CN103768600B - 一种磁性热敏脂质体纳米金复合物、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种磁性热敏脂质体纳米金复合物、制备方法及应用，所述磁性热敏脂质体纳米金复合物将热敏脂质体包裹Fe3O4磁性纳米粒子和化疗药物后，再负载金纳米粒制备而成；其中，Fe3O4磁性纳米粒子和化疗药物的质量比为1.7-2.3:1，所述化疗药物为盐酸阿霉素、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、柔红霉素中的一种。本发明的磁性热敏脂质体纳米金复合物可以作为用于治疗肿瘤的良好的热敏剂和磁共振成像造影剂，还可以作为抗肿瘤药物的具有磁靶向性的转运载体，是癌症治疗上的一大创新。
Description
技术领域
本发明涉及一种磁性热敏脂质体纳米金复合物、制备方法及应用，属于医药领域。
背景技术
随着纳米技术、生物工程技术的不断进步，非病毒载体的研究也发展到了一个新的阶段。目前，药物/核酸转运系统己经发展到靶向转运系统。该系统将能携带效应分子，主动或被动地转运到机体的靶部位发挥治疗作用，而对其它部位的毒副作用很低。国内外的研究显示，在磁性纳米粒子表面包附一层生物大分子（如蛋白质，脂质体，多糖等），能够得到良好的生物相容性和生物安全性。而且这种磁性脂质体具有磁响应性，在外加梯度磁场作用下能够趋向运动，可以作为携带药物或核酸分子的载体骨架进行肿瘤的磁控靶向治疗。而且其良好的亲水性使其可以制备成亲水凝胶状的纳米颗粒。这种天然的亲水表面能减弱机体内巨噬细胞的吞噬作用，延长其在血液中的循环时间，因此很适合用于生物大分子类药物的传递。
磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles，MNP）是一类智能型的纳米磁性材料，既具有纳米材料所特有的性质，又具有磁响应性和超顺磁性，可以在恒定磁场下聚集和定位到靶部位，或在交变磁场下吸收电磁波产热。常用的磁性物质有：铁氧化物，如Fe3O4、Fe2O3等；单体，如Fe、Co、Ni等；合金，如铁镍合金、铁锅合金等；混合磁性材料等。目前是铁及其氧化物（Fe，Fe3O4，γ-Fe2O3）被研究的最多，其中粒径在l～100nm内的Fe3O4粒子以其生物安全性高、磁响应性高而被应用的最为广泛，当磁性微粒的粒径足够小时，具有超顺磁性，即在外加磁场中有较强的磁性，撤离磁场时磁性很快消失，剩磁为零，不会被永久磁化。因此，四氧化三铁磁性微粒成为目前生物磁性材料领域的一个研究热点。
磁共振成像（MRI）是一种颇具潜力的诊断方法。它是以人体在核磁共振过程中所散发的电磁波以及与这些电磁波有关的参数，如质子密度、弛豫时间等作为成像参数进行成像。磁共振成像造影剂一定是磁性物质，其能同氢核发生磁性的相互作用，主要通过影响自旋晶格弛豫时间T1、自旋-自旋弛豫时间T2等来改变信号强度，进而提高MRI诊断的敏感性和特异性，增强信号对比度和提高软组织图像的分辨率，在早期肿瘤的诊断中具有很大的价值。磁性热敏脂质体可作为磁共振成像造影剂，利用其磁性和水溶性，进入体内后能选择性分布，在靶器官富集并停留一段时间，使被观测的组织或器官的弛豫速率比其他部位（背景部位）有更大的改变，提高MRI诊断的敏感性和特异性，增强MRI的效果。
热疗是一种治疗癌症的有效的方法，传统的加热方法包括导管引入、全身加热等。研究者发现适当调整纳米金的大小和形貌可使其吸收峰调整在近红外区，经近红外（NIR）激光照射后，纳米金能将吸收的光能转化成热能，使局域范围内的温度升高，杀死肿瘤细胞又不损伤正常细胞以达到治疗目的。肿瘤的纳米金红外热疗比化疗和放疗副反应少得多，不损伤正常组织，是近年来公认的“绿色疗法”，是一种新的肿瘤热疗技术，在生物医学领域有着广泛的应用前景。另一方面，纳米金也可用于红外断层成像，可应用在疾病的诊断和监测中。这种成像技术可利用散射的光形成图像。
脂质体作为药物载体具有独特的优势。脂质体的粒子大小处于纳米级的范围，具有无毒、无免疫原性、可降解、缓释等特点。磁性热敏脂质体是磁导向药物传递系统中一种新型的药物导向载体，可通过外磁场对肿瘤实施引导定位治疗，在靶区产生持续高浓度药物，增强对肿瘤细胞的杀伤作用，而在非肿瘤部位分布很少，可降低毒副作用。国内外学者就生物磁学用于恶性肿瘤的治疗进行了初步研究，认为恒定磁场具有抑制恶性肿瘤细胞增殖的作用，磁性微粒在足够强的外磁场作用下，可以引导负载药物在体内定向移动、定位浓集，从而达到提高药物治疗指数，降低药物毒副作用的目的。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种磁性热敏脂质体纳米金复合物、制备方法及应用，该复合物能够作为良好的抗肿瘤药物载体、热敏剂和核磁共振成像造影剂。
