CN104224721B - 一种敏感响应性聚合物纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供了一种敏感响应性聚合物纳米颗粒，包括聚(胱胺双丙烯酰胺‑alt‑精胺)和聚乙二醇‑b‑聚赖氨酸(2,3‑二甲基马来酸)，所述聚(胱胺双丙烯酰胺‑alt‑精胺)中胱胺双丙烯酰胺单体和精胺单体通过碳‑氮键连接，所述聚乙二醇‑b‑聚赖氨酸(2,3‑二甲基马来酸)中聚乙二醇链段为甲基‑聚乙二醇‑氨基，所述聚赖氨酸链段的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇链段的氨基端连接，所述2,3‑二甲基马来酸通过酰胺键与所述聚赖氨酸链段侧链的氨基相连。所述敏感响应性聚合物纳米颗粒稳定性良好，可以有效地在肿瘤部位富集，负载的药物分子可以很容易进入肿瘤细胞，且所述敏感响应性聚合物纳米颗粒生物相容性良好、易降解。
Description
技术领域
本发明涉及高分子化学和生物医学工程领域，特别是涉及一种敏感响应性聚合物纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康的一类疾病，死亡率高，在癌症的治疗中，预防和早期诊断是提高癌症治愈率的一个重要手段。癌症的早期诊断需要利用各种非侵入式的成像手段，包括核磁共振成像、超声波成像、荧光成像或X射线成像等。
作为美国联邦药物管理局批准的唯一人体可用的染料，吲哚菁绿(ICG)是用于肿瘤诊断成像的可靠选择。但是ICG存在光稳定性差、灵敏度不高和体内容易降解等缺点。为了克服这些缺点，现有技术利用纳米载体负载ICG，纳米载体由于具有增加肿瘤细胞内药物浓度，提高药物生物利用度等多种优点，成为当前肿瘤治疗的研究热点，其中聚合物颗粒是研究最多的纳米载体之一。但是现有技术中的聚合物颗粒存在：稳定性较差、容易被免疫系统清除，负载的ICG分子容易泄漏、在靶点部位累积少，ICG难以进入肿瘤细胞，聚合物颗粒生物相容性和生物可降解性差等一系列缺点，这些缺点限制了聚合物纳米载体的应用。
发明内容
鉴于此，本发明旨在提供一种敏感响应性聚合物纳米颗粒，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒同时具有还原敏感性和pH敏感性，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒稳定性良好，可以有效地在肿瘤部位富集，负载的药物分子可以很容易进入肿瘤细胞，且所述敏感响应性聚合物纳米颗粒生物相容性良好、易降解，克服了现有技术中聚合物颗粒作为载体时存在的缺点。
本发明实施例第一方面提供了一种敏感响应性聚合物纳米颗粒，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒具有两层结构，内层为聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)(Poly(CBA-SP))，外层为聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)(PEG-b-PLL(DMMA))，所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)中胱胺双丙烯酰胺单体和精胺单体通过碳-氮键连接，所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)中聚乙二醇链段为甲基-聚乙二醇-氨基(CH3-PEG-NH2)，所述聚赖氨酸链段的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇链段的氨基端连接，所述2,3-二甲基马来酸通过酰胺键与所述聚赖氨酸链段侧链的氨基相连，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒中，所述PEG-b-PLL(DMMA)和所述Poly(CBA-SP)的重量比大于1。
所述敏感响应性聚合物纳米颗粒中，所述PEG-b-PLL(DMMA)的重量大于所述Poly(CBA-SP)的重量，使所述敏感响应性聚合物纳米颗粒带负电荷。
优选地，所述PEG-b-PLL(DMMA)和所述Poly(CBA-SP)的重量比为(20-400):(5-100)。
优选地，所述Poly(CBA-SP)的数均分子量为4000-10000Da，所述PEG-b-PLL(DMMA)中聚乙二醇链段的数均分子量为500-10000Da，所述聚赖氨酸链段的聚合度为10-200。
优选地，所述聚赖氨酸链段侧链的全部氨基均被2,3-二甲基马来酸取代。
本发明第一方面提供了一种敏感响应性聚合物纳米颗粒，其包括Poly(CBA-SP)和PEG-b-PLL(DMMA)，所述Poly(CBA-SP)和所述PEG-b-PLL(DMMA)在水中可自组装为具有两层结构的纳米颗粒，外层为带负电荷的PEG-b-PLL(DMMA)，内层为带正电荷的Poly(CBA-SP)，通过控制这两种聚合物的投料比使所述聚合物纳米颗粒带负电荷，在血液循环中可以有效地避免特异性吸附，延长血液循环时间；当所述聚合物纳米颗粒到达肿瘤组织时，由于大部分肿瘤组织微环境的pH为6.5-7.2，呈微酸性，所述DMMA与所述聚赖氨酸链段侧链的氨基相连的酰胺键在酸性环境下极易水解，聚氨基酸链段上接枝的DMMA脱落导致聚氨基酸链段带正电，聚氨基酸链段和带正电荷的Poly(CBA-SP)排斥，导致PEG-b-PLL(DMMA)从所述纳米颗粒上脱落，此时，所述聚合物纳米颗粒带正电，所述带正电的聚合物纳米颗粒与带负电的肿瘤细胞相互吸引，极大的促进了聚合物纳米颗粒的入胞。在所述带正电的聚合物纳米颗粒入胞后，肿瘤细胞内高浓度的谷胱甘肽(GSH)还原胱胺双丙烯酰胺链段的二硫键，使Poly(CBA-SP)解离，药物被释放，同时Poly(CBA-SP)被降解。
综上，本发明第一方面提供的敏感响应性聚合物纳米颗粒同时具有还原敏感性和pH敏感性，在血液中循环时间长，稳定性良好，可以有效地在肿瘤部位富集，其中负载的药物分子可以很容易进入肿瘤细胞，同时，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒生物相容性良好、易降解。
本发明实施例第二方面提供了一种敏感响应性聚合物纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备PEG-b-PLL(DMMA)，包括以下步骤：
以甲基-聚乙二醇-氨基作为引发剂，通过逐步引发ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐开环聚合的方法合成聚乙二醇-b-苄氧羰基保护的聚赖氨酸嵌段聚合物(PEG-b-PLL(Z))，然后脱去苄氧羰基保护基，得到聚乙二醇-b-聚赖氨酸嵌段聚合物(PEG-b-PLL)，再将所述PEG-b-PLL和2,3-二甲基马来酸酐反应，得到PEG-b-PLL(DMMA)；所述聚赖氨酸链段的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇链段的氨基端连接，所述2,3-二甲基马来酸通过酰胺键与所述聚赖氨酸链段侧链的氨基相连；
