CN110559260A - 一种在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法及其产品和应用 - Google Patents

一种在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法及其产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法及其产品和应用，属于药物载体技术领域。本制备方法包括以下步骤：制备β‑天门冬氨酸苄酯，制备苄氧羰基天冬氨酸酸酐，制备聚天冬氨酸苄酯聚合物，制备羧基化‑聚天冬氨酸苄酯聚合物，制备羧基化‑聚天冬氨酸二甲基乙二胺聚合物，制备聚天冬氨酸二甲基乙二胺‑聚天冬氨酸苄酯聚合物，制备聚(天冬氨酸‑二甲基乙二胺)‑聚(天冬氨酸‑巯基乙胺)聚合物，制备在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束。通过本制备方法制备得到的负载药物纳米胶束具有pH敏感和还原敏感的双重敏感性，能够准确释放药物，有效的提高肿瘤治疗效果。

Description

一种在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备 方法及其产品和应用
技术领域
本发明属于药物载体技术领域，具体涉及一种在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法及其产品和应用。
背景技术
聚合物胶束通常是由双亲性嵌段共聚物在水和PBS中以自组装的方式，形成以疏水性段为内核，亲水段为外壳，核壳结构的生物医用高分子纳米材料。聚合物胶束的内核为疏水部分，可负载疏水性药物；聚合物胶束的外壳，为亲水部分，则分散在水和PBS中。高分子纳米载体以疏水性内核负载疏水性药物的形式，具有增加疏水性药物在水中的“分散性与溶解度”、具备提高疏水性药物的生物利用度等优点，成为近年来的研究热点。
肿瘤微环境具有复杂性，需要抗癌药物在肿瘤基质中释放药。多数肿瘤细胞外的基质的pH值为5.8～7.2，肿瘤组织呈现弱酸性，比周围正常组织器官的pH值7.4要低。而肿瘤细胞内的溶酶体(lysosome)和内涵体 (endosome)的pH值为5.0～5.5，因此需要控制抗癌药物在弱酸性环境下释放。
目前现有的聚合物胶束药物载体，在pH值为7.4时容易发生药物“丢失”、“泄漏”现象，将会导致药物DOX传输失败，而丢失的药物可能会对正常组织器官产生毒副作用。另外，在病灶部位药物聚集或者药物释放的剂量不足，在肿瘤病灶部位有效的药剂量减少会导致疗效较差，影响肿瘤治疗效果。
鉴于此，有必要提供一种新的聚合物胶束，以解决现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法。通过本制备方法制备得到的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束具有pH敏感和还原敏感的双重敏感性，能够精准识别到pH值，控制在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束上负载的药物在肿瘤基质中释放，能针对肿瘤细胞精准治疗，充分地发挥药物的药效，有效的提高肿瘤治疗效果，具有积极的意义。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：β-天门冬氨酸苄酯的制备
取100mL苯甲醇，加入10mL浓硫酸搅拌混合后，加入13.3g天冬氨酸，室温下搅拌反应24h，加入200mL 95％体积的乙醇，再边搅拌边滴加50mL吡啶，滴加完后，将混合液冰冻过夜，再取出恢复至室温，抽滤得到滤饼，对滤饼清洗抽干后，重结晶两次，得到β-天门冬氨酸苄酯；
步骤2：苄氧羰基天冬氨酸酸酐的制备
取10g步骤1制得的β-天门冬氨酸苄酯，在氮气保护下加入200mL乙酸乙酯，在90℃下回流反应，反应至溶液为澄清结束，得到含苄氧羰基天冬氨酸酸酐的溶液，对含苄氧羰基天冬氨酸酸酐的溶液冷却洗涤萃取，取上层液体，经干燥、过滤和浓缩，再进行重结晶，得到苄氧羰基天冬氨酸酸酐；
步骤3：聚天冬氨酸苄酯聚合物的制备
取50mLCH2Cl2溶液,加入74μL的正丁胺，得到溶有正丁胺的CH2Cl2溶液；取2.84g步骤2制得的苄氧羰基天冬氨酸酸酐，加入5mL的N,N-二甲基甲酰胺进行溶解，将溶解后的溶液加入到上述溶有正丁胺的CH2Cl2溶液中，充分混合后，密封置于35℃油浴中搅拌反应72h，反应后经蒸馏沉淀处理，再将沉淀物冷冻过夜后，取出恢复至室温，经离心、洗涤和真空干燥后，得到聚天冬氨酸苄酯聚合物；
