CN106893054B - 一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种阳离子聚合物基因载体，以N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺和N‑(1，3‑二羟基‑2‑丙基)甲基丙烯酰胺为单体合成嵌段聚合物N‑(1，3‑二羟基‑2‑丙基)甲基丙烯酰胺‑b‑N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺聚合物，随后在N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺链段上偶联胍基，得到N‑(1，3‑二羟基‑2‑丙基)甲基丙烯酰胺‑b‑N‑3‑胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物；或者接枝具有肿瘤靶向性的甲硫氨酸并将伯氨基胍基化，得到N‑(1，3‑二羟基‑2‑丙基)甲基丙烯酰胺‑b‑(N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺‑g‑甲硫氨酸)‑b‑胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物。本发明还提出了上述基因载体的制备方法。本发明的基因载体可以携带基因药物且具有良好的生物相容性和肿瘤靶向性，应用前景大。

Description

一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用。
背景技术
阳离子聚合物是一类新型非病毒基因载体，其具有病毒类基因载体所没有的良好的物理化学性质、高度的分子多样性、低免疫原性、结构易于修饰、携带基因大小和类型不受限制等优点[1]。聚乙烯亚胺(PEI)是目前应用最为广泛的阳离聚合物基因载体，1995年，Boussif等首次报道了PEI可作为阳离子聚合物基因载体携带含有负电的DNA分子形成PEI/DNA复合物[2]。这种PEI/DNA复合物进入细胞的溶酶体后，PEI分子链上的氮原子被质子化，使溶酶体pH升高，引起Cl离子内流，从而使得复合物从溶酶体中逃逸出来，DNA得到表达。而N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺(APMA)是具有伯胺基残基的单体，该单体合成的均聚物载体在基因递送研究中显示了较高的转染效果[3]。
N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺(DHPMA)是一类亲水性良好的单体，其均聚物作为聚合物载体的亲水性链段，使DHPMA对阳离子聚合物的正电荷掩蔽作用及血液中蛋白沉积的抑制作用更强，可大大降低聚合物毒性[4，5]。此外，DHPMA作为人工聚合物，分子量范围很宽，选择的自由度高[6]。聚合物骨架具有亲水性链段，使其具有舒展的分子结构，并对其本身的正电荷进行适当保护，提高载体在靶细胞外的稳定性能，减少细胞毒性[7，8]。
1988年，Green等证实人免疫缺损病毒HIV-1的反式激活蛋白Tat蛋白、果蝇触角足转录因子ANTP的同源异构结构域、单纯疱疹病毒1型VP22转录因子等都具有强大的细胞膜穿透能力。[9-11]人们把这类具有细胞膜穿透能力的短肽称为细胞穿透肽(CellPenetrating Peptides，CPPs)。研究结果表明，精氨酸能有效转运穿透细胞膜，在细胞穿透过程中扮演非常重要的角色，研究推测精氨酸中的胍基是赋予此类物质细胞膜穿透能力的功能部分。[12]有效地触发基因沉默是RNA干扰技术(RNAi)成功应用的关键。RNAi始于Dicer酶。作为RNaseIII家族的Dicer酶剪切dsRNA生成19-21个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)片段[13-15]。这些siRNA可选择性地沉默目的信使RNA(mRNA)[16-18]。尽管在体外细胞培养和动物体内研究中，siRNA显示出对目标基因的良好抑制效果。siRNA在临床应用方面面临着许多障碍，如较弱的细胞膜穿透能力，无靶向性，且在生理环境中不稳定。因此如何增强siRNA在体内的稳定性和穿透细胞膜的能力，增强其细胞和组织靶向性等都是急切需要解决的问题。因此，开发相应的载体成为发展占和实施RNAi的关键。病毒载体生产成本高，进入体内后具有诸多缺点(如无靶向性、产生免疫原性等)，这些因素限制了其实际使用[19]。1999年，美国出现首例因使用腺病毒载体而导致病人死亡的事件，这加快了研究者对于非病毒型基因载体的开发。[20]基于高分子材料的非病毒载体已经广泛用于对siRNA分子的传递，其中很多成果进入临床试验阶段。高分子载体具有较好的生物相容性和靶向传递的潜力，能有效提高生物活性分子在生理环境中的稳定性。高分子基因载体在系统给药后会产生EPR效应(Enhanced permeability and retention)，进而促进其在肿瘤组织的富集。[21]本发明提供高分子载体具有高效的转染能力，能有效负载疏水药物并保护siRNA分子，实现靶向治疗的同时干扰目的基因表达，达到协同治疗效果，具有良好的优势和应用前景。
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发明内容
本发明的目的在于提供一种阳离子聚合物基因载体。所述基因载体可大量负载基因药物且具有较好的穿透细胞膜能力和靶向性能。
本发明的另一目的在于提供所述阳离子聚合物基因载体的制备方法。
本发明的另一目的还在于提供所述阳离子聚合物基因载体作为生物载体材料在药物输送中的应用。
为了实现本发明的目的，采用如下技术方案：
