CN107446095B - 一种三嵌段peg-pbla-paapba聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种三嵌段peg-pbla-paapba聚合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种三嵌段PEG‑PBLA‑PAAPBA聚合物及其制备方法和应用。所述PEG‑PBLA‑PAAPBA聚合物中，单甲基醚聚乙二醇PEG的数均分子量为1.5~2.5 KD，聚天冬氨酸PBLA的重复单元数为6~10，聚丙烯酰胺基苯硼酸PAAPBA的重复单元数为8~15。本发明提供的三嵌段PEG‑PBLA‑PAAPBA聚合物同时具有亲水段PEG、疏水段PBLA和pH响应性的嵌段PAAPBA，以其为原料制备得到的PEG‑PBLA‑PAAPBA聚合物纳米胶束兼具靶向性和pH环境响应性，具有合适的粒径且毒性较低，可广泛应用于医学领域中。

Description

一种三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于高分子化学与生物医学工程领域，更具体地，涉及一种三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
近年来纳米医学的迅猛发展，自学术界首次报道脂质体作为药物载体并且对多肽类药物具有良好的负载效果后，诸如树枝状大分子、凝胶、聚合物等一系列纳米载体材料相继出现。两亲性聚合物通过自组装方式形成的聚合物纳米胶束，在医学临床治疗药物载体中具有巨大的应用潜力，与其他纳米材料相比，具有多项独特的性质与优势。一方面，在尺寸上，以聚合物为骨架的纳米胶束粒径一般为10nm～200nm，处于这个尺寸范围的粒子往往能够避开网状上皮细胞系统与单核吞噬细胞体系的识别，有效提高药物载体的体循环时间。另一方面，结合病变组织处的生化特征（如EPR效应，pH环境偏酸性等），作为药物载体的聚合物纳米胶束能通过被动靶向集中分布在病灶部位，使得该处的药物浓度大为提高，改善药物治疗的效果。
目前聚合物纳米胶束用作负载并传输药物主要存在两大问题：一是纳米载药体系在体循环中出现药物渗漏导致药物过早释放，以至于对机体产生毒副作用，同时这也使得载体到达病灶处时药物浓度过低，影响治疗效果；二是载药纳米粒子在进入病灶组织细胞之后，药物释放过慢，不能达到有效的自由药物浓度，影响杀灭病变细胞的效果，还可能导致细胞产生耐药性。针对上述两个难题，需要对聚合物纳米胶束材料的结构进行优化，设计新型的聚合物纳米载体，并有针对性地研究能实现药物控释的方法以提高药物的生物利用率。
环境敏感型聚合物纳米载体，因其有控制药物“智能释放”的功能，近年来吸引了越来越多研究学者的关注。当载体某些生化条件发生变化或受外加物理作用后，会对这些特定的刺激作出响应，其本身的结构或构象会发生改变（如分解、异构化等），从而实现了药物在特定环境下释放；选用环境敏感型聚合物纳米载体能够有效防止药物过早释放，确保载体达到病灶处时的药物浓度。
载体的靶向分为被动靶向与主动靶向。被动靶向一般是以削弱药物载体与非病变细胞、组织、器官的非特异性作用来加强对目标病灶部位的用物水平，从而提高治疗效果；主动靶向是指药物载体对靶细胞的特异性靶向作用，通过向载体外壳引入无毒副作用的配体分子如叶酸，配体再与目标细胞细胞膜上的相应受体相互作用，实现载药体系在靶细胞处的集中分布，再通过细胞的内吞使负载药物的载体进入靶细胞。提高聚合物纳米胶束对病变细胞的靶向性，是提高药物利用率及对降低药物毒副作用的关键。
因此，研究一种兼具环境敏感性和靶向性的聚合物纳米胶束材料以提高药物的生物利用率、降低药物毒副作用极为迫切。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中聚合物纳米胶束无法“智能控制”药物释放的缺陷，提供一种三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物，本发明提供的三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物同时具有亲水段PEG、疏水段PBLA和pH响应性的嵌段PAAPBA，以其为原料制备得到的聚合物纳米胶束兼具靶向性和pH响应性，具有合适的粒径且毒性较低，可广泛应用于医学领域中。
本发明的另一目的在于提供上述三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束。