步骤4：羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物的制备
取2.7g步骤3制得的聚天冬氨酸苄酯聚合物，加入30mL的CHCl3，搅拌溶解，再加入0.43g丁二酸酐，在70℃下，搅拌回流反应48h，得到含羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物的溶液，对含羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物的溶液，经清洗冷冻干燥后，得到羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物；
步骤5：羧基化-聚天冬氨酸二甲基乙二胺聚合物的制备
取1.8g步骤4制得的羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物，加入8mL的N,N- 二甲基甲酰胺进行溶解，再加入0.35mL的N,N-二甲基乙二胺，混合均匀后置于35℃油浴中，搅拌反应48h，反应完毕后经甲醇透析，得到羧基化-聚天冬氨酸二甲基乙二胺聚合物；
步骤6：聚天冬氨酸二甲基乙二胺-聚天冬氨酸苄酯聚合物的制备
取0.6g步骤5制得的羧基化-聚天冬氨酸二甲基乙二胺聚合物，加入二甲基亚砜溶解，加入0.115g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.069g的N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌30min，进行活化，再加入0.73g步骤3制得的聚天冬氨酸苄酯聚合物，反应48h后，以甲醇透析后，得到聚天冬氨酸二甲基乙二胺-聚天冬氨酸苄酯聚合物；
步骤7：聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸-巯基乙胺)聚合物的制备
取0.5g步骤6制得的聚天冬氨酸二甲基乙二胺-聚天冬氨酸苄酯聚合物，加入32mg巯基乙二胺，在35℃和氮气保护下反应，反应结束后过滤，取沉淀物，以甲醇透析后，得到聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸- 巯基乙胺)聚合物；
步骤8：在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备
取步骤7制得的聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸-巯基乙胺) 聚合物，加入到二甲基亚砜溶液中溶解后，加入待负载的抗癌药物和三乙胺，过滤，在碱性水和超声作用下自组装为胶束，再在无氧气水中透析，即得到在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束。
本发明的有益效果是：通过本制备方法制备得到的负载药物纳米胶束载体具有pH敏感和还原敏感的双重敏感性，能够精准识别到pH值，控制在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束上负载的药物在肿瘤基质中释放，针对肿瘤细胞精准治疗，充分地发挥药物的药效，有效的提高肿瘤治疗效果，具有积极的意义。而且，制备方法简单，操作容易，市场前景广阔，适合规模化生产。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1中，所述取100mL苯甲醇，加入10mL浓硫酸搅拌混合，具体为：取100mL无水乙醚，边滴加边搅拌的加入10mL浓硫酸，滴加后冷却至室温，再加入100mL苯甲醇，充分搅拌后，旋蒸除去乙醚；加入所述天冬氨酸时，分成2-5等份分次加入。
采用上述进一步方案的有益效果是：通过无水乙醚来溶解浓硫酸，避免出现发热情况。
进一步，步骤1中，所述对滤饼清洗抽干，具体为：
先用超纯水清洗滤饼2-5次，再用无水乙醚清洗滤饼清洗2次，清洗后抽干，再放入300-500mL超纯水中，在70℃下搅拌溶解，待溶液成澄清状后，经热过滤，取滤液冷藏过夜。
采用上述进一步方案的有益效果是：在β-天门冬氨酸苄酯的制备中，能够洗去多余残留杂质，提高成品率。
进一步，步骤2中，所述经冷却、洗涤萃取，取上层液体，经干燥、过滤和浓缩，再进行重结晶，具体为：