一种阳离子聚合物基因载体，所述基因载体以N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺和N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺为单体，采用可逆加成断裂链转移聚合法合成嵌段聚合物N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺聚合物；随后在N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺链段上偶联胍基基团，得到N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物；或者在N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺链段上分别接枝甲硫氨酸和偶联胍基基团，得到N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-(N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺-g-甲硫氨酸)-b-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，其中，N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺链段在聚合物中的摩尔百分比为17％～56％。
所述的阳离子聚合物基因载体的结构可以下式表示：
Figure GDA0001267905350000041
N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物(DHPMA-b-GPMA，DG)
Figure GDA0001267905350000042
N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-(N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺-g-甲硫氨酸)-b-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物(DHPMA-b-(APMA-g-methionine)-b-GPMA，mDG)
优选地，所述的阳离子聚合物基因载体的数均分子量为16400～45700g/mol。
所述的阳离子聚合物基因载体的主链中聚N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺的聚合度为10-90，N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺聚合度为10-90。
所述的阳离子聚合物基因载体优选为N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-(N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺-g-甲硫氨酸)-b-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，数均分子量为16400～19100g/mol。
本发明进一步提出了上述阳离子聚合物基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)聚DHPMA聚合物的制备：
取二硫代苯甲酸(4-氰基戊酸)酯和ACVA溶于1，4-二氧六环中，得到溶液A，然后将溶液A和DHPMA的水溶液加入到聚合瓶中，通氮气1～2h，蜡封聚合瓶，然后将聚合瓶放入预热至70～80℃的油浴中反应12～24h，将聚合瓶取出，冷却，终止聚合反应，将得到的产物加入到冰丙酮中沉淀，离心，反复溶解、沉淀若干次，最后将产物置于真空干燥箱50～60℃干燥得产物聚DHPMA聚合物，记为PDHPMA；
(2)聚DHPMA-b-APMA聚合物的制备：
将PDHPMA和APMA单体溶于蒸馏水中，得到溶液B，将溶液B和含ACVA的二氧六环溶液混合均匀后转移至聚合瓶中，体系用干燥氮气通气1～2h，蜡封聚合瓶，将聚合瓶放入预热至70℃～80℃油浴中反应12～24h，反应结束后将聚合瓶取出，冷却，终止聚合反应，产物加入到预冷的丙酮中沉淀，离心，反复溶解、沉淀若干次，然后将得到的产物置于真空干燥箱50～60℃干燥得到聚DHPMA-b-APMA聚合物，记为DA聚合物；
(3)胍基化DA聚合物的合成：
将步骤(2)中制备的DHPMA-b-APMA聚合物溶于水中，随后加入胍基化试剂，调节反应溶液pH至8～10，室温下反应12～24h，加入超滤管用超纯水离心洗涤3次，冷冻干燥得到产物N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，记为DHPMA-b-GPMA或DG；
进一步地
(4)甲硫氨酸接枝的DG聚合物的制备：
取甲硫氨酸溶于0.2M磷酸盐缓冲溶液PBS中，随后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，调节反应溶液pH至5.5-6.5，室温反应15～30min，加入2-巯基乙醇终止反应；将步骤(3)中制备的DG聚合物溶于0.2M PBS缓冲液中并加入到上述反应液中，调节溶液pH至7-8，室温反应2h；将反应液加入超滤管用超纯水离心洗涤3次，得甲硫氨酸接枝的DHPMA-b-GPMA聚合物，即N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-(N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺-g-甲硫氨酸)-b-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，记为DHPMA-b-(APMA-g-methionine)-b-GPMA或mDG。
