CN108210482B - 一种载miRNA复合纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种载miRNA复合纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种载miRNA复合纳米颗粒，其包括阳离子靶向膜材、酸敏膜材以及至少一种miRNA；阳离子靶向膜材选自半乳糖‑聚赖氨酸‑聚半胱氨酸聚合物、酸敏膜材选自侧链经过3,4,5,6‑四氢苯酐配体进行修饰的聚乙二醇‑聚赖氨酸聚合物；miRNA选自诱导肿瘤相关巨噬细胞向M1型巨噬细胞分化的miRNA。本发明的载miRNA复合纳米颗粒通过pH值靶向和主动靶向实现对肿瘤相关巨噬细胞的精准投递，并实现了促进肿瘤相关巨噬细胞向M1型巨噬细胞分化的功能。

Description

一种载miRNA复合纳米颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向传递载体。
背景技术
巨噬细胞作为一类重要的免疫细胞可分为经典活化的M1型和替代活化的M2型。其中M1型巨噬细胞是一类重要的效应细胞，不但可分泌大量促炎性细胞因子(IL-12、IL-23等)和活性氧中间产物，而且还具有强大的杀伤微生物和肿瘤细胞的能力。与之相反，M2型则主要分泌IL-10等抑炎性细胞因子、多种趋化因子和生长因子，具有抑制免疫反应和炎症，以及促进组织修复等作用。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)则由外周单核细胞在肿瘤微环境中各类细胞因子、生长因子、低氧等因素调控下分化而成。其细胞表型主要为M2型，在肿瘤细胞免疫逃逸/免疫抑制、肿瘤转移、血管生成等多个过程中扮演重要角色。
微小RNA(miRNA)是一类内生的，长度约为20-40个核苷酸的小RNA。它们不但在不同的物种中呈现高度的保守性和同源性，而且每个miRNA可同时调控多个靶基因，因而是一种具有广阔应用前景的基因调控手段。研究表明,TAM的分化与miRNA的表达水平密切相关。例如，miRNA-125a选择性地表达在M1型巨噬细胞中，miRNA-193b则在M2a型细胞中显著上调，而M2b型巨噬细胞则表现为miR-27a,miR-132,和miR-222的高表达。雷宇等利用miRNA基因芯片技术比较小鼠TAM和正常小鼠腹腔巨噬细胞的miRNA表达水平，发现有59个miRNA在TAM中的表达水平发生显著变化。更重要的是，调控巨噬细胞的miRNA表达谱可诱导其向M1型分化。例如，过表达miRNA-125a,miRNA-29b,或miRNA-155可诱导巨噬细胞分泌M1型特征细胞因子，抑制巨噬细胞中的miRNA-223则可显著增强TLR诱导的IL-1和IL-6水平。中山大学郑利民等发现在TAM中过表达miRNA-155能显著降低肿瘤上清诱导的促炎性因子分子水平。这些结果表明，调控miRNA表达水平是诱导TAM向M1型巨噬细胞转化的重要手段。然而遗憾的是，由于RNA在体内的稳定性差，其临床应用面临重大挑战。此外，一个miRNA可同时调控多个基因，因此如何将miRNA靶向递送至TAM，避免“脱靶效应”，对未来的临床应用尤为重要。
