CN109172521A - 一种用于载药的酸性响应纳米胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可用于载药的超敏感酸性响应纳米胶束及其制备方法和应用。该纳米胶束由两嵌段聚合物由亲水段聚乙二醇(PEG)和疏水段pH敏感聚天冬氨酸酰二异丙基乙二胺/二正丁基乙二胺(PAsp(DIP/DBA))自组装而成。该纳米胶束能延长药物的循环时间并在肿瘤部位聚集，增加局部药物浓度，且能响应肿瘤组织的微酸环境，作为刺激响应的药物载体，在肿瘤部位快速释放负载的化疗药物阿霉素，起到显著的抗肿瘤效果。同时，该纳米胶束负载磁共振造影剂超顺磁性氧化铁后，可用于肿瘤磁共振成像并监测药物的摄取、聚集情况。这种利用纳米药物在肿瘤部位聚集、载体自身酸性响应性实现药物快速释放来提高肿瘤治疗效果，同时赋予纳米胶束磁共振可视化功能的方法，为癌症的诊疗提供了一种有前途的创新性策略，应用前景广阔。

Description

一种用于载药的酸性响应纳米胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物载体技术领域，尤其是一种用于载药的酸性响应纳米胶束及其制备方法和应用。
背景技术
化疗是肿瘤最主要的治疗方法之一，也常与其它治疗方法联合应用以最大限度地提高杀灭肿瘤细胞的效率，改善患者生存率。但是，化疗是全身性的治疗手段，化疗药物的作用选择性不强，其在杀伤肿瘤细胞的同时也不可避免地会损伤机体的正常细胞，从而带来明显的毒副反应。而且，大多数的化疗药物为疏水性药物，溶解度低，半衰期短，生物利用率低。因此，如何提高药物的生物利用率、增强药物的作用效果并降低药物的毒副反应是肿瘤化疗面临的重要课题。
近十几年间，基于两性嵌段共聚物的聚合物胶束因其具有作为药物载体和影像探针的应用前景而倍受学者的关注。这些聚合物胶束拥有典型的“核-壳结构”，其疏水性的内核可用于负载疏水性的药物(如紫杉醇、阿霉素等)，亲水性的外壳则可使其逃逸网状内皮系统的诱捕，延长其在血液循环中的时间，提高药物的溶解度和生物利用率，增强治疗效果。而且，聚合物胶束负载药物后形成的纳米药物递送体系还可能通过高渗透滞留效应在肿瘤组织内聚集，局部药物浓度增高，当药物从纳米胶束中释放后，便可发挥其抗肿瘤效果。
然而，就算纳米载体能有效地把药物输送到肿瘤组织或细胞内，如果其负载的药物无法快速地释放，治疗效果也将大打折扣。许多传统纳米载体的药物释放特性就表现为，在制备后的初期(储存时或在血液循环中)会出现药物的快速释放，而剩余药物的释放则往往需要持续几天甚至使几周的时间。这样，由于药物释放缓慢，纳米药物被细胞摄取后也无法取得满意的作用，游离药物浓度不足以杀伤肿瘤细胞，而且可能诱发耐药的发生，导致治疗失败。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可用于载药的酸性响应纳米胶束，其可在肿瘤部位聚集，使得局部药物浓度增加；同时，该纳米胶束具有肿瘤微酸环境触发的释药功能，可以实现肿瘤组织聚集、肿瘤定点智能控制释放，可显著提高抗肿瘤药物的治疗效果。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
在第一个方面，本发明提供了一种用于载药的酸性响应纳米胶束，是由亲水性嵌段和疏水性pH敏感嵌段自组装形成的两嵌段聚合物。其中，酸性响应性的药物释放功能通过疏水性的pH敏感嵌段来实现，这种智能化的酸性响应药物递送体系在中性的生理环境中较为稳定，而在肿瘤组织和细胞内溶酶体的微酸性条件下则可快速释放药物，游离的药物浓度增高，从而显著增强了药物作用的效果。应当说明的是，本发明的纳米胶束除了用于载药，还可以用于负载其它疏水性化合物。