所述阳离子聚合物基因载体mDG的制备方法，还可以将上述制备方法的步骤(3)、步骤(4)的顺序对调，即DA聚合物先接枝甲硫氨酸，得到甲硫氨酸接枝的DHPMA-b-APMA聚合物(记为mDA)；再进行胍基化，制得胍基化mDA聚合物，最终也制得N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺-b-N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺聚合物，记为DHPMA-b-(APMA-g-methionine)-b-GPMA或mDG。
优选地，步骤(1)中，二硫代苯甲酸(4-氰基戊酸)酯与DHPMA的摩尔比为1∶10～90，二硫代苯甲酸(4-氰基戊酸)酯与ACVA的摩尔比为1∶1～4，DHPMA的水溶液中的水的质量为DHPMA质量的1～5倍。
步骤(2)中，PDHPMA聚合物与APMA单体的摩尔用量比为1∶10～90，PDHPMA与ACVA的摩尔用量比为1∶1～4。
步骤(3)或(4)中，DA聚合物中APMA链段与甲硫氨酸的摩尔比为10∶0.5～10∶1，甲硫氨酸、EDC及sulfo-NHS的摩尔比为1∶(2～6)∶(4～15)。
步骤(3)或(4)中，所述的胍基化试剂为1-H-吡唑-1-甲脒盐酸盐，DA聚合物中APMA链段与1-H-吡唑-1-甲脒盐酸盐的摩尔比为1∶1～10。
本发明还提出了上述阳离子聚合物基因载体作为生物载体材料在药物输送中的应用。
另一方面，本发明提出了一种负载基因药物的阳离子聚合物载体，其是通过静电吸引将基因药物负载在上述阳离子聚合物基因载体上得到，其中，所述的基因药物为siRNA、shRNA、质粒DNA等。
上述负载基因药物，尤其是疏水药物的阳离子聚合物载体在制备抗肿瘤药物中的应用同样在本发明的保护范围之内。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明制备的聚合物载体可大量负载基因药物，具有较好的疏水药物携带和基因药物结合能力；
(2)本发明制备的聚合物载体具有较好的穿透细胞膜能力；
(3)本发明制备的聚合物具有较小分子量分布且反应可控；
(4)本发明制备的聚合物携带siRNA后比“金标准”PEI有更高的转染效率。
(5)本发明制备的聚合物接枝了甲硫氨酸，使得所述阳离子聚合物基因载体具有良好的靶向性能。
附图说明
图1A为DG\mDG聚合物的合成路线；
图1B为mDG聚合物先接枝甲硫氨酸，再偶联胍基的合成路线；
图2为mDG/siRNA复合物在N/P为4～16时的电泳阻滞图；A图为mDG1/siRNA-NC复合物，B图为mDG2/siRNA-NC复合物，C图为mDG3/siRNA-NC复合物；
图3中，A为mDA3/siRNA-NC复合物与系列mDG/siRNA-NC复合物的粒径图；B为mDA3/siRNA-NC复合物与系列mDG/siRNA-NC复合物的表面电位图；
图4中，A为P-gp mRNA表达量示意图；B为mDG3/siRNA-NC组(1)、PEI/siRNA-2组(2)、mDA3/siRNA-2复合物组(3)和mDG3/siRNA-2组(4)的P-gp蛋白表达量，C为mDA3/siRNA-2复合物和mDG3/siRNA-2在血清中的稳定性；D为mDA3/siRNA-2复合物的甲硫氨酸竞争实验。*表明各组与空白组有显著性差异(p＜0.05，n＝3)；mDG聚合物与siRNA的复合比为16；
图5中，A为MTT法检测共孵育了DOX、mDG/siRNA-2复合物和mDG/siRNA-2复合物与DOX混合物对MCF-7/ADR细胞的IC50值(n＝3)；B为流式细胞术检测共孵育了DOX、mDG/siRNA-2复合物和mDG/siRNA-2复合物与DOX混合物(左：DOX组；中：mDG/siRNA-3复合物组；右：mDG/siRNA-3复合物与DOX混合物组；mDG聚合物与siRNA的复合比为16)；C为MCF-7/ADR细胞的荧光图(上：DOX；中：mDG3/siRNA-NC复合物和DOX组；mDG3/siRNA-2复合物和DOX组)；
图6为DG/siRNA复合物在N/P为1～32时的电泳阻滞图；A图为DG1/siRNA-NC复合物，B图为DG2/siRNA-NC复合物，C图为DG3/siRNA-NC复合物；
图7中，A为DA3/siRNA-NC复合物与系列DG/siRNA-NC复合物的粒径图；B为DA3/siRNA-NC复合物与系列DG/siRNA-NC复合物的表面电位图；C为DA3/siRNA-NC复合物(上)和DG3/siRNA-NC复合物(下)的扫描电镜图；
图8中，A为P-gp mRNA表达量示意图；B为DG3/siRNA-NC组(1)、DA3/siRNA-2复合物组(2)、DG3/siRNA-2组(3)、和PEI/siRNA-2组(4)的P-gp蛋白表达量，*表明各组与空白组有显著性差异(p＜0.05，n＝3)；DG聚合物与siRNA的复合比为12；
图9中，A为MTT法检测共孵育了DOX、DG/siRNA-3复合物和DG/siRNA-3复合物与DOX混合物对MCF-7/ADR细胞的IC50值(n＝3)；B为流式细胞术检测共孵育了DOX、DG/siRNA-3复合物和DG/siRNA-3复合物与DOX混合物(上：DOX组；中：DG/siRNA-3复合物组；下：DG/siRNA-3复合物与DOX混合物组；DG聚合物与siRNA的复合比为12)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
说明书中出现的缩略语含义如下表1所示：