本发明解决的技术方案是，一种磁性热敏脂质体纳米金复合物，所述复合物是将热敏脂质体包裹Fe3O4磁性纳米粒子和化疗药物后，再负载金纳米粒制备而成；其中，Fe3O4磁性纳米粒子和化疗药物的质量比为1.7-2.3:1，所述化疗药物为盐酸阿霉素、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、柔红霉素中的一种。
本发明解决的技术方案还在于，一种磁性热敏脂质体纳米金复合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2.30-2.40g FeCl3·6H2O和0.80-0.90g FeCl2·4H2O溶于超纯水中，调节pH值至9-10，然后加热至70-85℃并通入氮气保护，反应25-35min后，加入0.4-0.6g/mL改性溶液1.5-3mL，升温至88-95℃并继续反应80-100min，进行磁铁分离，再用超纯水和丙酮洗涤产物，真空冷冻干燥3-5h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；调节pH值的试剂为氨水、氢氧化钠中的一种或两种；改性溶液为柠檬酸溶液、柠檬酸钠溶液、聚乙二醇2000溶液中的一种，或两种、三种的混合溶液；
（2）分别称量二棕榈酰磷脂酰胆碱65-75mg、胆固醇8-12mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20000.8-1.2mg，溶解于氯仿和甲醇的体积比为1.5-2.5:1的有机溶剂中，得到有机溶液；
（3）将8.5-11.5mg Fe3O4磁性纳米粒子置于PBS溶液中，并加入化疗药物5mg溶解，形成磁性混合液，超声分散均匀，并加入至有机溶液中，充分振荡，然后在真空状态下旋转蒸发除去有机溶剂得到水性混悬液；将水性混悬液离心弃去沉淀，并将所得混悬液置于磁铁上除去上清液，得到化疗药物的磁性热敏脂质体；
（4）取步骤（3）化疗药物的磁性热敏脂质体2mL，加入浓度为80-120mM的氯金酸20-28μL，涡旋均匀，然后加入还原溶液30-40μL，涡旋4-6min，在磁性热敏脂质体表面负载金纳米粒，并透析22-26h，得到磁性热敏脂质体纳米金复合物；还原溶液为质量分数37%的甲醛溶液、浓度400-600mM的抗坏血酸溶液或盐酸羟胺溶液。
本发明解决的技术方案还在于，一种磁性热敏脂质体纳米金复合物在作为抗肿瘤药物载体方面的应用。
本发明解决的技术方案还在于，一种磁性热敏脂质体纳米金复合物在作为抗肿瘤光动力治疗的热敏剂方面的应用，具体为：
将磁性热敏脂质体纳米金复合物溶溶液静脉注射到荷瘤小鼠体内，给药后3h后用光源光照，光照时间为1-5min。光源为：780-1100nm波长的宽波长光源或者激光中的一种，优选808nm激光。
本发明解决的技术方案还在于，一种磁性热敏脂质体纳米金复合物在作为抗肿瘤治疗中的磁共振成像造影剂方面的应用，具体为：
将磁性热敏脂质体纳米金复合物溶液静脉注射到荷瘤小鼠体内，注射后24h后对荷瘤小鼠进行T2WI磁共振成像。核磁共振成像扫描参数为：横断位SE-T2WI、TR1000-5000ms、TE100-110ms、FOV10-8000mm、层厚0.8-3mm、层间距0.2-1mm、矩阵256×256。
本发明针对的肿瘤为器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤（颅内肿瘤），小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤。
本发明的磁性热敏脂质体纳米金复合物在应用时可以制成任意的药物制剂剂型，比如：注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的磁性热敏脂质体纳米金复合物可以加入各种制剂的添加剂，比如：生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等以便于制备成需要的剂型。给药方式可以为：静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射、透皮给药、体内植入方式等。
本发明与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：