本发明的另一目的在于提供上述PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束作为载体在医学领域中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物，所述聚合物中，单甲基醚聚乙二醇PEG的数均分子量为1.5~2.5KD， 聚天冬氨酸PBLA的重复单元数为6~10，聚丙烯酰胺基苯硼酸PAAPBA的重复单元数为8~15。
本发明提供的三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物，PEG为亲水段，PAAPBA为疏水段，PAAPBA段在pH为7.0~7.5条件下具有疏水性，pH高于8条件下具有亲水性，该聚合物随着pH条件的变化可自组装为纳米胶束或解组装。发明人研究发现，该聚合物在超声条件下，调节pH为7.0~7.5时能够自组装形成纳米胶束；该纳米胶束兼具pH响应性，同时具有合适的粒径（经TEM表征粒径为50~70nm），可作为多功能药物载体应用于医学诊疗领域。
优选地，所述三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物中PEG数均分子量为2KD， PBLA的重复单元数为8，PAAPBA的重复单元数为10。
上述三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物的制备方法，包括如下步骤：
S1：以单甲基醚聚乙二醇mPEG-OH、氨水为原料，新蒸甲苯、新蒸三氯甲烷为溶剂，并加入三乙胺、对甲苯磺酰氯、4-二甲基氨基吡啶DMAP反应，以乙醚沉淀，得到氨基聚乙二醇mPEG-NH2；
S2：以天冬氨酸为原料，无水乙醚为溶剂，浓硫酸为催化剂，加入苯甲醇、95%乙醇，再加入氨水至体系pH为中性，溶液冷冻抽滤，重结晶，得天冬氨酸苄酯BLA；
S3：以mPEG-NH2、BLA为原料，经酯化、开环、链引发反应后得mPEG-PBLA；
S4：：以mPEG-PBLA、2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸DDAT为原料，新蒸二氯甲烷为溶剂，氮气保护下加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS、N,N-二环己基碳二亚胺DCC，避光反应，乙醚沉淀，得到mPEG-PBLA-DDAT；
S5：以间氨基苯硼酸APBA、丙烯酰氯为原料， NaOH水溶液为溶剂，冰浴反应，乙醇重结晶，得到丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA；
S6：AAPBA作为单体，mPEG-PBLA-DDAT作为链转移剂，偶氮二异丁腈AIBN为引发剂，溶解于DMF和水的混合溶剂中，室温用氮气鼓泡，发生RAFT聚合；然后脱去聚合物中的硫代碳酸酯基团，用无水乙醚沉淀若干次，最后得到PEG-PBLA-PAAPBA。
一种PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束，其制备方法如下：将上述PEG-PBLA-PAAPBA聚合物溶于有机溶剂后，超声条件下加入至pH为7.0~7.5的水中，即得PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束。
本发明提供的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束兼具pH响应性和靶向功能，还具有合适的粒径，可作为载体负载药物。负载有药物的纳米胶束在环境pH发生变化时胶束结构被破坏，胶束解组装从而实现在特定酸碱性条件下（如肿瘤细胞内酸性环境）释放药物。本发明提供的三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物可制备成纳米胶束作为多功能载体应用于肿瘤诊疗领域。
为赋予聚合物纳米胶束还原敏感性，以拓宽其应用范围，优选地，所述胶束表面的硼酸基团交联有3,3-二硫代二[1,2(S)-丙二醇]DTBPD。
DTBPD基团的交联实质上是在胶束表面引入了双硫键，当细胞内外还原性物质谷胱甘肽浓度差异造成氧化-还原电位时，双硫键可使载体作出响应，从而智能的释放药物，因此表面交联有DTBPD的胶束还具有还原敏感性。
本发明中为提高纳米胶束对病变细胞的靶向性，扩宽该胶束作为药物载体的应用范围，提高药物利用率，可引入叶酸基团。优选地，所述DTBPD通过金-硫键连接有纳米金，所述纳米金通过金-硫键连接有带叶酸基团的化合物HS-PEG-FA。
在纳米胶束上引入的无毒副作用的叶酸配体可以很快与病变细胞的叶酸受体作用，诱导细胞内吞作用而被病变细胞吸收，从而提高聚合物纳米胶束的靶向性。
上述PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束作为载体在医学领域中的应用。
PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束本身具有较好的pH响应性与靶向性，当其交联有DTBPD时还具有较好的还原敏感性；当其交联有DTBPD并引入有叶酸基团时，在赋予还原敏感性的同时还进一步提高了其靶向性，该胶束的性能进一步被优化，具有更为广泛的应用范围。
优选地，所述PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束作为载体在负载造影剂SPIO或盐酸阿霉素中的应用。
SPIO是一种常用的磁共振成像（MRI）造影剂，但是SPIO在体内应用时容易发生聚集。本发明提供的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束可用于负载有造影剂SPIO，这能够有效避免SPIO在体内聚集，并且能够特异性地靶向病变细胞，提高对病灶的成像效果。
化疗药物盐酸阿霉素抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用。在亲水条件下，本发明提供的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束能够负载盐酸阿霉素。在环境条件变化时，负载有盐酸阿霉素的胶束解组装将化疗药物盐酸阿霉素释放出来，从而提高药物利用率、降低药物毒副作用，达到较好的治疗效果。
优选地，所述造影剂SPIO的质量分数为10~15%；所述盐酸阿霉素的载药率为5~7%。
优选地，所述造影剂SPIO的质量分数为14.2%；所述盐酸阿霉素的载药率为6.5%。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物同时具有亲水段PEG、疏水段PBLA和pH响应性的嵌段PAAPBA，可在特定pH条件下自组装为具有较好环境敏感性和靶向性的聚合物纳米胶束，并作为载体负载药物。以本发明提供的三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物为原料制备得到的聚合物纳米胶束具有较好的pH响应性和靶向性，当在该聚合物纳米胶束表面交联DTBPD和叶酸基团时还具有还原敏感性和更好的靶向性，可作为多功能载体应用于医学领域中，尤其可作为造影剂SPIO和化疗药物盐酸阿霉素的载体。
附图说明
图1为三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物的制备流程图；
图2为三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物的核磁谱图；
图3为三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物凝胶渗透色谱图；
图4为负载有造影剂SPIO的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束的透射电镜；
图5为负载有造影剂SPIO的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束的粒径分布图；
图6为负载有造影剂SPIO的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束在10K与300K下的磁化曲线；
图7为负载有造影剂SPIO的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束T2弛豫曲线；
图8为不同pH及还原条件下PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束的荧光光谱；
图9为不同pH及还原条件下PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束中DOX·HCl的体外释放曲线
图10分别为PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束（简称为PPP）、交联有DTBPD的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束(简称为PPP-NG)、负载化疗药物盐酸阿霉素的PPP-NG（简称为D-PPP-NG）、连接有叶酸基团的D-PPP-NG（简称为FA-D-PPP-NG）的细胞毒性试验结果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料，试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物
