CN101588821A - 寡核苷酸非病毒递送系统 - Google Patents

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Abstract

低分子量壳聚糖寡聚体能够将siRNA自组织成纳米化的颗粒，提供针对酶降解的保护作用并介导在体外长时间稳定的基因沉默。用低分子量壳聚糖配制siRNA复合物过程中对结构变量的控制提供了有效的siRNA体内外替代递送系统。

Description

寡核苷酸非病毒递送系统
发明领域
本发明总地涉及核酸递送和基因表达领域。具体说，本发明涉及用于寡核苷酸，尤其是小干扰RNA(siRNA)的新的非病毒递送系统。
发明背景
RNA干扰(RNAi)是一种涉及由双链短干扰RNA(siRNA)特异性下调靶基因表达的天然机制[1]。RNAi越来越多地成为功能基因组学以及靶标筛选和体外验证中的常用工具[2，3]。更重要地，基于siRNA的药物的开发有希望发现复杂疾病如糖尿病、癌症和病毒感染的疗法[4-7]。对于其他形式的核酸如质粒DNA(pDNA)，血清稳定性差，不利的体内药动学性质以及无效的细胞摄取仍然是成功的基因沉默应用的主要挑战[8]。一种方案部分地克服了这些问题，该方案利用了耐受核酸酶降解且细胞摄取改善的化学修饰的siRNA[9-11]。另一种方案涉及利用基于聚阳离子的siRNA制剂。例如，基于阳离子脂质的制剂在体外和体内siRNA的递送中有效[12-15]。相反，最初认为阳离子聚合物不适合用作寡核苷酸递送[16]。然而，近来研究发现，阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺型胺(PAMAM)树状聚合物和聚-L-赖氨酸(PLL)可用于siRNA递送[17-19]。在pDNA优化条件下进行配制和递送的阳离子聚合物作为寡核苷酸递送系统的效率有相反报导。而且，一些报道关注上述聚阳离子的体内毒性可能妨碍其未来临床应用[20-22]。因此，激发了用于siRNA递送的无毒有效载体的研究。
发明概述
本发明涉及一种组合物，其包含以下成分的复合物：(a)数均聚合度(DPn)为30-300的低分子量壳聚糖，其中低分子量壳聚糖的脱乙酰化程度大于90％；和(b)寡核苷酸。如权利要求1所述的组合物，该组合物包含利用化学或酶方法由高分子量壳聚糖获得的低分子量壳聚糖。低分子量壳聚糖的脱乙酰化程度大于95％，最优选大于99％。此外，组合物的净电荷比基本上为正。所述低分子量壳聚糖用寻靶配基和稳定剂进行衍生化。寡核苷酸包含引入宿主细胞时表达其功能的沉默序列。寡核苷酸选自：RNA分子、反义分子、核酶和微小RNA。本发明组合物的pH为3.5-8.0，更优选7.1-7.6。本发明还涉及制备本发明组合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)使低分子量壳聚糖与水性溶剂相接触；(b)将步骤(a)的水性溶液与寡核苷酸在水性溶剂中混合；和(c)保持组合物的pH为3.5-8.0，更优选为7.1-7.6。本发明还涉及制备组合物的方法，该方法包括在步骤(b)之后，降低步骤(b)所得产物溶液的体积以实现所需的组合物浓度。本发明还涉及将核酸给予哺乳动物的方法，该方法包括利用所述的组合物并将该组合物引入哺乳动物内。将组合物引入哺乳动物体内的方法可通过肺部、鼻腔、口服、眼睛、含服、舌下、局部、直肠或阴道途径给予粘膜组织来实现。或者，组合物可通过静脉内、肌内、真皮内、颅内、椎管内、皮下或心内的胃肠外途径给予粘膜下组织，或给予内脏器官、血管或外科手术期间暴露的其他体表或体腔而引入哺乳动物。本发明方法包括将所述组合物给予哺乳动物，其中所述寡核苷酸能够在至少一种哺乳动物的细胞内表达其功能。本发明还涉及制备成预防性或治疗性治疗哺乳动物的药物的所述组合物制备的使用方法。这些应用包括但不限于：用于预防性或治疗性治疗恶性肿瘤、自身免疫病、遗传病症、病原感染和其他病理学疾病的基因疗法、反义疗法、或基因疫苗接种。而且，本发明还涉及利用所述组合物作为体内和体外诊断方法中使用的诊断试剂。
附图简要说明和序列表
图1显示了siRNA制剂的物理稳定性(A)和RNA酶A的保护作用(B)。用线型DPn85壳聚糖配制的siRNA复合物在两种pH值和所有测试的电荷比的条件下显示最高的物理稳定性。所有选择的聚阳离子能够保护siRNA免于RNA酶A的降解。对于琼脂糖凝胶电泳，将100ng siRNA加载到各个孔中。对于壳聚糖DPn18制剂，复合物以30∶1(+/-)和60∶1(+/-)的电荷比进行配制。对于PEI制剂则采用电荷比15∶1(+/-)，而siRNA与脂质转染胺试剂2000的复合物则以重量比2∶1(+/-)配制。显示了三次独立实验的代表性凝胶。