（1）本发明提供的磁性热敏脂质体纳米金复合物可以作为一种良好的药物载体，具有良好的磁靶向性，可以靶向定位于作用对象，本身有着极小的毒性，较强的水溶性，生物相容性好，比表面积大，化学惰性高等优点。测试结果表明，本发明提供的磁性热敏脂质体纳米金复合物作为药物的载体时，粒径均匀，能够起到一定的缓释作用，而且还能够更多的到达肿瘤组织中起到靶向的作用，结合光照和外加磁场还可以发挥出更为优秀的抗肿瘤活性。
（2）本发明提供的磁性热敏脂质体纳米金复合物可以作为抗肿瘤热敏治疗的一种良好的热敏剂，测试表明无论是体外还是体内在光照的情况下都可以很好的抑制肿瘤细胞以及组织的发生和发展，在体内合并外加磁场时更加显著地抑制肿瘤细胞以及组织的发生和发展，而在不光照的情况下本发明提供的磁性热敏脂质体纳米金复合物对正常细胞以及组织毒副作用很小。
（3）本发明提供的磁性热敏脂质体纳米金复合物可以作为一种良好的磁共振成像造影剂，进入体内后能选择性分布，在靶器官富集并停留一段时间，使被观测的组织或器官的弛豫速率比其他部位（背景部位）有更大的改变，提高MRI诊断的敏感性和特异性，增强MRI的效果。测试结果表明，该复合物具有良好的负性增强效果，对肿瘤显影的效果良好，并且还可以结合体内热疗，利用MRI对肿瘤治疗效果进行监测。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本实施例的磁性热敏脂质体纳米金复合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2.35g FeCl3·6H2O和0.86g FeCl2·4H2O溶于超纯水中，加入氨水调节pH值至9，然后加热至80℃并通入氮气保护，反应30min后，加入0.5g/mL柠檬酸溶液2mL，升温至90℃并继续反应90min，进行磁铁分离，再用超纯水和丙酮洗涤产物，真空冷冻干燥4h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
（2）分别称量二棕榈酰磷脂酰胆碱70mg、胆固醇10mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20001mg，溶解于氯仿和甲醇的体积比为2:1的有机溶剂中，得到有机溶液；
（3）将10mg Fe3O4磁性纳米粒子置于PBS溶液中，并加入盐酸阿霉素5mg溶解，形成磁性混合液，超声分散均匀，并加入至有机溶液中，充分振荡，然后在真空状态下旋转蒸发除去有机溶剂得到水性混悬液；将水性混悬液离心弃去沉淀，并将所得混悬液置于磁铁上除去上清液，得到化疗药物的磁性热敏脂质体；
（4）取步骤（3）化疗药物的磁性热敏脂质体2mL，加入浓度为100mM的氯金酸24μL，涡旋均匀，然后加入浓度为500mM的抗坏血酸36μL，涡旋5min，在磁性热敏脂质体表面负载金纳米粒，并透析24h，得到磁性热敏脂质体纳米金复合物。
实施例2
本实施例的磁性热敏脂质体纳米金复合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2.30g FeCl3·6H2O和0.80g FeCl2·4H2O溶于超纯水中，加入氢氧化钠调节pH值至10，然后加热至70℃并通入氮气保护，反应25min后，加入0.6g/mL柠檬酸钠溶液1.5mL，升温至95℃并继续反应100min，进行磁铁分离，再用超纯水和丙酮洗涤产物，真空冷冻干燥3h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
（2）分别称量二棕榈酰磷脂酰胆碱65mg、胆固醇8mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20000.8mg，溶解于氯仿和甲醇的体积比为2.5:1的有机溶剂中，得到有机溶液；
（3）将8.5mg Fe3O4磁性纳米粒子置于PBS溶液中，并加入米托蒽醌5mg溶解，形成磁性混合液，超声分散均匀，并加入至有机溶液中，充分振荡，然后在真空状态下旋转蒸发除去有机溶剂得到水性混悬液；将水性混悬液离心弃去沉淀，并将所得混悬液置于磁铁上除去上清液，得到化疗药物的磁性热敏脂质体；
（4）取步骤（3）化疗药物的磁性热敏脂质体2mL，加入浓度为120mM的氯金酸20μL，涡旋均匀，然后加入浓度为400mM的抗坏血酸36μL，涡旋4min，在磁性热敏脂质体表面负载金纳米粒，并透析26h，得到磁性热敏脂质体纳米金复合物。
实施例3
本实施例的磁性热敏脂质体纳米金复合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2.40g FeCl3·6H2O和0.90g FeCl2·4H2O溶于超纯水中，加入氨水调节pH值至9，然后加热至85℃并通入氮气保护，反应35min后，加入0.4g/mL聚乙二醇2000溶液3mL，升温至88℃并继续反应80min，进行磁铁分离，再用超纯水和丙酮洗涤产物，真空冷冻干燥5h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