优选地，所述亲水性嵌段为聚乙二醇(PEG)，聚乙二醇分子量优选为1kDa～5kDa；所述疏水性pH敏感嵌段为聚天冬氨酸酰二异丙基乙二胺/二正丁基乙二胺(PAsp(DIP/DBA))，分子量优选为5kDa～15kDa。
更优选地，所述PEG的分子量选定为2kDa，所述PAsp(DIP/DBA)的分子量选定为10kDa。
在第二个方面，本发明提供了一种酸性响应纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
S1、以单甲氧基聚乙二醇(PEG-OH)为原料合成氨基化的PEG-NH2；
S2、以S1所得PEG-NH2为引发剂，在氯仿(CHCl3)与无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合溶剂中引发苄氧羰基天冬氨酸酸酐(BLA-NCA)开环聚合，得到聚乙二醇-聚天冬氨酸(PEG-PBLA)；
S3、用无水二甲基亚砜(DMSO)溶解S2所得PEG-PBLA，然后按五种不同的摩尔比加入N,N-二异丙基乙二胺(DIP)和N,N-二正丁基乙二胺(DBA)进行氨解，得到聚乙二醇-聚天冬酰二异丙基乙二胺/聚二正丁基乙二胺的共聚物(PEG-PAsp(DIP/DBA))，即得所述纳米胶束。其中，加入DIP和DBA进行氨解的五种不同摩尔比例分别为：1:0；3:1；1:1；1:3；0:1。
优选地，S1的具体步骤为：
S11、用无水CHCl3溶解PEG-OH后，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)、三乙胺和对甲苯磺酰氯，室温持续搅拌12小时，后沉淀在大量乙醚中，过滤干燥，所得固体即磺酸化的PEG；
S12、将S11所得固体加于氨水中，密封，搅拌反应至少5天，浓缩，用CHCl3萃取，加入稀盐酸充分搅拌2小时；萃取，CHCl3层再加入NaOH溶液搅拌8小时以上；萃取，CHCl3层再加入纯水和无水NaHCO3搅拌8小时以上，萃取；
S13、向S12所得萃取液加入过量无水Na2SO4干燥至少2小时以上，过滤，浓缩，乙醚沉淀，抽滤，干燥，得到产物PEG-NH2。
在第三个方面，本发明提供了采用第二个方面的方法制备的酸性响应纳米胶束。
在第四个方面，本发明提供了第三方面的纳米胶束在制备抗肿瘤纳米药物中的应用。
在第五个方面，本发明提供了一种抗肿瘤纳米药物，所述抗肿瘤纳米药物由载体和载体负载的药物组成，所述载体为第三个方面的纳米胶束，所述载体负载的试剂为阿霉素和/或磁共振造影剂超顺磁性氧化铁(SPIO)。
需要说明的是，所述载药纳米胶束可延长药物的血液循环时间，增加药物在肿瘤组织的聚集和组织渗透性；并且，其具有微酸环境响应的药物释放特性，进入肿瘤组织和细胞后可触发药物快速释放；而当纳米胶束负载了SPIO后便具备了磁共振造影剂功能，可用于肿瘤磁共振成像和药物聚集情况的监测；这种利用纳米药物在肿瘤部位聚集、载体自身酸性响应实现药物快速释放来提高肿瘤治疗效果，同时赋予纳米胶束磁共振可视化功能的方法，为癌症的诊疗提供了一种有前途的创新性策略；阿霉素是一种广谱抗肿瘤药物，本发明的抗肿瘤纳米药物中，载体上负载的药物包括但不限于阿霉素，还可以是其它抗肿瘤药物，例如紫杉醇、甲氨蝶呤、拓扑替康等。
优选地，所述抗肿瘤纳米药物的粒径为130.5±8.0nm，表面ζ电位优选为6.00±0.27mV。
