有较好的生物相容性、生物可降解性和靶向性,因此巧妙地将其设计为门控材料来封堵介孔二氧化硅的孔道,能够避免药物的泄漏和突释。羧甲基纤维素钠和壳聚糖是常见的生物大分子,具有良好的生物可降解性、生物相容性和可交联性能,在药物传递、组织工程和生物医学等领域具有巨大的应用潜力。
本发明将介孔二氧化硅、阿糖胞苷、透明质酸钠、胱胺、甲氨蝶呤、壳聚糖和羧甲基纤维素钠通过温和的化学反应结合在一起,制备了一种具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统。该双药物控释系统可用于同时负载两类抗癌药物,一种药物阿糖胞苷被负载于介孔二氧化硅的介孔孔道中,而另一种药物甲氨蝶呤和负载了阿糖胞苷的介孔二氧化硅一起被包埋于壳聚糖/羧甲基纤维素钠的凝胶体系中,这两种药物可在肿瘤的微酸性和高浓度谷胱甘肽条件下实现先后释放,从而达到双药控制释放的目的。
本发明所制备的pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统能够同时负载两种抗癌药物,并在肿瘤的微酸性和高浓度谷胱甘肽环境下实现两类药物的先后释放。该双药物控释系统制备简单、生物相容性高,可广泛应用于生物医药领域。
附图说明
下面结合附图对本实验进一步说明。
图1为实施例一中阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅的场发射扫描电镜图;
图2为实施例一中阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠的场发射扫描电镜图;
图3为实施例一中阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统的场发射扫描电镜图;
图4为实施例一中氨基化的介孔二氧化硅、阿糖胞苷、透明质酸钠、阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠的红外光谱图;
图5为实施例一中羧甲基纤维素钠、氧化羧甲基纤维素钠、壳聚糖、甲氨蝶呤、和阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统的红外光谱图;
图6为实施例一中不同pH条件下,阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统中甲氨蝶呤的释药曲线图;
图7为实施例一中pH为5.0时,在不同浓度的谷胱甘肽下,阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统中阿糖胞苷的释药曲线图。
图8为对比例一中阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠对HepG2细胞的活性影响图。
图9为对比例二中甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠对HepG2细胞的活性影响图。
图10为对比例三中介孔二氧化硅/透明质酸钠/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠对HepG2和LO2细胞的活性影响图。
图11为实施例一中阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统对HepG2和LO2细胞的活性影响图。
具体实施方式
现在结合具体实施例对本发明做进一步说明,以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例一:
一种具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统的制备方法,包括以下步骤:
(1)称取0.9g的十六烷基三甲基溴化铵,加入到1.4mL氨水、90mL去离子水和70mL乙醇的混合溶液中,将混合溶液机械搅拌30分钟,随后将0.8mL正硅酸乙酯和0.4mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷依次逐滴加入到连续搅拌的溶液中,反应6小时,将沉淀物离心分离,并用去离子水和无水乙醇反复洗涤后干燥,将干燥后的产物放入到90mL无水甲醇和5mL盐酸的混合溶液中75℃下回流24h以除去模板剂十六烷基三甲基溴化铵,重复3次后,将产物用无水乙醇和去离子水反复洗涤,并在50℃下干燥后研磨,即得氨基化的介孔二氧化硅;
(2)称取已制备的550mg氨基化的介孔二氧化硅,加入到50mL浓度为60μg/mL的阿糖胞苷溶液当中,磁力搅拌12h后离心分离,即得到阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅;
