CN104758948A

CN104758948A - 基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物的制备方法及应用

Info

Publication number: CN104758948A
Application number: CN201510199648.0A
Authority: CN
Inventors: 王蕾; 孟德辉; 郝永伟; 张潘潘; 史进进; 赵亚林; 李懂; 张兵详; 张振中; 张云
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2015-04-25
Filing date: 2015-04-25
Publication date: 2015-07-08
Anticipated expiration: 2035-04-25
Also published as: CN104758948B

Abstract

本发明涉及基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物的制备方法及应用，可有效解决现有抗肿瘤药物毒副作用大，生物相容性差，靶向性差的问题，方法是，首先对金纳米星载体进行结构修饰，与含有巯基的氨基化合物反应，得到氨基修饰的金纳米星溶液；再将氨基修饰的金纳米星与活化羧基的肼键化合物进行酰胺反应，生成末端连接有肼键修饰的金纳米星溶液；然后再利用其末端的肼键与含有羰基的阿霉素进行化学反应，形成具有pH敏感的腙键化合物；最后，将此化合物通过硫金健与巯基化的NGR反应，即得，本发明体物理化学稳定性良好，制备工艺简单且原料来源丰富，成本低，毒副作用小，能有效抑制肿瘤细胞增殖，是抗肿瘤靶向诊断治疗药物上的创新。

Description

基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及医药，特别是一种基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物（系统）的制备方法及应用。

背景技术

纳米金/银是以金、银的金属盐为原料，通过控制实验条件合成具有不同性质的纳米尺度的金或银。目前可以通过不同的合成方法，合成球形、棒形、星形等形态，从而使纳米金/银具备不同的理化特性，其尺寸大小一般10～100 nm。它们具备如下优点: （1）制备过程简单，分散性好；（2）可调控的介电、光电特性；（3）颗粒表面与生物分子(如抗体、激素、蛋白等)能有效结合；（4）良好的生物相容性和稳定性；（5）具有表面增强拉曼散射（SERS）性质；（6）纳米金能很好地吸收近红外光，并将之转化为热能或者产生单线态氧，是一种优良的光热/光动力材料；（7）可作为抗肿瘤药物的载体。

射频（Radiofrequency， RF）是一种高频交流变化电磁波的简称，表示可以辐射到空间的电磁频率，频率范围从300KHz～30GHz之间。其中最常用频率是13.56MHz。在13.56 MHz射频作用下，纳米金材料溶液的温度比无射频照射的纳米金材料溶液升高10～20℃。射频治疗是通过射频电磁场对人体局部组织进行加热治疗，其作用主要是通过感应电作用、电解作用以及热效应等对组织产生的生物学效应，从而杀死肿瘤细胞或者组织。

金纳米星作为一种新型纳米材料，有内核和尖锐分支结构组成，其核结构与尖端分支结构在近红外区均具有等离子共振吸收峰，能够在射频照射的情况下可以产生活性氧，活性氧包括单线态氧、超氧负离子等。金纳米星的纯态氧发生的量子产出率显著高于其他代表性的光敏剂（例如：卟啉类），并且对人体无毒性，因此，被寄予较大期望用作光动力学治疗疗的光敏剂。金纳米星在射频照射下产生活性氧为高度反应性的，并且可以表现出明显的细胞毒性，比如裂解细胞中的DNA，抑制细胞的有丝分裂以及生长，还可以抑制细胞蛋白水解酶的活性。由此推断，金纳米星可以用于射频治疗肿瘤。

金纳米星在高盐和某些生物分子(核酸、蛋白质等)存在情况下易发生聚集和团聚，稳定性差。为提高金纳米星的稳定性和生物相容性，我们将巯基化的聚乙二醇和聚醚酰亚胺通过巯基和金形成的硫金键连接于金纳米星表面。将水溶性的具有长循环特性的聚乙二醇连接于金纳米星表面，不但能够利用空间位阻效果，改善金纳米星稳定性，延长体内循环时间，降低毒性，而且聚乙二醇携带的不同侧链结构为金纳米星表面的靶向修饰提供了有效的修饰位点。另外，巯基化聚醚酰亚胺含有较多质子化的多级氨的氮原子，能够在酸性的溶酶体中大量捕获质子，导致溶酶体渗透性肿胀、破裂，进而将内吞的药物迅速释放到细胞质，实现溶酶体逃逸。

