CN103255174A - 以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物及三元复合物的液体与应用 - Google Patents

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CN103255174A CN2013101579801A CN201310157980A CN103255174A CN 103255174 A CN103255174 A CN 103255174A CN 2013101579801 A CN2013101579801 A CN 2013101579801A CN 201310157980 A CN201310157980 A CN 201310157980A CN 103255174 A CN103255174 A CN 103255174A
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本发明提供了一种以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物及三元复合物的液体与应用，该三元复合物含有A物质，B物质和D物质，A物质为带有正电荷的载体，B物质为带有负电荷的核酸，D物质为透明质酸与聚乙二醇形成的接枝共聚物。还提供了含有该三元复合物的液体，A物质的水溶液与B物质的水溶液混合，并将所得的混合物与D物质的水溶液混合，形成粒径在20-400纳米的三元复合物的水分散液。本发明提供的三元复合物和含有三元复合物的液体能够兼具低毒和高转染效率。因此，能够广泛的用于细胞转染、疾病的预防、诊断和基因治疗中。

Description

以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物及三元复合物的液体与应用
技术领域
本发明涉及一种以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物，一种含有该三元复合物的液体，以及该三元复合物与含有该三元复合物的液体的应用。 
背景技术
基因治疗在癌症治疗、病毒感染和心血管疾病的治疗上具有很好的应用前景。合成的阳离子聚合物作为基因的非病毒载体得到了广泛的关注，如聚乙烯亚胺（PEI）、聚赖氨酸（PLL）、聚酰胺-胺型树枝状聚合物（PAMAM）、聚二甲胺基丙烯酸乙酯（PDMAEMA）等阳离子聚合物或含有这些阳离子聚合物链的共聚物以及表面带有正电荷的纳米金颗粒、纳米硅胶颗粒，通过静电相互作用与带负电荷核酸形成复合纳米粒子。上述阳离子聚合物或纳米粒与DNA或siRNA形成复合纳米粒子虽然可以促进基因的转染效果，但存在复合物表面正电性太强导致的毒性较大、体内运转时间短等问题。本实验室之前的研究表明通过加入聚乙二醇修饰的聚阴离子（如聚谷氨酸）中和复合纳米粒子表面过多的正电荷，形成的三元复合物(CN201010557300.1)可以有效提高生物相容性、降低纳米复合体系的毒性，延长纳米粒子在体内的循环时间等，但同时也导致纳米复合体系的细胞转染效率大大下降。 
本发明在前期研究基础上进一步对三元复合物进行结构优化，有效克服了第三元复合导致的转染效率下降的问题。即利用聚乙二醇接枝的透明质酸作为外层中和复合纳米粒表面多于的正电荷，同时结合透明质酸对肿瘤细胞上的CD44受体的靶向作用以及肿瘤组织内高浓度的透明质酸酶对透明质酸的降解作用，有效提高了肿瘤细胞的内吞和体内外转染效率。 
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种兼具低毒和高转染效率的三元复合物及其液体及应用。 
一种以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物，该三元复合物含有A物质，B物质和D物质，A物质为带有正电荷的载体，B物质为带有负电荷的核酸，D物质为聚乙二醇接枝的透明质酸。 
所述的三元复合物是A物质与B物质在水溶液中通过静电相互作用复合形成正电性的二元复合物，再与D在水溶液中通过静电相互作用在外层复合上第三元，形成三元复合物。复合过程与结构示意如S1和S2。 
Figure BDA00003136656700021
本发明中，聚乙二醇接枝的透明质酸，透明质酸为主链，聚乙二醇为侧链，接枝率为2-20%；其中，所述接枝率沿用本领域常规的定义，接枝率即接枝效率，接枝率为接枝共聚物中聚乙二醇侧链摩尔数占透明质酸上的羧基摩尔数的百分比。 
本发明中，透明质酸的数均分子量5000-1000000，聚乙二醇的数均分子量为800-10000。 
所述的三元复合物中，A物质中的氨基摩尔数N、B物质核酸中的核苷酸的摩尔数P与D物质中的羧基摩尔数C的比值(简称为N/P/C)为2-20:1:1-20；所述A物质带有的正电荷、B物质带有的负电荷与D物质带有的负电荷使得三元复合物的Zeta电位为-25mV到15mV；所述的三元复合物的粒径为20-400纳米。 