随着纳米技术的发展，基于纳米材料的新型非病毒载体系统为miRNA靶向递送提供了新的思路。中科大的王均研究组采用一种基于磷脂-鱼精蛋白-透明质酸(LRH)的壳核结构纳米颗粒负载miR-296反义寡核苷酸链，并通过表面修饰cRGD多肽将其靶向递送至肿瘤新生血管内皮细胞。结果表明，具有靶向修饰的LRH纳米颗粒可显著抑制血管内皮细胞的迁移和新生血管的形成。Saltzman等采用穿膜肽修饰的PLGA纳米颗粒anti-miRNA负载寡核苷酸类似物PMO和肽核酸(PNA)，结果显示纳米颗粒不但有效地增强人口腔上皮癌KB细胞对寡核苷酸类似物的摄取，而且能有效地阻断胞内miRNA-155(一种促癌miRNA)的活性。为此，Nature杂志专门指出：“基于纳米材料的非病毒载体是实现体内miRNA靶向递送的重要手段。”
公开号CN102512683A公开了一种高分子基因药物载体及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用，该方案是使用环糊精羟丙基环糊精作为载体骨架，低分子量聚乙烯亚胺作为载体支链，叶酸作为可以靶向肿瘤的功能基团，形成具有靶向肿瘤功能的高效低毒药物载体。运用此基因药物载体运载能够抑制肿瘤血管内皮生长因子生成的siRNA进入肿瘤细胞，从而抑制肿瘤生长。该发明虽然利用了带正电荷的纳米颗粒负载siRNA，但是其以叶酸作为靶向基团，能够促进siRNA进入肿瘤细胞，但是该方案只用于基因治疗，不能用于纳米载体介导的免疫治疗。
公开号CN101787120A公开了一种聚氨基酸b-聚氨基酸a-聚氨基酸b或聚氨基酸a-聚氨基酸b-聚氨基酸a的聚氨基酸三嵌段共聚物及其水凝胶，聚氨基酸b作为亲水性链段，聚氨基酸a作为疏水性链段，三嵌段聚氨基酸遇水在一定浓度会形成水凝胶。但是，该发明仅涉及一种基于聚合氨基酸的水凝胶体系，并未实现将其作为miRNA载体的用途，也未公开其pH敏感等特性。
综上所述，处于肿瘤微环境中的TAMs不但功能受到抑制，而且对免疫佐剂的刺激反应低下，是制约肿瘤疫苗临床疗效的重要原因。目前尚无有效的手段可以将TAMs活化成具有抑瘤作用的M1型巨噬细胞，也缺乏高效安全的载体可将miRNA递送到TAMs以阻断其胞内的免疫抑制性信号通路。此外，现有的纳米载体仍然存在许多不足，如多数纳米载体稳定性较差，生物相容性不是非常良好，不能在体内完全降解和代谢等，制备复杂且不能很好的控制纳米载体的粒径大小等，这些缺点的存在很大程度上限制了聚合物纳米载体的应用。
发明内容
本发明通过合成聚赖氨酸-聚半胱氨酸二嵌段聚合物，得到一种具有氧化还原响应的阳离子纳米胶束。另外在纳米胶束外面接上半乳糖基团修饰，使其颗粒能够具有很好的巨噬细胞靶向性。为了精准靶向肿瘤里面的巨噬细胞，最后在纳米颗粒的最外面结合上具有pH响应的聚乙二醇。这种纳米胶束带正电荷，可以有效地负载上带负电的microRNA。本发明构建靶向TAM的聚多肽纳米胶束作为miRNA载体；通过综合调控纳米颗粒的氨基酸序列和还原响应性，增强miRNA对TAM的基因调控作用；采用被动+主动联合靶向方式提高miRNA的TAM靶向性；结合pH敏感的聚乙二醇修饰，防止miRNA的“脱靶效应”；旨在诱导TAM分化成为具有抑癌作用的M1型活化巨噬细胞，从而引发抗肿瘤免疫反应。
本发明公开了一种聚合物多功能纳米载体制剂及其制备方法，旨在提供一种制备工艺简单，粒径可调控、性质稳定、可生物降解、可负载小分子RNA的新型纳米载体制剂和其制备方法，通过将肿瘤微环境中免疫抑制的巨噬细胞转化为能够一直肿瘤生长的M1型巨噬细胞，增强机体的肿瘤免疫应答，为肿瘤免疫治疗提供新思路。