（2）分别称量二棕榈酰磷脂酰胆碱75mg、胆固醇12mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20001.2mg，溶解于氯仿和甲醇的体积比为1.5:1的有机溶剂中，得到有机溶液；
（3）将11.5mg Fe3O4磁性纳米粒子置于PBS溶液中，并加入柔红霉素5mg溶解，形成磁性混合液，超声分散均匀，并加入至有机溶液中，充分振荡，然后在真空状态下旋转蒸发除去有机溶剂得到水性混悬液；将水性混悬液离心弃去沉淀，并将所得混悬液置于磁铁上除去上清液，得到化疗药物的磁性热敏脂质体；
（4）取步骤（3）化疗药物的磁性热敏脂质体2mL，加入浓度为80mM的氯金酸28μL，涡旋均匀，然后加入浓度为600mM的抗坏血酸40μL，涡旋6min，在磁性热敏脂质体表面负载金纳米粒，并透析22h，得到磁性热敏脂质体纳米金复合物。
实施例4
本实施例的磁性热敏脂质体纳米金复合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2.35g FeCl3·6H2O和0.86g FeCl2·4H2O溶于超纯水中，加入氨水调节pH值至9，然后加热至80℃并通入氮气保护，反应30min后，加入0.2g/mL柠檬酸和0.3g/mL聚乙二醇2000的混合溶液2mL，升温至90℃并继续反应90min，进行磁铁分离，再用超纯水和丙酮洗涤产物，真空冷冻干燥4h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
（2）分别称量二棕榈酰磷脂酰胆碱70mg、胆固醇10mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20001mg，溶解于氯仿和甲醇的体积比为2:1的有机溶剂中，得到有机溶液；
（3）将10mg Fe3O4磁性纳米粒子置于PBS溶液中，并加入顺铂5mg溶解，形成磁性混合液，超声分散均匀，并加入至有机溶液中，充分振荡，然后在真空状态下旋转蒸发除去有机溶剂得到水性混悬液；将水性混悬液离心弃去沉淀，并将所得混悬液置于磁铁上除去上清液，得到化疗药物的磁性热敏脂质体；
（4）取步骤（3）化疗药物的磁性热敏脂质体2mL，加入浓度为100mM的氯金酸24μL，涡旋均匀，然后加入质量分数37%的甲醛溶液30μL，涡旋5min，在磁性热敏脂质体表面负载金纳米粒，并透析24h，得到磁性热敏脂质体纳米金复合物。
实施例5
本实施例的磁性热敏脂质体纳米金复合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2.35g FeCl3·6H2O和0.86g FeCl2·4H2O溶于超纯水中，加入氨水和氢氧化钠调节pH值至9，然后加热至80℃并通入氮气保护，反应30min后，加入0.5g/mL柠檬酸溶液2mL，升温至90℃并继续反应90min，进行磁铁分离，再用超纯水和丙酮洗涤产物，真空冷冻干燥4h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
（2）分别称量二棕榈酰磷脂酰胆碱70mg、胆固醇10mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20001mg，溶解于氯仿和甲醇的体积比为2:1的有机溶剂中，得到有机溶液；
（3）将10mg Fe3O4磁性纳米粒子置于PBS溶液中，并加入卡铂5mg溶解，形成磁性混合液，超声分散均匀，并加入至有机溶液中，充分振荡，然后在真空状态下旋转蒸发除去有机溶剂得到水性混悬液；将水性混悬液离心弃去沉淀，并将所得混悬液置于磁铁上除去上清液，得到化疗药物的磁性热敏脂质体；
（4）取步骤（3）化疗药物的磁性热敏脂质体2mL，加入浓度为100mM的氯金酸24μL，涡旋均匀，然后加入浓度为500mM的盐酸羟胺30μL，涡旋5min，在磁性热敏脂质体表面负载金纳米粒，并透析24h，得到磁性热敏脂质体纳米金复合物。
实验例1、磁性热敏脂质体纳米金复合物的粒子大小和表面带电量的确定