本实施例提供了一种三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物，所述PEG-PBLA-PAAPBA聚合物中亲水段PEG的数均分子量为2KD、疏水段PBLA的重复单元数为8、PAAPBA的重复单元数为10。
上述三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物的制备方法如下：
先以单甲基醚聚乙二醇（mPEG-OH，Mn=2kDa），天冬氨酸，2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DDAT)，间氨基苯硼酸（APBA）为原料，通过酯化、开环、链引发反应制备丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)及大分子mPEG-PBLA-DDAT。然后利用可逆-加成断裂链转移(RAFT)聚合原理，将丙烯酰胺基苯硼酸单体(AAPBA)0.29g(1.53mmol)，大分子链转移剂mPEG-PBLA-DDAT 0.4g (0.1mmol)，引发剂偶氮二异丁腈1.6mg(AIBN,0.01mmol)加至25ml反应瓶，溶解于10ml反应级DMF和水的混合溶剂中(95:5,v/v)。室温用氮气鼓泡45min后，将反应体系转移至70℃油浴下反应36h。迅速冷却至室温，加入AIBN 0.33g(2mmol)，通氮气鼓泡45min后再置于70℃反应20 h，如此反复操作两次以脱去聚合物中的硫代碳酸酯基团。之后反应体系于无水乙醚中重复沉淀两次，过滤，固体再用丙酮洗涤，抽真空干燥后，最后得到产物0.47g三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物，反应流程如下图1所示。
更改相应物料的用量，按照上述同样的方法可制备得到不同PEG的数均分子量、PBLA的重复单元数和PAAPBA的重复单元数的三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物，在此不再赘述。
（1）三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物的核磁分析
对三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物进行核磁分析，结果如图2所示，主要的核磁峰都有一个很好的归属。
（2）三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物的凝胶渗透色谱
采用凝胶渗透色谱法对该三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物进行分子量及分子量分布的检测。以色谱纯四氢呋喃为流动相，如图3所示，该样品流出曲线为单峰，检测出的分子量为Mn=4561；Mw=5995，多分散系数为1.31，可理解为单分散分布。
上述表征测试结果可证明成功制备三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物。
实施例2 PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束
取上述制备得到的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物溶于有机溶剂后，超声条件下加入至pH为7.4的水中，即得PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束（PPP）。
应用例1 负载有造影剂SPIO的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束
本应用例中的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束未交联有DTBPD，具体制备方法A如下：
取30mg实施例2中PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束溶于3ml DMF中，2.4mg SPIO溶解于1ml四氢呋喃中并混合，之后于超声条件下逐滴加到pH为7.4的去离子水中。再用截留分子量14K的透析袋，于pH7.4的去离子水中透析2d，以除去体系中的有机溶剂。所得溶液在室温下8000rpm离心30min，除掉下层黑色沉淀（聚集体），上清液9000rpm离心60min，取下层沉淀用pH7.4去离子水洗涤一次，超声下加入pH7.4去离子水重新分散样品，得到负载有造影剂SPIO的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束，其中SPIO的质量百分数为14.2%。