(2)制备Poly(CBA-SP)，包括以下步骤：
将胱胺双丙烯酰胺(CBA)和三氟乙酰基保护的精胺(DISP)通过迈克尔加成聚合反应，得到聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-三氟乙酰基保护的精胺)交替共聚物(Poly(CBA-DISP))，然后脱去精胺上的三氟乙酰基，得到Poly(CBA-SP)；所述Poly(CBA-SP)中胱胺双丙烯酰胺单体和精胺单体通过碳-氮键连接；
(3)将所述PEG-b-PLL(DMMA)和所述Poly(CBA-SP)混合，得到所述敏感响应性聚合物纳米颗粒，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒具有两层结构，内层为聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)(Poly(CBA-SP))，外层为聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)(PEG-b-PLL(DMMA))，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒中，所述PEG-b-PLL(DMMA)和所述Poly(CBA-SP)的重量比大于1。
优选地，所述PEG-b-PLL(DMMA)和所述Poly(CBA-SP)的重量比为(20-400):(5-100)。
优选地，所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)的数均分子量为4000-10000Da，所述聚乙二醇链段的数均分子量为500-10000Da，所述聚赖氨酸链段的聚合度为10-200。
优选地，所述PEG-b-PLL(DMMA)聚合物的制备，具体包括以下步骤：
(a)将数均分子量为500-10000Da的CH3-PEG-NH2溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到浓度为1-100mg/mL的CH3-PEG-NH2溶液，在氮气保护下，将所述CH3-PEG-NH2溶液加热至30-50℃后，加入ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐(Lys(Z)-NCA)单体得到反应液，所述Lys(Z)-NCA单体与CH3-PEG-NH2的摩尔比为10-200：1，恒温反应24-120小时，然后加入体积为DMF体积5-50倍的乙醚沉淀、过滤、干燥，得到PEG-b-PLL(Z)嵌段聚合物；
(b)将所得产物PEG-b-PLL(Z)溶于三氟乙酸中，然后在冰浴下加入PEG-b-PLL(Z)5倍摩尔量的HBr溶液，反应1-4小时脱去苄氧羰基保护基，再加入体积为步骤(a)DMF体积5-50倍的乙醚沉淀、过滤和纯化得到PEG-b-PLL聚合物；
(c)将所得PEG-b-PLL聚合物溶于DMF中，加入PLL重复单元总摩尔量3～10倍的DMMA，并同时加入和DMMA等摩尔量的吡啶，在室温下搅拌反应12～120小时，反应结束后，加入体积为步骤(c)DMF体积5～50倍的乙醚沉淀，过滤、干燥和纯化后得到PEG-b-PLL(DMMA)聚合物；所述聚赖氨酸链段的聚合度为10-200。
更优选地，步骤(b)中所述HBr溶液为质量分数为33％的HBr乙酸溶液。
更优选地，步骤(b)中的纯化方法为：将所述含有PEG-b-PLL的溶液溶解于极性有机溶剂中，使用截留分子量为2000-8000的透析袋在水中透析12-96小时，每2-6小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-b-PLL聚合物；
更优选地，步骤(c)中的纯化方法为：
将所得PEG-b-PLL(DMMA)聚合物粗产物溶解于DMF中，然后使用截留分子量为3500的透析袋在pH＝8.5的NaOH的水溶液中透析12～36小时，每2小时换透析水一次，随后冻干，得到纯化后的PEG-b-PLL(DMMA)聚合物。
优选地，所述Poly(CBA-SP)聚合物的制备，具体包括以下步骤：
(a)将精胺溶于甲醇中，再加入三氟乙酸乙酯得到混合液，室温反应24-36h后，将混合液中的溶剂蒸干，得到精胺双三氟乙酰胺；
在冰浴条件下，将丙烯酰氯和氢氧化钠同时缓慢地加入胱胺二盐酸水溶液中，待冰浴反应1-2h后转为室温反应1-2h，反应结束后过滤、干燥和纯化得到胱胺双丙烯酰胺；
(b)将所述精胺双三氟乙酰胺溶于甲醇水溶液中，氮气保护下，加入胱胺双丙烯酰胺，50-60℃反应3-4天，反应结束后加入体积为甲醇水溶液体积5-50倍的乙醚沉淀、过滤、干燥得到Poly(CBA-DISP)交替共聚物；
(c)将所得Poly(CBA-DISP)交替聚合物溶于含有甲醇和氢氧化钠的混合溶液中，得到反应液，调节反应液pH为11-14，冰浴条件下反应3-6h，纯化和冻干后，得到Poly(CBA-SP)聚合物。
优选地，步骤(a)中所述精胺和所述三氟乙酸乙酯的摩尔比为1:2.5。
优选地，步骤(a)中所述丙烯酰氯、氢氧化钠和胱胺二盐酸的摩尔比为1:2:1。
优选地，步骤(a)所述胱胺双丙烯酰胺的纯化方法为：将胱胺双丙烯酰胺粗产物溶于四氢呋喃中，50-65℃下加入正己烷重结晶得到胱胺双丙烯酰胺纯品。
优选地，步骤(b)所述甲醇水溶液为甲醇按和去离子水的体积比9:1溶于去离子水中得到。
优选地，步骤(c)的纯化方法为：反应结束后，将反应液使用截留分子量为3500的透析袋在水中透析48小时，每6小时换透析水一次，随后冻干得到Poly(CBA-SP)聚合物。
优选地，所述聚赖氨酸链段侧链的全部氨基均被2,3-二甲基马来酸取代。
本发明实施例第二方面提供的敏感响应性聚合物纳米颗粒的制备方法，操作简便、便于推广应用。
本发明实施例第三方面提供了一种敏感响应性聚合物纳米颗粒在作为药物载体中的应用。
本发明实施例第四方面提供了一种负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒，所述负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒具有三层结构，内层为吲哚菁绿(ICG)，次外层为聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)(Poly(CBA-SP))，最外层为聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)(PEG-b-PLL(DMMA))，所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)中胱胺双丙烯酰胺单体和精胺单体通过碳-氮键连接，所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)中聚乙二醇链段为甲基-聚乙二醇-氨基(CH3-PEG-NH2)，所述聚赖氨酸链段的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇链段的氨基端连接，所述2,3-二甲基马来酸通过酰胺键与所述聚赖氨酸链段侧链的氨基相连；所述负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒中，所述PEG-b-PLL(DMMA)和所述Poly(CBA-SP)的重量比大于1。