(3)称取0.8g的透明质酸钠,加入到40mL pH=6.5的磷酸盐缓冲溶液中磁力搅拌12h溶解,再加入1.14g的1-乙基-3-二甲基氨基丙基-碳酰二亚胺盐酸盐和0.68g的N-羟基琥珀酰亚胺,在37℃下反应15min后,将450mg已制备的阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅加入到活化后的透明质酸钠溶液中,磁力搅拌1h后加入0.68g的胱胺,反应12h后将样品冷冻干燥48h,将干燥后的样品充分研磨得到阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠;
(4)称取1.0g的羧甲基纤维素钠在100mL超纯水中溶解12h,随后加入1.0g的高碘酸钠,将该溶液在避光条件下连续搅拌24h,然后添加1.0mL乙二醇搅拌2h后终止反应,将产物置于分子截留量为3500的透析袋后放到去离子水中纯化3天,在-45℃下冷冻干燥48h即得氧化羧甲基纤维素钠;
(5)将已制备的1.0g氧化羧甲基纤维素钠溶于70μg/mL的甲氨蝶呤中,再加入550mg的阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠,待其分散均匀后,加入1.0g的壳聚糖和2mL冰醋酸,在-45℃下冷冻干燥48h,制备了阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统;
(6)将阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统在不同的pH条件下进行甲氨蝶呤的体外释放:取2g步骤(5)制备的阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统,将其置于分子截留量为3500的透析袋中,并将透析袋分别置于50mL pH分别为5.0、6.8和7.4的磷酸盐缓冲溶液中,恒温37℃磁力搅拌进行药物的体外释放,在药物释放过程中每隔1h取出4mL溶液测定释放出的甲氨蝶呤的量,同时补加4mL新鲜的磷酸盐缓冲溶液。使用紫外可见分光光度计测定甲氨蝶呤在302nm处的特征吸收峰强度,计算其浓度,从而计算出在不同pH值时甲氨蝶呤在不同时刻的释药累积百分数;
(7)阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统在不同谷胱甘肽浓度下进行阿糖胞苷的体外释放:将10mL浓度分别为1mmol/L、5mmol/L、20mmol/L的谷胱甘肽溶液加入到步骤(6)中pH为5.0时释药24h后的透析袋中,继续恒温37℃磁力搅拌进行阿糖胞苷的体外释放,在药物释放的过程中每隔1h取出4mL溶液测定释放出的阿糖胞苷的量,同时补加4mL新鲜的磷酸盐缓冲溶液。使用紫外可见分光光度计测定阿糖胞苷在272nm处的特征吸收峰强度,计算其浓度,从而计算出在不同谷胱甘肽浓度下阿糖胞苷在不同时刻的释药累积百分数;
(8)阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统对HepG2和LO2细胞的活性测试:将阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统分别配置成浓度为0.16、0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00和100.00μg/mL的溶液。然后将HepG2和LO2细胞经消化、计数、制成1×105个/mL的细胞悬液,接种于96孔板中,置于37℃,5%CO2培养箱中培养过夜,每孔加入上述浓度的溶液,同时设立阴性对照组及空白组,将板置于培养箱中培养72h后,显微镜下观察各组细胞形态,每孔加入10μL CCK8溶液,在细胞培养箱内继续孵育4小时,用酶标仪在450nm下测定吸光值,并计算细胞活性。
对比例一:
阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠对HepG2细胞的活性测试,包括以下步骤:
(1)称取0.9g的十六烷基三甲基溴化铵,加入到1.4mL氨水、90mL去离子水和70mL乙醇的混合溶液中,将混合溶液机械搅拌30分钟,随后将0.8mL正硅酸乙酯和0.4mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷依次逐滴加入到连续搅拌的溶液中,反应6小时,将沉淀物离心分离,并用去离子水和无水乙醇反复洗涤后干燥,将干燥后的产物放入到90mL无水甲醇和5mL盐酸的混合溶液中75℃下回流24h以除去模板剂十六烷基三甲基溴化铵,重复3次后,将产物用无水乙醇和去离子水反复洗涤,并在50℃下干燥后研磨,即得氨基化的介孔二氧化硅;
(2)称取已制备的550mg氨基化的介孔二氧化硅,加入到50mL浓度为60μg/mL的阿糖胞苷溶液当中,磁力搅拌12h后离心分离,即得到阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅;