有研究表明，NGR基序可以特异性靶向肿瘤血管的氨基肽酶N（CD13），但是对正常的髓样细胞或上皮细胞中表达的氨基肽酶基本没有影响。因此，本研究利用NGR作为肿瘤靶向分子，利用末端用半胱氨酸进行修饰的NGR多肽通过硫金键连接于金纳米星表面以达到肿瘤靶向的目的。

阿霉素是一种广谱的化疗药物，在临床上常用于治疗乳腺癌,儿童实体瘤，软组织瘤，恶心淋巴癌等恶性肿瘤。近年来的临床研究发现，肿瘤细胞对阿霉素的耐药性，以及其潜在的心脏毒性限制了其进一步的应用。若长期使用阿霉素容易导致心肌损伤，可诱发充血性心力衰竭。临床肿瘤病理学研究发现，肿瘤组织局部组织缺血时，肿瘤间质液会出现异常酸化现象及pH比正常组织低的事实。因此，鉴于肿瘤的微酸性环境，我们将阿霉素通过低pH敏感的腙键连接于靶向药物传递系统中，不但能够借助靶向递送系统将药物递送至肿瘤部位，而且能够实现药物在酸性肿瘤微环境中有效释放，进而提高疗效、降低毒副作用。同时，由于PEI的质子海绵作用，促进药物溶酶体逃逸，减少药物在溶酶体内的降解，可以进一步提高药物的抗肿瘤效果。

X-射线计算机断层（X-ray Computed Tomography，CT）成像技术是利用X射线对不同物质穿透本领的差异，由于生物体不同组织有密度和厚度区别，当X线透过生物体不同组织结构时，其被吸收的程度不同，所以于X 射线片上显现黑白强度不同的影像图。在肿瘤成像技术中，X-ray/CT 成像是目前医院最常用的诊断工具，能够示踪肿瘤的位置、尺寸和扩散等。然而，目前使用CT造影剂主要是含碘（Z = 53）的分子（如碘海酶、碘帕醇和碘普罗胺等），而这些造影剂在临床上也逐渐出现不足。例如，容易被肾脏清除而使造影时间很短，具有肾毒性，而且，X 射线会诱导含碘物质电离出碘离子，造成毒性。然而，纳米颗粒的尺寸小（1～100 nm），可以进入微米尺寸内径的毛细血管，因此能更多地进入组织；而且，由于癌变组织部位毛细血管的通透性增强，纳米颗粒可以通过渗漏作用更多地沉积在癌变组织上，从而更好地对癌变区域成像。同时，与碘相比，金有着较高的原子序数（Au：79；I：53）和 X 射线吸收系数（100keV时Au：5.16 cm2 /g；I：1.94 cm2 /g），金可以显著阻碍 X 射线的传播。所以纳米金可以用于 CT 造影剂的开发，且作为X-ray成像剂有望用于肿瘤的早期诊断。

纳米诊疗学通过将药物和成像试剂集成于纳米颗粒中，有针对性地递送到病变组织，提高治疗效果和减少对正常组织的毒副作用，实现在肿瘤治疗中实时检测肿瘤治疗效果，为改进肿瘤治疗方案，提高肿瘤治愈率和减轻患者痛苦具有重要意义。其中，金纳米星因其独特的表面效应和尺寸效应而有望用于癌症的诊断和治疗。通过优化载体材料构建稳定、无毒和生物相容性好的纳米载体，利用纳米载体结合抗癌药物和靶向分子，集合药物靶向运输、活体实时追踪、药物治疗和预后监测等功能于一体的多功能纳米体系将是未来的研究趋势，这将为有效地提高药物传递效率和减轻药物毒副作用提供强有力的支持。金纳米星将能够实现癌症诊疗一体化，并具有针对性强、治疗效率高和安全无毒等显著优势，为癌症的诊疗一体化带来了新的机遇。那么如何制备基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物，至今未见有切实有效方法的报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术上的缺陷，本发明之目的就是提供一种基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物的制备方法及应用，可有效解决现有抗肿瘤药物毒副作用大，生物相容性差，靶向性差的问题。

本发明解决的技术方案是，首先对金纳米星载体进行结构修饰，与含有巯基的氨基化合物反应，得到氨基修饰的金纳米星溶液；再将氨基修饰的金纳米星与活化羧基的肼键化合物进行酰胺反应，生成末端连接有肼键修饰的金纳米星溶液；然后再利用其末端的肼键与含有羰基的阿霉素进行化学反应，形成具有pH敏感的腙键化合物；最后，将此化合物通过硫金健与巯基化的NGR反应，即得基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物（系统），具体步骤如下：