对磁性热敏脂质体纳米金复合物的粒子大小和表面带电量的确定，使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行测定，折射率设置为1.590，吸收系数设置为0.010，温度设置为25℃，测量模式设置为自动，以Z平均统计值作为测定结果。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。介电常数设置为79，黏度系数设置为0.8872，温度设置为25℃，测量模式设置为自动。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果，所得结果为粒径为100～200nm，电位为-26mV。因此可以证明，本发明的磁性热敏脂质体纳米金复合物的颗粒稳定性高，容易分布至肿瘤部位；电位为负点，更容易在表面包裹金纳米粒。
实验例2、磁性热敏脂质体纳米金复合物的细胞摄取率
将PC-3前列腺癌细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。将PC-3细胞培养在含胎牛血清（FBS）10%，青链霉素混合液1%的RPMI1640培养基中，培养箱条件为37℃、5%CO2，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，按2×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，置于37℃，5%CO2，完全湿度条件下培养24h，弃去孔中原培养基，用PBS洗3次。将伴随磁场和NIR热疗的磁性热敏脂质体纳米金复合物作为实验组，将单纯的磁性热敏脂质体纳米金复合物为对照组，设置复孔为6个，盐酸阿霉素浓度为8μg/mL。实验组放置在808nm近红外光2W中2min，光照结束后用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中磁场作用下孵育4h。对照组则直接用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育4h。在培养结束后弃去孔中旧培养基，PBS冲洗3次，每孔用1mL胰酶消化后弃去胰酶，加入3mL全培养基吹打成单细胞悬液；1000rpm离心10min收集细胞，用PBS洗涤，最后以1mL PBS重悬细胞。放入流式细胞仪检测各组载体系统的摄取率，结果见表1。
表1磁性热敏脂质体纳米金复合物在不同条件下的摄取率
摄取实验结果显示，磁性热敏脂质体纳米金复合物在磁场作用下联合热疗，可有效提高细胞对药物的摄取，摄取率最终可以达到90%以上。同时可以证明，本发明的磁性热敏脂质体纳米金复合物作为药物载体时能装载药物进入肿瘤细胞内部。
实验例3、磁性热敏脂质体纳米金复合物的抗肿瘤活性
1、对于体外抗肿瘤活性的分析
将PC-3前列腺癌细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。将PC-3细胞培养在含胎牛血清（FBS）10%，青链霉素混合液1%的RPMI1640培养基中，培养箱条件为37℃、5%CO2，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200μL，铺板使待测细胞调密度至6×103个/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。置于5%CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），将伴随磁场和NIR热疗的磁性热敏脂质体纳米金复合物作为实验组，将单纯的磁性热敏脂质体纳米金复合物为对照组，设置复孔为6个，盐酸阿霉素浓度为8μg/mL，另设空白对照组。实验组放置在808nm近红外光2W中2min，光照结束后用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中磁场作用下孵育24h，对照组则直接用铝箔包裹细胞板置于CO2培养箱中孵育24h。培养结束后，吸出含药培养基，每孔用150μL PBS洗2遍，加入预冷的10%TCA200μL，4℃放置1h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100μL的SRB溶液，静置10min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用10mmol/L非缓冲Tris碱150μL溶解。在808nm处测定每孔的OD值。抑制率的计算公式：抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值，结果见表2。
表2磁性热敏脂质体纳米金复合物在不同条件下的细胞抑制率
细胞抑制率结果显示，磁性靶向和化疗药物以及热疗联合治疗，可以更好的发挥抗肿瘤药物的疗效，能够更明显的抑制肿瘤细胞的增殖。