这种纳米载体制剂以合成的聚赖氨酸-聚半胱氨酸二嵌段聚合物为基础，使其在水溶液中自组装形成纳米胶束，所形成的纳米胶束的阳离子层用来负载具有电负性的microRNA。二嵌段聚合物修饰上半乳糖基团，使得具有巨噬细胞靶向性。最后与具有pH响应的聚乙二醇混合所形成的纳米胶束，其聚乙二醇表层用来保护载体，增加生物体内循环时间和减少吸附。解决了现有技术中纳米载体制剂稳定性差，生物相容性差，体内循环时间短，不能定点靶向释放等问题。
具体的，本发明一方面提供了一种载miRNA复合纳米颗粒，其包括阳离子靶向膜材、酸敏膜材以及至少一种miRNA；
其中阳离子靶向膜材为靶向巨噬细胞基团-聚氨基酸a-聚氨基酸b的共聚物，酸敏膜材为PEG-聚氨基酸c的共聚物；
靶向巨噬细胞基团选自半乳糖、甘露糖；
聚氨基酸a选自聚赖氨酸；
聚氨基酸b选自聚半胱氨酸；
聚氨基酸c选自侧链经过酸酐配体进行修饰的聚赖氨酸，所述酸酐选自2,3-二甲基马来酸酐、2-甲基马来酸酐、3,4,5,6-四氢苯酐、2,2,3,3-四甲基丁二酸酐、丁二酸酐或马来酸酐中的一种或多种。
在一个具体技术方案中，阳离子靶向膜材与酸敏膜材摩尔比为1：0.5～1：1.5，更优选为1：0.8～1：1.2，更优选为1：1。
在一个具体技术方案中，miRNA、阳离子靶向膜材与酸敏膜材摩尔比为1：20～60：20～60；更优选为1：30～50：30～50，更优选为1：40：40。
在一个具体技术方案中，阳离子靶向膜材选自半乳糖-聚赖氨酸-聚半胱氨酸聚合物、酸敏膜材选自侧链经过3,4,5,6-四氢苯酐配体进行修饰的聚乙二醇-聚赖氨酸聚合物。
在一个具体技术方案中，miRNA选自诱导肿瘤相关巨噬细胞向M1型巨噬细胞分化的miRNA，优选为miRNA155。
本发明的PEG聚合度选自100-10000，优选为200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000。
本发明中的聚合物a的聚合度选自5-300(优选为10-100，或20、30、40、50、60、70、80、90)，聚合物b的聚合度选自5-300(优选为10-100，或20、30、40、50、60、70、80、90)，聚合物c的聚合度选自5-300(优选为10-100，或20、30、40、50、60、70、80、90)。
本发明的载miRNA复合纳米颗粒的粒径为80-300nm，优选为100-200nm。
本发明的载miRNA复合纳米颗粒的能够在pH7.0以下自动脱落酸敏膜材，优选在pH6.8-5.0时自动脱落酸敏膜材。
本发明另一个方面提供了前述载miRNA复合纳米颗粒用于制备靶向肿瘤相关巨噬细胞的载体或药物的应用。
本发明另一个方面提供了前述载miRNA复合纳米颗粒用于制备促进肿瘤相
关巨噬细向M1型巨噬细胞的药物中的应用。
本发明另一个方面提供了前述载miRNA复合纳米颗粒用于制备抑制肿瘤的药物中的应用。
本发明另一个方面提供了前述载miRNA复合纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：
1)制备阳离子靶向膜材；
2)制备酸敏膜材；
3)将阳离子靶向膜材、酸敏膜材以及miRNA水溶液混合获得负载miRNA的复合纳米颗粒。
进一步地，阳离子靶向膜材通过以下方法获得：
以正丁烷和Lys(Z)-NCA在无氧条件下聚合获得PLL(Z)；
通过NCA开环聚合的方法，以PLL(Z)与Cys(Z)-NCA在惰性气体保护下反应完全，合成PLL(Z)-PLC(Z)二嵌段聚合物；