优选地，所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)、聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)和吲哚菁绿的重量比为(5-100):(20-400):(1-20)。
优选地，所述负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒三层之间的作用力均为静电作用。
优选地，所述Poly(CBA-SP)的数均分子量为4000-10000Da。所述PEG-b-PLL(DMMA)中聚乙二醇链段的数均分子量为500-10000Da，所述聚赖氨酸链段的聚合度为10-200。
优选地，所述负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒的平均纳米粒径为100-200nm。
优选地，根据不同需要，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒可以为冻干粉针剂或水溶液针剂。
本发明提供了一种通过合成了一种负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒，所述纳米颗粒具有三层结构，其中最外层是具有肿瘤微环境pH敏感响性的PEG-b-PLL(DMMA)分子构成的负电荷层，次外层是具有还原响应性的Poly(CBA-SP)分子构成的正电荷层，内层是ICG分子。通过控制PEG-b-PLL(DMMA)和Poly(CBA-SP两种聚合物的投料比，使负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒整体带负电荷，在血液循环中可以有效地避免特异性吸附，延长了该聚合物纳米颗粒在血液的循环时间，此时包载在纳米颗粒内部的ICG分子的荧光处于淬灭状态，当负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒到达肿瘤组织时，由于大部分肿瘤组织微环境的pH为6.5-7.2，呈微酸性，所述2,3-二甲基马来酸与所述聚赖氨酸链段侧链的氨基相连的酰胺键在酸性环境下极易水解，聚氨基酸链段上接枝的DMMA脱落导致聚氨基酸链段带正电，聚氨基酸链段和带正电荷的Poly(CBA-SP)排斥，导致聚氨基酸链段从所述纳米颗粒上脱落，得到了外层为带正电的Poly(CBA-SP)、内层为ICG的两层聚合物纳米颗粒，所述两层聚合物纳米颗粒的纳米颗粒能与带负电的肿瘤细胞相互吸引，极大的促进了聚合物纳米颗粒的入胞。在所述两层聚合物纳米颗粒入胞后，肿瘤细胞内高浓度的谷胱甘肽(GSH)还原CBA链段的二硫键，Poly(CBA-SP)解离，ICG被释放，ICG分子的荧光恢复，发挥成像作用。
本发明负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒的最外层中的聚乙二醇作为亲水性外壳来保护载体，可以减少特异性吸附，能够有效保护纳米颗粒在体内不被快速清除，从而延长敏感响应性聚合物纳米颗粒在生物体内的循环时间。
所述Poly(CBA-SP)和PEG-b-PLL(DMMA)聚合物两者均具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且降解产物没有毒性。
综上，本发明将Poly(CBA-SP)和PEG-b-PLL(DMMA)聚合物包裹吲哚菁绿得到所述具有三层结构的聚合物纳米颗粒，可以提高ICG的稳定性，避免ICG在运输过程中泄露或被降解，所述聚合物纳米颗粒带有负电荷，具有pH敏感性和还原敏感性，可以长时间地在血液内循环，并有效地在肿瘤部位富集和更容易入胞，同时，ICG在进入肿瘤细胞前荧光处于淬灭状态，进入肿瘤细胞后ICG分子的荧光恢复，可有效提高ICG成像的信噪比。
本发明实施例第五方面提供了一种负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备PEG-b-PLL(DMMA)，包括如下步骤：
以甲基-聚乙二醇-氨基作为引发剂，通过逐步引发ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐开环聚合的方法合成聚乙二醇-b-苄氧羰基保护的聚赖氨酸嵌段聚合物(PEG-b-PLL(Z))，然后脱去苄氧羰基保护基，得到聚乙二醇-b-聚赖氨酸嵌段聚合物(PEG-b-PLL)，再将PEG-b-PLL和2,3-二甲基马来酸酐反应，得到PEG-b-PLL(DMMA)；所述聚赖氨酸链段的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇链段的氨基端连接，所述2,3-二甲基马来酸通过酰胺键与所述聚赖氨酸链段侧链的氨基相连；
(2)制备Poly(CBA-SP)，包括如下步骤：
将三氟乙酰基保护的精胺(DISP)和胱胺双丙烯酰胺(CBA)通过迈克尔加成聚合反应得到聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-三氟乙酰基保护的精胺)交替共聚物(Poly(CBA-DISP))，然后脱去精胺上的三氟乙酰基，得到Poly(CBA-SP)；所述Poly(CBA-SP)中胱胺双丙烯酰胺单体和精胺单体通过碳-氮键连接；
(3)分别将Poly(CBA-SP)、PEG-b-PLL(DMMA)和ICG溶解，得到Poly(CBA-SP)溶液、PEG-b-PLL(DMMA)溶液和ICG溶液，将所述ICG溶液加入所述Poly(CBA-SP)溶液中，剧烈搅拌1～2h后，再加入PEG-b-PLL(DMMA)溶液，继续搅拌5～10min，得到所述负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒，所述负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒中，所述PEG-b-PLL(DMMA)和所述Poly(CBA-SP)的重量比大于1。
优选地，所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)、聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)和吲哚菁绿的重量比为(5-100):(20-400):(1-20)。
优选地，所述负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒三层之间的作用力均为静电作用。
优选地，所述Poly(CBA-SP)的数均分子量为4000-10000Da。