图2显示了在正常HEK 293细胞(A)以及稳定表达萤光素酶的HEK293细胞(293-Luc)(B，C)中siRNA的体外递送。与对照未处理细胞相比，用特异性siRNA-Luc与pLuc(A)或pGFP(C)共转染时实现了显著的萤光素酶沉默。仅将siRNA-Luc递送至293-Luc细胞时萤光素酶抑制效率降低(B)。转染后48小时分析萤光素酶基因表达。
利用已为pDNA递送作了优化的壳聚糖(支化DPn34)[27]，与siRNA以电荷比10∶1配制形成复合物。对于PEI复合物采用电荷比5∶1(+/-)，而siRNA与LF2000的复合物则以重量比2∶1(+/-)配制。基因表达结果表示为平均值±S.D.；n＝4。
图3显示了在293-Luc细胞中与寡核苷酸形成复合物的线型(A)和支化(B)壳聚糖的结构变化对萤光素酶沉默活性的影响。虽然对于链长大于34个单体单元(数均聚合度高于34个单体单元)的线型壳聚糖形成的复合物来说链长和电荷比似乎不是关键，但支化壳聚糖复合物介导有效的萤光素酶沉默要求对于较长的壳聚糖链长有较高的电荷密度和较高的电荷比。采用siRNA浓度150纳摩尔(100纳克/孔)。转染后48小时分析萤光素酶基因表达。以电荷比30∶1(+/-)配制壳聚糖复合物。基因表达结果表示为平均值±S.D.；n＝4。
图4显示了线型低分子量壳聚糖的siRNA浓度依赖性和相对效率。对于较低的siRNA浓度(15-30纳克/孔，相当于22-44纳摩尔/孔siRNA浓度)，线型DPn85低分子量壳聚糖显示最高效能，即将萤光素酶表达相对于对照未处理293-Luc细胞敲减72-95％。转染后48小时分析萤光素酶基因表达。以电荷比30∶1(+/-)配制壳聚糖复合物。基因表达结果表示为平均值±S.D.；n＝4。
图5显示了血清对萤光素酶沉默活性的影响。在测试的各种聚阳离子制剂中，在转染介质中存在10％血清时，在293-Luc细胞中，所有线型壳聚糖和支化DPn85保留其萤光素酶沉默活性。采用siRNA浓度150纳摩尔。转染后48小时分析萤光素酶基因表达。对于低分子量壳聚糖和PEI，分别以电荷比30∶1和15∶1(+/-)配制siRNA复合物。siRNA与LF2000的复合物以重量比2∶1(+/-)配制。基因表达结果表示为平均值±S.D.；n＝4。
图6显示了siRNA制剂的细胞毒性。用各种siRNA制剂转染293-Luc细胞后立即或24小时后通过MTT方法测定胞内脱氢酶活性(细胞毒性的衡量)。与PEI和LF2000相反，用线型DPn85配制的siRNA复合物转染后细胞形态和胞内脱氢酶活性均保留。虽然LF2000复合物在转染后立即显示显著的毒性，但转染24小时后细胞活力恢复。采用siRNA浓度150纳摩尔。对于低分子量壳聚糖和PEI，分别以电荷比30∶1和15∶1(+/-)配制siRNA复合物。siRNA与LF2000的复合物以重量比2∶1(+/-)配制。基因表达结果表示为平均值±S.D.；n＝4-5。
图7显示了在体外293-Luc(A、B、C)中和稳定表达萤光素酶的SKOV-3细胞(D)中萤光素酶沉默的时程。在293-Luc和SKOV-3-Luc细胞中，DPn85的线型壳聚糖在起效较早和持续的萤光素酶沉默(持续5天)方面显示最佳的萤光素酶沉默动力学，提示完整siRNA胞内稳定释放。采用siRNA浓度44纳摩尔(30纳克/孔)。对于低分子量壳聚糖和PEI，分别以电荷比30∶1和15∶1(+/-)配制siRNA复合物。siRNA与LF2000的复合物以重量比2∶1(+/-)配制。基因表达结果表示为平均值±S.D.；n＝4。
序列表简述
SEQ ID NO.1：siGL3(正义，5′-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3′；
SEQ ID NO.2：反义，5′-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-S1)是靶向萤光素酶基因(siRNA-Luc)的未修饰的siRNA双链体，从瑞典兰德的医学探针公司(MedProbe，Lund，Sweden)定购[28]。
SEQ ID NO.3：错配siRNA；siCONTROL非靶向siRNA#1(siCON1；正义，5’-UAGCGACUAAACACAUCAAUU-3′；