将PLL(Z)-PLC(Z)二嵌段聚合物在酸性条件下脱除保护基，得到PLL-PLC二嵌段聚合物。
通过缩合反应将乳糖酸偶联至PLL(Z)-PLC(Z)二嵌段聚合物上。
优选地，阳离子靶向膜材通过以下方法获得：
将正丁烷和Lys(Z)-NCA溶入有机溶剂中，惰性气体保护下反应至完全，加入乙醚沉淀、过滤、干燥得到PLL(Z)；
通过NCA开环聚合的方法，以引发剂PLL(Z)与Cys(Z)-NCA在惰性气体保护下反应完全，合成PLL(Z)-PLC(Z)二嵌段聚合物；
将PLL(Z)-PLC(Z)二嵌段聚合物溶于0℃的三氟乙酸，加入30％的HBr/HAc反应2小时后，加入乙醚沉淀、过滤，将所得产物溶解于极性有机溶剂，使用截留分子量为3500的透析袋在水中透析，随后冻干得到PLL-PLC二嵌段聚合物。
以EDC和NHS溶于有机溶剂中，加入乳糖酸，活化羧基，将PLL-PLC溶液加入乳糖酸活化反应液中，反应至完全得到Gal-PLL-PLC(GPP)；其中乳糖酸加入摩尔量与PLL-PLC二嵌段聚合物摩尔量之比为5:1。
2)酸敏膜材通过以下方法获得：
通过NCA开环聚合的方法聚合PEG-NH2与Lys(Z)-NCA，合成PEG-PLL聚合物；
将酸酐加入PEG-PLL聚合物溶液中避光反应，随后调节pH至8.5，透析纯化后，冻干得到酸敏膜材。
优选地，酸敏膜材通过以下方法获得：
通过NCA开环聚合的方法，以引发剂PEG-NH2与Lys(Z)-NCA在氮气保护下恒温反应至完全，合成PEG-PLL聚合物；
将3，4，5，6-四氢苯酐DCA加入PEG-PLL聚合物溶液中避光反应至完全后，加入3MNaOH，以维持pH 8.5，透析纯化后，冻干得到PEG-PLL(DCA)，即PPD。
本发明再一个方面提供了一种药物组合物，其包含前述的载miRNA复合纳米颗粒以及药用辅料，优选地，其药物剂型为注射剂。
有益效果
1、本发明利用还原响应性交联增强miRNA对TAM的基因调控作用。本发明载miRNA复合纳米颗粒的内部引入具有还原响应性的二硫键交联，不但提高纳米颗粒在循环和肿瘤微环境中的稳定性，防止miRNA过早释放，而且促进miRNA在TAM细胞内的选择性释放和基因调控。
2、本发明利用被动和主动协同靶向结合提高靶向准确性和效率。由于TAM是肿瘤微环境中的浸润性白细胞，且与正常的巨噬细胞和树突状细胞表达类似的表面受体，采用单一手段很难在体内将miRNA有效地靶向递送至TAM。因此，本发明通过调控纳米颗粒的粒径、电荷、以及在表面进行半乳糖修饰等多重手段，实现对TAM的主动靶向。与此同时，采用pH敏感的PEG分子对纳米颗粒表面的靶分子进行“屏蔽”，防止正常细胞对miRNA的摄取，提高了靶向运送的效率。而当纳米胶束携带miRNA进入具有弱酸性的肿瘤微环境中，pH敏感的PEG分子将首先从纳米颗粒表面断裂脱落，暴露出靶向修饰的纳米胶束。随后，纳米胶束携带miRNA进入TAM，在胞内GSH等还原剂的作用下将miRNA迅速释放至胞浆中，实现精准投递的作用。
3、本发明的载miRNA复合纳米颗粒精确高效地运送miRNA进入肿瘤相关巨噬细胞内，并通过调控一系列基因表达，使TAM分化为具有“抑癌”作用的M1型巨噬细胞，从而引发抗肿瘤免疫反应。
4、本发明不但为研制高效安全的miRNA载体供理论依据，还将为肿瘤免疫治疗提供新策略。
附图说明
图1为聚合物纳米载体负载microRNA的结构图和示意图。
图2为复合纳米载体促进巨噬细胞对microRNA的摄取。