(3)称取0.8g的透明质酸钠,加入到40mL pH=6.5的磷酸盐缓冲溶液中磁力搅拌12h溶解,再加入1.14g的1-乙基-3-二甲基氨基丙基-碳酰二亚胺盐酸盐和0.68g的N-羟基琥珀酰亚胺,在37℃下反应15min后,将450mg已制备的阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅加入到活化后的透明质酸钠溶液中,磁力搅拌1h后加入0.68g的胱胺,反应12h后将样品冷冻干燥48h,将干燥后的样品充分研磨得到阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠;
(4)阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠对HepG2细胞的活性测试:将阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠分别配置成浓度为0.16、0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00和100.00μg/mL的溶液。然后将HepG2细胞经消化、计数、制成1×105个/mL的细胞悬液,接种于96孔板中,置于37℃,5%CO2培养箱中培养过夜,每孔加入上述浓度的溶液,同时设立阴性对照组及空白组,将板置于培养箱中培养72h后,显微镜下观察各组细胞形态,每孔加入10μL CCK8溶液,在细胞培养箱内继续孵育4小时,用酶标仪在450nm下测定吸光值,并计算细胞活性。
对比例二:
甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠对HepG2细胞的活性测试,包括以下步骤:
(1)称取1.0g的羧甲基纤维素钠在100mL超纯水中溶解12h,随后加入1.0g的高碘酸钠,将该溶液在避光条件下连续搅拌24h,然后添加1.0mL乙二醇搅拌2h后终止反应,将产物置于分子截留量为3500的透析袋后放到去离子水中纯化3天,在-45℃下冷冻干燥48h即得氧化羧甲基纤维素钠;
(2)将已制备的1.0g氧化羧甲基纤维素钠溶于70μg/mL的甲氨蝶呤中,待其完全溶解后,加入1.0g的壳聚糖和2mL冰醋酸,在-45℃下冷冻干燥48h,制备得到了甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠;
(3)甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠对HepG2细胞的活性测试:将甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠分别配置成浓度为0.16、0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00和100.00μg/mL的溶液。然后将HepG2细胞经消化、计数、制成1×105个/mL的细胞悬液,接种于96孔板中,置于37℃,5%CO2培养箱中培养过夜,每孔加入上述浓度的溶液,同时设立阴性对照组及空白组,将板置于培养箱中培养72h后,显微镜下观察各组细胞形态,每孔加入10μL CCK8溶液,在细胞培养箱内继续孵育4小时,用酶标仪在450nm下测定吸光值,并计算细胞活性。
对比例三:
介孔二氧化硅/透明质酸钠/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠对HepG2和LO2细胞的活性测试,包括以下步骤:
(1)称取0.9g的十六烷基三甲基溴化铵,加入到1.4mL氨水、90mL去离子水和70mL乙醇的混合溶液中,将混合溶液机械搅拌30分钟,随后将0.8mL正硅酸乙酯和0.4mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷依次逐滴加入到连续搅拌的溶液中,反应6小时,将沉淀物离心分离,并用去离子水和无水乙醇反复洗涤后干燥,将干燥后的产物放入到90mL无水甲醇和5mL盐酸的混合溶液中75℃下回流24h以除去模板剂十六烷基三甲基溴化铵,重复3次后,将产物用无水乙醇和去离子水反复洗涤,并在50℃下干燥后研磨,即得氨基化的介孔二氧化硅;
(2)称取0.8g的透明质酸钠,加入到40mL pH=6.5的磷酸盐缓冲溶液中磁力搅拌12h溶解,再加入1.14g的1-乙基-3-二甲基氨基丙基-碳酰二亚胺盐酸盐和0.68g的N-羟基琥珀酰亚胺,在37℃下反应15min后,将550mg已制备的氨基化的介孔二氧化硅加入到活化后的透明质酸钠溶液中,磁力搅拌1h后加入0.68g的胱胺,反应12h后将样品冷冻干燥48h,将干燥后的样品充分研磨得到介孔二氧化硅/透明质酸钠;