若改变上述SPIO的添加量，可得到其它SPIO质量百分数的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束。
（1）透射电镜测试
采用透射电子显微镜（TEM）对上述负载有造影剂SPIO的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束的形貌尺寸进行直观的检测。取负载有造影剂SPIO的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束（浓度为0.2mg/mL）5μL滴在纯碳膜铜网上，室温条件下置于干燥器中晾干，充分干燥后，不加染色剂，用JEM-2010透射电镜在80kV下对样品形貌进行观察。结果如图4，可见所制备样品粒径分布较为均匀，胶束内能观察到小粒径SPIO纳米颗粒。而从图5中粒径分布可以看出样品粒径主要分布在79nm，分布均一。
（2）磁滞回线测试
取上述负载有造影剂SPIO的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束冻干样10mg于特定样品管，设定测试温度为10K与300K，外加磁场从-2×104 kOe变化到2×104kOe，用MPMS XL-7 超导量子干涉仪检测样品的超顺磁性。所得数据制得样品的磁滞回曲线，以检测样品是否具超顺磁性。如图6，可见在测试温度设定为10K时，磁化曲线中明显出现磁滞环，矫顽力约为260 Oe；而测试温度为300K时，没有磁滞环出现，样品具有超顺磁性，磁化强度为42emu/g。与尺寸6nm的市售四氧化三铁（84.5 emu/g）相比磁化强度偏低，这是SPIO包裹在PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束中被屏蔽而引起的。
（3）弛豫率回归分析
SPIO作为T2型对比剂，在外加磁场作用下缩短质子横向弛豫时间T2,增强T1/T2对比度，从而增大磁共振检测的灵敏度。SPIO对横向弛豫时间的响应性是它作为T2对比剂的首要考虑因素。将上述负载有造影剂SPIO的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束溶液逐级稀释，用MRI扫描仪对不同浓度下胶束样品进行测试。测试条件设置如下：磁场强度3.0T，体外测试用11-cm环形线圈。T2加权图像使用下列参数：TR/TE:2000/104ms；FOV:5×6；层厚：2.0mm；矩阵：256×256。选取目标信号区域，测得T2的弛豫时间。采用最小二乘法对1/T2（设为r2）随样品铁浓度变化进行线性回归分析，所得的r2随铁浓度变化直线的斜率为T2的弛豫率。通过计算图像（图7）的斜率，得出样品弛豫率r2为102.24 Fe mM-1s-1，高于目前市售的葡聚糖包裹的SPIO（r2为30-50 Fe mM-1s-1）。说明上述负载有造影剂SPIO的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束作为T2造影剂的灵敏度会显著增强。
应用例2 负载有化疗药物盐酸阿霉素PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束
本应用例中PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束上交联有DTBPD，且所述DTBPD上通过金-硫键连接有纳米金，所述纳米金通过金-硫键连接有叶酸基团。具体制备方法如下：
取30mg PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束、1.2mg PAAPBA7，溶解于3ml DMF中，之后于超声条件下逐滴加到30ml pH7.4的去离子水中。再用截留分子量14K的透析袋，于pH7.4的去离子水中透析2d，以除去体系中的有机溶剂。调节体系pH至8.5，取3mg阿霉素盐酸盐溶于1ml pH7.4水中，超声下缓慢滴入至上述弱碱性胶束液中，将DTBPD与纳米金溶液滴加到上述胶束液中，在此基础上再往体系加入双功能基聚乙二醇HS-PEG3500-FA的DMSO溶液以进一步修饰纳米金。投料时控制胶束中苯硼酸基团与交联剂摩尔比为1:2，交联剂与纳米金摩尔比为2:1，HS-PEG-FA与嵌段共聚物摩尔比为1:5，常温下反应20h，之后将溶液透析，过滤，浓缩，冷冻保存，即得到负载有化疗药物盐酸阿霉素的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束（FA-D-PPP-NG），其中盐酸阿霉素的载药率为6.5%。