在第六个方面，本发明提供了一种抗肿瘤纳米药物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：采用超声乳化法诱导第三个方面的酸性响应纳米胶束、阿霉素和SPIO自组装制得磁共振可视化的抗肿瘤纳米药物。其中，阿霉素、SPIO与纳米胶束的投料质量比为1:1:10。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种超敏感的酸性响应载药纳米胶束，载药纳米胶束可在肿瘤部位聚集，局部药物浓度增加；同时，该纳米胶束具有微酸性环境触发释药功能，在正常生理环境(pH 7.4)下药物释放缓慢，可避免药物对正常组织的损伤，而在肿瘤微酸性环境中(肿瘤组织pH值约为6.4，肿瘤细胞内溶酶体pH值约为5.0)则药物快速释放，提高局部游离药物浓度，显著增强药物抗肿瘤效果；另外，纳米胶束负载SPIO后具备了磁共振对比成像功能，可用于肿瘤的磁共振成像和药物聚集情况的监测。
附图说明
图1为本发明的嵌段聚合物合成线路图；
图2为不同比例氨解得到的聚合物所组装成的纳米胶束的粒径及电位分布图；
图3为不同氨解比例得到的四种聚合物负载阿霉素的纳米胶束在pH7.4和pH5.0环境下的药物释放曲线；
图4为优选DBA75％氨解比例载药纳米胶束的透视电子显微镜照片；
图5为HepG2细胞对负载阿霉素纳米胶束在不同pH条件下的摄取情况的激光扫描共聚焦显微镜照片；
图6A为与负载超顺磁性氧化铁纳米胶束孵育后HepG2细胞样品的磁共振扫描T2WI和T2-map图像；图6B为细胞样品T2WI上T2信号的变化情况；图6C为细胞样品T2-map上T2值的变化情况；图6D为与不同铁浓度纳米胶束孵育后细胞的普鲁士蓝染色显微镜照片；
图7A为非载药(未负载阿霉素)纳米胶束的细胞毒性试验结果；图7B为游离阿霉素、不同pH预处理后载药纳米胶束的细胞毒性试验结果；图7C、D为流式细胞术检测不同试剂处理后细胞的凋亡情况(a，对照组；b，游离阿霉素组；c，pH 7.4预处理的载药纳米胶束组；d，pH 5.0预处理的载药纳米胶束组)。
具体实施方式
本发明涉及纳米医学领域，具体地，涉及一种用于载药的酸性响应纳米胶束及其制备方法和应用，尤其涉及一种能负载化疗药物阿霉素和磁共振造影剂SPIO的肿瘤微酸环境响应性的纳米胶束及其制备方法及应用。
本发明提供了一种磁共振可视化、酸性环境响应的载药纳米胶束。该纳米胶束能够响应肿瘤组织的微酸环境而快速释放药物(如阿霉素)；另外，该载药纳米胶束负载了SPIO，具备磁共振造影剂功能，可用于肿瘤磁共振成像和药物聚集情况的监测。
纳米胶束负载可用于成像的分子，制备影像探针，作为一种诊疗一体化的工具，可在治疗肿瘤的同时对药物的分布和聚集情况，以及治疗效果等进行实时无创的监测。磁共振成像是目前临床上最常使用的成像技术之一，具有空间和组织分辨率高、无创、无电离辐射和多参数成像等优点，故有许多纳米诊疗体系将其作为影像示踪的基础。SPIO纳米颗粒因其独特的磁响应性，能缩短自旋-自旋弛豫时间，降低T2信号，而且生物相容性高、低毒，所以常被制作成磁共振造影剂或分子探针。由此，在一些实施例中，向载药纳米胶束中引入SPIO，使其具备磁共振T2对比成像的功能。
本发明的载药纳米胶束可增加药物的溶解度，延长药物的循环时间，增加肿瘤组织的药物浓度，而且通过酸性刺激响应的功能化修饰可使其在肿瘤组织内的微酸环境中快速地释放药物，提高药物治疗效果。同时，纳米胶束在负载成像分子SPIO后还具备磁共振造影剂的功能，使载药纳米胶束成为一种诊疗一体化的纳米药物体系。
本发明的另一个目的是提供上述磁共振可视化酸性响应载药纳米胶束的制备方法。
本发明的再一个目的是提供上述载药纳米胶束制备成抗肿瘤纳米药物后在肿瘤治疗中的应用。
为实现上述目的，在一些实施例中，提供了一种磁共振可视化的酸性响应载药纳米胶束，是由两嵌段聚合物包含亲水段PEG和疏水段PAsp(DIP/DBA)自组装形成纳米胶束。其中，PAsp(DIP/DBA)作为胶束的疏水链段，其能在微酸环境下质子化转化为亲水链段，使负载的疏水性药物得以释放；而引入亲水链段PEG可增加纳米胶束的稳定性及生物相容性。