SEQ ID NO.4：反义，5’-UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU-3′)从科罗拉多州拉斐特的DR有限公司(Dharmacon Research，Inc.，Lafayette，CO)定购。
发明详述
壳聚糖是一类由(1-4)连接的2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GIcN)和N-乙酰化类似物2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GIcNAc)构成的线型二元多糖，是生物相容的阳离子聚合物，其已显示适用于质粒pDNA基因递送[23-27]。在体外和体内快速有效的基因递送可利用分子量分布充分确定的线型和支化壳聚糖寡聚体来实现[25，27]。基于壳聚糖寡聚体的复合物具有改善的物理性质，包括粘度降低和聚合倾向较低。这些复合物还具有改善的效率，包括改善的细胞摄取、起效早和高水平体内基因表达。
在本发明中，实现了在新型siRNA递送系统中潜在的低分子量(7-17kDa)基本完全脱乙酰化(大于99％脱乙酰化)的壳聚糖。利用脂质转染胺2000(LF2000)和PEI(线型和支化)作为对照，研究用低分子量壳聚糖配制的siRNA复合物的物理稳定性和抗RNA酶降解性。在大多数关于siRNA递送的报道中，采用共转染方法将非生理学相关靶标或无关pDNA掺入siRNA制剂中。因此，我们首先在稳定表达萤光素酶的细胞系中体外检查这种掺入对通过各种聚阳离子的siRNA递送效率的影响。然后，我们研究了siRNA制剂和低分子量壳聚糖复合物的配方和结构。更具体说，研究了低分子量壳聚糖(链长和支化程度)结构变化的作用、配方参数(电荷比，siRNA浓度)、血清影响，并将这些因素与体外基因沉默活性的效率相关联。比较了各种siRNA制剂的细胞毒性，例如萤光素酶基因沉默的体外动力学。
这些研究表明，低分子量壳聚糖有可能用作小干扰RNA(siRNA)的新型递送系统。采用聚乙烯亚胺(PEI)和脂质转染胺2000(LF2000)作为对照，使各种链长的壳聚糖与siRNA形成复合物并检查其物理稳定性和针对酶降解的保护作用。在稳定表达萤光素酶的293细胞中体外研究siRNA复合物的细胞毒性和萤光素酶基因沉默活性。也研究了壳聚糖结构变化以及配方参数对siRNA复合物萤光素酶沉默活性的影响。低分子量壳聚糖能与siRNA复合形成物理稳定的纳米粒(34-86nm)，提供针对RNA酶降解的保护作用。壳聚糖链较长和/或低分子量壳聚糖与siRNA之间的电荷比较高导致正电荷数较高的重要性表现在体外介导萤光素酶沉默活性最高。与PEI和LF2000不同，用低分子量壳聚糖配制的siRNA复合物在含10％血清的转染培养基中保留其萤光素酶沉默活性。与PEI和LF2000相比，低分子量壳聚糖的细胞毒性也最小。数均聚合度(DPn)为85个单体单元(DPn85)的低分子量壳聚糖要求低至44nM的siRNA浓度以实现在293-Luc细胞中维持5天的萤光素酶基因表达95％沉默。同时考虑这些因素，我们的发现表明，低分子量壳聚糖是用于siRNA的有效替代递送系统。我们过去曾报道，链长非常短的基本完全脱乙酰化的低分子量壳聚糖(18-34个单体单元)在体外和体内最宜用于pDNA递送。在目前的研究中，我们报道了基本完全脱乙酰化的壳聚糖寡聚体作为siRNA体外递送系统的结构-性质关系。为此，选择各种链长的线型和三糖-取代(支化)的壳聚糖寡聚体。我们发现，与pDNA递送相反，34个单体单元以上的线型壳聚糖寡核苷酸与siRNA形成物理稳定的复合物，并在表达萤光素酶的HEK293(293-Luc)细胞中体外介导最高萤光素酶沉默活性。显然，siRNA和pDNA之间的结构-性质关系显著不同。这种差异可能是因为与pDNA相比，siRNA分子较短，柔韧性较低且负电荷密度较低。因此，siRNA复合形成物理稳定且有效的纳米粒需要与聚阳离子较强的离子间相互作用[18，33]。
我们的研究中用基本完全脱乙酰化的低分子量壳聚糖配制的siRNA复合物的粒度(小于100nm)意外地远比过去报道的脂质、PLL和高分子量壳聚糖(85％脱乙酰化)的粒度小[33，34]。这可能是因为基本完全脱乙酰化壳聚糖主链上较高的电荷密度。此外，低分子量壳聚糖的溶解度提高和粘度降低可能是因为siRNA复合物的粒度小[35]。与过去的报道相一致，siRNA-Luc与无关pDNA(pGFP)以单一基因包(package)形式共转染在体外293-Luc细胞中导致显著的萤光素酶沉默活性[17]。然而，我们发现当siRNA制剂不含pDNA时，基因沉默活性显著受损。因此，我们认为，pDNA，这种高负电荷密度大分子的存在显著促进siRNA通过改良的协同作用与各种聚阳离子形成复合物的效率。