上述DTBPD（3,3-二硫代二[1,2(S)-丙二醇）制备方法可参考文献：孙小成，杨浩，王建祖等.基于含苯硼酸聚合物的双响应性胶束[J].高等学校化学学报，2014,7(35)：1570-1578.
上述纳米金溶液由以下制备方法制得：取氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液于离心管，定容后加入NaBH4水溶液，室温下剧烈搅拌后用水性滤头过滤即得纳米金。
上述HS-PEG-FA由以下制备方法制得：以FA为原料，DMSO为溶剂，加入NHS、EDC.HCl，搅拌过夜以活化FA；以HS-PEG-NH2为原料与FA进行酰胺化反应，以无水甲醇透析，二氯甲烷沉淀，滤液再以乙醚沉淀，浓缩干燥得HS-PEG-FA。
上述PAAPBA7，由以下制备方法得到：以丙烯酰胺基苯硼酸（AAPBA）为单体，制备得到的重复单元数为7的低聚物即为PAAPBA7。
在上述制备反应过程中，若不添加盐酸阿霉素、纳米金和双功能基聚乙二醇HS-PEG3500-FA的DMSO溶液，其余操作步骤一致，则可制备得到交联有DTBPD的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束（PPP-NG）；若不添加纳米金和双功能基聚乙二醇HS-PEG3500-FA的DMSO溶液，其余操作步骤一致，则可制备得到负载有化疗药物盐酸阿霉素及交联有DTBPD的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束（D-PPP-NG）。
（1）双重敏感荧光测试
取上述FA-D-PPP-NG溶液（pH=7.4），分成四等份，其中一份不作任何处理，另外三份分别作出如下处理：加入200μL 15mM的DTT水溶液；用1mol/L HCl调节pH为5.0；用上述HCl调节pH至5.0同时加入200μL 15mM的DTT水溶液。避光环境下静置3h后分别对四组样品用PE-LS55荧光分光光度计进行测试。对荧光测试条件进行设置：激发波长480nm，扫描速率为60nm/min，扫描范围为500-800nm，狭缝宽度为4nm。
上述实验通过荧光光谱分析药物在不同环境下的释放情况。结果如图8所示，在pH7.4，由于无环境因素的刺激，纳米胶束的结构稳定，盐酸阿霉素被包载于胶束内发生聚集导致荧光淬灭效应，因此相应测得的荧光值很低。往pH7.4体系中加入10mM DTT避光静置3h后，发现阿霉素荧光值增大，表明DTT使胶束中二硫键断裂，胶束结构开始受到破坏，药物开始释放；当pH降到5.0时3h后，药物的荧光显著增强了，证明在酸性条件下胶束交联结构被破坏，大量药物从胶束内释放出来荧光解淬灭。在pH 5.0和10mM DTT浓度下，药物的荧光进一步增强，这表明在pH及还原双重刺激作用下胶束加速解体，进一步促进盐酸阿霉素的释放。
（2）体外模拟释放实验
取上述FA-D-PPP-NG溶液样品平均分成四份，四份样品条件分别设置为pH为7.4、pH7.4加上10mmol/L DTT溶液、pH5.0以及pH5.0加上10mmol/L DTT溶液，并且每份样品设置三个平行组，每组加入3ml胶束液于14kDa透析袋中，透析袋外加入20ml相同条件下的PBS缓冲液，于摇床中进行体外模拟释放（设置温度为37℃，转速75rpm/min）。然后在设定的不同时间点收集各组透析袋外的溶液，并补加等量的PBS缓冲液。收集液用紫外可见分光光度计检测在480nm处的吸收强度，利用已经制定的标准曲线算出阿霉素盐酸盐的各个时间点的累计释放率。结果如图9所示，可见载药胶束在pH7.4且无DTT存在条件下，阿霉素盐酸盐的释放十分缓慢，24小时的累积释放率仅为10.97%；而在此基础上向体系加入10mM的DTT后，药物的释放速率稍微增大，24小时累计释放率升至16.36%；而调节体系pH至5.0，药物的释放量较之前两组显著增大，24小时累积释放率高达77.68%，而且释药速率也明显提高，前6小时的释药率已经达到48.69%；而在pH5.0条件的基础上再加入10mM DTT，药物的释放量及释放速率均进一步增大，在6小时这个时间点的累计释放率高达65.13%，24小时后累积释药率达88.34%。
上述化疗药物盐酸阿霉素的中小分子DTBPD与PAAPBA嵌段末端的硼酸基团通过脱水缩合形成的环酯交联结构在弱碱性与中性环境下能保持稳定，而在酸性条件下稳定性降低，会发生解离，使得交联胶束的结构受到破坏，药物快速释放。而此时再加入还原剂DTT，小分子DTBPD中的二硫键发生断裂，促进胶束中的药物进一步释放。从上述载药交联胶束的药物释放行为来看，该胶束具有pH及还原双重敏感性。
（3）细胞毒性试验