2、对于体内抗肿瘤活性的分析
取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3mL，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×106个/mL的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7d后，取其中360只肿瘤体积≥100mm3昆明小鼠，随机分为6组，每组60只。具体分组如下：（1）对照组（NS组）：生理盐水；（2）盐酸阿霉素注射液组；（3）磁性热敏脂质体纳米金复合物组；（4）磁性热敏脂质体纳米金复合物+磁场组；（5）磁性热敏脂质体纳米金复合物+磁场+NIR组。盐酸阿霉素注射液组、磁性热敏脂质体纳米金复合物组、磁性热敏脂质体纳米金复合物+磁场组和磁性热敏脂质体纳米金复合物+磁场+NIR组的盐酸阿霉素给药剂量相等，都为10mg/kg。5组均采用静脉给药的方式，其中光照组使用的光源为808nm红外光源，功率为2W，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为10min。每2d给药一次，共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径（A）与短径（B），按公式肿瘤体积计算肿瘤体积，结果见表3。
表3治疗结束后各组小鼠的相对肿瘤体积
结果发现，磁性热敏脂质体纳米金复合物光照加外磁场组相对肿瘤体积（治疗后小鼠平均肿瘤体积/治疗前小鼠平均肿瘤体积）比值小于1，肿瘤基本消失，与单独给药盐酸阿霉素注射液组相比，对肿瘤增长有明显的抑制，且与其他实验组的抑制肿瘤生长率的结果都具有显著性差异。
实验例4、磁性热敏脂质体纳米金复合物作为磁共振成像造影剂在肿瘤治疗中的应用
取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3mL，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×106个/mL的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7d后，取其中120只肿瘤体积≥100mm3昆明小鼠，随机分为2组，每组60只。具体分组如下：（1）对照组（NS组）：生理盐水；（2）磁性热敏脂质体纳米金复合物+磁场组。对两组小鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠0.04mL进行麻醉，固定后两组小鼠均采用静脉给药的方式，其中生理盐水200mL，2mg/mL磁性热敏脂质体纳米金复合物生理盐水溶液200μL。注射后24h后对小鼠进行T2WI磁共振成像。扫描参数为：横断位SE-T2WI，TR4240ms，TE1108.47ms，FOV8cm，层厚（横断位2mm，冠状位3mm），层间距1mm，矩阵9256×256。在两组小鼠的肿瘤区域的T2WI图像上绘制大小一致的感兴趣区ROI测量肿瘤实体部分信号强度（SIT），取其平均值，测量面积不小于6mm2，结果见表4。
表4小鼠肿瘤内部核磁信号强度分布百分率
结果表明，本发明的磁性热敏脂质体纳米金复合物组肿瘤区域的T2WI信号与对照组小鼠相应区域的信号相比，信号明显减低，MRI的效果明显增强。因此可以证明，磁性热敏脂质体纳米金复合物在磁场的作用下能够更多的分布于肿瘤部位。
Claims (9)
1.一种磁性热敏脂质体纳米金复合物，其特征在于，所述复合物是将热敏脂质体包裹Fe3O4磁性纳米粒子和化疗药物后，再负载金纳米粒制备而成；其中，Fe3O4磁性纳米粒子和化疗药物的质量比为1.7-2.3:1，所述化疗药物为盐酸阿霉素、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、柔红霉素中的一种；
所述的磁性热敏脂质体纳米金复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将2.30-2.40g FeCl3·6H2O和0.80-0.90g FeCl2·4H2O溶于超纯水中，调节pH值至9-10，然后加热至70-85℃并通入氮气保护，反应25-35min后，加入0.4-0.6g/mL改性溶液1.5-3mL，升温至88-95℃并继续反应80-100min，进行磁铁分离，再用超纯水和丙酮洗涤产物，真空冷冻干燥3-5h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；调节pH值的试剂为氨水、氢氧化钠中的一种或两种；改性溶液为柠檬酸溶液、柠檬酸钠溶液、聚乙二醇2000溶液中的一种，或两种、三种的混合溶液；