在一些实施例中，为了实现纳米胶束对肿瘤组织的高渗透滞留效应、增加胶束的组织渗透性，同时又达到高效负载药物(阿霉素)及磁共振造影剂(SPIO)的目的，嵌段聚合物选用的PEG分子量优选为2kDa，PAsp(DIP/DBA)分子量优选为10kDa。
在一些实施例中，提供了一种超敏感的微酸环境响应纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
S1.以PEG-OH为原料合成氨基化的PEG-NH2；
S2.以氨基化的PEG-NH2为引发剂，在新蒸CHCl3与无水DMF混合溶剂中引发BLA-NCA开环聚合得到PEG-PBLA；
S3.以PEG-PBLA为原料，在无水DMSO中按照五种不同摩尔比加入DIP和DBA(1:0；3:1；1:1；1:3；0:1)进行氨解，得到PEG-PAsp(DIP/DBA)。
在一些实施例中，S1以PEG-OH为原料合成PEG-NH2的具体步骤为：将PEG-OH用新蒸CHCl3溶解后，在0℃条件下，加入DMAP、三乙胺及对甲苯磺酰氯，室温搅拌12小时后沉淀在大量乙醚中，过滤干燥。将固体加于大量氨水(23％～28％)中，密封，搅拌反应至少5天，浓缩，用CHCl3萃取，加入稀盐酸(3mol/L)充分搅拌2小时。萃取，CHCl3层再加入NaOH溶液(6mol/L)搅拌8小时以上，萃取，CHCl3层再加入100mL纯水和18g无水NaHCO3搅拌8小时以上，萃取。萃取液加入过量无水Na2SO4干燥至少2小时以上，过滤，浓缩，乙醚沉淀，抽滤，干燥，得到产物PEG-NH2。
在一些实施例中，本发明提供了上述超敏感的微酸环境响应纳米胶束在制备磁共振可视化抗肿瘤纳米药物中的应用。
在一些实施例中，本发明提供了一种磁共振可视化抗肿瘤纳米药物，由上述纳米胶束负载阿霉素和SPIO制备得到。该纳米药物能够延长药物循环时间，增加肿瘤组织内药物聚集，提高药物生物利用率，增强抗肿瘤效果，同时可实现肿瘤磁共振成像及实时监测。
在一些实施例中，磁共振可视化抗肿瘤纳米药物由PEG-PAsp(DIP/DBA)自组装负载药物(阿霉素)及SPIO制备而成。
作为优选实施方式，纳米胶束的粒径控制在100～200nm，可增加肿瘤局部的药物聚集和组织渗透。
作为优选实施方式，纳米药物的水合粒径为130.5±8.0nm。
作为优选实施方式，获得嵌段聚合物(即纳米胶束)后，通过乳化法超声诱导聚合物、阿霉素和SPIO组装制备纳米药物，并控制阿霉素、SPIO与聚合物的投料质量比为1:1:10，以获得最大的载药量及最佳的纳米药物尺寸。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本申请中的试剂浓度均采用质量浓度。
实施例1
本发明中用于载药的酸性响应纳米胶束的一种实施例，是由亲水嵌段和疏水嵌段自组装形成的两嵌段聚合物；其中，亲水性嵌段为PEG，疏水性嵌段为PAsp(DIP/DBA)；PEG的优选分子量为2kDa，PAsp(DIP/DBA)的优选分子量为10kDa。
本发明中抗肿瘤纳米药物的一种实施例，由上述纳米胶束负载阿霉素和/或SPIO组成；其中，抗肿瘤纳米药物的粒径为130.5±8.0nm。
本发明中抗肿瘤纳米药物的制备方法的一种实施例，包括如下步骤：采用乳化法超声诱导上述纳米胶束、阿霉素和SPIO组装制得磁共振可视化的抗肿瘤纳米药物。其中，阿霉素、SPIO与纳米胶束的投料质量比为1:1:10。
实施例2嵌段聚合物(即纳米胶束)的合成
本发明的纳米胶束的制备方法的一种实施例，嵌段聚合物(纳米胶束)的合成路线如图1所示，具体包括如下步骤：