优选地，所述PEG-b-PLL(DMMA)中聚乙二醇链段的数均分子量为500-10000Da，所述聚赖氨酸链段的聚合度为10-200。
优选地，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒的平均纳米粒径为100-200nm。
优选地，分别将Poly(CBA-SP)、PEG-b-PLL(DMMA)和ICG溶解于去离子水、生理盐水或磷酸盐缓冲液中得到Poly(CBA-SP)水溶液、PEG-b-PLL(DMMA)水溶液和ICG水溶液。
优选地，根据所需要的剂型，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒可以制成冻干粉针剂或水溶液针剂。
本发明实施例第六方面提供了一种负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒在制备肿瘤荧光成像药物中的应用。
本发明提供的一种敏感响应性聚合物纳米颗粒及其制备方法和应用具有如下有益效果：
(1)本发明提供的敏感响应性聚合物纳米颗粒整体带负电荷，在血液循环中可以有效地避免与血液中带负电的蛋白等分子结合，因而可以延长血液循环时间；
(2)本发明提供的敏感响应性聚合物纳米颗粒中的PEG-b-PLL(DMMA)在肿瘤组织微环境中易脱落，可以得到带正电的纳米颗粒，极大的促进了该纳米颗粒的入胞；
(3)所述Poly(CBA-SP)聚合物主链中含有二硫键，ICG被包载在纳米颗粒内部时，ICG分子的荧光处于淬灭状态，当纳米颗粒入胞后，肿瘤细胞内高浓度的谷胱甘肽还原CBA链段的二硫键，Poly(CBA-SP)解离，ICG释放，ICG分子的荧光恢复，极大地提高了荧光成像的信噪比；
(4)本发明提供的敏感响应性聚合物纳米颗粒，其生物相容性和生物可降解性好，毒性低，降解产物无毒无害可被吸收或被代谢；
(5)本发明提供的敏感响应性聚合物纳米颗粒及负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒的制备方法简便易行，稳定性良好，便于操作推广。
附图说明
图1为PEG-b-PLL(DMMA)聚合物的1HNMR谱图；
图2为本发明实施例1制备的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒的DLS粒径分布图；
图3为本发明实施例1制备的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒在牛血清白蛋白中的粒径稳定性；
图4为本发明实施例1制备的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒在肿瘤微环境pH下敏感性；
图5为本发明实施例1制备的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒对癌细胞的激光共聚焦显微镜成像图。
具体实施方式
以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
实施例1
一种负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)PEG-b-PLL(DMMA)聚合物的制备，包括以下步骤：
(a)将聚合管抽真空后充氮气保护，将1g分子量为500Da的CH3-PEG-NH2 溶解于20mL DMF后加入到聚合管内，得到CH3-PEG-NH2溶液，在氮气保护下，将该CH3-PEG-NH2溶液加热至30℃后，再加入Lys(Z)-NCA单体得到反应液，Lys(Z)-NCA单体和CH3-PEG-NH2的摩尔比为20:1，氮气保护下恒温反应24小时，反应结束后加入体积为DMF体积10倍的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-b-PLL(Z)嵌段聚合物聚赖氨酸链段的一端通过酰胺键与聚乙二醇链段的氨基端连接；
(b)将PEG-b-PLL(Z)溶于室温的三氟乙酸中，在冰浴搅拌下加入PEG-b-PLL(Z)的5倍摩尔量的质量分数为33％HBr的AcOH溶液，反应3小时后脱去苄氧羰基保护基，再加入体积为步骤(a)DMF体积10倍的乙醚沉淀、过滤，得到PEG-b-PLL聚合物的粗产物，将该粗产物溶解于极性有机溶剂乙醇中，使用截留分子量为3000的透析袋在水中透析96小时，每6小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-b-PLL聚合物
(c)将PEG-b-PLL聚合物再次加入到DMF中，加入PLL重复单元总摩尔量5倍的DMMA，并同时加入和DMMA等摩尔量的吡啶，在室温下搅拌反应48小时，反应完后加入体积为步骤(c)DMF体积10倍的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-b-PLL(DMMA)聚合物粗产物。将所得PEG-b-PLL(DMMA)聚合物粗产物溶解于DMF中使用截留分子量为3500的透析袋在pH＝8.5的NaOH的水溶液中透析24小时，每6小时换透析水一次，随后冻干，得到纯化后的PEG-b-PLL(DMMA)聚合物2,3-二甲基马来酸通过酰胺键与聚赖氨酸链段侧链的氨基相连。其中，聚赖氨酸链段的聚合度为20。由图1核磁谱图分析计算得到PEG-b-PLL(DMMA)中PLL的氨基将近100％被DMMA取代了。
(2)Poly(CBA-SP)聚合物的制备，包括以下步骤：
(a)将0.1g精胺溶于甲醇中，再加入180uL三氟乙酸乙酯，室温反应24后使用旋转蒸发仪将反应溶剂蒸干得到精胺双三氟乙酰胺
将1.16g胱胺二盐酸盐溶于去离子水中得到胱胺二盐酸盐水溶液，0.93g丙烯酰氯溶于二氯甲烷中得到丙烯酰氯溶液，0.8g氢氧化钠溶于去离子水中得到氢氧化钠溶液，在冰浴条件下将丙烯酰氯(AC)溶液和氢氧化钠溶液同时缓慢地加入胱胺二盐酸水溶液中，待冰浴反应1h后转为室温反应1h。反应结束后过滤、干燥得到胱胺双丙烯酰胺粗产物。将胱胺双丙烯酰胺粗产物溶于四氢呋喃中，65℃下加入正己烷重结晶得到胱胺双丙烯酰胺纯品
(b)将90mg精胺双三氟乙酰胺溶于甲醇水溶液中(MeOH和去离子水按体积比为9:1混合得到甲醇水溶液)，氮气保护下加入53.9mg胱胺双丙烯酰胺，氮气保护下于60℃反应3天。反应结束后加入体积为甲醇水溶液体积10倍的乙醚沉淀、过滤、干燥得到Poly(CBA-DISP)聚合物。
(c)再将所得产物Poly(CBA-DISP)聚合物溶于甲醇和氢氧化钠的混合溶液中得到反应液，调节反应液的溶液的PH为11，冰浴反应3h后使用截留分子量为3500的透析袋在水中透析48小时，每6小时换透析水一次，随后冻干得到Poly(CBA-SP)聚合物，该Poly(CBA-SP)的数均分子量为4000Da左右。聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)中胱胺双丙烯酰胺单体和精胺单体通过碳-氮键连接。
(3)称取步骤1制得的PEG-b-PLL(DMMA)聚合物4mg，将聚合物完全溶解于1mL去离子水中，形成均一、透明的PEG-b-PLL(DMMA)水溶液；