表1
Figure GDA0001267905350000071
Figure GDA0001267905350000081
本发明以N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺和N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺为单体，采用可逆加成断裂链转移聚合法合成了嵌段聚合物N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺-b-N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺聚合物，随后在N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺链段上偶联甲硫氨酸和胍基基团，得到N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-(N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺-g-甲硫氨酸)-b-N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，或者在N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺链段上偶联胍基基团，得到N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，得到了具有较高转染效率的聚合物载体。随后通过凝胶排阻色谱确定了聚合物的分子量，下面通过具体的实施例详细说明本发明。
实施例1基因药物的阳离子聚合物载体及其制备
(1)聚DHPMA聚合物的制备：
DHPMA(1.0430g，7.0mmol)溶于1.0mLmL蒸馏水中，后加入到5mLmL聚合小瓶中，二硫代苯甲酸(4-氰基戊酸)酯(0.0336g，0.12mmol)，ACVA(0.0167g，0.06mmol)溶于0.5mL 1，4-二氧六环中，将其加入到聚合小瓶中。体系用干燥氮气通气1h，蜡封聚合小瓶。将聚合瓶放入预热至70℃油浴中反应24h。将聚合管取出，置于0℃冷泵中冷却，终止聚合反应，得产物。将产物加入到冰丙酮中沉淀，离心，反复溶解/沉淀三次，产物置于真空干燥箱50℃干燥得产物聚DHPMA聚合物(PDHPMA)0.0362g(产率72％)。
(2)聚DA聚合物的制备：
将APMA(0.267g，1.5mmol)、PDHPMA(0.131g，0.02mmol)溶于蒸馏水中，ACVA(0.0028g，0.01mmol)溶于0.5mL 1，4-二氧六环中，将二者混合均匀后转移至5mL聚合小瓶中。体系用干燥氮气通气1h，蜡封聚合小瓶。将聚合瓶放入预热至70℃油浴中反应24h。反应结束后将聚合管取出，置于0℃冷泵中冷却，终止聚合反应。产物加入到预冷的丙酮中沉淀，离心，反复溶解/沉淀三次。产物置于真空干燥箱50℃干燥得产物聚DA聚合物0.254g(产率64％)。
(3)甲硫氨酸接枝的DA聚合物的合成
取甲硫氨酸(1.49mg，0.01mmol)溶于5mL PBS缓冲液中，加入EDC.HCl(3.84mg，0.02mmol)和sulfo-NHS(8.68mg，0.04mmol)，调节溶液pH至6.0，室温反应30min后加入2-巯基乙醇终止反应。将DA聚合物(1.65g，0.1mmol)溶于10mL PBS中并加入到上述溶液中，调节溶液pH至7.4，室温反应2h。将反应液加入到超滤管中(10kd)，超纯水清洗3次，冻干后得甲硫氨酸接枝的DA聚合物1.36g(产率81％)。
(4)胍基化mDA聚合物的合成：
将mDA聚合物溶于水中，使伯胺基浓度为12mM，加入过量胍基化试剂1-H-吡唑-1-甲脒盐酸盐，使其浓度为65mM，饱和碳酸钠溶液调节反应溶液pH至9.0，室温下反应24h。将反应液加入到超滤管中(10kd)，超纯水清洗3次，冷冻干燥产物mDG聚合物0.087g(产率83％)。产物mDG的1H NMR结构表征数据如下，1H NMR(300MHz，D2O)：δ(ppm)0.99-1.20(CH2C(CH3)CO)，1.70-1.95(CH2C(CH3)CO，CH2CH2CH2NH2)，2.31-2.43((NH2)CHCH2CH2S)，2.69-2.87(CONHCH2CH2CH2NH)，3.40-3.77((NH2C(NH)NHCH2CH2)，NHCH(CH2OH)CH2OH).
表2为根据上述方法制备的不同链段比例的聚合物mDG1、mDG2、mDG3的聚合物组成及平均分子量。在全文中，mDG1、mDG2、mDG3有相同的含义。
表2三种聚合物组成及分子量
名称 APMA拟聚合度(％mol) <sup>1</sup>实际APMA比例(％mol) Mw PDI
mDG1 20％ 17％ 16400 1.49
mDG2 40％ 37％ 17800 1.45
mDG3 60％ 56％ 19100 1.51
1APMA链段所占聚合物摩尔比例采用茚三酮法检测
实施例2基因药物的阳离子聚合物载体的及其制备
(1)聚DHPMA聚合物的制备：
同实施例一第(1)步
(2)聚DA聚合物的制备：
同实施例一第(2)步
(3)胍基化DG聚合物的合成：
取DA聚合物(1.78g，0.1mmol)溶于水中，加入胍基化试剂1-H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(0.059g，0.4mmol)，饱和碳酸钠溶液调节反应溶液pH至9.0，室温下反应24h。将反应液加入到超滤管中(10kd)，超纯水清洗3次，冷冻干燥产物DG聚合物1.23g(产率67％)。