（1）制备氨基化的金纳米星：在18～25℃，300～720r/min的磁力搅拌下，在重量浓度为50μg/mL的金纳米星溶液10～20 mL中加入重量浓度0.1～10.0 mg/mL的氨基化合物1～5mL，室温避光搅拌反应6～12h，10000 rpm高速离心30min，再用超纯水复溶，得氨基化的金纳米星溶液；

所述的氨基化合物为NH₂-PEG2000-SH或PEI-SH；

（2）制备肼键修饰的金纳米星溶液：先称取对羧基苯肼1.5～4.5 mg，用超纯水溶解，得羧基化溶液，再称取1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2.5～6.0 mg、N-羟基琥珀酰亚胺0.5～3.5 mg和4-二甲氨基吡啶1.6-2.0mg依次加入1～3mL二甲基亚砜中，然后将羧基化溶液加入到二甲基亚砜溶剂中进行羧基化反应，得活化溶液，将活化溶液加入步骤（1）制备的氨基化的金纳米星溶液中，在氮气保护下，室温避光搅拌反应24～48h，再10000rpm高速离心30 min，去除游离的小分子，得肼键修饰的金纳米星溶液；

（3）制备载阿霉素的金纳米星：将步骤（2）制备的肼键修饰的金纳米星溶液干燥，得粉末（GNSTs-PEG/PEI-HBA），将粉末和阿霉素（DOX）以重量比1：1.5～3.0依次加到10～20 mL的反应溶剂中，室温避光反应24～48h，得以腙键连接的金纳米星载抗肿瘤药物溶液，再10000 rpm高速离心30min（去除游离的阿霉素和二甲基亚砜），干燥，得载阿霉素的金纳米星；

所述的干燥为冷冻干燥、真空干燥或烘干中的一种；反应溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲液（中性）中的一种；

（4）制备基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物：将步骤（3）制备的载阿霉素的金纳米星在18～25℃、300～720 r/min的磁力搅拌下用超纯水10～20mL溶解，再在氮气保护下，加入NGR 1～3mg， 25～35 ℃、200～400r/min避光反应24～48h，最终得基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物。

本发明制备的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物粒径为80～150nm，可有效用于制备主动靶向抗肿瘤药物，或在制备抗肿瘤光动力在射频照射热敏剂中的应用，或在制备抗肿瘤早期诊断X-ray成像造影剂中的应用，或制备作为集诊断和治疗为一体的抗肿瘤传递系统药物中的应用。

本发明基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物，可以负载化疗药物。金纳米星具有在射频照射下产生过高热和X-ray成像的特性，通过利用在射频照射下产生高温（＞42℃）可促使阿霉素在肿瘤部位靶向释放，用于杀死肿瘤细胞，同时金纳米星可以作为造影剂用于X-Ray成像。从而实现诊断和热疗、化疗联合抗肿瘤的作用；本发明体物理化学稳定性良好，制备工艺简单且原料来源丰富，成本低，毒副作用小，能有效抑制肿瘤细胞增殖，是抗肿瘤靶向诊断治疗药物（载体）上的创新。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。

实施例1

本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：

（1）制备氨基化的金纳米星：在25℃，540r/min的磁力搅拌下，在重量浓度为50μg/mL的金纳米星溶液20 mL中加入重量浓度0.5mg/mL的NH₂-PEG2000-SH溶液1mL和重量浓度10/mg/mL的PEI-SH溶液1mL，室温避光搅拌反应12h，10000 rpm高速离心30min，得沉淀，沉淀用超纯水22mL复溶，得氨基化的金纳米星（GNSTs-PEG/PEI）溶液；

（2）制备肼键修饰的金纳米星溶液：先取对羧基苯肼2.54mg，用0.2mL超纯水溶解，得到羧基化溶液，再分别称取1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐4.06mg、N-羟基琥珀酰亚胺1.78mg和4-二甲氨基吡啶1.8mg依次加入2mL二甲基亚砜中，然后将羧基化溶液加入到二甲基亚砜溶剂中进行羧基化反应，得活化溶液，将活化溶液加入步骤（1）制备的氨基化的金纳米星溶液中，在氮气保护下，室温避光搅拌反应48h，再10000rpm高速离心30 min，去除游离的小分子，得肼键修饰的金纳米星（GNSTs-PEG/PEI-HBA）溶液；