我们还发现，较长的壳聚糖链的高电荷密度和/或较高的电荷比不仅将产生物理稳定的复合物，而且还能在体外获得最有效的基因沉默。我们的发现与过去报道的PAMAM树状聚合物的结果相一致，siRNA/树状聚合物复合物要得到较好的复合作用和基因沉默活性，就要求较高的代数(generation number)、较高的电荷比和较高的siRNA浓度(100nM)[18]。基于LF2000的制剂也推荐类似的高浓度siRNA。在本发明中，最有效的低分子量壳聚糖(线型DPn85)要求siRNA浓度低至44nM，以在293-Luc细胞中实现大于95％的萤光素酶基因表达沉默。
而且，在本研究的实验条件下，用长链线型低分子量壳聚糖配制的siRNA复合物在含10％血清的转染培养基中保留其萤光素酶沉默活性。沉默活性被保留最可能的原因是，与PEI和LF2000相反，这些复合物在这种相对较高的血清浓度中抗聚集，反映了增强的胶体稳定性。发现较短且支化的壳聚糖寡聚体具有较低的基因沉默活性，可能的原因是，电荷密度降低以及壳聚糖主链与siRNA之间电荷相互作用的空间位阻导致siRNA复合受损。
与报道的用高分子量壳聚糖配制的siRNA复合物的细胞毒性最小相一致，我们发现在该研究中，即使制剂中采用高siRNA浓度(150nM)，用DPn85低分子量壳聚糖转染后293-Luc细胞保留其胞内脱氢酶活性[33]。低分子量壳聚糖的细胞毒性远低于过去公开的PAMAM树状聚合物所得结果，PAMAM树状聚合物中利用50-100nM的siRNA浓度可导致细胞活力显著降低(60-50％)。
最后，与过去报道的PEI[17]相比，用线型低分子量壳聚糖配制的siRNA复合物起效较早且保留萤光素酶沉默活性。估计DPn85壳聚糖寡核苷酸动力学的改善是小的纳米级siRNA复合物的细胞摄取改善以及完整siRNA胞内持续释放的结果。
2.材料和方法
2.1.材料
含巨细胞病毒启动子和萤火虫萤光素酶(pLuc)或绿色荧光蛋白(pGFP)的GMP-级质粒(gWizTM)购自美国北达科他州法戈的爱德闻公司(Aldevron，Fargo，ND，USA)。脂质转染胺2000(LF2000)购自英杰公司(Invitrogen)。线型PEI；ExGen 500(分子量22kDa)购自德国弗莱蒙塔公司(Ferementas)。支化PEI(分子量25kDa)购自瑞典斯德哥尔摩的瑞典阿尔得里奇公司(AldrichSweden，Stockholm，Sweden)。
2.2.siRNA双链体
SEQ ID NO.1：siGL3(正义，5′-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3′；
SEQ ID NO.2：反义，5′-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3′)是靶向萤光素酶基因(siRNA-Luc)的未修饰的siRNA双链体，由瑞典兰德的医学探针公司(MedProbe，Lund，Sweden)定制[28]。
SEQ ID NO.3：错配siRNA；siCONTROL非靶向siRNA#1(siCON1；正义，5’-UAGCGACUAAACACAUCAAUU-3′；
SEQ ID NO.4：反义，5′-UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU-3′)由科罗拉多州拉斐特的DR有限公司(Dharmacon Research，Inc.，Lafayette，CO)定制。
2.3.低分子量壳聚糖
制备了各种链长的完全N-脱乙酰化(脱乙酰化程度＞99.8％；FA＜0.001)的线型和7％三糖取代的低分子量壳聚糖(支化壳聚糖)并根据所述进行表征[25，29]。全部采用数均聚合度(DPn)为34、50和85个单体单元的低分子量壳聚糖。用多角度激光散射的大小排阻色谱(SEC-MALLS)分析链长分布。
2.4.细胞