其中从左侧起第1列和第4列为仅miRNA组结果，第2列为不含半乳糖的聚赖氨酸-聚半胱氨酸聚合物(PLL-PLC)与miRNA组合的试验结果，第3列为本发明复合纳米颗粒与miRNA组合的结果。左侧3列为RAW细胞的摄取结果；右侧两列为B16细胞的摄取结果。
图3为不同pH条件影响聚合物纳米胶束负载microRNA的入胞效果。
图4为聚合物纳米胶束负载microRNA诱导TAMs活化。
图5本发明载miRNA复合纳米颗粒粒径分布图
具体实施方式
实施例1半乳糖-聚赖氨酸-聚半胱氨酸聚合物Gal-PLL-PLC(GPP)的制备
将正丁烷(12.58μL)和Lys(Z)-NCA(0.78g)溶入20mL的二甲基甲酰胺DMF中，氮气保护下30℃搅拌，反应72小时。反应结束后加入5到50倍的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PLL(Z)。
通过NCA开环聚合的方法，以引发剂PLL(Z)(0.41g)与Cys(Z)-NCA(0.22g)在氮气保护下加热至30℃，恒温反应48小时进行反应，合成聚赖氨酸-聚半胱氨酸(PLL(Z)-PLC(Z))二嵌段聚合物。将PLL(Z)-PLC(Z)二嵌段聚合物溶于0℃的三氟乙酸，加入30％的HBr/HAc反应2小时后，加入10倍的乙醚沉淀、过滤，将所得产物溶解于极性有机溶剂，使用截留分子量为3500的透析袋在水中透析48小时，每2小时换透析水一次，随后冻干得到PLL-PLC二嵌段聚合物。
以EDC(4.0mg)和NHS(2.36mg)溶于15mL DMSO中，加入乳糖酸(1.84mg)，避光25℃反应12小时。将PLL-PLC溶液(15mg,1.0mg/mL)加入乳糖酸活化反应液中，反应24小时得到Gal-PLL-PLC(GPP)；其中乳糖酸加入摩尔量与PLL-PLC二嵌段聚合物摩尔量之比为5:1。
实施例2具有酸敏效应的聚乙二醇-聚赖氨酸聚合物的制备
通过NCA开环聚合的方法，以引发剂PEG-NH2(0.4g)与Lys(Z)-NCA(0.49g)在氮气保护下恒温反应48小时，合成PEG-PLL聚合物。将3，4，5，6-四氢苯酐DCA(49mg)加入PEG-PLL的溶液(5.7mg,10mg/mL)中避光25℃搅拌2小时。在上述混合液中加入3M NaOH，以维持pH8.5，透析48小时，每2小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-PLL(DCA)，即PPD。
实施例3负载microRNA的复合纳米颗粒制备：
将合成的microRNA-CY3与半乳糖-聚赖氨酸-聚半胱氨酸聚合物及酸敏效应的聚乙二醇-聚赖氨酸聚合物水溶液(microRNA:GPP:PPD＝1:40:40)进行混合振荡，于室温下静置5分钟，获得载miRNA复合纳米颗粒(图1)。其粒径分布及电镜表征如图5所示。
实施例4负载microRNA的复合纳米颗粒制备：
方法同实施例3，区别仅在于microRNA:GPP:PPD＝1:40:0。
实施例5负载microRNA的复合纳米颗粒制备：
方法同实施例3，区别仅在于microRNA:GPP:PPD＝1:40:20。
实施例6载miRNA复合纳米颗粒体外的细胞摄取
将游离的miRNA或载miRNA复合纳米颗粒体(实施例3)分别与巨噬细胞RAW264.7和肿瘤细胞B16孵育2小时，microRNA-CY3的终浓度分别为100nM。结果表明聚多肽纳米胶束显著提高巨噬细胞对microRNA-CY3的摄取(图2)，而肿瘤细胞对microRNA-CY3几乎没有摄取。