（3）制备载阿霉素的金纳米星：将步骤（2）制备的肼键修饰的金纳米星溶液冷冻干燥，得肼键修饰的金纳米星（GNSTs-PEG/PEI-HBA）粉末，将粉末和阿霉素（DOX）以重量比1：2依次加到20mL的二甲基亚砜中，室温避光反应48h，得以腙键连接的金纳米星载抗肿瘤药物溶液，再10000 rpm高速离心30min（去除游离的阿霉素和二甲基亚砜），冷冻干燥，得载阿霉素的金纳米星（GNSTs-PEG/PEI-HBA-DOX）；

（4）制备基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物：将步骤（3）制备的载阿霉素的金纳米星在25℃、540 r/min的磁力搅拌下用超纯水20mL溶解，再在氮气保护下，加入NGR 2mg，35 ℃、300r/min避光反应24h，最终得基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物（NGR/GNSTs-PEG/PEI-HBA-DOX）。

实施例2

本发明在具体实施中，还可由以下步骤实现：

（1）制备氨基化的金纳米星：在19℃，700r/min的磁力搅拌下，在重量浓度为50μg/mL的金纳米星溶液15mL中加入重量浓度5mg/mL的NH₂-PEG2000-SH 3mL，室温避光搅拌反应9h，10000 rpm高速离心30min，再用超纯水复溶，得氨基化的金纳米星（GNSTs-PEG）溶液；

（2）制备肼键修饰的金纳米星溶液：先称取对羧基苯肼3mg，用超纯水溶解，得羧基化溶液，再称取1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐4.5mg、N-羟基琥珀酰亚胺2mg和4-二甲氨基吡啶1.7mg依次加入2mL二甲基亚砜中，然后将羧基化溶液加入到二甲基亚砜溶剂中进行羧基化反应，得活化溶液，将活化溶液加入步骤（1）制备的氨基化的金纳米星溶液中，在氮气保护下，室温避光搅拌反应36h，再10000rpm高速离心30 min，去除游离的小分子，得肼键修饰的金纳米星（GNSTs-PEG-HBA）溶液；

（3）制备载阿霉素的金纳米星：将步骤（2）制备的肼键修饰的金纳米星溶液真空干燥，得粉末（GNSTs-PEG-HBA），将粉末和阿霉素（DOX）以重量比1：1.8依次加到15mL的二甲基甲酰胺中，室温避光反应36h，得以腙键连接的金纳米星载抗肿瘤药物溶液，再10000 rpm高速离心30min（去除游离的阿霉素和二甲基亚砜），真空干燥，得载阿霉素的金纳米星（GNSTs-PEG-HBA-DOX）；

（4）制备基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物：将步骤（3）制备的载阿霉素的金纳米星在22℃、500r/min的磁力搅拌下用超纯水15mL溶解，再在氮气保护下，加入NGR 2mg， 30℃、300r/min避光反应36h，最终得基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物（NGR/GNSTs-PEG-HBA-DOX）。

实施例3

本发明在具体实施中，还可由以下步骤实现：

（1）制备氨基化的金纳米星：在23℃，400r/min的磁力搅拌下，在重量浓度为50μg/mL的金纳米星溶液18mL中加入重量浓度9mg/mL的PEI-SH 4mL，室温避光搅拌反应10h，10000 rpm高速离心30min，再用超纯水复溶，得氨基化的金纳米星（GNSTs-PEI）溶液；

（2）制备肼键修饰的金纳米星溶液：先称取对羧基苯肼3.5mg，用超纯水溶解，得羧基化溶液，再称取1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐4mg、N-羟基琥珀酰亚胺3mg和4-二甲氨基吡啶1.9mg依次加入2.5mL二甲基亚砜中，然后将羧基化溶液加入到二甲基亚砜溶剂中进行羧基化反应，得活化溶液，将活化溶液加入步骤（1）制备的氨基化的金纳米星溶液中，在氮气保护下，室温避光搅拌反应40h，再10000rpm高速离心30 min，去除游离的小分子，得肼键修饰的金纳米星（GNSTs-PEI-HBA）溶液；

（3）制备载阿霉素的金纳米星：将步骤（2）制备的肼键修饰的金纳米星溶液烘干，得粉末（GNSTs-PEI-HBA），将粉末和阿霉素（DOX）以重量比1：1.6依次加到12mL的反应溶剂中，室温避光反应40h，得以腙键连接的金纳米星载抗肿瘤药物溶液，再10000 rpm高速离心30min（去除游离的阿霉素和二甲基亚砜），烘干燥，得载阿霉素的金纳米星（GNSTs-PEI-HBA-DOX）；