人胚肾细胞系HEK 293(293细胞)得自美国马里兰州罗克维尔(Rockville，MD，USA)的ATCC。表达萤火虫萤光素酶的稳定表达萤光素酶的HEK 293(293-Luc细胞)由芬兰库奥皮奥大学药学院的帕弗豪卡斯基博士(Dr.Paavo Honkakoski，Department of Pharmaceutics，University of Kuopio，Finland)赠送[30]。稳定表达萤光素酶的卵巢癌细胞系(SKOV-3-Luc)是由德国马尔堡菲利普大学药理与毒理学院的阿奇埃尼博士(Dr.Achim Aigner，Department of Pharmacology and Toxicology，Philipps-University Marburg，Germany)赠送[17]。所有细胞根据供应商的建议进行培养。
2.5.siRNA复合物的配制
将壳聚糖溶解在pH6.2的MilliQ无菌水中并进行除菌过滤而制备壳聚糖储备液(0.2毫克/毫升)。在涡旋混合机(Heidolph REAX 2000，4级，瑞典斯帕歌凯伯实验室(Kebo Lab，Spanga，Sweden))上剧烈搅拌的同时，依次将壳聚糖和siRNA储备液或siRNA/pDNA(在共转染的情况下)加入MilliQ无菌水中，配制壳聚糖复合物，如[25]所述。每微克pDNA或siRNA采用以下各种含量的壳聚糖来制备电荷比1∶1(+/-)的壳聚糖复合物：0.58微克线型壳聚糖，0.69微克被7％A-A-M取代的壳聚糖(支化壳聚糖)[25，27]。在涡旋混合机上剧烈搅拌的同时，将PEI溶液加入siRNA储备液或siRNA/pDNA(在共转染的情况下)中，制备PEI的siRNA复合物，如[31]所述。将该制剂在室温下静置约10分钟后进行转染。为形成LF2000复合物，在涡旋混合机上剧烈搅拌的同时将siRNA储备液或siRNA/pDNA(在共转染的情况下)加入壳聚糖溶液中。用转染介质OptiMEM I稀释siRNA和LF2000溶液。将LF2000复合物在室温下静置约30分钟后进行转染。根据基础试验，全部选择和使用电荷比15∶1(+/-)的PEI复合物和重量比2∶1(+/-)的LF2000复合物(数据未显示)。
2.6.凝胶阻滞试验
利用琼脂糖凝胶阻滞试验研究siRNA复合物的物理稳定性。采用40mM TAE缓冲液中配制的4％琼脂糖(
Figure A20078003434400121
琼脂糖，美国马萨诸塞州罗克兰的CBS罗克兰有限公司(Cambrex Bio Science Rockland，Inc.，Rockland，ME，USA)，如[25]所述。用1.5U RNA酶A(英国安碧公司(Ambion，UK))孵育30-90分钟后研究形成复合物的siRNA抵御酶降解的保护作用，如[18]所述。孵育后，用肝素(5毫克/毫升)使复合物解离，用琼脂糖阻滞试验检查siRNA的完整性。从储备液获得的siRNA作为对照。
2.7.壳聚糖多聚复合体(polyplex)的大小测定
复合物的大小采用纳米筛选仪ZS(英国马勒文的马勒文设备公司(Malvem Instruments，Malvern，UK)，通过光子相关光谱学进行测定，如[25]所述。用MilliQ水制备siRNA浓度为5微克/毫升的复合物。所有测量在25℃下进行。
2.8.体外传染试验
转染试验前24小时，将HEK 293(293，293-Luc)细胞和SKOV-3-Luc细胞接种到96-孔组织培养板(英国剑桥的科斯塔公司(Costar，Cambridge，UK))中，转染当天达到80-90％细胞汇合。在pH 7.4无血清培养基(OptiMEMI血清减少的培养基，瑞典戴比的吉布可/BRL生命科学AB(Gibco/BRL LifeTechnologies AB，Taby，Sweden))中或在10％血清(FBS)存在下进行转染。加入甘露醇实现等渗(300mOsm/kg)。用预热的OptiMEM洗涤细胞，并在各孔中加入50微升siRNA复合物制剂。在共转染实验中，每孔中加入0.33微克pDNA(pLuc或pGFP)。所有体外实验中包括错配(对照)siRNA。5小时孵育后，去除制剂，加入0.2毫升新鲜培养液。对于超过两天的实验，每个第二天更换培养液。在转染后24-120小时的预定时间点，用预热的PBS(pH7.4)洗涤细胞，并用萤光素酶裂解缓冲液(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega，Madison，WI))裂解细胞。然后用发光计(澳大利亚维也纳的米迪塔公司(Mediators PhL，Vienna，Austria))测定萤光素酶基因表达。由萤火虫萤光素酶(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St Louis，MO))制备的标准曲线确定萤光素酶的表达量。
