CN113425851B - 修饰bix-01294的金纳米星制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种修饰BIX‑01294的金纳米星制备方法及其应用，属于分子生物学与生物医学技术领域。本发明提出了修饰BIX‑01294的金纳米星可以减轻脂多糖(LPS)诱导的脓毒血症相关病症，包括LPS的三个主要靶器官(肾脏、肝脏、肺)的细胞损伤、炎症因子的表达及分泌、肝/肾功能等病症。

Description

修饰BIX-01294的金纳米星制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学与生物医学技术领域，特别是涉及一种修饰BIX-01294的金纳米星制备方法及其应用。
背景技术
脓毒症(Sepsis)是由感染因素引起的全身性炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponse syndrome，SIRS)，以广泛的炎症反应及感染的器官细胞死亡为特征，最终导致多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)，其中急性肾损伤(acutekidney injury，AKI)、急性肝损伤(Acute liver injury，ALI)和急性肺损伤(Acute lungInjury，ALI)是脓毒症患者最常见的合并症。它已成为导致临床危重症患者死亡的首要因素，目前尚无有效的药物用于临床治疗。内毒素(LPS)作为G-菌的毒性成分，在启动体内免疫系统反应、介导炎性介质因子的释放、导致脓毒症和中毒性休克中起着重要的作用。
BIX-01294是一种G9α组蛋白甲基转移酶(G9a Histone Methyltransferase)特异性抑制剂。G9α(也被称作KMT1C或者EHMT2)是第二个被报道的组蛋白甲基转移酶。它属于含SET结构域的Suv39h蛋白家族的成员之一，是一种重要的常染色质HMT，主要负责常染色质区域组蛋白H3中K9和K27位点的甲基化。G9α主要在肌肉、心脏、肝脏等组织中高表达。G9α通过两种不同的机制来调控基因转录：一方面，G9α可以促进基因启动子区域组蛋白或DNA的甲基化，从而抑制基因转录；另一方面，G9α可以作为一种脚手架蛋白来募集转录激活子，从而激活基因转录。近年来，随着研究的深入，发现G9α可以调控自噬反应和细胞分化，并在肿瘤发生、胚胎发育、认知及适应性行为和脂肪形成等多种生物过程中起着重要作用。有研究显示，给予G9α抑制剂BIX-01294，能够增强神经胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性，并促进细胞凋亡；也有研究报道BIX-01294可以改善神经损伤引起的痛觉过敏；在肺和肾脏中，均发现给予BIX-01294来抑制G9α，可以改善肺部及肾脏间质纤维化；也有研究人员发现，BIX-01294可以阻断疟原虫生长周期治疗疟疾。而在脓毒症方面尚未有研究报道BIX-01294可以对抗脓毒症的多器官损伤。
发明内容
本发明的目的是提供一种修饰BIX-01294的金纳米星制备方法及其应用，以期为治疗脓毒症提供更多的药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种修饰BIX-01294的金纳米星制备方法，包括以下步骤：
(1)制备金纳米星：首先制备金种子，然后在氯金酸溶液中依次加入金种子、柠檬酸钠和对苯二酚水溶液，室温搅拌，得到金纳米星溶液；
(2)制备修饰BIX-01294的金纳米星：在所述金纳米星溶液中加入修饰有巯基的BIX-01294溶液，搅拌均匀，得到修饰BIX-01294的金纳米星。
本发明还提供一种由所述的制备方法制备得到的修饰BIX-01294的金纳米星。
本发明还提供所述的修饰BIX-01294的金纳米星在制备治疗脓毒症的药物中的应用。
进一步地，所述修饰BIX-01294的金纳米星在制备用于减轻LPS诱导的脓毒症相关病症的药物中的应用。
进一步地，所述修饰BIX-01294的金纳米星在制备用于减轻LPS诱导的急性肾小管损伤、肾功能下降及肾炎症因子的表达与分泌的药物中的应用。
进一步地，所述修饰BIX-01294的金纳米星在制备用于减轻LPS诱导的急性肝损伤、肝细胞凋亡、肝功能下降及肝炎症因子的表达与分泌的药物中的应用。
进一步地，所述修饰BIX-01294的金纳米星在制备用于减轻LPS诱导的急性肺损伤的药物中的应用。
纳米修饰的药物输送是纳米医学领域的一个关键技术，能够提高药物生物利用度、药物分子精准定位的潜能等。而金纳米材料由于具有明显的表面效应，量子效应，小尺寸效应和生物相容性，已成为生物医药等领域的研究和应用的热点。因此，本发明对BIX-01294进行金纳米星修饰，通过开发纳米制剂来降低毒性、提高疗效、增加药物靶向性。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提出了修饰BIX-01294的金纳米星可以减轻脂多糖(LPS)诱导的脓毒血症相关病症，包括LPS的三个主要靶器官(肾脏、肝脏、肺)的细胞损伤、炎症因子的表达及分泌、肝/肾功能等病症，修饰BIX-01294的金纳米星可用于制备治疗脓毒症的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为制备修饰BIX-01294的金纳米星的扫描电镜和紫外-可见吸收光谱结果，其中，A为金纳米星的扫描电镜图(200nm)，B为金纳米星的扫描电镜图(100nm)，C为金纳米星的紫外-可见吸收光谱，D为修饰BIX-01294的金纳米星SERS光谱图；