（4）制备基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物：将步骤（3）制备的载阿霉素的金纳米星在23℃、400r/min的磁力搅拌下用超纯水18mL溶解，再在氮气保护下，加入NGR 2.5mg， 28℃、350r/min避光反应40h，最终得基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物（NGR/GNSTs-PEI-HBA-DOX）。

实施例4

本发明在具体实施中，也可由以下步骤实现：

（1）制备氨基化的金纳米星：在20～22℃，500～600r/min的磁力搅拌下，在重量浓度为50μg/mL的金纳米星溶液14～16mL中加入重量浓度4～6mg/mL的氨基化合物2～4mL，室温避光搅拌反应8～10h，10000 rpm高速离心30min，再用超纯水复溶，得氨基化的金纳米星溶液；

（2）制备肼键修饰的金纳米星溶液：先称取对羧基苯肼2.5～3.5mg，用超纯水溶解，得羧基化溶液，再称取1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐3～4mg、N-羟基琥珀酰亚胺1.5～2.5mg和4-二甲氨基吡啶1.7～1.9mg依次加入1.5～2.5mL二甲基亚砜中，然后将羧基化溶液加入到二甲基亚砜溶剂中进行羧基化反应，得活化溶液，将活化溶液加入步骤（1）制备的氨基化的金纳米星溶液中，在氮气保护下，室温避光搅拌反应30～35h，再10000rpm高速离心30 min，去除游离的小分子，得肼键修饰的金纳米星溶液；

（3）制备载阿霉素的金纳米星：将步骤（2）制备的肼键修饰的金纳米星溶液干燥，得粉末（GNSTs-PEG/PEI-HBA），将粉末和阿霉素（DOX）以重量比1：2～2.5依次加到14～16mL的反应溶剂中，室温避光反应30～35h，得以腙键连接的金纳米星载抗肿瘤药物溶液，再10000 rpm高速离心30min（去除游离的阿霉素和二甲基亚砜），干燥，得载阿霉素的金纳米星；

（4）制备基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物：将步骤（3）制备的载阿霉素的金纳米星在20～22℃、500～600 r/min的磁力搅拌下用超纯水14～16mL溶解，再在氮气保护下，加入NGR 1.5～2.5mg，28～32℃、260～340r/min避光反应30～40h，最终得基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物。

本发明方法制备的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物粒径为80-150 nm，在主动靶向抗肿瘤方面的应用，在射频照射情况下作为热敏剂运用于抗肿瘤方面的光动力学疗法，作为X-ray成像造影剂在抗肿瘤方面早期诊断的应用，作为集诊断和治疗为一体的抗肿瘤药物传递系统。经试验，取得了非常好的有益技术效果，本发明基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统在抗肿瘤治疗中的应用分为体外和体内两部分：

（1）体外:将本发明基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统加入到肿瘤细胞中进行培养，给药后4～6 h使用射频照射（13.56MHz，1～5 min），然后再换新鲜的培养基继续孵育24h，测定肿瘤细胞的存活率。

上述癌细胞为:器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀肤癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，翠丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

（2）体内:将本发明基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统静脉注射到荷瘤小鼠体内，给药后4～6h使用射频照射（13.56 MHz，1～5min），照射后用红外热敏相机记录照射部位的温度。

上述荷瘤小鼠为:器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀肤癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，翠丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

本发明新型的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统作为热敏剂可制成多种药物剂型，如注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的制剂可加入各种制剂添加剂，如生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等。给药方式可为静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射、透皮给药、体内植入方式等。

相关试验资料如下：

一、本发明基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统其载药量的测定：

取本发明基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统，通过紫外分光光度法测定其载药量为1.16mg/mL，表明本发明基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统可作为抗肿瘤药物的载体。

二、本发明基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统的粒子大小和表面带电量的测定：

本发明中基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统的粒子大小和表面带电量的测定，使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行测定，折射率设置为1.590，吸收系数设置为0.010，温度设置为25℃，测量模式设置为自动，以Z平均统计值作为测定结果。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。介电常数设置为79，黏度系数设置为0.8872，温度设置为25℃，测量模式设置为自动。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。测得的结果是粒径为80～150nm，电位是＋10～30mV。