2.9.胞内脱氢酶活性(MTT方法)
通过MTT方法评价各种siRNA制剂在293-Luc细胞中对胞内脱氢酶活性的影响(细胞毒性的衡量)，如[32]所述。简言之，如上所述转染293-Luc细胞。转染5小时后，加入用磷酸盐缓冲盐水(PBS)配制的MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓)(德国迪森豪夫的西格玛公司(Sigma，Deisenhofen，Germany))溶液。4小时后，加入100微升酸-异丙醇(配制的0.04M盐酸)溶解甲
Figure A20078003434400131
结晶。采用读板仪(澳大利亚格劳迪的TA有限公司(TECAN Satire2，Tecan Austria GmbH，Grodig，Austria))测定570nm的吸光度，在690nm进行背景校正。设备将以相同方式处理的培养基的吸光度设定为0。处理细胞的胞内脱氢酶活性与对照(未处理)细胞相关联，并由以下方程进行计算：
％相对胞内脱氢酶活性＝[A(试验)*100/A(对照)]，
其中A(试验)和A(对照)分别是处理细胞和对照细胞的吸光度值。在另一设定条件下，转染后使细胞在培养基中生长24小时。然后，用MTT试剂处理细胞以检测各种制剂的延迟毒性。
2.10.数据分析
试验利用一式四份样品进行至少两次。所有数据表示为平均值±标准偏差。用ANOVA分析平均值之间的统计学差异。p＜0.05时认为组间均值间差异显著。
物理稳定性和酶保护作用
我们首次在凝胶阻滞试验中研究了各种链长的线型和支化壳聚糖寡聚体与siRNA形成稳定复合物的能力。只有用较高电荷比的较长的线型寡核苷酸配制的复合物才能在pH8.0保留siRNA，该pH是电泳缓冲液常用的pH(图1A)。数均聚合度(DPn)为85个单体单元(DPn85)的线型低分子量壳聚糖在所有检测的电荷比下提供的物理稳定性最高。相反，当凝胶缓冲液的pH降至7.4时，所有检测的低分子量壳聚糖能够与siRNA形成稳定的复合物。在升高的pH值下支化或较短的壳聚糖寡聚体的siRNA制剂的物理稳定性降低提示，为形成与过去优化的用低分子量壳聚糖配制的pDNA复合物相比物理稳定的复合物，要求较高的聚阳离子电荷密度和较强的siRNA相互作用[25，27]。
由于酶降解可能是基因沉默活性的限制性因素，我们也研究了选定低分子量壳聚糖保护siRNA免于RNA酶A酶降解的能力(孵育时间采用30-90分钟)。
根据基因递送的要求，与裸siRNA相比，所有检测的低分子量壳聚糖以及阳性对照(PEI和LF2000)提供对抗酶降解的保护作用，而裸siRNA被RNA酶A完全降解(图1B)。需要与肝素进行较长的孵育时间(2小时)以破坏用线型DPn85和LF2000配制的复合物，反映出与其他检测的聚阳离子相比物理稳定性提高(数据未示出)。
粒度
由于siRNA制剂的粒度可大大影响其组织分布和细胞摄取，因此我们研究了用低分子量壳聚糖配制的siRNA的粒度。表1显示，低分子量壳聚糖与siRNA自组装形成纳米化粒子(34-86nm)。所得粒子的粒度取决于组分的+/-电荷比。虽然在最低电荷比10∶1(+/-)的情况下得到小粒度(34-46nm)，使用较高电荷比导致相对较大的粒度(61-86nm)。粒度通过光子相关光谱学进行测定。
表1
  A/P 10   A/P 30   A/P 60
  DPn18   38.1±1.2   54.5±0.1   62.5±3.7
  DPn34   37.7±0.5   53.1±0.9   68.2±3.0
  DPn50   34.0±0.5   51.7±1.2   63.6±1.1
  DPn85   37.4±1.1   51.6±3.3   61.0±2.5
  DPn34-AAM-7％   38.5±0.8   50.8±0.4   68.9±2.7
  DPn85-AAM-7％   46.0±2.5   69.9±1.7   86.1±2.9
比较共转染和稳定表达靶标的沉默
由于在大多数体外试验中，siRNA分子与其pDNA靶标同时递送(共转染)，我们利用错配(非沉默)siRNA作为对照，首次检测了低分子量壳聚糖递送编码萤火虫萤光素酶报告序列的pDNA(pLuc)与靶向相同报告序列的siRNA(siRNA-Luc)的基因包的效率。在pDNA剂量、我们实验室中为pDNA递送而优化的最有效低分子量壳聚糖和电荷比的优化转染条件下[27]，在293细胞(不表达萤光素酶报告序列)中进行转染。通过支化DPn34壳聚糖寡聚体或LF2000递送的siRNA-Luc导致与对照制剂(仅pLuc)相比，萤光素酶表达显著敲减(图2A)。对于两种递送系统，均未观察到错配siRNA显著抑制萤光素酶表达。