(3)称取1.0g的羧甲基纤维素钠在100mL超纯水中溶解12h,随后加入1.0g的高碘酸钠,将该溶液在避光条件下连续搅拌24h,然后添加1.0mL乙二醇搅拌2h后终止反应,将产物置于分子截留量为3500的透析袋后放到去离子水中纯化3天,在-45℃下冷冻干燥48h即得氧化羧甲基纤维素钠;
(4)将已制备的1.0g氧化羧甲基纤维素钠溶于20mL的超纯水中,再加入550mg的介孔二氧化硅/透明质酸钠,待其分散均匀后,加入1.0g的壳聚糖和2mL冰醋酸,在-45℃下冷冻干燥48h,制备了介孔二氧化硅/透明质酸钠/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠;
(5)介孔二氧化硅/透明质酸钠/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠对HepG2和LO2细胞的活性测试:将介孔二氧化硅/透明质酸钠/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠分别配置成浓度为0.16、0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00和100.00μg/mL的溶液。然后将HepG2细胞经消化、计数、制成1×105个/mL的细胞悬液,接种于96孔板中,置于37℃,5%CO2培养箱中培养过夜,每孔加入上述浓度的溶液,同时设立阴性对照组及空白组,将板置于培养箱中培养72h后,显微镜下观察各组细胞形态,每孔加入10μL CCK8溶液,在细胞培养箱内继续孵育4小时,用酶标仪在450nm下测定吸光值,并计算细胞活性。
实施例一中制备的阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅,阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠、阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统的场发射扫描电镜图分别如图1、图2和图3所示。从图1中可以清晰地看到阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅呈粒径均一的球形结构。从图2中能够看到形貌规整的球型阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅被透明质酸钠包覆。从图3中可以看到阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统呈现出具有较大空腔的三维结构。
实施例一中制备的氨基化的介孔二氧化硅、阿糖胞苷、透明质酸钠、和阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠的红外光谱图如图4所示,其中氨基化的介孔二氧化硅在1087cm-1处的吸收峰主要归因于Si–O–Si基团的特征峰,在1560cm-1处出现的弱峰归因于N–H键的弯曲振动,表明了氨基化的介孔二氧化硅的成功合成,阿糖胞苷在1652cm-1处的特征峰归因于阿糖胞苷六元环的分子结构中C=O键的伸缩振动,798cm-1处的特征峰归因于阿糖胞苷分子结构中C–H键的弯曲振动,透明质酸钠在3407cm-1处的特征峰归因于透明质酸钠分子结构中–OH的伸缩振动,1411cm-1处的强吸收峰归因于C–O和C=O特征峰的互相叠加。阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠在3407cm-1、1411cm-1处的特征峰分别归属于透明质酸钠分子结构中的–OH、C–O和C=O基团的特征峰,在1087cm-1处的特征峰归属于介孔二氧化硅中Si–O–Si基团的特征峰,1652cm-1和798cm-1处的特征峰证实了阿糖胞苷分子中C=O键和C–H键的存在。由上述红外光谱数据可知,阿糖胞苷被加载到了氨基化的介孔二氧化硅的孔道中并且被透明质酸钠包封,因此成功制备了阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠。
实施例一中制备的羧甲基纤维素钠、氧化羧甲基纤维素钠、壳聚糖、甲氨蝶呤、和阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统的红外光谱图如图5所示,从图中可以看出羧甲基纤维素钠在1600cm-1和1413cm-1处的特征吸收峰归属为羧甲基纤维素钠结构中–COO–的不对称伸缩振动和对称伸缩振动。而氧化羧甲基纤维素钠在1735cm-1处出现了一个新的特征峰,这主要是由于羧甲基纤维素钠中的羟基被高碘酸钠氧化生成了醛基后产生的吸收峰。壳聚糖中1157cm-1处出现的特征峰主要归因于C–O–C基团的弯曲振动,896cm-1处的特征峰归因于壳聚糖中β-(1→4)糖苷键的特征峰。甲氨蝶呤在1500cm-1和831cm-1处的特征峰归属于芳环系统。最终合成的阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统在1413cm-1和1157cm-1处的特征峰分别归属于羧甲基纤维素钠中的–COO–基团和壳聚糖中的C–O–C基团,1500cm-1和831cm-1处的特征峰证实了甲氨蝶呤分子中芳香环的存在,而1650cm-1处的特征峰归因于氧化羧甲基纤维素钠中的醛基和壳聚糖中的氨基发生席夫碱反应生成了酰腙键。由上述红外光谱数据可知成功制备了阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统。