三、使用光照射本发明基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统对肿瘤细胞生长活性的测定：

通过射频照射基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统在体外抗肿瘤活性实验：将MCF-7乳腺癌细胞(由上海细胞库提供)用作待考察的癌细胞。将人源乳腺癌细胞MCF-7用含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI1640培养基培养，将其置于37℃含有5%CO₂的细胞培养箱内孵育，隔天换液，2～3天用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化传代一次，待细胞长至70%～80%时进行相关实验。所有实验均选用对数生长期的细胞。用SRB法检测基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统对MCF-7细胞的毒性作用。取对数生长期细胞，常规消化为单细胞悬液后计数，调整待测细胞密度至5×10³个/孔(边缘孔用无菌PBS填充)，铺96孔板，每孔加入200μl培养基，然后置于37℃含有5%CO₂的细胞孵育箱中培养。待24h细胞全部贴壁后，弃去原培养基，实验组分别加入浓度梯度为（0.5，1，5，10，50，100μg/mL）培养基稀释的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统，每个浓度设置3～5个复孔，空白细胞组加入空白培养基，设3～5个复孔，作为对照组，继续置于培养箱中培养。射频组加药后4h，使用射频照射（13.56MHz，2min），光照结束后将细胞培养板置于培养箱中继续培养24h，终止培养，在培养液表面轻轻加入25μl的预冷的50%TCA固定，室温静置5min后，再将细胞板移至4℃冰箱放置1h，这样可使悬浮细胞固定在培养孔的底部。倒掉固定液，每个复孔用去离子水洗5遍，风干，完全干燥。每孔加50μl以1%乙酸配置的0.4% SRB染色液，室温避光20～30min后，倒掉染色液，用1%乙酸洗5遍，除去未结合的染料。空气干燥后以10mmol/L(pH 10.5) 150μl/孔非缓冲Tris碱溶解。室温静置5 min后，将细胞板放置在振荡器上振荡5min，将会提高染料的混合性。可用全自动酶标仪于565nm，690nm波长处分别测定对照组和实验组的吸光度。按公式:细胞抑制率=1-(实验组0D值/对照组0D值)×100%计算各个浓度的细胞抑制率。

实验结果表明，本发明基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统进入肿瘤细胞内部，发挥出抗肿瘤药物的良好疗效，而且结合射频照射后，能够更明显的抑制肿瘤细胞增殖。

四、本发明中基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统的体内抗肿瘤活性的测定：

将MCF-7细胞按照1×10⁷个/只，皮下接种于BALB/c裸鼠右前腋窝下。裸鼠接种肿瘤7 d后，取其中36只肿瘤体积≥100 mm³裸鼠，随机分为6组，每组6只。具体分组如下:(1)对照组(生理盐水组);(2)生理盐水射频组;(3)靶向药物组;(4)靶向药物射频组;(5)非靶向药物组;(6)非靶向药物射频组。6组均采用尾静脉给药的方式，其中射频组在给药4h后照射肿瘤部位，使用的是最常用的射频频率13.56MHz（1min）。隔天给药一次，每次注射生理盐水或者药物溶液或者100 μg/mL的制剂溶液200μl，共给药3次。整个实验过程中每日观察裸鼠生活状态，每隔一天称其体重并使用游标卡尺测量裸鼠瘤的长径(A)与短径(B)，按公式V=1/2（A×B²）计算肿瘤体积。

实验证明，当将本发明基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统给药后，裸鼠肿瘤体积的增加比单独靶向组或者单独射频组有明显的抑制，结合射频照射后，裸鼠瘤体积的增加能得到更加明显的抑制。

五、本发明基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统作为X-ray成像剂在肿瘤早期诊断中的应用:

将接种MCF-7乳腺癌肿瘤细胞的12只小鼠随机分为实验组和对照组，其中6只实验组的小鼠经尾静脉注入200μl 1.16mg/mL的NGR/GNSTs-PEG/PEI-HBA-DOX溶液。而另外6只对照组小鼠不作任何处理。小鼠麻醉方法为3%戊巴比妥钠0.04mL，腹腔注射，并在注射NGR/GNSTs-PEG/PEI-HBA-DOX溶液前(即0 h)及注射NGR/GNSTs-PEG/PEI-HBA-DOX后24h进行X-ray成像。在0h及24h对实验组及对照组小鼠的肿瘤区域的T2WI图像上绘制大小一致的感兴趣区ROI测量肿瘤实体部分信号强度(SI_T)，取其平均值，测量面积不小于6mm²。用SPSS 19.0统计软件包，测量数据符合正态分布表示为x士S，不符的用中位数(M)表示。0h时及24h时实验组和对照组之间的肿瘤实体部分信号强度(SIT)比较用两独立样本t检验。P<0.05为差异具有统计学意义，p<0.01认为差异具有高度统计学意义。

已经证实，本发明基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统可以作为X-ray成像造影剂，用于肿瘤的早期诊断。