图2为注射修饰BIX-01294的金纳米星后小鼠活体成像和血生化结果，其中，A为注射修饰BIX-01294的金纳米星后小鼠不同器官的活体成像结果，B为注射修饰BIX-01294的金纳米星后小鼠血生化结果；
图3为PAS染色法和血生化检查法研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的急性肾小管损伤、肾功能下降的影响，其中A为用LPS造模以及用修饰BIX-01294的金纳米星治疗后的肾脏PAS染色结果，B为用LPS造模以及用修饰BIX-01294的金纳米星治疗后的肾小管损伤指数变化结果，C为用LPS造模以及用修饰BIX-01294的金纳米星治疗后的肾功能改善情况；
图4为QPCR法和ELISA法研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的肾脏炎症分子的表达及分泌的影响，其中A为ELISA法研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的肾脏炎症分子IL-6的表达及分泌结果，B为ELISA法研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的肾脏炎症分子TNF-α的表达及分泌结果，C为QPCR法研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的肾脏炎症分子的表达及分泌结果；
图5为HE染色、血生化检测及QPCR法研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的急性肝损伤、肝细胞凋亡、肝功能下降及肝炎症因子的表达与分泌的影响，其中A为修饰BIX-01294的金纳米星治疗组小鼠的血谷丙转氨酶、血谷草转氨酶含量结果，B为QPCR法研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的肝脏炎症分子的表达及分泌结果，C为用LPS造模以及用修饰BIX-01294的金纳米星治疗后的肝脏HE染色结果；
图6为HE染色研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的急性肺损伤的影响；
图7为HE染色法检测研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的急性肾小管损伤、急性肝损伤、急性肺损伤的病理变化结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明中实时荧光定量PCR、肝/肾功能及肝/肾/肺组织病理损伤的评估(PAS、HE)方法的具体操作步骤如下：
实时荧光定量PCR(QPCR)：
提取肾脏组织总RNA，用分光光度法测定RNA溶液浓度和纯度。利用逆转录试剂盒(Takara，DaLian)将1μgRNA逆转录成cDNA，按照下面的反应体系检测不同基因的变化情况。
a.反应体系
Figure BDA0003155572640000071
b.PCR热循环参数
Figure BDA0003155572640000072
肝/肾功能及肝/肾/肺组织病理损伤的评估：
取小鼠血清采用生化法检测血谷丙转氨酶及血谷草转氨酶含量；取肝组织石蜡切片，常规进行HE、MPO染色检测肝组织病理损伤。
PAS染色：
4％多聚甲醛固定组织48h，石蜡包埋切片，脱蜡至水，蒸馏水冲洗，70％酒精冲洗3次。浸入高碘酸酒精溶液10min(此溶液温度以17-20℃为好)，70％酒精洗后，浸入还原液中1min(此溶液温度以17-20℃为好)，70％酒精洗后，浸入无色盐基性品红溶液1-1.5h，冬天室温较低时，可放入37度温箱。流水冲洗10min，用Mayer's苏木素复染液复染细胞核3-5min，再用1％盐酸酒精分化，流水冲洗后，脱水透明，最后封片。
HE染色：
4％多聚甲醛固定组织48h，石蜡包埋切片，脱蜡至水；依次用自来水、蒸馏水冲洗3次；用Weigert苏木精液染核5-10min，流水冲洗10min；用Masson代丽春红酸性复红染色液染色5-10min；以2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；1％磷钼酸水溶液分化3-5min；不经水洗，直接用苯胺蓝或光绿液染色5min；以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；95％酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。