表3为根据上述方法制备的不同链段比例的聚合物DG1、DG2、DG3的聚合物组成及平均分子量。
表3三种聚合物组成及分子量
名称 聚合物 DHPMA聚合度 GPMA聚合度 Mw PDI
DG1 DHPMA-b-GPMA 90 10 23700 1.51
DG2 DHPMA-b-GPMA 60 40 31500 1.45
DG3 DHPMA-b-GPMA 40 60 45700 1.54
进一步地，包括步骤(4)，
(4)甲硫氨酸接枝的DA聚合物的合成
取甲硫氨酸(44.7mg，0.3mmol)溶于5mL PBS缓冲液中，加入EDC.HCl(172.8mg，0.9mmol)和sulfo-NHS(195.3mg，0.9mmol)，调节溶液pH至6.0，室温反应30min后加入2-巯基乙醇终止反应。将DG聚合物(1.78g，0.1mmol)溶于10mL PBS中并加入到上述溶液中，调节溶液pH至7.4，室温反应2h。将反应液加入到超滤管中(10kd)，超纯水清洗3次，冻干后得甲硫氨酸接枝的DA聚合物1.15g(产率63％)。
实施例3 mDG/siRNA复合物的制备与表征
(1)mDG/siRNA复合物的制备：
取定量siRNA储备液溶于无酶水中，按mDG聚合物中氨基氮的摩尔量与siRNA(siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3和siRNA-NC)中磷酸根的摩尔量比制备mDG/siRNA复合物，即取mDG1、mDG2和mDG3聚合物按N/P为1∶1，1∶4，1∶8等比例加入siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-NC中的任意一种)储备液混合室温孵育30min，制得系列DHPMA-b-GPMA/siRNA复合物(即mDG1、mDG2、mDG3和siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-NC任意两者的复合物)，随后将复合物溶液超声并过0.22μm滤膜存于4℃备用。
(2)mDG/siRNA复合物的琼脂糖凝胶电泳
按电荷比1∶4、1∶8和1∶16混合mDG聚合物和siRNA，室温孵育30min得mDG1/siRNA-NC、mDG2/siRNA-NC和mDG3/siRNA-NC复合物。取1uL上样缓冲液(EDTA 30mM，甘油36％，二甲苯蓝0.035％，溴酚蓝0.05％，TaKaRa)与上述不同N/P的复合物混匀后加入1％琼脂糖凝胶中，以100V电压，在TBE缓冲溶液中电泳15min。随后在303nm的紫外光下观察DNA电泳情况并拍照。结果如图3所示，在电荷比为8时mDG3聚合物可将siRNA-NC包覆，同时mDG1和mDG2在N/P为16时可将siRNA-NC包覆。结果表明，随着mDG聚合物中胍基化的APMA链段所占摩尔比例的增加，mDG聚合物对siRNA的吸附能力逐渐增强。当N/P为8时mDG3聚合物能完全阻滞siRNA向正极移动，表明本发明的mDG3聚合物载体具有较高的基因携带能力。
(3)mDA/siRNA和mDG/siRNA复合物的粒径、Zeta电位和扫描电镜分析。
将制备的mDA3/siRNA-NC和三种mDG/siRNA-NC复合物(mDG1/siRNA-NC、mDG2/siRNA-NC和mDG3/siRNA-NC复合物)的在PBS(pH 7.2)溶液，置于Malvern Zetasizer nanoZS激光粒度仪中，在室温下检测四种复合物的粒径和Zeta电位，结果如表4和附图4所示。
表4
Figure GDA0001267905350000111
比较不同GPMA链段比例的mDG/siRNA复合物粒径可知，在相同N/P下，随着GPMA链段在聚合物中的比例增高，mDG/siRNA复合物的平均粒径越低，siRNA在不同N/P下，经胍基化后的mDG3/siRNA复合物的平均粒径低于未胍基化的mDA3/siRNA复合物，表明聚合物中GPMA链段所占比例对负载和压缩siRNA有决定性作用，而经胍基化后的聚合物进一步提高了对siRNA的压缩能力。文献表明，粒径小于300nm的粒子均可以跨膜进入细胞，而制备的mDG2、mDG3聚合物与siRNA以电荷比为8时复合物的粒径小于300nm(如附图3)，随着N/P增加，聚合物对siRNA的压缩更为充分，当N/P为32时，所有GD/siRNA复合物的平均粒径均下降至300nm以下，mDG2、mDG3聚合物与siRNA复合物粒径更进一步降低至150nm左右。
不同电荷比下mDA3/siRNA与系列mDG/siRNA复合物的表面zeta电位值如附图4所示。结果表明，不同GPMA链段的mGD/siRNA复合物在N/P大于1时zeta电位都显正值，表明带负电的siRNA分子在此电荷范围下可被包裹在复合物中。随着N/P增加，即聚合物的量增加，复合物的正电荷密度逐渐增加，使得zeta电位逐渐升高。其中，胍基后的mDG3/siRNA复合物比未胍基化的复合物表现出强烈的正电性。
实施例4 DG/siRNA复合物的制备与表征
根据与实施例4相同的方法进行DG/siRNA复合物的制备与表征，DG/siRNA复合物的电泳阻滞图如图6。结果表明，随着DG聚合物中胍基化的APMA链段所占摩尔比例的增加，DG聚合物对siRNA的吸附能力逐渐增强。当N/P为8时DG3聚合物能完全阻滞siRNA向正极移动，表明本发明的DG3聚合物载体具有较高的基因携带能力。
对DA/siRNA和DG/siRNA复合物的粒径、Zeta电位和扫描电镜分析如图7和表5。
表5
项目 DA3/siRNA-NC DG1/siRNA-NC DG2/siRNA-NC DG3/siRNA-NC
平均粒径 151.0nm 249.6nm 163.2nm 150.7nm
Zeta电位 9.1mV 10.0mV 11.2mV 12.2mV