将含苄氧羰基天冬氨酸酸酐的溶液放在冰盐浴中冷却1h，采用5-10℃的饱和碳酸氢钠溶液洗涤含苄氧羰基天冬氨酸酸酐的溶液三次，萃取分液，取上层液体，再用5-10℃的饱和氯化钠溶液洗涤两次，萃取分液，取上层液体；
将上述上层液体用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，再加入石油醚沉淀，进行减压抽滤，取沉淀物；
再用体积比为1：3乙酸乙酯和石油醚的混合溶液对沉淀物进行重结晶，析出白色针状晶体，即为苄氧羰基天冬氨酸酸酐。
采用上述进一步方案的有益效果是：能够有效去除杂质，提高成品率。
进一步，步骤3中，所述反应后经蒸馏沉淀处理，具体为：取出反应后的溶液通过蒸馏去除CH2Cl2，得到残余混合液，再将残余混合液边搅拌边缓慢滴加到过量乙醚中沉淀，取出沉淀物。
采用上述进一步方案的有益效果是：能够更好将成品沉淀出来。
进一步，步骤4中，所述对含羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物的溶液经清洗冷冻干燥，具体为：
将30mL超纯水加入到对含羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物的溶液中，在40℃下，继续搅拌回流反应30min，反应结束后通过旋转蒸发除去CHCl3，过滤弃去水相，再加入30mLCHCl3溶解，再次在40℃下，回流反应30min；再重复以上操作三次，然后旋转蒸发除去CHCl3，将未反应的丁二酸酐水解成丁二酸，经过滤后弃去水相，得到固相物，固相物经冷冻干燥，得到白色粉末状产物，即为羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物。
采用上述进一步方案的有益效果是：能够剃除杂质，提高成品率。
进一步，步骤8中，所述过滤采用平均孔径为220nm的尼龙6，所述聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸-巯基乙胺)聚合物与所述待负载的抗癌药物的质量比为10：1；所述碱性水的pH值为10.0，所述超声作用的功率为20-30Mw，时间为5min，所述无氧气水的pH值为10.0,；所述透析采用截留分子量为50Kda的透析袋。
采用上述进一步方案的有益效果是：利于聚合物自组装成在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束。
进一步，所述抗癌药物为阿霉素。
采用上述进一步方案的有益效果是：药物抗癌效果好。
本发明的目的之二，是提供一种如上述的制备方法制备得到的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束。本发明的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束，能精准靶向抗癌药物在肿瘤基质中释放，充分发挥药物的药效，有效提高肿瘤治疗效果，具有积极的社会意义和经济意义。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种如上述的制备方法制备得到的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束。
本发明的目的之三，是还提供上述的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束在药物载体领域的应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种如上述的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束在药物载体领域的应用。
本应用的有益效果是：能够提高对癌症的治疗率，使得人们免于受到癌症的痛苦。
附图说明
图1为本发明的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法的流程示意图；
图2为本发明得到的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束，在负载药物——阿霉素(DOX)时的释放百分含量-释放时间的曲线图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例
如图1所示，本实施例的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：β-天门冬氨酸苄酯(BLA)的制备