首先，以PEG-OH为原料合成磺酸化的PEG。具体地，将7.0g PEG-OH先用50mL无水CHCl3溶解，然后在0℃条件下，加入43mg DMAP、0.73mL三乙胺及1.0g对甲苯磺酰氯，室温搅拌反应12小时后将反应液沉淀在大量的无水乙醚(反应液体积的8倍以上)中，过滤得到固体，真空干燥后得到固体磺酸化的PEG；
然后，将固体加于大量氨水(23％～28％)中，密封，搅拌反应至少5天，浓缩，用CHCl3萃取，加入稀盐酸(3mol/L)充分搅拌2小时。萃取，CHCl3层再加入NaOH溶液(6mol/L)搅拌8小时以上，萃取，CHCl3层再加入100mL纯水和18g无水NaHCO3搅拌8小时以上，萃取。萃取液加入过量无水Na2SO4干燥至少2小时以上，过滤，浓缩，乙醚沉淀，抽滤，干燥，得到产物PEG-NH2；
利用PEG-NH2作大分子引发剂引发BLA-NCA开环聚合：于100mL反应瓶内，称取2.0gPEG-NH2(1.0mmol)，70℃真空除水0.5小时，冷却后，在氮气保护下加入40mL新蒸二氯甲烷溶解和用15mL无水四氢呋喃溶解的12.45g BLA-NCA(50.0mmol)。35℃搅拌反应48小时后将反应液沉淀在500mL冷乙醚中，抽滤，用乙醚洗涤、真空干燥后得到10.3g PEG-PBLA；
利用DIP和DBA的伯胺基与天冬氨酸苄酯进行氨解反应：取4.5g(0.374mmol)按上述方法合成的PEG-PBLA在氮气保护下用50mL DMSO溶解，依次取10mL加入A、B、C、D、E五个反应瓶中，再分别加入1.604g(9.8mmol)、0.4812g(2.7mmol)、0.3208g(1.8mmol)、0.1604g(0.9mmol)、0g DBA，35℃搅拌反应22小时。然后在A、B、C、D、E中分别加入0g、0.5370g(0.9mmol)、1.0742g(1.8mmol)、1.6113g(2.7mmol)、1.3427g(9.8mmol)DIP，35℃搅拌反应22小时。将反应液用14kDa透析袋在无水甲醇中透析24小时，再在蒸馏水中透析24小时后冻干，得到五种比例氨解的PEG-PAsp(DBA/DIP)共聚物，即所述纳米胶束。
为了验证聚合物(即纳米胶束)的质子缓冲能力，对其进行酸碱滴定实验。方法如下，80mg的五种上述制备的聚合物和NaCl固体(做对照)溶解于10mL的pH＝1的盐酸中。用移液枪每次吸取50μL pH＝13的氢氧化钠溶液滴定至上述溶液中，用全自动电位滴定仪记录每次加碱的体积以及对应的pH值。筛选出DIP与DBA氨解比例为1:3的聚合物PPAP75％作为最终的载药体系。
实施例3本发明的纳米药物的制备及表征
取实施例2制备得到的聚合物PPAP75％20mg和2mg的阿霉素、2mg SPIO溶于1.5mLDMSO和0.5mLCHCl3的混合溶剂中，在超声作用下滴加到20mL水中。旋蒸除去混合溶液的CHCl3，然后用14kDa透析袋在水中透析24小时，超滤浓缩，用水洗涤三次。粒径检测结果显示，纳米胶束的粒径为130.5±8.0nm(图2)，电镜结果显示，纳米药物为均匀的球形结构，直径为130nm左右(图4)。
由于PEG-PAsp(DIP100％)聚合物制备的载药纳米胶束在pH 7.4的条件下疏水性较差，DOX的负载量太低，难以进行释放实验，故只对聚合物PEG-PAsp(DBA100％)、PEG-PAsp(DIP25％/DBA75％)、PEG-PAsp(DIP50％/DBA50％)和PEG-PAsp(DIP75％/DBA25％)制备的载药纳米胶束PPAPD100％、PPAPD75％、PPAPD50％和PPAPD25％分别在pH 7.4生理环境和pH 5.0酸性环境下进行体外释放研究。