(2)分别称量二棕榈酰磷脂酰胆碱65-75mg、胆固醇8-12mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 0.8-1.2mg，溶解于氯仿和甲醇的体积比为1.5-2.5:1的有机溶剂中，得到有机溶液；
(3)将8.5-11.5mg Fe3O4磁性纳米粒子置于PBS溶液中，并加入化疗药物5mg溶解，形成磁性混合液，超声分散均匀，并加入至有机溶液中，充分振荡，然后在真空状态下旋转蒸发除去有机溶剂得到水性混悬液；将水性混悬液离心弃去沉淀，并将所得混悬液置于磁铁上除去上清液，得到化疗药物的磁性热敏脂质体；
(4)取步骤(3)化疗药物的磁性热敏脂质体2mL，加入浓度为80-120mM的氯金酸20-28μL，涡旋均匀，然后加入还原溶液30-40μL，涡旋4-6min，在磁性热敏脂质体表面负载金纳米粒，并透析22-26h，得到磁性热敏脂质体纳米金复合物；还原溶液为质量分数37％的甲醛溶液、浓度400-600mM的抗坏血酸溶液或盐酸羟胺溶液。
2.根据权利要求1所述的磁性热敏脂质体纳米金复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将2.35g FeCl3·6H2O和0.86g FeCl2·4H2O溶于超纯水中，加入氨水调节pH值至9，然后加热至80℃并通入氮气保护，反应30min后，加入0.5g/mL柠檬酸溶液2mL，升温至90℃并继续反应90min，进行磁铁分离，再用超纯水和丙酮洗涤产物，真空冷冻干燥4h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
(2)分别称量二棕榈酰磷脂酰胆碱70mg、胆固醇10mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 1mg，溶解于氯仿和甲醇的体积比为2:1的有机溶剂中，得到有机溶液；
(3)将10mg Fe3O4磁性纳米粒子置于PBS溶液中，并加入盐酸阿霉素5mg溶解，形成磁性混合液，超声分散均匀，并加入至有机溶液中，充分振荡，然后在真空状态下旋转蒸发除去有机溶剂得到水性混悬液；将水性混悬液离心弃去沉淀，并将所得混悬液置于磁铁上除去上清液，得到化疗药物的磁性热敏脂质体；
(4)取步骤(3)化疗药物的磁性热敏脂质体2mL，加入浓度为100mM的氯金酸24μL，涡旋均匀，然后加入浓度为500mM的抗坏血酸36μL，涡旋5min，在磁性热敏脂质体表面负载金纳米粒，并透析24h，得到磁性热敏脂质体纳米金复合物。
3.根据权利要求1所述的磁性热敏脂质体纳米金复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将2.30g FeCl3·6H2O和0.80g FeCl2·4H2O溶于超纯水中，加入氢氧化钠调节pH值至10，然后加热至70℃并通入氮气保护，反应25min后，加入0.6g/mL柠檬酸钠溶液1.5mL，升温至95℃并继续反应100min，进行磁铁分离，再用超纯水和丙酮洗涤产物，真空冷冻干燥3h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
(2)分别称量二棕榈酰磷脂酰胆碱65mg、胆固醇8mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 0.8mg，溶解于氯仿和甲醇的体积比为2.5:1的有机溶剂中，得到有机溶液；
(3)将8.5mg Fe3O4磁性纳米粒子置于PBS溶液中，并加入米托蒽醌5mg溶解，形成磁性混合液，超声分散均匀，并加入至有机溶液中，充分振荡，然后在真空状态下旋转蒸发除去有机溶剂得到水性混悬液；将水性混悬液离心弃去沉淀，并将所得混悬液置于磁铁上除去上清液，得到化疗药物的磁性热敏脂质体；
(4)取步骤(3)化疗药物的磁性热敏脂质体2mL，加入浓度为120mM的氯金酸20μL，涡旋均匀，然后加入浓度为400mM的抗坏血酸36μL，涡旋4min，在磁性热敏脂质体表面负载金纳米粒，并透析26h，得到磁性热敏脂质体纳米金复合物。
4.根据权利要求1所述的磁性热敏脂质体纳米金复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将2.40g FeCl3·6H2O和0.90g FeCl2·4H2O溶于超纯水中，加入氨水调节pH值至9，然后加热至85℃并通入氮气保护，反应35min后，加入0.4g/mL聚乙二醇2000溶液3mL，升温至88℃并继续反应80min，进行磁铁分离，再用超纯水和丙酮洗涤产物，真空冷冻干燥5h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