取500mL的单口茄形瓶，取100mL的无水乙醚加入到单口茄形瓶，边滴加边搅拌的加入10mL浓硫酸，滴加后冷却至室温，再加入100mL浓度为 108.06g·mol-1，密度为1.04g·mL-1的苯甲醇，充分搅拌后，旋蒸除去乙醚，分2-5次加入共计13.3g浓度为133.04g·mol-1天冬氨酸(L-aspartic acid)，室温下搅拌反应24h，反应后加入200mL95％体积的乙醇，再边搅拌边滴加50mL吡啶，滴加完后，取出混合液，将混合液置于冰箱中在-20-15℃下冰冻过夜，过夜之后再取出恢复至室温，抽滤得到滤饼，先用超纯水清洗滤饼2-5次，再用无水乙醚清洗滤饼2次，清洗后抽干，置于500mL烧杯中，再放入300-500mL超纯水中，在70℃下搅拌溶解，待溶液成澄清状后，经热过滤，取滤液放入冰箱中在2-8℃冷藏过夜，过夜之后取出再次抽滤，并重结晶两次，取结晶冻干后得到β-天门冬氨酸苄酯(BLA)。β-天门冬氨酸苄酯(BLA)的制备过程的具体反应式如下：
步骤2：苄氧羰基天冬氨酸酸酐(BLA-NCA)的制备
取10g步骤1制得的β-天门冬氨酸苄酯(BLA)加入到干燥的500mL两口圆底烧瓶中，在氮气保护下加入200mL的乙酸乙酯，在90℃下回流反应，反应1-2h后，再取5.4g三光气溶于100mL的乙酸乙酯中，通过恒压滴液漏斗缓慢滴加至两口圆底烧瓶中，继续在90℃下回流反应至溶液为澄清结束，将两口圆底烧瓶，放在冰盐浴中冷却1h，得到含苄氧羰基天冬氨酸酸酐的溶液，对含苄氧羰基天冬氨酸酸酐的溶液快速地采用冷的饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次，萃取分液，取上层液体，再用冷的饱和氯化钠溶液洗涤两次，萃取分液，取上层液体；将得到的上层液体用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，再加入石油醚沉淀，进行减压抽滤，取沉淀物；再用体积比为1:3乙酸乙酯和石油醚的混合溶液对沉淀物进行重结晶，析出白色针状晶体，取白色针状晶体，即得到苄氧羰基天冬氨酸酸酐(BLA-NCA)，共计7.5g。苄氧羰基天冬氨酸酸酐(BLA-NCA)的制备过程的具体反应式如下：
步骤3：聚天冬氨酸苄酯聚合物(PBLA)的制备
在手套箱中，取50mLCH2Cl2溶液加入到干燥的反应烧瓶中,再加入74μL 的正丁胺，充分搅拌，得到溶有正丁胺的CH2Cl2溶液，取2.84g步骤2制得的苄氧羰基天冬氨酸酸酐(BLA-NCA)加入到干燥的小烧杯中，加入5mL的 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)进行溶解，将溶解后的溶液加入到上述溶有正丁胺的CH2Cl2溶液中，充分混合后，反应开始时，有大量小气泡生成，将反应瓶密封，移出手套箱，置于35℃油浴中搅拌反应72h，取出反应后的溶液通过蒸馏去除大多数CH2Cl2，得到残余混合液，再将残余混合液边搅拌边缓慢滴加到500mL过量的乙醚中沉淀，取出沉淀物，再将沉淀物放入冰箱在-20-15℃下冷冻过夜后，取出恢复至室温，经离心、无水乙醚反复洗涤和真空干燥后，得到白色固体，即为聚天冬氨酸苄酯聚合物(PBLA)；聚天冬氨酸苄酯聚合物(PBLA)的制备过程的具体反应式如下：
步骤4：羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物(PBLA-COOH)的制备
取2.7g步骤3制得的聚天冬氨酸苄酯聚合物(PBLA)加入到100mL单口施莱克反应瓶中，加入30mL的CHCl3，搅拌溶解，再加入0.43g丁二酸酐，在70℃下，搅拌回流反应48h，反应完毕后，得到含羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物的溶液，向单口施莱克反应瓶中加入30mL超纯水，在40℃下，继续搅拌回流反应30min，反应结束后通过旋转蒸发除去CHCl3，过滤弃去水相，再加入30mLCHCl3溶解，再次在40℃下，回流反应30min，重复以上操作三次，然后旋转蒸发除去CHCl3，将未反应的丁二酸酐水解成丁二酸，酸酐能够自然水解成酸，经过滤后弃去水相，得到固相物，将固相物经冻干机冷冻干燥后，得到白色粉末状产物，即为羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物 (PBLA-COOH)；羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物(PBLA-COOH)的制备过程的具体反应式如下：