称取步骤2制得的Poly(CBA-SP)聚合物1mg，将聚合物完全溶解于1mL去离子水中，形成均一、透明的Poly(CBA-SP)水溶液；
称取ICG 3mg，将ICG完全溶解于1mL去离子水中形成均一、透明的ICG水溶液；
将33.3uL ICG水溶液加入1mL Poly(CBA-SP)水溶液中，待剧烈搅拌2h后加入1mLPEG-b-PLL(DMMA)水溶液，继续搅拌10min，得到负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒。该负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒具有三层结构，内层为吲哚菁绿，次外层为聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)，最外层为聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)。
图2为本发明实施例1制备的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒的DLS粒径分布图；其中左图为外层为Poly(CBA-SP)、内层为ICG的两层的聚合物纳米颗粒的DLS粒径分布图；右图为发明实施例1制备的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒的DLS粒径分布图，从图中可以看出，左图的纳米颗粒平均粒径为粒径为115nm，粒径分散比较均匀。右图的纳米颗粒平均粒径为粒径为120nm，大于左图纳米颗粒粒径，说明在Poly(CBA-SP)表面又形成了PEG-b-PLL(DMMA)层得到了具有三层结构的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒，该负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒粒径大小比较均匀。
图3为本发明实施例1制备的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒在牛血清白蛋白中(BSA)的粒径稳定性；从图中可以看出，本发明实施例1制备的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒(实施例1制得的三层纳米颗粒)在牛血清白蛋白中(BSA)中的粒径大小变化不大，而外层为Poly(CBA-SP)、内层为ICG的两层的聚合物纳米颗粒(Poly(CBA-SP)/ICG两层纳米颗粒)随着时间的延长，粒径从初始的400nm左右，增长到120min时的2100nm，这是由于该两层聚合物纳米颗粒带正电荷，在牛血清白蛋白中(BSA)环境中，在血液循环中容易与血液中带负电的蛋白等分子结合，纳米颗粒粒径变大，而本发明实施例1制备的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒带负电荷，不易于血液中带负电的蛋白等分子结合，因此，该负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒在血液中粒径更加稳定。
图4为本发明实施例1制备的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒在肿瘤微环境pH下的敏感性。对负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒在不同pH值下的Zeta电位进行测定，在pH＝7.4的缓冲液中，纳米球的Zeta电位为-23mV到-5mV，始终保持负电荷；而pH＝6.8时，其电位在60min内从-7.5mV迅速上升并趋于8mV左右，以上结果表明，负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒能在pH＝7.4的环境中较长时间地保持负电性，而在pH＝6.8时快速转变成正电性，说明本发明实施例1制备的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒在肿瘤微环境pH下具有敏感性。
图5为应用于本发明实施例1制备的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒对癌细胞的激光共聚焦显微镜成像图，癌细胞为人乳腺癌细胞(MCF-7)，检测仪器为激光共聚焦显微镜，图5中第一行为游离的ICG对癌细胞的荧光成像图，第二行为本实施例制得的纳米颗粒在pH＝7.4的环境下对癌细胞的荧光成像图，第三行为本实施例制得的纳米颗粒在pH＝6.8的环境下对癌细胞的荧光成像图，第一列为Hoechst(赫克斯特)染料的染色结果，第二列为ICG的染色结果，第三列为第一列和第二列的荧光合并的结果，从图中可以看出，pH＝6.8的ICG荧光最为强烈，说明负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒中的ICG在pH＝6.8的情况下更多地在细胞内聚集，极大的促进了聚合物纳米颗粒的入胞。
实施例2
一种负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)PEG-b-PLL(DMMA)聚合物的制备，包括以下步骤：
(a)将聚合管抽真空后充氮气保护，将2g分子量为1000Da的CH3-PEG-NH2溶解于20mL DMF后加入到聚合管内，得到CH3-PEG-NH2溶液，在氮气保护下，将CH3-PEG-NH2溶液加热至50℃后，再加入Lys(Z)-NCA单体得到反应液，Lys(Z)-NCA单体和PEG-NH2的摩尔比为50:1，氮气保护下恒温反应100小时，反应结束后加入体积为DMF体积20倍的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-b-PLL(Z)嵌段聚合物；聚赖氨酸链段的一端通过酰胺键与聚乙二醇链段的氨基端连接；
(b)将PEG-b-PLL(Z)溶于室温的三氟乙酸中，在冰浴搅拌下加入PEG-b-PLL(Z)的5倍量的质量分数为33％HBr的AcOH溶液，反应2小时后，加入体积为步骤(a)DMF体积20倍的乙醚沉淀、过滤，得到PEG-b-PLL聚合物的粗产物，将该粗产物溶解于极性有机溶剂乙醇中，使用截留分子量为3500的透析袋在水中透析72小时，每6小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-b-PLL聚合物；
(c)将PEG-b-PLL聚合物再次加入到DMF中，加入PLL重复单元总摩尔量3倍的DMMA，并同时加入和DMMA等摩尔量的吡啶，在室温下搅拌反应12小时，反应完后加入体积为步骤(c)DMF体积10倍的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-b-PLL(DMMA)聚合物粗产物。将所得PEG-b-PLL(DMMA)聚合物粗产物溶解于DMF中使用截留分子量为3500的透析袋在pH＝8.5的NaOH的水溶液中透析24小时，每6小时换透析水一次，随后冻干，得到纯化后的PEG-b-PLL(DMMA)聚合物。2,3-二甲基马来酸通过酰胺键与聚赖氨酸链段侧链的氨基相连。