然而，当在相同条件下siRNA-Luc改为仅由选定聚阳离子递送至稳定表达萤光素酶的293-Luc细胞(与基因沉默应用较相关的情况)时，所得萤光素酶沉默活性非常低，要实现萤光素酶表达的显著性沉默要求较高的siRNA浓度(图2B)。
为研究共转染技术是否会影响293-Luc细胞中的基因沉默活性，将无关质粒(pGFP)掺入上述检测的相同siRNA-Luc制剂中。与293细胞所得结果类似，支化壳聚糖寡聚体、PEI和LF2000以最低siRNA浓度(1-30纳克/孔，相当于1.5-40纳摩尔/孔)介导显著的萤光素酶表达敲减(40-85％)(图2C)。在siRNA制剂中掺入pDNA(共转染)对基因沉默活性有正面作用。这些结果提示，用于siRNA递送的制剂要求与pDNA不同，为在体外通过聚阳离子成功递送siRNA需要表征重要的参数。
低分子量壳聚糖的结构变化和配方参数对基因沉默活性的影响
a)链长、主链支化程度和电荷比
为了检查壳聚糖结构和配方参数对低分子量壳聚糖递送siRNA的影响，我们首先测试了链长、支化程度和电荷比对siRNA复合物在293-Luc细胞中体外介导萤光素酶表达沉默的影响。对于线型壳聚糖，链长大于34个单体单元的壳聚糖介导不依赖电荷比的显著萤光素酶沉默(图3A)。用支化壳聚糖寡聚体配制的复合物介导萤光素酶沉默同时取决于电荷比和链长(图3B)。对于较长的支化壳聚糖寡聚体，较高的电荷比可弥补壳聚糖主链支化(取代)的负面作用。这些结果强调，低分子量壳聚糖的高电荷密度不仅能够产生物理稳定的复合物，而且能够提供在体外有效的siRNA制剂。
b)线型低分子量壳聚糖的siRNA浓度和相对效率
下一步，在293-Luc细胞中研究siRNA浓度对用各种线型低分子量壳聚糖(以恒定的电荷比)配制的复合物的萤光素酶沉默活性的影响。对于最低siRNA浓度(15-50纳克/孔，相当于22-73纳摩尔/孔)，线型DPn85复合物将萤光素酶表达相对于对照未处理细胞敲减72-95％而显示最高效能(图4)。当siRNA浓度从70增加至300纳克/孔(103-440纳摩尔/孔)时，除DPn18之外，所测试的线型壳聚糖复合物显示相当的萤光素酶沉默曲线。用线型、较长链低分子量壳聚糖配制的复合物的效能较高支持siRNA制剂的物理稳定性在实现最高基因沉默活性中有作用。
血清存在下的体外转染
我们还研究了转染介质中的血清对各种siRNA制剂效率的影响。在10％血清的存在下，用DP值为34-85个单体单元的线型壳聚糖及支化DPn85壳聚糖寡聚体配制的siRNA复合物在293-Luc细胞中保留其基因沉默活性(图5)。)。相反，用PEI和LF2000配制的siRNA复合物的基因沉默活性受损。效率受损一种可能的原因是转染期间粒子聚集。
体外细胞毒性
为确保较高的萤光素酶沉默效率不是细胞毒性升高的结果，我们采用MTT方法研究了用相对较高浓度的siRNA(150纳摩尔)配制的各种聚阳离子复合物对细胞形态和胞内脱氢酶活性的影响。转染5小时后，未观察到用线型DPn85配制的siRNA复合物对细胞形态和胞内脱氢酶活性(细胞毒性的衡量)有影响(图6)。相反，用PEI和LF2000观察到显著的毒性影响，其中线型PEI毒性最高。虽然用LF2000复合物处理的细胞在24小时后恢复其胞内脱氢酶活性，但用PEI处理的细胞显示24小时后脱氢酶活性的进一步降低。这些结果表明，即使使用较高浓度的siRNA，线型DPn85低分子量壳聚糖的急性细胞毒性亦低于PEI和LF2000。
siRNA体外动力学
最后，研究了将siRNA-Luc递送至293-Luc细胞后萤光素酶沉默的时程。测试了DP值为34-85个单体单元的低分子量壳聚糖、PEI和LF2000。不包括DPn18壳聚糖，因为它不如长链壳聚糖有效(图4)。用线型DPn85配制的siRNA复合物介导萤光素酶沉默起效早，1天后检测到显著作用(70％)，2天后达到最大(92％)(图7A)。基因沉默活性持续5天，提示完整siRNA胞内稳定释放。支化壳聚糖寡聚体的萤光素酶沉默动力学效率不如线型寡聚体(图7B)。LF2000和PEI的基因沉默作用比低分子量壳聚糖介导的作用低(图7C)。在另一种细胞系SKOV-3-Luc细胞中，萤光素酶沉默动力学给出类似于293-Luc细胞的结果(图7D)。