实施例一中不同pH值下阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统的药物释放曲线图如图6所示。从图中可以看出,甲氨蝶呤的累积释药百分数具有明显的pH敏感性,酸性越强,在相同的时间内累积释药百分数越大,这是由于酸性条件下酰腙键的水解使得阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统的三维空腔结构被破坏,进而导致药物甲氨蝶呤首先释放。在12h时释药基本达到平衡,这时甲氨蝶呤的累积释药百分数在pH为5.0、6.8和7.4时分别为79.76%、45.65%和28.84%。说明酸性条件下有利于酰腙键的水解,从而更有利于甲氨蝶呤的释放。
实施例一中在pH为5.0的条件下,当不同浓度的谷胱甘肽加入时,阿糖胞苷的药物释放曲线图如图7所示。从图中可以看出,阿糖胞苷的释放具有明显的谷胱甘肽响应性,这主要是由于在pH=5.0的条件下,首先阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统的三维空腔结构分解,在谷胱甘肽存在的条件下,可以将交联透明质酸钠的胱胺中的二硫键还原为巯基,从而导致包封材料透明质酸钠从介孔二氧化硅的表面脱落进而导致药物的加速释放。在24h时释药基本达到平衡,这时阿糖胞苷的累积释药百分数在浓度为1mmol/L、5mmol/L和20mmol/L时分别为17.63%、31.66%和92.24%。说明阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统在谷胱甘肽刺激的条件下有利于阿糖胞苷的释放。
对比例一中阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠对HepG2细胞的活性影响如图8所示。从图中可看出,阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠对HepG2细胞具有浓度依赖性的细胞毒性。随着浓度的增加,细胞抑制率明显上升,在浓度为100.00μg/mL下,HepG2的细胞存活率为36.87%,说明在HepG2细胞内部高浓度谷胱甘肽刺激下,阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠能够释放阿糖胞苷杀死肿瘤细胞。
对比例二中甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠对HepG2细胞的活性影响如图9所示。从图中可看出,甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠对HepG2细胞同样具有浓度依赖性的细胞毒性。随着浓度的增加,细胞抑制率明显上升,在浓度为100.00μg/mL下,HepG2的细胞存活率为45.10%,说明在HepG2细胞的微酸性环境中,甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠能够释放甲氨蝶呤杀死肿瘤细胞。
对比例三中介孔二氧化硅/透明质酸钠/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠对HepG2细胞和LO2细胞的活性影响如图10所示。从图中可看出,孵育72小时后,即使在高浓度100.00μg/mL的条件下,超过95%的LO2和HepG2依旧存活,几乎没有观察到介孔二氧化硅/透明质酸钠/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠的细胞毒性。表明了载体介孔二氧化硅/透明质酸钠/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠具有优异的生物相容性。