(2)Poly(CBA-SP)聚合物的制备，包括以下步骤：
(a)将0.1g精胺溶于甲醇中，再加入180uL三氟乙酸乙酯，室温反应24后使用旋转蒸发仪将反应溶剂蒸干得到精胺双三氟乙酰胺；
将1.16g胱胺二盐酸盐溶于去离子水中得到胱胺二盐酸盐水溶液，0.93g丙烯酰氯溶于二氯甲烷中得到丙烯酰氯溶液，0.8g氢氧化钠溶于去离子水中得到氢氧化钠溶液，在冰浴条件下将丙烯酰氯溶液和氢氧化钠溶液同时缓慢地加入胱胺二盐酸水溶液中，待冰浴反应1h后转为室温反应1h。反应结束后过滤、干燥得到胱胺双丙烯酰胺粗产物。将胱胺双丙烯酰胺粗产物溶于四氢呋喃中，65℃下加入正己烷重结晶得到胱胺双丙烯酰胺纯品。
(b)将90mg精胺双三氟乙酰胺溶于甲醇水溶液中(MeOH和去离子水按体积比为9:1混合得到甲醇水溶液)，氮气保护下加入55.6mg胱胺双丙烯酰胺，氮气保护下于60℃反应4天。反应结束后加入体积为甲醇水溶液体积10倍的乙醚沉淀、过滤、干燥得到Poly(CBA-DISP)聚合物。
(c)再将所得产物Poly(CBA-DISP)聚合物溶于甲醇和氢氧化钠的混合溶液中得到反应液，调节反应液的溶液的pH为11，冰浴反应3h后使用截留分子量为3500的透析袋在水中透析48小时，每6小时换透析水一次，随后冻干得到Poly(CBA-SP)聚合物。该Poly(CBA-SP)的数均分子量为6000Da左右。聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)中胱胺双丙烯酰胺单体和精胺单体通过碳-氮键连接。
(3)称取步骤1制得的PEG-b-PLL(DMMA)聚合物4mg，将聚合物完全溶解于1mL去离子水中，形成均一、透明的PEG-b-PLL(DMMA)水溶液；
称取步骤2制得的Poly(CBA-SP)聚合物1mg，将聚合物完全溶解于1mL去离子水中，形成均一、透明的Poly(CBA-SP)水溶液；
称取ICG 3mg，将ICG完全溶解于1mL去离子水中形成均一、透明的ICG水溶液；
将33.3uL ICG水溶液加入1mL Poly(CBA-SP)水溶液中，待剧烈搅拌1h后加入1mLPEG-b-PLL(DMMA)水溶液，继续搅拌5min，得到负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒。该负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒具有三层结构，内层为吲哚菁绿，次外层为聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)，最外层为聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)。
实施例3
一种负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)PEG-b-PLL(DMMA)聚合物的制备，包括以下步骤：
(a)将聚合管抽真空后充氮气保护，将0.1g分子量为10000Da的CH3-PEG-NH2溶解于100mL DMF后加入到聚合管内，得到CH3-PEG-NH2溶液，将CH3-PEG-NH2溶液加热至40℃后，再加入Lys(Z)-NCA单体，Lys(Z)-NCA单体和PEG-NH2的摩尔比为200:1，氮气保护下恒温反应120小时，反应结束后加入体积为DMF体积10倍的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-b-PLL(Z)嵌段聚合物；聚赖氨酸链段的一端通过酰胺键与聚乙二醇链段的氨基端连接；
(b)将PEG-b-PLL(Z)溶于室温的三氟乙酸中，在冰浴搅拌下加入PEG-b-PLL(Z)的5倍摩尔量的质量分数为33％HBr的AcOH溶液，反应3小时后，加入体积为步骤(a)DMF体积10倍的乙醚沉淀、过滤，得到PEG-b-PLL聚合物的粗产物，将该粗产物溶解于极性有机溶剂乙醇中，使用截留分子量为3000的透析袋在水中透析96小时，每6小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-b-PLL聚合物；
(c)将PEG-b-PLL聚合物再次加入到DMF中，加入PLL重复单元总摩尔量10倍的DMMA，并同时加入和DMMA等摩尔量的吡啶，在室温下搅拌反应120小时，反应完后加入体积为步骤(c)DMF体积10倍的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-b-PLL(DMMA)聚合物粗产物。将所得PEG-b-PLL(DMMA)聚合物粗产物溶解于DMF中使用截留分子量为3500的透析袋在pH＝8.5的NaOH的水溶液中透析24小时，每6小时换透析水一次，随后冻干，得到纯化后的PEG-b-PLL(DMMA)聚合物。2,3-二甲基马来酸通过酰胺键与聚赖氨酸链段侧链的氨基相连。
(2)Poly(CBA-SP)聚合物的制备，包括以下步骤：
(a)将0.1g精胺溶于甲醇中，再加入180uL三氟乙酸乙酯，室温反应24后使用旋转蒸发仪将反应溶剂蒸干得到精胺双三氟乙酰胺；
将1.16g胱胺二盐酸盐溶于去离子水中得到胱胺二盐酸盐水溶液，0.93g丙烯酰氯溶于二氯甲烷中得到丙烯酰氯溶液，0.8g氢氧化钠溶于去离子水中得到氢氧化钠溶液，在冰浴条件下将丙烯酰氯溶液和氢氧化钠溶液同时缓慢地加入胱胺二盐酸水溶液中，待冰浴反应1h后转为室温反应1h。反应结束后过滤、干燥得到胱胺双丙烯酰胺粗产物。将胱胺双丙烯酰胺粗产物溶于四氢呋喃中，65℃下加入正己烷重结晶得到胱胺双丙烯酰胺纯品。
(b)将90mg精胺双三氟乙酰胺溶于甲醇水溶液中(MeOH和去离子水按体积比为9:1混合得到甲醇水溶液)，氮气保护下加入57.1mg胱胺双丙烯酰胺，氮气保护下于60℃反应3-4天。反应结束后加入体积为甲醇水溶液体积10倍的乙醚沉淀、过滤、干燥得到Poly(CBA-DISP)聚合物。
(c)再将所得产物Poly(CBA-DISP)聚合物溶于甲醇和氢氧化钠溶液形成的混合溶液中得到反应液，调节反应液的溶液的pH为14，冰浴反应3h后使用截留分子量为3500的透析袋在水中透析48小时，每6小时换透析水一次，随后冻干得到Poly(CBA-SP)聚合物。该Poly(CBA-SP)的数均分子量为10000Da左右。聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)中胱胺双丙烯酰胺单体和精胺单体通过碳-氮键连接。
(3)称取步骤1制得的PEG-b-PLL(DMMA)聚合物4mg，将聚合物完全溶解于1mL去离子水中，形成均一、透明的PEG-b-PLL(DMMA)水溶液；
称取步骤2制得的Poly(CBA-SP)聚合物1mg，将聚合物完全溶解于1mL去离子水中，形成均一、透明的Poly(CBA-SP)水溶液；