下面通过具体的实施例详细说明本发明。
实施例1制备修饰BIX-01294的金纳米星。
1.金纳米星制备
金种子的制备：称取1g柠檬酸钠溶于100mL的去离子水配成质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液。将300μL质量分数为1％的HAuCl4加入30mL剧烈搅拌并沸腾的去离子水中，紧接着加入900μL 1％的柠檬酸钠水溶液，在700rpm转速下搅拌直到金溶胶的颜色变成酒红色为止，制备的金种子冷却至室温，静置1天备用。
金纳米星的制备：将25μL浓度为100mM的HAuCl4溶液加入10mL不断搅拌的去离子水中，接着将50μL的金种子、22μL质量分数为1％的柠檬酸钠和1mL浓度为30mM的对苯二酚水溶液依次加入到反应体系中，在室温下搅拌反应30min，溶液由红色最终变为蓝绿色。
2.修饰BIX-01294的金纳米星的制备
制备的金纳米星溶液置于搅拌器上，在搅拌状态下向其中加入修饰有巯基的BIX-01294溶液，继续搅拌10分钟，得到修饰BIX-01294的金纳米星。
制备的金纳米星的直径是80nm左右，且金纳米星是由一个核和许多不规则的枝角构成，具有比金壳更好的SERS增强效果，如图1A-B所示。图1C是金纳米星的紫外-可见吸收光谱，从600nm到近红外区域，金纳米星表现为吸收带，在650nm处出现局域表面等离子体共振峰。图1D是修饰BIX-01294的金纳米星SERS光谱图，可以观察到BIX-01294的SERS特征峰，证明BIX-01294成功修饰到金纳米星上。
实施例2修饰BIX-01294的金纳米星的体内组织分布及对心、肝、肾组织的影响。
小鼠尾静脉注射修饰BIX-01294的金纳米星，24h后进行小鼠活体成像，观察修饰BIX-01294的金纳米星的组织分布情况，结果如图2所示，可以看出修饰BIX-01294的金纳米星主要集中分布在肾脏、肝脏和肺，证明修饰BIX-01294的金纳米星可以靶向到肾脏、肝脏和肺器官(图2A)。小鼠活体成像观察结束后，处死小鼠，并取血，采用生化法检测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、谷丙转氨酶(ALT)、血谷草转氨酶(AST)含量和乳酸脱氢酶(LDH)的含量。结果显示，和对照相比，五个指标均没有显著变化，证明小鼠尾静脉注射修饰BIX-01294的金纳米星后，小鼠肝、肾、心脏功能并没有受到影响(图2B)。
实施例3修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的急性肾小管损伤、肾功能下降的影响。
取体重18-22g的雄性C57BL/6小鼠，分为3组，即对照组(Sham)，LPS模型组以及修饰BIX-01294的金纳米星治疗组(n＝8)。
对照组：1次腹腔注射等体积介质，共1天；
LPS模型组：腹腔注射，10mg/kg，单次给药；
修饰BIX-01294的金纳米星治疗组：修饰BIX-01294的金纳米星提前给药2天(尾静脉注射，1.5mg/ml，200μL)，随后单次给药LPS(腹腔注射，10mg/kg)，24h后取血，留取肾组织。
将血标本离心(20min，3000r/min)，用肌酐试剂盒(Creatinine Assay Kit(cat:K625-100，biomars))、尿素氮试剂盒(QuantiChrom Urea Assay kit(cat:DIUR-500，Hayward，CA))测定血肌酐、尿素氮，实验结果见图3A，修饰BIX-01294的金纳米星可以明显抑制LPS诱导的SCr和BUN的升高，显著改善肾功能。
图3B为用LPS造模以及用修饰BIX-01294的金纳米星治疗后的肾脏PAS染色结果，从结果中可以看出，使用LPS以后造模成功，血肌酐、尿素氮显著升高，提示肾脏受到损伤。而使用修饰BIX-01294的金纳米星治疗后，可以明显改善肾功能，肌酐、尿素氮水平与模型组相比模型降低，p<0.05。根据PAS染色结果，LPS组肾小管结构破坏，修饰BIX-01294的金纳米星能够显著改善LPS诱导的肾脏损伤。
实施例4修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的肾脏炎症分子的表达及分泌的影响。
利用QPCR法及ELISA法研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的肾脏炎症分子的表达及分泌的影响。
如图4A所示，利用ELISA法研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的肾脏炎症分子的表达及分泌的影响。在LPS诱导的脓毒血症模型中，LPS模型组的炎症因子IL-6、TNF-α表达水平与对照组相比明显升高，p<0.001。而修饰BIX-01294的金纳米星治疗组能够显著降低IL-6、TNF-α表达水平，p<0.001。