通过四唑盐比色法（MTT）检测载体对C6细胞毒性的影响。将细胞接种于96孔板（1×103个细胞/孔），于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。分成对照组和实验组，每组各设3个复孔，加入不同的载体体系如：1）PPP；2）PPP-NG；3）D-PPP-NG；4）FA-D-PPP-NG，其中FA-D-PPP-NG的培养液换成不含FA及血清的培养基，再培养24h，弃去原有培养基，每孔加10μL 5mg/mLMTT溶液和100uL培养基混合液，同时设3个本底孔，于37℃继续孵育4h，弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜（DMSO）溶液，震荡10min，用酶标仪检测各孔在570nm波长的吸光度值，取3孔平均值。以空白对照组为基准，计算细胞存活率。结果如图10，显然，随着胶束浓度的增加，C6细胞的存活率出现下降，对于样品PPP，其对细胞的毒性不大，样品浓度达到0.5mg/mL时，超过90%的C6细胞存活；当胶束浓度进一步升至1.5mg/mL，C6细胞存活率仍在85%的水平。相比而言，PPP-NG的细胞毒性略为增大。而对于载药胶束D-PPP-NG，随着样品中阿霉素盐酸盐浓度的增加，C6细胞的存活率发生下降，DOX·HCl浓度升至15μg/ml时，C6细胞存活率降至不足60%。而对于胶束FA-D-PPP-NG，药物浓度的增大相应细胞的存活率下降更加明显，DOX·HCl浓度为2.5μg/ml情况下，C6细胞存活率已经低于60%。从细胞毒性测试的结果可说明负载盐酸阿霉素的胶束能有效增强对C6细胞的杀灭能力；而引入叶酸基团的载药胶束，由于具有靶向肿瘤细胞的功能，其杀灭C6细胞的能力进一步提高。

Claims (5)

1.一种三嵌段PEG-PBLA-PAAPBA聚合物的制备方法，其特征在于，所述PEG-PBLA-PAAPBA聚合物中，单甲基醚聚乙二醇PEG的数均分子量为1.5～2.5KD，聚天冬氨酸PBLA的重复单元数为6～10，聚丙烯酰胺基苯硼酸PAAPBA的重复单元数为8～15；所述制备方法包括如下步骤：
S1：以单甲基醚聚乙二醇mPEG-OH、氨水为原料，新蒸甲苯、新蒸三氯甲烷为溶剂，加入三乙胺、对甲苯磺酰氯、4-二甲基氨基吡啶DMAP反应，以乙醚沉淀，得到氨基聚乙二醇mPEG-NH2；
S2：以天冬氨酸为原料，无水乙醚为溶剂，浓硫酸为催化剂，加入苯甲醇、95％乙醇，再加入氨水至体系pH为中性，溶液冷冻抽滤，重结晶，得天冬氨酸苄酯BLA；
S3：以mPEG-NH2、BLA为原料，经酯化、开环、链引发反应后得到聚乙二醇-聚天冬氨酸mPEG-PBLA；
S4：以mPEG-PBLA、2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸DDAT为原料，新蒸二氯甲烷为溶剂，氮气保护下加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS、N,N-二环己基碳二亚胺DCC，避光反应，乙醚沉淀，得到大分子链转移剂mPEG-PBLA-DDAT；
S5：以间氨基苯硼酸APBA、丙烯酰氯为原料，NaOH水溶液为溶剂，冰浴反应，乙醇重结晶，得到丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA；
S6：以AAPBA作为单体，mPEG-PBLA-DDAT作为链转移剂，偶氮二异丁腈AIBN为引发剂，溶解于DMF和水的混合溶剂中，室温用氮气鼓泡，发生RAFT聚合；然后脱去聚合物中的硫代碳酸酯基团，用无水乙醚沉淀若干次，最后得到PEG-PBLA-PAAPBA。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，PEG的数均分子量为2KD，PBLA的重复单元数为8，PAAPBA的重复单元数为10。
3.一种PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束，其特征在于，所述聚合物纳米胶束的制备方法如下：将权利要求1或2所述方法制备得到的PEG-PBLA-PAAPBA聚合物溶于有机溶剂后，超声条件下加入至pH为7.0～7.5的水中，即得所述聚合物纳米胶束。
4.根据权利要求3所述PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束，其特征在于，所述胶束表面的硼酸基团交联有3,3-二硫代二[1,2(S)-丙二醇]DTBPD。
5.根据权利要求4所述PEG-PBLA-PAAPBA聚合物纳米胶束，其特征在于，所述DTBPD通过金-硫键连接有纳米金，所述纳米金通过金-硫键连接有带叶酸基团的化合物HS-PEG-FA。
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