称取ICG 3mg，将ICG完全溶解于1mL去离子水中形成均一、透明的ICG水溶液；
将33.3uL ICG水溶液加入1mL Poly(CBA-SP)水溶液中，待剧烈搅拌2h后加入1mLPEG-b-PLL(DMMA)水溶液，继续搅拌10min，得到负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒。该负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒具有三层结构，内层为吲哚菁绿，次外层为聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)，最外层为聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)。
本发明的替代方案可以设计同样结构但不同材料的三嵌段聚合物作为纳米载体制剂的骨架，其中CBA部分不可替代，SP部分可用亚精胺等物质替代，PEG部分不可代替，PLL部分不可代替，DMMA部分可用其他酸酐如乙酸酐、己酸酐或琥珀酸酐等替代，其他代替方案的具体效果可能略有差异，但设计思想和精神同本方案无异。
Claims (10)
1.一种敏感响应性聚合物纳米颗粒，其特征在于，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒具有两层结构，内层为聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)，外层为聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)，所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)中胱胺双丙烯酰胺单体和精胺单体通过碳-氮键连接，所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)中聚乙二醇链段为甲基-聚乙二醇-氨基，所述聚赖氨酸链段的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇链段的氨基端连接，所述2,3-二甲基马来酸通过酰胺键与所述聚赖氨酸链段侧链的氨基相连，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒中，所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)和所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)的重量比大于1。
2.如权利要求1所述的敏感响应性聚合物纳米颗粒，其特征在于，所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)和所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)的重量比为(4-80):1。
3.如权利要求1所述的敏感响应性聚合物纳米颗粒，其特征在于，所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)的数均分子量为4000-10000Da，所述聚乙二醇链段的数均分子量为500-10000Da，所述聚赖氨酸链段的聚合度为10-200。
4.一种敏感响应性聚合物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)，包括以下步骤：
以甲基-聚乙二醇-氨基作为引发剂，通过逐步引发ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐开环聚合的方法合成聚乙二醇-b-苄氧羰基保护的聚赖氨酸嵌段聚合物，然后脱去苄氧羰基保护基，得到聚乙二醇-b-聚赖氨酸嵌段聚合物，再将所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸嵌段聚合物和2，3-二甲基马来酸酐反应，得到聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)；所述聚赖氨酸链段的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇链段的氨基端连接，所述2,3-二甲基马来酸通过酰胺键与所述聚赖氨酸链段侧链的氨基相连；
(2)制备聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)，包括以下步骤：
将胱胺双丙烯酰胺和三氟乙酰基保护的精胺进行迈克尔加成聚合反应，得到聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-三氟乙酰基保护的精胺)交替共聚物，然后脱去精胺上的三氟乙酰基，得到聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)；所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)中胱胺双丙烯酰胺单体和精胺单体通过碳-氮键连接；
(3)将所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)和所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)混合，得到所述敏感响应性聚合物纳米颗粒，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒具有两层结构，内层为所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)，外层为所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)，所述敏感响应性聚合物纳米颗粒中，所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)和所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)的重量比大于1。
5.如权利要求4所述的敏感响应性聚合物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中制备所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)，具体包括以下步骤：
(a)将精胺溶于甲醇中，再加入三氟乙酸乙酯得到混合液，室温反应24-36h后，将混合液中的溶剂蒸干，得到精胺双三氟乙酰胺；
在冰浴条件下，将丙烯酰氯和氢氧化钠同时缓慢地加入胱胺二盐酸水溶液中，待冰浴反应1-2h后转为室温反应1-2h，反应结束后过滤、干燥和纯化得到胱胺双丙烯酰胺；
(b)将所述精胺双三氟乙酰胺溶于甲醇水溶液中，氮气保护下，加入胱胺双丙烯酰胺，50-60℃反应3-4天，反应结束后加入乙醚沉淀、过滤、干燥得到聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-三氟乙酰基保护的精胺)交替共聚物；