步骤5：羧基化-聚天冬氨酸二甲基乙二胺聚合物[PAsp(DMA)-COOH] 的制备
取1.8g步骤4制得的所述羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物(PBLA-COOH) 加入到25mL的反应管中，加入8mL反应级的N,N-二甲基甲酰胺进行溶解，待溶解完毕后，再加入0.35mLN,N-二甲基乙二胺，混合均匀后置于35℃油浴中，搅拌反应48h，反应完毕后，取出反应物置于分子量为1KDa的透析袋中，经甲醇透析除去杂质，得到羧基化-聚天冬氨酸二甲基乙二胺聚合物 [PAsp(DMA)-COOH]；羧基化-聚天冬氨酸二甲基乙二胺聚合物[PAsp(DMA) -COOH]的制备过程的具体反应式如下：
步骤6：聚天冬氨酸二甲基乙二胺-聚天冬氨酸苄酯聚合物[PAsp(DMA) -PBLA]的制备
取0.6g步骤5制得的所述羧基化-聚天冬氨酸二甲基乙二胺聚合物 [PAsp(DMA)-COOH]加入到25mL的反应瓶中，加入二甲基亚砜溶解，加入 0.115g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.069g的N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌30min，进行活化，再加入0.73g步骤3制得的聚天冬氨酸苄酯聚合物，反应48h后，以甲醇透析后，得到0.7g聚天冬氨酸二甲基乙二胺-聚天冬氨酸苄酯聚合物[PAsp(DMA)-PBLA]；聚天冬氨酸二甲基乙二胺-聚天冬氨酸苄酯聚合物[PAsp(DMA)-PBLA]的制备过程的具体反应式如下：
步骤7：聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸-巯基乙胺)聚合物 [PAsp(DMA)-PAsp(MEA)]的制备
取0.5g步骤6制得的聚天冬氨酸二甲基乙二胺-聚天冬氨酸苄酯聚合物 [PAsp(DMA)-PBLA]，加入32mg巯基乙二胺，在35℃和氮气保护下反应，反应结束后过滤，取沉淀物，以甲醇透析后，得到0.3g聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸-巯基乙胺)聚合物[PAsp(DMA)-PAsp(MEA)]；聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸-巯基乙胺)聚合物[PAsp(DMA)- PAsp(MEA)]的制备过程的具体反应式如下：
步骤8：在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备
取20mg步骤7制得的聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸-巯基乙胺)聚合物[PAsp(DMA)-PAsp(MEA)]，加入到过量二甲基亚砜溶液中溶解，加入2mg药物(DOX)，加入1μL的干燥过的三乙胺，以平均孔径为220nm的尼龙6过滤，在pH值为10.0的碱性水中，经功率为20-30Mw超声下，处理5min，自组装为胶束，再将胶束放入pH值为10.0的无氧气水中，以截留分子量为50KDa的透析袋透析，除去杂质，即得到在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束。
实验例
另外本发明还提供在肿瘤基质中释放抗癌药物的未负载药物的纳米胶束的制备，以用于对上述实施例制备得到的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束进行比较，具体为：
取20mg所述聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸-巯基乙胺)聚合物[PAsp(DMA)-PAsp(MEA)]，加入到过量二甲基亚砜溶液中溶解，以平均孔径为220nm的尼龙6过滤，在pH值为10.0的碱性水中，经功率为20-30Mw 超声下，处理5min，自组装为胶束，再将胶束放入pH值为10.0的无氧气水中，以截留分子量为50KDa的透析袋透析，除去杂质，得到未负载药物 (DOX)的纳米胶束。
另外本发明还提供一种对各步骤反应产物的核磁表征方法，将各步反应的产物用相应的核磁溶剂溶解后，用1H-NMR 300MHz进行测试。为研究聚合物的酸敏性，将PDM溶于D2O中，用氘代氢氧化钠与氘代盐酸，调节pH值。