本发明提供的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统预期可以用于治疗肿瘤的一种良好的热敏剂，能够作为化学药物、蛋白质、核酸的转运载体，还可以作为X-ray成像造影剂，是药物制备上的一大创新。

本发明与现有技术相比具有以下突出的有益技术效果:

（1）本发明新的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统，不会对金纳米星本身特性进行破坏，水分散性很好，对生物体的毒性很低，物理以及化学稳定性良好，能够在水溶液中于4℃条件放置三个月，其粒径不发生明显变化，制备条件容易满足，原料来源丰富。-

（2）本发明提供的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统，作为抗肿瘤热敏治疗中的一种良好的热敏剂，在射频照射时产生热能能够发挥抗肿瘤活性，而在不使用射频照射时，其载药系统的抗肿瘤活性很小。

（3）本发明提供的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统，作为一种pH敏感型药物传递系统，在pH小于或等于6.4时可被细胞大量吞噬，在pH大于或等于7.4时不易被细胞吞噬，这种性质可用于识别肿瘤特征性微酸环境。同时该药物系统具有靶向性且在射频照射下可产生过高温现象，这不仅可以提高抗肿瘤的疗效，联合治疗组较单独的药物组其疗效提高1.6倍，还能够明显降低其对周围组织的毒副作用。

（4）本发明提供的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗系统，作为一种良好的X-ray成像造影剂，有着较好的负性增强效果，肿瘤显影效果好，利用X-ray成像能够对肿瘤治疗效果进行实时监测，具有很强的实用性，经济和社会效益巨大。

Claims

1.一种基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物的制备方法，其特征在于，首先对金纳米星载体进行结构修饰，与含有巯基的氨基化合物反应，得到氨基修饰的金纳米星溶液；再将氨基修饰的金纳米星与活化羧基的肼键化合物进行酰胺反应，生成末端连接有肼键修饰的金纳米星溶液；然后再利用其末端的肼键与含有羰基的阿霉素进行化学反应，形成具有pH敏感的腙键化合物；最后，将此化合物通过硫金健与巯基化的NGR反应，即得基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物，具体步骤如下：

所述的氨基化合物为NH₂-PEG2000-SH或PEI-SH；

（3）制备载阿霉素的金纳米星：将步骤（2）制备的肼键修饰的金纳米星溶液干燥，得粉末，将粉末和阿霉素以重量比1：1.5～3.0依次加到10～20 mL的反应溶剂中，室温避光反应24～48h，得以腙键连接的金纳米星载抗肿瘤药物溶液，再10000 rpm高速离心30min，干燥，得载阿霉素的金纳米星；

所述的干燥为冷冻干燥、真空干燥或烘干中的一种；反应溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲液中的一种；

2.根据权利要求1所述的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）制备氨基化的金纳米星：在25℃，540r/min的磁力搅拌下，在重量浓度为50μg/mL的金纳米星溶液20 mL中加入重量浓度0.5mg/mL的NH₂-PEG2000-SH溶液1mL和重量浓度10/mg/mL的PEI-SH溶液1mL，室温避光搅拌反应12h，10000 rpm高速离心30min，得沉淀，沉淀用超纯水22mL复溶，得氨基化的金纳米星溶液；

（2）制备肼键修饰的金纳米星溶液：先取对羧基苯肼2.54mg，用0.2mL超纯水溶解，得到羧基化溶液，再分别称取1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐4.06mg、N-羟基琥珀酰亚胺1.78mg和4-二甲氨基吡啶1.8mg依次加入2mL二甲基亚砜中，然后将羧基化溶液加入到二甲基亚砜溶剂中进行羧基化反应，得活化溶液，将活化溶液加入步骤（1）制备的氨基化的金纳米星溶液中，在氮气保护下，室温避光搅拌反应48h，再10000rpm高速离心30 min，去除游离的小分子，得肼键修饰的金纳米星溶液；

（3）制备载阿霉素的金纳米星：将步骤（2）制备的肼键修饰的金纳米星溶液冷冻干燥，得肼键修饰的金纳米星粉末，将粉末和阿霉素以重量比1：2依次加到20mL的二甲基亚砜中，室温避光反应48h，得以腙键连接的金纳米星载抗肿瘤药物溶液，再10000 rpm高速离心30min，冷冻干燥，得载阿霉素的金纳米星；

（4）制备基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物：将步骤（3）制备的载阿霉素的金纳米星在25℃、540 r/min的磁力搅拌下用超纯水20mL溶解，再在氮气保护下，加入NGR 2mg，35 ℃、300r/min避光反应24h，最终得基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物。