如图4B所示，利用QPCR法研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的肾脏炎症分子的表达及分泌的影响。在LPS诱导的脓毒血症模型中，LPS模型组的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1、IL-18表达水平与对照组相比明显升高，p<0.05。而修饰BIX-01294的金纳米星治疗组能够显著降低IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1、IL-18表达水平，p<0.01。
实施例5修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的急性肝损伤、肝细胞凋亡、肝功能下降及肝炎症因子的表达与分泌的影响。
取体重18-22g的雄性C57BL/6小鼠，分为3组，即对照组，LPS模型组以及修饰BIX-01294的金纳米星治疗组(n＝8)。
对照组：1次腹腔注射等体积介质，共1天；
LPS模型组：腹腔注射，10mg/kg，单次给药；
修饰BIX-01294的金纳米星治疗组：修饰BIX-01294的金纳米星提前给药2天(尾静脉注射，1.5mg/ml，200μL)，随后单次给药LPS(腹腔注射，10mg/kg)，24h后取血，留取肝组织。
将血标本离心(20min，3000r/min)，用ALT试剂盒、AST试剂盒测定血谷丙转氨酶、血谷草转氨酶含量，实验结果见图5A，修饰BIX-01294的金纳米星可以明显抑制LPS诱导的ALT和AST的升高，显著改善肝功能。如图5B所示，利用QPCR法研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的肝脏炎症分子的表达及分泌的影响。在LPS诱导的脓毒血症模型中，LPS模型组的炎症因子IL-6、TNF-α表达水平与对照组相比明显升高，p<0.05。而修饰BIX-01294的金纳米星治疗组能够显著降低IL-6、TNF-α表达水平，p<0.05。
图5C为用LPS造模以及用修饰BIX-01294的金纳米星治疗后的肝脏HE染色结果，从结果中可以看出，使用LPS以后造模成功，脏脏受到损伤。修饰BIX-01294的金纳米星能够显著改善LPS诱导的肝脏损伤。
实施例6修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的急性肺损伤的影响。
取体重18-22g的雄性C57BL/6小鼠，分为3组，即对照组，LPS模型组以及修饰BIX-01294的金纳米星治疗组(n＝8)。
对照组：1次腹腔注射等体积介质，共1天；
LPS模型组：腹腔注射，10mg/kg，单次给药；
修饰BIX-01294的金纳米星治疗组：修饰BIX-01294的金纳米星提前给药2天(尾静脉注射，1.5mg/ml，200μL)，随后单次给药LPS(腹腔注射，10mg/kg)，24h后取血，留取肺组织。
图6为用LPS造模以及用修饰BIX-01294的金纳米星治疗后的肺HE染色结果，从结果中可以看出，使用LPS以后造模成功，肺结构受到损伤，修饰BIX-01294的金纳米星能够显著改善LPS诱导的肺损伤。
图7为HE染色法检测研究修饰BIX-01294的金纳米星对LPS诱导的急性肾小管损伤、急性肝损伤、急性肺损伤的病理变化结果，如图7所示，修饰BIX-01294的金纳米星可以改善LPS诱导的急性肾小管损伤、急性肝损伤、急性肺损伤。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种修饰BIX-01294的金纳米星制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备金纳米星：首先制备金种子，然后在氯金酸溶液中依次加入金种子、柠檬酸钠和对苯二酚水溶液，室温搅拌，得到金纳米星溶液；
(2)制备修饰BIX-01294的金纳米星：在所述金纳米星溶液中加入修饰有巯基的BIX-01294溶液，搅拌均匀，得到修饰BIX-01294的金纳米星。
2.修饰BIX-01294的金纳米星，其特征在于，由权利要求1所述的制备方法制备得到。
3.权利要求2所述的修饰BIX-01294的金纳米星在制备治疗脓毒症的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述修饰BIX-01294的金纳米星在制备用于减轻LPS诱导的脓毒症相关病症的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述修饰BIX-01294的金纳米星在制备用于减轻LPS诱导的急性肾小管损伤、肾功能下降及肾炎症因子的表达与分泌的药物中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述修饰BIX-01294的金纳米星在制备用于减轻LPS诱导的急性肝损伤、肝细胞凋亡、肝功能下降及肝炎症因子的表达与分泌的药物中的应用。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述修饰BIX-01294的金纳米星在制备用于减轻LPS诱导的急性肺损伤的药物中的应用。
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