另外本发明还提供一种对各步骤反应产物的红外表征方法，将各步反应的产物与干燥的KBr粉末混合，通过碾钵碾压均匀后压片。用型号为 Nicolet/Nexus 670的红外光谱分析仪以空白的KBr为背景进行红外扫描。
另外本发明还提供一种对各步骤反应产物的凝胶色谱表征方法，将各步反应的产物的分子量与分布，以GPC法表征，分析柱采用两柱串联型号分别为Waters UltrahydrogelTM 500和Waters Ultrahydrogel TM 250。DMF (含LiBr 1.0g/L)为流动相(流速为1.0mL/min)，聚合物的浓度为3mg/mL，完全溶解后，以平均孔径为220nm的尼龙6过滤。
通过上述3种表征方法对各步反应得到的产物进行确认。
将上述实施例制得的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束进行采用透析法进行体外释放，来模拟体内药物释放，具体测试方法如下：
步骤201：将上述实施例制得的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束样品，加入到50mL定容瓶中定容，定容后，平均分成19份，3份为1组，共有6组，每组有3个平行实验，每组中三份分别放入三个分子量为14,000Da的透析袋中，余下一份备用。
步骤202：第一组，加入40mL的pH值为10.0的氨-氯化铵缓冲液,第二组，加入40mL的含10mM二硫苏糖醇(DTT)的pH值为10.0的氨-氯化铵缓冲液；第三组，加入40mL的pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲溶液；第四组,加入40mL的含10mM DTT的pH值为7.4的PBS缓冲溶液；第五组,加入40mL的pH值为6.8的PBS缓冲溶液；第六组,加入40mL的含10mM DTT的pH值为6.8的PBS缓冲溶液；余下的一份，用冻干机冻干，用于测定负载率。
步骤203:将6组均放在37℃恒温水浴培养摇床中。每隔1h，采集6组透析袋外面的相同体积的缓冲液，并更换同体积的、新鲜的、同类型的缓冲溶液。
步骤204：对所采集的6组缓冲液样品用波长扫描法检测药物(DOX)在 482.5nm波长下的紫外吸收强度，通过药物(DOX)标准曲线，计算每个时间段的药物(DOX)累积的释放量。作出药物(DOX)释放百分含量-释放时间的曲线图，如图2所示。其中图2中所取各点为三组平行测定药物(DOX) 释放结果的平均值，误差由三次平均值计算所得。
通过对采集的6组缓冲液用波长扫描法测定在430nm-530nm的紫外吸收强度，然后取药物(DOX)的最大吸收峰482.5nm来定量，并通过DOX标准曲线计算样品中药物(DOX)的含量以研究药物(DOX)在体外释放行为，以模拟体外实验来模拟体内释放行为。
从图2中可以看出：
(1)在pH值为10.0氨-氯化铵缓冲液中，未添加DTT时，药物(DOX) 的释放量比较缓慢，24h释放率约10％。
(2)在pH值为10.0氨-氯化铵缓冲液中，在添加10mM的DTT时，其载体外部溶液环境的pH值为10.0，负载药物纳米胶束的侧链叔胺基的pKa 为7.4，整个叔胺基链段呈现疏水性，即便在DTT的作用下，打开已经交联的-SH基团，但负载药物纳米胶束任然处于稳定状态，药物(DOX)任然只能缓慢的从纳米胶束中释放出来，在24h时其释放量也在10％左右。
(3)在pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，未添加DTT时，负载药物纳米胶束的侧链叔胺基的pKa为7.4，与PBS缓冲溶液的pH值相同，负载药物纳米胶束中的-SH基团在一定程度上处于部分交联状态，亲水的-SH基团形成了保护层。亲水的-SH基团形成的保护层有效地提高负载药物纳米胶束的稳定性，阻止了所负载药物(DOX)的释放，在24h时其释放量为15％左右。
(4)在pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，在添加10mM的DTT时，负载药物纳米胶束的侧链叔胺基的pKa为7.4，与PBS缓冲溶液的pH值相同，在负载药物纳米胶束中的-SH基团在一定程度上处于部分交联状态，在DTT的作用下，进一步打开已经交联的-SH基团。但亲水的-SH基团形成的保护层仍然能够提高负载药物纳米胶束的稳定性，阻止了所负载药物(DOX)的释放，在24h时其释放量为25％左右。