(2)分别称量二棕榈酰磷脂酰胆碱75mg、胆固醇12mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 1.2mg，溶解于氯仿和甲醇的体积比为1.5:1的有机溶剂中，得到有机溶液；
(3)将11.5mg Fe3O4磁性纳米粒子置于PBS溶液中，并加入柔红霉素5mg溶解，形成磁性混合液，超声分散均匀，并加入至有机溶液中，充分振荡，然后在真空状态下旋转蒸发除去有机溶剂得到水性混悬液；将水性混悬液离心弃去沉淀，并将所得混悬液置于磁铁上除去上清液，得到化疗药物的磁性热敏脂质体；
(4)取步骤(3)化疗药物的磁性热敏脂质体2mL，加入浓度为80mM的氯金酸28μL，涡旋均匀，然后加入浓度为600mM的抗坏血酸40μL，涡旋6min，在磁性热敏脂质体表面负载金纳米粒，并透析22h，得到磁性热敏脂质体纳米金复合物。
5.根据权利要求1所述的磁性热敏脂质体纳米金复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将2.35g FeCl3·6H2O和0.86g FeCl2·4H2O溶于超纯水中，加入氨水调节pH值至9，然后加热至80℃并通入氮气保护，反应30min后，加入0.5g/mL柠檬酸溶液2mL，升温至90℃并继续反应90min，进行磁铁分离，再用超纯水和丙酮洗涤产物，真空冷冻干燥4h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
(2)分别称量二棕榈酰磷脂酰胆碱70mg、胆固醇10mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 1mg，溶解于氯仿和甲醇的体积比为2:1的有机溶剂中，得到有机溶液；
(3)将10mg Fe3O4磁性纳米粒子置于PBS溶液中，并加入盐酸阿霉素5mg溶解，形成磁性混合液，超声分散均匀，并加入至有机溶液中，充分振荡，然后在真空状态下旋转蒸发除去有机溶剂得到水性混悬液；将水性混悬液离心弃去沉淀，并将所得混悬液置于磁铁上除去上清液，得到化疗药物的磁性热敏脂质体；
(4)取步骤(3)化疗药物的磁性热敏脂质体2mL，加入浓度为100mM的氯金酸24μL，涡旋均匀，然后加入质量分数37％的甲醛溶液30μL，涡旋5min，在磁性热敏脂质体表面负载金纳米粒，并透析24h，得到磁性热敏脂质体纳米金复合物。
6.根据权利要求1所述的磁性热敏脂质体纳米金复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将2.35g FeCl3·6H2O和0.86g FeCl2·4H2O溶于超纯水中，加入氨水调节pH值至9，然后加热至80℃并通入氮气保护，反应30min后，加入0.5g/mL柠檬酸溶液2mL，升温至90℃并继续反应90min，进行磁铁分离，再用超纯水和丙酮洗涤产物，真空冷冻干燥4h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
(2)分别称量二棕榈酰磷脂酰胆碱70mg、胆固醇10mg和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 1mg，溶解于氯仿和甲醇的体积比为2:1的有机溶剂中，得到有机溶液；
(3)将10mg Fe3O4磁性纳米粒子置于PBS溶液中，并加入盐酸阿霉素5mg溶解，形成磁性混合液，超声分散均匀，并加入至有机溶液中，充分振荡，然后在真空状态下旋转蒸发除去有机溶剂得到水性混悬液；将水性混悬液离心弃去沉淀，并将所得混悬液置于磁铁上除去上清液，得到化疗药物的磁性热敏脂质体；
(4)取步骤(3)化疗药物的磁性热敏脂质体2mL，加入浓度为100mM的氯金酸24μL，涡旋均匀，然后加入浓度为500mM的盐酸羟胺30μL，涡旋5min，在磁性热敏脂质体表面负载金纳米粒，并透析24h，得到磁性热敏脂质体纳米金复合物。
7.一种如权利要求1所述的磁性热敏脂质体纳米金复合物在制备作为抗肿瘤药物载体方面的应用。
8.一种如权利要求1所述的磁性热敏脂质体纳米金复合物在制备作为抗肿瘤光动力治疗的热敏剂方面的应用。
9.一种如权利要求1所述的磁性热敏脂质体纳米金复合物在制备作为抗肿瘤治疗中的磁共振成像造影剂方面的应用。
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