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[35]Janes KA，Calvo P，Alonso MJ，用作大分子递送系统的多糖胶体颗粒(Polysaccharaide colloidal particles as delivery systems formacromolecules).Adv Drug Deliver Rev.47(1)(2001)83-97。

Claims (19)

1.一种组合物，其包含以下成分的复合物：
(a)聚合度(DPn)为30-300的低分子量壳聚糖，其中所述低分子量壳聚糖的脱乙酰化程度大于90％；和
(b)寡核苷酸。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述低分子量壳聚糖是利用化学或酶方法由高分子量壳聚糖获得的。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述低分子量壳聚糖的脱乙酰化程度大于95％。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述低分子量壳聚糖的脱乙酰化程度大于99％。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物基本上具有净正电荷比。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，用寻靶配基和稳定剂衍生所述低分子量壳聚糖。
7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸包含引入宿主细胞时表达其功能的沉默序列。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述寡核苷酸选自：RNA分子、反义分子、核酶和微小RNA。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物的pH范围为3.5-8.0。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物的pH范围为7.1-7.6。
11.一种制备如权利要求1所述组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使低分子量壳聚糖与水性溶剂相接触；
(b)在水性溶剂中混合步骤(a)的水性溶液与寡核苷酸；和
(c)维持组合物的pH为3.5-8.0。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包括降低步骤(b)产生的产物溶液的体积以得到所需的组合物浓度。
13.将核酸给予哺乳动物的方法，所述方法包括将如权利要求1所述的组合物引入哺乳动物。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，通过肺部、鼻腔、口服、眼睛、含服、舌下、局部、直肠或阴道途径给予粘膜组织而将所述组合物引入哺乳动物体内。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，通过静脉内、肌内、真皮内、颅内、椎管内、皮下或心内的胃肠外途径给予粘膜下组织，或给予内脏器官、血管或外科手术期间暴露的其他体表或体腔而将所述组合物引入哺乳动物。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述组合物是能够在至少一种哺乳动物细胞中表达其功能的寡核苷酸。
17.一种使用如权利要求1所述组合物的方法，所述方法包括制造用于预防性或治疗性治疗哺乳动物的药物，所述药物包含如权利要求1所述的组合物。
18.一种使用如权利要求1所述组合物作为诊断试剂的方法，所述方法包括在体内或体外诊断方法中使用。
19.如权利要求17所述的组合物在制造用于预防性或治疗性治疗恶性肿瘤、自身免疫病、遗传病症、病原感染和其他病理疾病的基因治疗、反义治疗或遗传疫苗接种中使用的药物中的应用，所述应用包括通过以下给药途径给予将所述组合物引入哺乳动物体内：
a)通过肺部、鼻腔、口服、眼睛、含服、舌下、直肠或阴道途径给予粘膜组织，
b)通过静脉内、肌内、真皮内、颅内、椎管内、皮下或心内给予的胃肠外途径给予粘膜下组织，
c)给予内脏、血管或外科手术期间暴露的其他体表或体腔。
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