比较不同GPMA链段比例的DG/siRNA复合物粒径可知，在相同N/P下，随着GPMA链段在聚合物中的比例增高，DG/siRNA复合物的平均粒径越低，siRNA在不同N/P下，经胍基化后的DG3/siRNA复合物的平均粒径低于未胍基化的DA3/siRNA复合物，表明聚合物中GPMA链段所占比例对负载和压缩siRNA有决定性作用，而经胍基化后的聚合物进一步提高了对siRNA的压缩能力。文献表明，粒径小于300nm的粒子均可以跨膜进入细胞，而制备的DG2、DG3聚合物与siRNA以电荷比为8时复合物的粒径小于300nm，随着N/P增加，聚合物对siRNA的压缩更为充分，当N/P为32时，所有GD/siRNA复合物的平均粒径均下降至300nm以下，DG2、DG3聚合物与siRNA复合物粒径更进一步降低至150nm左右。
不同电荷比下DA3/siRNA与系列DG/siRNA复合物的表面zeta电位值如附图8所示。结果表明，不同GPMA链段的GD/siRNA复合物在N/P大于1时zeta电位都显正值，表明带负电的siRNA分子在此电荷范围下可被包裹在复合物中。随着N/P增加，即聚合物的量增加，复合物的正电荷密度逐渐增加，使得zeta电位逐渐升高。其中，胍基后的DG3/siRNA复合物比未胍基化的复合物表现出强烈的正电性。
取DA3/siRNA和DG3/siRNA复合物溶液各10μL滴加在干燥的硅片上，用滤纸吸去多余液体并在室温下自然晾干。然后在扫描电镜(ZEISS Ultra plus)下观察两种复合物的形貌及粒径分布。结果表明，两种复合物形态成近球型，粒径分布比较规则，直径在150～200nm之间。
实施例5 DG/siRNA、mDG/siRNA复合物体外转染、体外靶向性验证及稳定性试验
(1)mDG/siRNA复合物体外转染
取实施例1制备的mDA3和mDG3与三种P-gp siRNA按N/P为16混合并孵育备用，在6孔板中接种(1×106个/孔)处于对数生长期的MCF-7/ADR细胞，待细胞融合率在60～70％后更换无血清无抗生素。随后将上述mDA3/siRNA和mDG3/siRNA复合物分别加入不同孔中(n＝3)，共培养4h后更换新鲜的有血清培养液继续培养至48h后通过实时定量PCR和Westernblot检测P-gp表达情况。如附图5所示，实验表明，mDA3/siRNA-2、mDG3/siRNA-2和mDA3/siRNA-3、mDG3/siRNA-3复合物均能显著沉默P-gp mRNA表达(p＜0.05)，其中mDG3/siRNA-2和mDG3/siRNA-3组对P-gp mRNA沉默率较高，高于相同情况下的PEI组。Western blot实验结果表明mDA3/siRNA-2和mDG3/siRNA-2复合物能有效抑制P-gp蛋白的表达。
(2)DG/siRNA复合物体外转染
方法同上。实验表明，DA3/siRNA-2、DG3/siRNA-2和DA3/siRNA-3、DG3/siRNA-3复合物均能显著沉默P-gp mRNA表达(p＜0.05)，其中DG3/siRNA-2和DG3/siRNA-3组对P-gpmRNA沉默率较高，高于相同情况下的PEI组。Western blot实验结果表明DG3/siRNA-2和DG3/siRNA-3复合物能有效抑制P-gp蛋白的表达。
(3)mDG/siRNA复合物体外靶向性实验
mDG/siRNA复合物体外靶向性通过甲硫氨酸竞争实验检测。取实施例1制备的mDG3/siRNA-2按N/P为16混合并孵育备用，在6孔板中接种(1×106个/孔)处于对数生长期的MCF-7/ADR细胞，待细胞融合率在60～70％后更换无血清无抗生素。随后将上述mDG3/siRNA-2复合物和1mg/mL甲硫氨酸分别加入孔中，对照孔只加mDG3/siRNA-2复合物，共培养4h后更换新鲜的有血清培养液继续培养至20h后通过实时定量PCR检测P-gp表达情况。结果表明1mg/mL甲硫氨酸竞争实验组的P-gp mRNA表达高于正常实验组，可能由于细胞上的位点被甲硫氨酸竞争而减少了载体被细胞摄取的量，使得P-gp mRNA未被大量沉默。(n＝3)。
(4)mDG/siRNA复合物体稳定性实验
取实施例1制备的mDG3/siRNA-2按N/P为16混合并孵育备用，在6孔板中接种(1×106个/孔)处于对数生长期的MCF-7/ADR细胞，待细胞融合率在60～70％后更换有血清无抗生素。随后将上述mDG3/siRNA-2复合物加入孔中，共培养4h后更换新鲜的有血清培养液继续培养至20h后通过实时定量PCR检测P-gp表达情况。结果表明，mGA3/siRNA-2和mGD3/siRNA-2组的P-gp mRNA的表达量低于PEI/siRNA-2对照组，可能由于mGA3和mGD3聚合物结构中含有较多羟基，提高了聚合物亲水性。(n＝3)
可见，阳离子聚合物载体mDG还具有良好的靶向性能和稳定性。
实施例6 DG3/siRNA、mDG3/siRNA复合物的逆转MCF-7/ADR耐药性。
(1)mDG3/siRNA复合物的逆转MCF-7/ADR耐药性
取对数生长期的人乳腺癌细胞(MCF-7/ADR)，以1×104个/孔加入96孔板中，每孔加入150μL培养基，在37℃、5％CO2下培养至细胞融合率70～80％后，每孔按比例mDG3/siRNA-2复合物和mDG3/siRNA-NC复合物(100nM siRNA)，共培养培养4h后更换新鲜完全培养基并继续培养44h。随后每孔按比例分别加入DOX(0.001μM～1mM)共培养24h。每孔加入20μL(5mg/mL)的MTT溶液继续培养4h，小心倒去所有培养基并加入150μL二甲亚砜(DMSO)后置振荡仪上振荡10min使蓝色甲瓒充分溶解，在酶标仪上检测每孔在490nm波长处的吸光度。另取对数生长期的人乳腺癌细胞(MCF-7/ADR)，以1×106个/孔加入6孔板中，按上述方法培养72h后，胰酶消化收集细胞并用7AAD/APC凋亡试剂染色后上流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果如图6所示，DOX组MCF-7/ADR细胞的耐药性为37.1μM而mDG3/siRNA-2与DOX混合溶液组MCF-7/ADR细胞的耐药性显著降低至4.9μM，表明mDG3聚合物能够携带siRNA至肿瘤细胞并成功逆转MCF-7/ADR细胞耐药性，同时协助DOX消灭肿瘤细胞。此外，MCF-7/ADR细胞的荧光图也表明mDG3/siRNA-2与DOX混合溶液组细胞的耐药性被逆转。