结果如图3B所示，可见，四种载药纳米胶束在pH 7.4的环境中释放药物均较慢，在24小时时即使释放最快的体系也只达到20％。而在pH 5.0的环境中则形成鲜明对比，聚合物胶束释放药物的速度显著上升，在2小时时即使释放最慢的体系释放量就达到20％，在24小时时释放最快的体系释放速率已接近90％。四种聚合物胶束体系的释放速率也存在很明显的规律。无论在pH 7.4还是pH 5.0的环境中，随着聚合物中DIP氨解比例的升高，相应的聚合物胶束释放速率也增加；这是因为DIP氨解比例高的聚合物pKa值更高，在相同的环境下较其他聚合物的酸敏感性就越强，故而释放速率就越快。
实施例4本发明的纳米药物的细胞摄取能力检测
发明人采用激光扫描共聚焦显微镜来观察纳米药物进入细胞的能力。将负载阿霉素的载药纳米胶束(实施例3的载药纳米胶束PPAPD75％)经不同pH预处理后(pH 7.4或5.0条件下4小时)与HepG2细胞孵育。
结果如图5所示，pH 7.4预处理的纳米胶束，随着孵育时间的延长，细胞内阿霉素红色荧光逐渐增加并逐渐向胞核聚集，而pH 5.0预处理的纳米胶束与细胞孵育0.5小时后即可见胞核中红色荧光聚集，这也进一步验证了纳米胶束的酸性响应释药特性。PPAPD75％经pH 5.0条件预处理后，负载的部分药物释放成为游离的阿霉素，游离阿霉素为小分子药物，可通过自由扩散快速进入细胞内到达细胞核，所以，与细胞孵育0.5小时即可见细胞核中阿霉素的红色(在图中相对背景更白的部分)荧光聚集。
实施例5本发明的纳米药物的磁共振成像潜力检测
发明人采用细胞样品的磁共振扫描和普鲁士蓝染色来评估纳米药物的磁共振成像潜能。HepG2细胞1.5×106个/孔种于6孔板内孵育过夜，后加入不同浓度纳米胶束(实施例2的聚合物PPAP75％负载SPIO后的纳米胶束PPAPS75％)孵育4小时，后收集细胞重悬于400μL2％的琼脂糖溶液中并转移至可拆卸酶标板内，固定后使用3T磁共振扫描仪进行T2加权成像(T2WI)和T2-mapping成像。另外，HepG2细胞1×106个/孔种于6孔板内孵育过夜，后加入不同浓度纳米胶束孵育4小时，固定后进行普鲁士蓝染色并于显微镜下观察、拍摄照片。
结果如图6A、B和C所示，随着与细胞孵育纳米胶束铁浓度的增加细胞样品在T2WI和T2-map图像上的信号强度和T2值则逐渐降低；而普鲁士蓝染色(图6D)结果显示，与铁浓度较高的纳米胶束孵育后细胞内蓝染的铁颗粒明显增多；这些结果提示了负载SPIO的纳米胶束具有磁共振可视化功能，而磁共振扫描可用于反映、评估细胞对载药纳米胶束的摄取情况。
实施例6本发明的纳米药物的抗肿瘤细胞效果评估
发明人通过CCK-8细胞毒性试验和细胞凋亡试验来评估纳米药物的抗肿瘤效用。
细胞毒性试验：HepG2细胞以5×103个/孔种于96孔板内孵育过夜，加入不同浓度pH 7.4和pH 5.0预处理(4小时)的未载药和载药纳米胶束(实施例5的负载SPIO的纳米胶束PPAPS75％及实施例2的聚合物PPAP75％同时负载SPIO和阿霉素后的纳米胶束PPAPSD75％)，孵育24小时后，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续孵育3小时后于酶标仪检测450nm和610nm处吸收值。
结果如图7A所示，非载药纳米胶束的细胞毒性很低，当胶束浓度达800μg/mL时，细胞活性仍超过80％。图7B显示载药纳米胶束呈现出明显的细胞毒性作用，且pH 5.0预处理的纳米药物的毒性作用明显高于pH 7.4预处理的纳米药物。
细胞凋亡试验：HepG2细胞以2×105个/孔种于6孔板内孵育过夜，加入pH 7.4和pH5.0预处理(4小时)的载药纳米胶束PPAPSD75％(DOX浓度为0.25μg/mL)，孵育24小时后，收集细胞重悬于500μL结合缓冲液中，分别加入5μL Annexin-V-FITC和DAPI孵育15分钟，后于流式细胞仪检测。未加药物处理的细胞作为对照组。