实施例7载miRNA复合纳米颗粒在不同pH条件下入胞效果
将RAW264.7细胞与载miRNA复合纳米颗粒(实施例3-5)在pH6.5和pH7.4培养基中共孵育2h，microRNA的终浓度为100nM。结果表明，单纯的GPP在不同的pH条件下不影响其入胞效果。但是随着PPD的比例增加，在pH7.4的条件下入胞效果逐渐降低，并且在pH6.5酸性条件下，随着PPD的脱落，聚多肽纳米胶束包裹的microRNA入胞效果重新恢复(图3)。
实施例8载miRNA复合纳米颗粒活化TAMs试验
将TAMs细胞与载miRNA复合纳米颗粒在pH6.5培养基中共孵育2h，microRNA的终浓度为100nM。流式细胞术结果表明，本发明的载miRNA复合纳米颗粒可显著上调MHCII和CD86的比例，诱导TAM活化(图4)。
以上实施例只为说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

Claims (14)

1.一种载miRNA复合纳米颗粒，其包括阳离子靶向膜材、酸敏膜材以及至少一种miRNA；
其中阳离子靶向膜材为靶向巨噬细胞基团-聚赖氨酸-聚半胱氨酸的共聚物，酸敏膜材为PEG-聚氨基酸c的共聚物；
靶向巨噬细胞基团选自半乳糖、甘露糖；聚氨基酸c选自侧链经过酸酐配体进行修饰的聚赖氨酸，所述酸酐选自3,4,5,6-四氢苯酐。
2.根据权利要求1所述的载miRNA复合纳米颗粒，阳离子靶向膜材与酸敏膜材摩尔比为1：0.5～1：1.5。
3.根据权利要求1所述的载miRNA复合纳米颗粒，阳离子靶向膜材与酸敏膜材摩尔比为1：0.8～1：1.2。
4.根据权利要求1所述的载miRNA复合纳米颗粒，阳离子靶向膜材与酸敏膜材摩尔比为1：1。
5.根据权利要求1所述的载miRNA复合纳米颗粒，miRNA、阳离子靶向膜材与酸敏膜材摩尔比为1：20～60：20～60。
6.根据权利要求1所述的载miRNA复合纳米颗粒，miRNA、阳离子靶向膜材与酸敏膜材摩尔比为1：30～50：30～50。
7.根据权利要求1-4任一项所述的载miRNA复合纳米颗粒，miRNA、阳离子靶向膜材与酸敏膜材摩尔比为1：40：40。
8.根据权利要求1-4任一项所述的载miRNA复合纳米颗粒，所述miRNA为诱导肿瘤相关巨噬细胞向M1型巨噬细胞分化的miRNA。
9.根据权利要求8所述的载miRNA复合纳米颗粒，所述miRNA为miRNA155。
10.权利要求8-9任一项所述的载miRNA复合纳米颗粒用于制备靶向肿瘤相关巨噬细胞的载体或药物的应用。
11.权利要求8-9任一项所述的载miRNA复合纳米颗粒用于制备抑制肿瘤的药物中的应用。
12.一种药物组合物，其包含权利要求8-9任一项所述的载miRNA复合纳米颗粒以及药用辅料。
13.权利要求12所述的药物组合物，其药物剂型为注射剂。
14.权利要求1-9任一项所述的载miRNA复合纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：
1)制备阳离子靶向膜材；
2)制备酸敏膜材；
3)将阳离子靶向膜材、酸敏膜材以及miRNA水溶液混合获得负载miRNA的复合纳米颗粒。
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