(2)DG3/siRNA复合物的逆转MCF-7/ADR耐药性。
方法同上。结果如图9所示，DG3/siRNA-3复合物没有影响P-gp siRNA逆转MCF-7/ADR细胞的耐药性，其中DOX组MCF-7/ADR细胞的耐药性为32.58μM而DG3/siRNA-3与DOX混合溶液组MCF-7/ADR细胞的耐药性显著降低至4.43μM，表明DG3聚合物能够携带siRNA至肿瘤细胞并发挥协同作用。
综上所述，本发明提出了一种新型肿瘤靶向的基因药物载体N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-(N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺-g-甲硫氨酸)-b-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，其在极性溶剂中可通过静电引力负载基因药物。这种载体的表面为N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺亲水性层，内部是含有正电的N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺结构。这种基因药物载体可增加治疗基因长循环时间、保护治疗基因不被体内酶降解。正常细胞与多种肿瘤细胞之间存在着甲硫氨酸的代谢差异，利用肿瘤细胞对甲硫氨酸的依赖性可极大提高药物载体对肿瘤细胞靶向性，并以较小剂量达到相同的治疗效果，从而减少治疗药物在非靶器官的浓度。本发明提供的生物相容性好的聚合物，可在水溶液中可与基因药物自组装形成纳米颗粒，具有良好的稳定性，且制备方法简单，可重复性高。聚合物反应条件较为温和，单体材料廉价易得，合成及后处理方法简单产率较高，其与基因药物形成的复合物制备方法简单，可大量负载基因药物，接枝的甲硫氨酸基团可特异性的靶向肿瘤细胞，接枝的胍基基团可高效携带基因药物且转染率高，并具有良好的生物相容性，同时具有很好的稳定性等特点。这类可携带基因药物且具有良好生物相容性的基因载体在疾病治疗中具有良好的应用前景。
通过N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺来结合基因药物，N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺链段形成亲水层。实验发现N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺链段具有最好的亲水性，N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺链段具有较好的基因药物负载能力，其原因是链段上具有较多的伯氨基，提高了其结合基因药物的能力，但是N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺链段上伯氨基越高其毒性就越大，而N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺链段形成的外层可以减少内部伯氨基带来的细胞毒性。
本发明制备的三种聚合物(mDG1、mDG2和mDG3)与siRNA形成的复合物的粒径及形态结果表明，三种复合物粒径大小均能满足被细胞吞噬的要求。
本发明制备的mDG3/siRNA复合物体外转染实验通过转染P糖蛋白(P-gp)siRNA验证载体转染效率。通过与“金标准”PEI相比，说明了mDG3/siRNA具有较高的转染效率。同时，mDG3/siRNA复合物与甲硫氨酸竞争性实验也表明，复合物具有肿瘤靶向性。体外稳定性实验表明，mDG3/siRNA-2复合物在有血清下的转染效率高于PEI/siRNA-2复合物。
本发明制备的mDG3/siRNA-2复合物体外逆转乳腺癌(MCF-7/ADR)耐药性通过细胞毒性实验表明，通过与DOX相比，mDG3/siRNA-2与DOX共孵育组显著的(p＜0.05)逆转了MCF-7/ADR细胞的耐药性。

Claims (9)

1.一种阳离子聚合物基因载体，其特征在于，该基因载体以N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺和N-(1,3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺为单体，采用可逆加成断裂链转移聚合法合成嵌段聚合物N-(1,3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺聚合物，随后在N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺链段上接枝甲硫氨酸并偶联胍基基团，得到N-(1,3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-(N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺-g-甲硫氨酸)-b-N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，其中，N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺链段在聚合物中的摩尔百分比为17％～56％，数均分子量为16400～19100g/mol。