结果如图7C和D所示，细胞凋亡试验的结果与细胞毒性试验结果相似。pH5.0预处理纳米药物共孵育的细胞的凋亡比例明显高于pH 7.4预处理纳米药物。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种用于载药的酸性响应纳米胶束，其特征在于，所述纳米胶束是由亲水性嵌段和疏水性pH敏感嵌段自组装形成的两嵌段聚合物。
2.根据权利要求1所述的酸性响应纳米胶束，其特征在于，所述亲水性嵌段为聚乙二醇，所述疏水性pH敏感嵌段为聚天冬氨酸酰二异丙基乙二胺/二正丁基乙二胺。
3.根据权利要求2所述的酸性响应纳米胶束，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为1kDa～5kDa，优选为2kDa；所述聚天冬氨酸酰二异丙基乙二胺/二正丁基乙二胺的分子量为5kDa～15kDa，优选为10kDa。
4.一种酸性响应纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以单甲氧基聚乙二醇为原料合成氨基化的PEG-NH2；
S2、以S1所得PEG-NH2为引发剂，在CHCl3与无水N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂中引发苄氧羰基天冬氨酸酸酐开环聚合，得到聚乙二醇-聚天冬氨酸；
S3、用无水二甲基亚砜溶解S2所得的聚乙二醇-聚天冬氨酸，然后按照五种不同的摩尔比加入N,N-二异丙基乙二胺和N,N-二正丁基乙二胺进行氨解，得到聚乙二醇-聚天冬酰二异丙基乙二胺/二正丁基乙二胺的共聚物，即得所述纳米胶束。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S1的具体步骤为：
S11、用无水CHCl3溶解PEG-OH后，加入4-二甲氨基吡啶、三乙胺和对甲苯磺酰氯，后沉淀在大量乙醚中，过滤干燥，所得固体为磺酸化的聚乙二醇；
S12、将S11所得固体加于氨水中，密封，搅拌反应，浓缩，用CHCl3萃取，加入稀盐酸充分搅拌；萃取，CHCl3层再加入NaOH溶液搅拌均匀；萃取，CHCl3层再加入纯水和无水NaHCO3搅拌，萃取；
S13、向S12所得萃取液加入过量无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，乙醚沉淀，抽滤，干燥，得到产物PEG-NH2。
6.根据权利要求4或5所述的方法制备的酸性响应纳米胶束。
7.权利要求1～3任一项所述的纳米胶束或权利要求6所述的纳米胶束在制备抗肿瘤纳米药物中的应用。
8.一种抗肿瘤纳米药物，其特征在于，所述抗肿瘤纳米药物由载体和载体负载的药物组成，所述载体为权利要求1～3任一项所述的酸性纳米胶束或权利要求6所述的纳米胶束，所述载体负载的试剂为阿霉素和/或超顺磁性氧化铁。
9.根据权利要求8所述的抗肿瘤纳米药物，其特征在于，所述抗肿瘤纳米药物的粒径为130.5±8.0nm。
10.一种抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：采用超声乳化法诱导权利要求1～3任一项所述的纳米胶束或权利要求6所述的纳米胶束、阿霉素和超顺磁性氧化铁组装制得磁共振可视化的抗肿瘤纳米药物，其中，阿霉素、超顺磁性氧化铁与纳米胶束的投料质量比为1:1:10。
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