(5)在pH值为6.8的PBS缓冲溶液中，未添加DTT时，载体外部溶液环境的pH值为6.8，小于负载药物纳米胶束侧链叔胺基的pKa，整个叔胺基链段基本上呈现亲水性，胶束处于不稳定状态，疏水性的药物(DOX)从亲水性的链段被释放出来，而有些没有被负载在疏水内核中的药物(DOX)，滞留在交联层中，从而没有无法被释放，被滞留在纳米胶束内部，在24h时其释放量为60％左右。
(6)在pH值为6.8的PBS缓冲溶液中，在添加10mM的DTT时，在DTT 的作用下，交联层被逐步地打开，滞留在交联层的药物慢慢地被释放出来，使得药物的释放量的提高，在24h时其释放量为75％左右。
从上述结果能够看出，本发明制备的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束处于环境pH值为弱酸性的情况下，能够有效释放药物，有利于药物直接作用到肿瘤细胞上，提高了对癌症的治疗效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：β-天门冬氨酸苄酯的制备
取100mL苯甲醇，加入10mL浓硫酸搅拌混合后，加入13.3g天冬氨酸，室温下搅拌反应24h，加入200mL95％体积的乙醇，再边搅拌边滴加50mL吡啶，滴加完后，将混合液冰冻过夜，再取出恢复至室温，抽滤得到滤饼，对滤饼清洗抽干后，重结晶两次，得到β-天门冬氨酸苄酯；
步骤2：苄氧羰基天冬氨酸酸酐的制备
取10g步骤1制得的β-天门冬氨酸苄酯，在氮气保护下加入200mL乙酸乙酯，在90℃下回流反应，反应至溶液为澄清结束，得到含苄氧羰基天冬氨酸酸酐的溶液，经冷却、洗涤萃取，取上层液体，经干燥、过滤和浓缩，再进行重结晶，得到苄氧羰基天冬氨酸酸酐；
步骤3：聚天冬氨酸苄酯聚合物的制备
取50mL CH2Cl2溶液,加入74μL的正丁胺，得到溶有正丁胺的CH2Cl2溶液；取2.84g步骤2制得的苄氧羰基天冬氨酸酸酐，加入5mL的N,N-二甲基甲酰胺进行溶解，将溶解后的溶液加入到上述溶有正丁胺的CH2Cl2溶液中，充分混合后，密封置于35℃油浴中搅拌反应72h，反应后经蒸馏沉淀处理，再将沉淀物冷冻过夜后，取出恢复至室温，经离心、洗涤和真空干燥后，得到聚天冬氨酸苄酯聚合物；
步骤4：羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物的制备
取2.7g步骤3制得的聚天冬氨酸苄酯聚合物，加入30mL的CHCl3，搅拌溶解，再加入0.43g丁二酸酐，在70℃下，搅拌回流反应48h，得到含羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物的溶液，经清洗冷冻干燥后，得到羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物；
步骤5：羧基化-聚天冬氨酸二甲基乙二胺聚合物的制备
取1.8g步骤4制得的羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物，加入8mL的N,N-二甲基甲酰胺进行溶解，再加入0.35mL的N,N-二甲基乙二胺，混合均匀后置于35℃油浴中，搅拌反应48h，反应完毕后经甲醇透析，得到羧基化-聚天冬氨酸二甲基乙二胺聚合物；
步骤6：聚天冬氨酸二甲基乙二胺-聚天冬氨酸苄酯聚合物的制备
取0.6g步骤5制得的羧基化-聚天冬氨酸二甲基乙二胺聚合物，加入二甲基亚砜溶解，加入0.115g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.069g的N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌30min，进行活化，再加入0.73g步骤3制得的聚天冬氨酸苄酯聚合物，反应48h后，以甲醇透析后，得到聚天冬氨酸二甲基乙二胺-聚天冬氨酸苄酯聚合物；
步骤7：聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸-巯基乙胺)聚合物的制备
取0.5g步骤6制得的聚天冬氨酸二甲基乙二胺-聚天冬氨酸苄酯聚合物，加入32mg巯基乙二胺，在35℃和氮气保护下反应，反应结束后过滤，取沉淀物，以甲醇透析后，得到聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸-巯基乙胺)聚合物；
步骤8：在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备