2.权利要求1所述的阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)DHPMA聚合物的制备：
取二硫代苯甲酸(4-氰基戊酸)酯和ACVA溶于1,4-二氧六环中，得到溶液A，然后将溶液A和DHPMA的水溶液加入到聚合瓶中，通氮气1～2h，蜡封聚合瓶，然后将聚合瓶放入预热至70～80℃的油浴中反应12～24h，将聚合瓶取出，冷却，终止聚合反应，将得到的产物加入到冰丙酮中沉淀，离心，反复溶解、沉淀若干次，最后将产物置于真空干燥箱50～60℃干燥得产物DHPMA聚合物，记为PDHPMA；
(2)DHPMA-b-APMA聚合物的制备：
将PDHPMA和APMA单体溶于蒸馏水中，得到溶液B，将溶液B和ACVA的二氧六环溶液混合均匀后转移至聚合瓶中，体系用干燥氮气通气1～2h，蜡封聚合瓶，将聚合瓶放入预热至70℃～80℃油浴中反应12～24h，反应结束后将聚合瓶取出，冷却，终止聚合反应，产物加入到预冷的丙酮中沉淀，离心，反复溶解、沉淀若干次，然后将得到的产物置于真空干燥箱50～60℃干燥得到DHPMA-b-APMA聚合物，记为DA聚合物；
其后的步骤选自以下两种方法中的一种，
(3)胍基化DA聚合物的合成：
将步骤(2)中制备的DHPMA-b-APMA聚合物溶于水中，随后加入胍基化试剂，调节反应溶液pH至8～10，室温下反应12～24h，用超纯水离心洗涤，冷冻干燥得到产物N-(1,3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，记为DHPMA-b-GPMA或DG；
(4)甲硫氨酸接枝的DG聚合物的制备：
取甲硫氨酸溶于0.2M磷酸盐缓冲溶液PBS中，随后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，调节反应溶液pH至5.5-6.5，室温反应15～30min，加入2-巯基乙醇终止反应；将步骤(3)中制备的DG聚合物溶于0.2M PBS缓冲液中并加入到上述反应液中，调节溶液pH至7-8，室温反应2h；将反应液用超纯水离心洗涤，制得N-(1,3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-(N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺-g-甲硫氨酸)-b-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，记为DHPMA-b-(APMA-g-methionine)-b-GPMA或mDG；
或者，
(3)甲硫氨酸接枝的DA聚合物的合成：
取甲硫氨酸溶于0.2M pH为7.4的PBS缓冲液中，随后加入EDC和sulfo-NHS，调节反应溶液pH至5.5-6.5，室温反应15～30min，加入2-巯基乙醇终止反应；将步骤(2)中制备的DHPMA-b-APMA聚合物溶于0.2M pH为7.4的PBS缓冲液中并加入到上述反应液中，调节反应溶液pH至7-8，室温反应2h；将反应液用超纯水离心洗涤，得甲硫氨酸接枝的DHPMA-b-APMA聚合物，记为mDA聚合物；
(4)胍基化mDA聚合物的合成：
将步骤(3)中制备的mDA聚合物溶于水中，随后加入胍基化试剂，调节反应溶液pH至8～10，室温下反应12～24h，用超纯水离心洗涤，冷冻干燥得到产物N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺-b-N-(1,3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺聚合物，记为mDG。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，二硫代苯甲酸(4-氰基戊酸)酯与DHPMA的摩尔比为1:10～1:90，二硫代苯甲酸(4-氰基戊酸)酯与ACVA的摩尔比为1:1～1:4，DHPMA与水的质量比为1：3～5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，PDHPMA聚合物与APMA单体的摩尔用量比为1:10～1:90，PDHPMA与ACVA的摩尔用量比为1:1～1:4。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)或(4)中，DA聚合物中APMA链段与甲硫氨酸的摩尔比为10:0.5～10:1，甲硫氨酸，EDC及sulfo-NHS的摩尔比为1:(2～6):(4～15)。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)或(4)中，所述的胍基化试剂为1-H-吡唑-1-甲脒盐酸盐，DA聚合物中APMA链段与1-H-吡唑-1-甲脒盐酸盐的摩尔比为1:1～1:10。
7.权利要求1所述的阳离子聚合物基因载体作为生物载体材料在药物主动靶向输送中的应用。
8.一种负载基因药物的阳离子聚合物载体，其特征在于，通过将基因药物通过静电引力负载在权利要求1所述的阳离子聚合物基因载体上得到，其中，所述的基因药物为siRNA、shRNA、质粒DNA。
9.权利要求8所述的负载基因药物的阳离子聚合物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
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