实施例一中阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统对HepG2和LO2细胞的活性影响如图11所示。从图中可看出,阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统对LO2细胞的杀伤性较小,在浓度为100.00μg/mL下,LO2细胞的存活率高达83%,说明该药物控释系统对正常细胞的副作用较小;而对HepG2细胞具有浓度依赖性的细胞毒性。随着浓度的增加,细胞抑制率明显上升,在浓度为100.00μg/mL下,HepG2的细胞存活率仅为10.2%,说明在HepG2细胞的微酸性和高浓度谷胱甘肽环境中,阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠/甲氨蝶呤/壳聚糖/氧化羧甲基纤维素钠双药物控释系统能够先后释放甲氨蝶呤和阿糖胞苷两种抗癌药,从而更多的杀死肿瘤细胞。上述结果表明,该双药物控释系统相比于单载药药物控释系统,可以更为有效的抑制肿瘤细胞的生长,因而在生物医学领域具有更为广阔的应用前景。
Claims (8)
1.一种具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统制备方法,其特征在于,所述双药物控释系统采用介孔二氧化硅构建,以透明质酸钠作为门控材料封堵介孔二氧化硅的孔道;所述介孔二氧化硅的介孔孔道中负载有阿糖胞苷;所述介孔二氧化硅与壳聚糖、羧甲基纤维素钠形成凝胶体系,所述凝胶体系中负载有甲氨蝶呤;
所述方法包括以下步骤:
将氨基化的介孔二氧化硅加入到阿糖胞苷溶液中,磁力搅拌后离心分离,得到阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅;
将阿糖胞苷/氨基化的介孔二氧化硅加入到活化后的透明质酸钠溶液中,磁力搅拌后加入胱胺,反应后冷冻干燥、充分研磨,得到阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠;
将羧甲基纤维素钠采用高碘酸钠氧化,得到氧化羧甲基纤维素钠,将氧化羧甲基纤维素钠溶解于甲氨蝶呤溶液中,再加入阿糖胞苷/介孔二氧化硅/透明质酸钠,待其分散均匀后,加入壳聚糖和冰醋酸,冷冻干燥后得到双药物控释系统;
氨基化的介孔二氧化硅制备过程中,以十六烷基三甲基溴化铵为模板剂;
氨基化的介孔二氧化硅制备方法为:将十六烷基三甲基溴化铵加入到氨水、去离子水和乙醇的混合溶液中,将混合溶液机械搅拌30分钟,随后将正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷先后逐滴加入到连续搅拌的溶液中,反应6小时后,将沉淀物离心分离,并用去离子水和无水乙醇反复洗涤后干燥,将干燥后的固体放入到无水甲醇和盐酸的混合溶液中75℃下回流24h以除去模板剂十六烷基三甲基溴化铵,重复3次,将产物用无水乙醇和去离子水反复洗涤,并在50℃下干燥后研磨,即得氨基化的介孔二氧化硅。
2.根据权利要求1所述的具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统制备方法,其特征在于,活化透明质酸钠溶液的步骤为:将透明质酸钠加入到磷酸盐缓冲溶液中磁力搅拌12h后溶解,再加入1-乙基-3-二甲基氨基丙基-碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺以活化透明质酸钠,在37℃下反应15min。
3.根据权利要求1所述的具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统制备方法,其特征在于,氧化羧甲基纤维素钠的制备步骤为:将羧甲基纤维素钠在超纯水中溶解12h,加入高碘酸钠,将该溶液在避光条件下连续搅拌24h,然后添加乙二醇搅拌2h后终止反应,将产物置于透析袋放到去离子水中纯化3天,在-45℃下冷冻干燥48h即得氧化羧甲基纤维素钠。
4.根据权利要求1所述的具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统制备方法,其特征在于,加入壳聚糖和冰醋酸后,在-45℃下冷冻干燥48h。
5.根据权利要求1所述的具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统制备方法,其特征在于,阿糖胞苷溶液的浓度是20~80μg/mL;甲氨蝶呤溶液的浓度是20~80μg/mL。
6.根据权利要求2所述的具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统制备方法,其特征在于,磷酸盐缓冲溶液的pH是6.0~7.5。
7.一种具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统,其特征在于,由权利要求1~6任一项所述方法制备而成。
8.权利要求7所述的具有pH和谷胱甘肽双重响应的双药物控释系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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