(c)将所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-三氟乙酰基保护的精胺)交替共聚物溶于含有甲醇和氢氧化钠的混合溶液中，调节pH为11-14，冰浴条件下反应3-6h，纯化和冻干后，得到聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)。
6.如权利要求1-3任一项所述的敏感响应性聚合物纳米颗粒在作为药物载体中的应用。
7.一种负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒，其特征在于，所述负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒具有三层结构，内层为吲哚菁绿，次外层为聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)，最外层为聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)，所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)中胱胺双丙烯酰胺单体和精胺单体通过碳-氮键连接，所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)中聚乙二醇链段为甲基-聚乙二醇-氨基，所述聚赖氨酸链段的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇链段的氨基端连接，所述2,3-二甲基马来酸通过酰胺键与所述聚赖氨酸链段侧链的氨基相连；所述负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒中，所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)和所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)的重量比大于1。
8.如权利要求7所述的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒，其特征在于，所述负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒的平均纳米粒径为100-200nm。
9.一种负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)，包括以下步骤：
以甲基-聚乙二醇-氨基作为引发剂，通过逐步引发α-氨基酸-N-羧基内酸酐开环聚合的方法合成聚乙二醇-b-苄氧羰基保护的聚赖氨酸嵌段聚合物，然后脱去苄氧羰基保护基，得到聚乙二醇-b-聚赖氨酸嵌段聚合物，再将所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸嵌段聚合物和2，3-二甲基马来酸酐反应，得到聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)；所述聚赖氨酸链段的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇链段的氨基端连接，所述2,3-二甲基马来酸通过酰胺键与所述聚赖氨酸链段侧链的氨基相连；
(2)制备聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)，包括以下步骤：
将三氟乙酰基保护的精胺和胱胺双丙烯酰胺通过迈克尔加成聚合反应得到聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-三氟乙酰基保护的精胺)交替共聚物，然后脱去精胺上的三氟乙酰基，得到聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)；所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)中胱胺双丙烯酰胺单体和精胺单体通过碳-氮键连接；
(3)分别将聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)、聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)和吲哚菁绿溶解，得到聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)溶液、聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)溶液和吲哚菁绿溶液，将所述吲哚菁绿溶液加入所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)溶液中，剧烈搅拌1～2h后，再加入所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)溶液，继续搅拌5～10min，得到所述负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒，所述负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒中，所述聚乙二醇-b-聚赖氨酸(2,3-二甲基马来酸)和所述聚(胱胺双丙烯酰胺-alt-精胺)的重量比大于1。
10.如权利要求7所述的负载吲哚菁绿的敏感响应性聚合物纳米颗粒在制备肿瘤荧光成像药物中的应用。
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| CN103351597A (zh) * | 2007-11-07 | 2013-10-16 | 犹他大学研究基金会 | 可还原聚（酰胺乙烯亚胺）的可切割修饰以增强核苷酸递送 |
| CN103566379A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-02-12 | 中国药科大学 | 一种“胞内触发”式还原敏感型药物联合基因靶向共传递体的制备及应用 |
| CN103690961A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-04-02 | 深圳先进技术研究院 | 一种智能两亲性聚合物纳米胶束及其制备方法和应用 |
| CN103705931A (zh) * | 2013-12-12 | 2014-04-09 | 深圳先进技术研究院 | 一种壳层可脱落聚合物纳米载体、其制备方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104224721A (zh) | 2014-12-24 |
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