取步骤7制得的聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸-巯基乙胺)聚合物，加入到过量二甲基亚砜溶液中溶解后，加入待负载的抗癌药物，过滤，在碱性水和超声作用下自组装为胶束，再在无氧气水中透析，即得到在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束。
2.根据权利要求1所述的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述取100mL苯甲醇，加入10mL浓硫酸搅拌混合，具体为：取100mL无水乙醚，边滴加边搅拌的加入10mL浓硫酸，滴加后冷却至室温，再加入100mL苯甲醇，充分搅拌后，旋蒸除去乙醚；加入所述天冬氨酸时，分成2-5等份分次加入。
3.根据权利要求1所述的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述对滤饼清洗抽干，具体为：先用超纯水清洗滤饼2-5次，再用无水乙醚清洗滤饼2次，清洗后抽干，再放入300-500mL超纯水中，在70℃下搅拌溶解，待溶液成澄清状后，经热过滤，取滤液冷藏过夜。
4.根据权利要求1所述的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述经冷却、洗涤萃取，取上层液体，经干燥、过滤和浓缩，再进行重结晶，具体为：
将含苄氧羰基天冬氨酸酸酐的溶液放在冰盐浴中冷却1h，采用5-10℃的饱和碳酸氢钠溶液洗涤含苄氧羰基天冬氨酸酸酐的溶液三次，萃取分液，取上层液体，再用5-10℃的饱和氯化钠溶液洗涤两次，萃取分液，取上层液体；
将上述上层液体用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，再加入石油醚沉淀，进行减压抽滤，取沉淀物；
再用体积比为1：3的乙酸乙酯和石油醚的混合溶液对沉淀物进行重结晶，析出白色针状晶体，即为苄氧羰基天冬氨酸酸酐。
5.根据权利要求1所述的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述反应后经蒸馏沉淀处理，具体为：取出反应后的溶液通过蒸馏去除CH2Cl2，得到残余混合液，再将残余混合液边搅拌边缓慢滴加到过量乙醚中沉淀，取出沉淀物。
6.根据权利要求1所述的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述对含羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物的溶液经清洗冷冻干燥，具体为：
将30mL超纯水加入到对含羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物的溶液中，在40℃下，继续搅拌回流反应30min，反应结束后通过旋转蒸发除去CHCl3，过滤弃去水相，再加入30mL CHCl3溶解，再次在40℃下，回流反应30min；再重复以上操作三次，然后旋转蒸发除去CHCl3，将未反应的丁二酸酐水解成丁二酸，经过滤后弃去水相，得到固相物，固相物经冷冻干燥，得到白色粉末状产物，即为羧基化-聚天冬氨酸苄酯聚合物。
7.根据权利要求1所述的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法，其特征在于，步骤8中，所述过滤采用平均孔径为220nm的尼龙6，所述聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸-巯基乙胺)聚合物与所述待负载的抗癌药物的质量比为10-1；所述聚(天冬氨酸-二甲基乙二胺)-聚(天冬氨酸-巯基乙胺)聚合物与所述三乙胺的比例为20：1；所述碱性水的pH值为10.0，所述超声作用的功率为20-30Mw，时间为5min；所述无氧气水的pH值为10.0；所述透析采用截留分子量为50KDa的透析袋。
8.根据权利要求1所述的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述抗癌药物为阿霉素。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束。
10.一种如权利要求9所述的在肿瘤基质中释放抗癌药物的负载药物纳米胶束在药物载体领域的应用。
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