3.根据权利要求1所述的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）制备氨基化的金纳米星：在19℃，700r/min的磁力搅拌下，在重量浓度为50μg/mL的金纳米星溶液15mL中加入重量浓度5mg/mL的NH₂-PEG2000-SH 3mL，室温避光搅拌反应9h，10000 rpm高速离心30min，再用超纯水复溶，得氨基化的金纳米星溶液；

（2）制备肼键修饰的金纳米星溶液：先称取对羧基苯肼3mg，用超纯水溶解，得羧基化溶液，再称取1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐4.5mg、N-羟基琥珀酰亚胺2mg和4-二甲氨基吡啶1.7mg依次加入2mL二甲基亚砜中，然后将羧基化溶液加入到二甲基亚砜溶剂中进行羧基化反应，得活化溶液，将活化溶液加入步骤（1）制备的氨基化的金纳米星溶液中，在氮气保护下，室温避光搅拌反应36h，再10000rpm高速离心30 min，去除游离的小分子，得肼键修饰的金纳米星溶液；

（3）制备载阿霉素的金纳米星：将步骤（2）制备的肼键修饰的金纳米星溶液真空干燥，得粉末，将粉末和阿霉素以重量比1：1.8依次加到15mL的二甲基甲酰胺中，室温避光反应36h，得以腙键连接的金纳米星载抗肿瘤药物溶液，再10000 rpm高速离心30min，真空干燥，得载阿霉素的金纳米星；

（4）制备基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物：将步骤（3）制备的载阿霉素的金纳米星在22℃、500r/min的磁力搅拌下用超纯水15mL溶解，再在氮气保护下，加入NGR 2mg， 30℃、300r/min避光反应36h，最终得基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物。

4.根据权利要求1所述的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）制备氨基化的金纳米星：在23℃，400r/min的磁力搅拌下，在重量浓度为50μg/mL的金纳米星溶液18mL中加入重量浓度9mg/mL的PEI-SH 4mL，室温避光搅拌反应10h，10000 rpm高速离心30min，再用超纯水复溶，得氨基化的金纳米星溶液；

（2）制备肼键修饰的金纳米星溶液：先称取对羧基苯肼3.5mg，用超纯水溶解，得羧基化溶液，再称取1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐4mg、N-羟基琥珀酰亚胺3mg和4-二甲氨基吡啶1.9mg依次加入2.5mL二甲基亚砜中，然后将羧基化溶液加入到二甲基亚砜溶剂中进行羧基化反应，得活化溶液，将活化溶液加入步骤（1）制备的氨基化的金纳米星溶液中，在氮气保护下，室温避光搅拌反应40h，再10000rpm高速离心30 min，去除游离的小分子，得肼键修饰的金纳米星溶液；

（3）制备载阿霉素的金纳米星：将步骤（2）制备的肼键修饰的金纳米星溶液烘干，得粉末，将粉末和阿霉素以重量比1：1.6依次加到12mL的反应溶剂中，室温避光反应40h，得以腙键连接的金纳米星载抗肿瘤药物溶液，再10000 rpm高速离心30min，烘干燥，得载阿霉素的金纳米星；

（4）制备基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物：将步骤（3）制备的载阿霉素的金纳米星在23℃、400r/min的磁力搅拌下用超纯水18mL溶解，再在氮气保护下，加入NGR 2.5mg， 28℃、350r/min避光反应40h，最终得基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物。

5.根据权利要求1所述的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（3）制备载阿霉素的金纳米星：将步骤（2）制备的肼键修饰的金纳米星溶液干燥，得粉末，将粉末和阿霉素以重量比1：2～2.5依次加到14～16mL的反应溶剂中，室温避光反应30～35h，得以腙键连接的金纳米星载抗肿瘤药物溶液，再10000 rpm高速离心30min，干燥，得载阿霉素的金纳米星；

6.权利要求1或2-5任一项所述的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物在制备主动靶向抗肿瘤药物中的应用。

7.权利要求1或2-5任一项所述的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物在制备抗肿瘤光动力在射频照射热敏剂中的应用。

8.权利要求1或2-5任一项所述的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物在制备抗肿瘤早期诊断X-ray成像造影剂中的应用。

9.权利要求1或2-5任一项所述的基于金纳米星的多功能抗肿瘤靶向诊断治疗药物在制备作为集诊断和治疗为一体的抗肿瘤传递系统药物中的应用。