所述的氨基基团的纳米颗粒为直径10-200纳米的带氨基基团的金纳米颗粒、或10-200纳米的硅胶纳米颗粒、或直径10-600纳米的两亲性阳离子聚合物纳米粒，所述的两亲性阳离子聚合物是疏水性聚合物与聚阳离子形成的嵌段或接枝共聚物。 
所述的带有氨基基团的阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、聚β-氨基酯、壳聚糖、壳聚糖季铵盐、含有式（1）所示结构单元的聚合物、聚酰胺-胺型树枝状聚合物中的一种或多种或它们的共聚物；阳离子聚合物的数均分子量为2000-100000。 
Figure BDA00003136656700022
其中，R1为H或C1-C4的烷基，R2为C1-C4的亚烷基，R3和R4各自独立地为C1-C4的烷基。C1-C4代表含有1-4个碳原子。 
所述的两亲性阳离子聚合物是阳离子聚合物为侧链接枝到疏水性聚合物主链上形成的两亲性阳离子接枝共聚物；主链数均分子量2000-30000，侧链数均分子量300-15000，每个 大分子主链上接枝的侧链数为2-50。 
所述的两亲性阳离子梳型接枝共聚物是由含溴官能团的聚酯为大分子引发剂引发阳离子烯类单体聚合，或引发阳离子烯类单体与其它非阳离子烯类单体聚合制备的；其中，含溴官能团的聚酯选自γ-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)-己内酯（BMPC）与内酯的共聚物、BMPC与交酯的共聚物中的一种或多种；其中，所述内酯为β-羟基丁酯、β-羟基戊酯、1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮和己内酯中的一种或多种，所述交酯为乙交酯和/或丙交酯。 
所述的阳离子烯类单体聚合为式（2）所示结构的单体中的一种或多种；所述的非阳离子烯类单体选自丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、乙烯基吡咯烷酮、两性单体羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯、酯基含有1～18个碳原子的(甲基)丙烯酸酯、苯乙烯、醋酸乙烯； 
Figure BDA00003136656700031
其中，R1为H或C1-C4的烷基，R2为C1-C4的亚烷基，R3和R4各自独立地为H或C1-C4的烷基。 
所述聚乙二醇为一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇，所述靶向性物质为叶酸、甘露糖、半乳糖、具有导向作用的短肽和适配子中的一种或多种。 
本发明还涉及到一种含有以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物的液体，是由所述的三元复合物中的一种或多种和水组成，制备方法是：使A物质的水溶液与B物质的水溶液混合，并将所得的混合物与D物质的水溶液混合，形成粒径在20-400纳米的三元复合物的水分散液。 
本发明还涉及到：以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物以及含有该三元复合物的液体的应用，三元复合物和含有三元复合物的液体能够兼具低毒和高转染效率。在细胞转染、疾病的预防、诊断和基因治疗中的应用，以及在制备细胞转染试剂、制备疾病的预防、诊断或基因治疗的药物中的应用。 
附图说明
图1为本发明实施方式中P10-P14及对比例NP-D(10/1)的凝胶电泳。 
图2为本发明一种实施方式中P11透射电镜照片。 
图3为本发明实施方式中P2，P5，P10-P12以及对比例NP-D-PGgP的HepG2细胞转染效率柱状图。 
图4为本发明P21，P27和P36的基因沉默效率柱状图。 
图5为本发明中P10-P12以及对比例NP-D、NP-D-PGgP的HepG2细胞毒性柱状图。 
具体实施方式
本发明提供的以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物，所述A物质带有的正电 荷由所述带有正电荷的基团Z提供，并且基团Z中的至少一部分与氢离子结合，形成了所述带有正电荷的基团，进一步优选基团Z为氨基，具体地，本发明中所述基团Z优选为伯氨基、仲氨基和叔氨基中的一种或多种，进一步优选为叔氨基；B物质带有的负电荷由核酸中的磷酸二酯键失去至少部分氢离子后得到的基团提供，其中，磷酸二酯键为本领域公知的概念，即：一种化学基团，指一分子磷酸与两分子醇（羟基）酯化形成的两个酯键，在水溶液中，至少部分磷酸上羟基的氢原子会解离，从而使核酸带有负电荷；D物质带有的负电荷由所述共聚物中的羧基失去至少部分氢离子后得到的基团提供，所述羧基为透明质酸上没有用于键合的羧基，在水溶液中，至少部分所述羧基能够电离，从而使D物质带有负电荷。需要明确的是，本发明中所述共聚物中羧基的摩尔数指呈电离状态的羧基的摩尔数与没有呈电离状态的羧基的摩尔数之和。 
根据本发明，所述基团Z的摩尔数（记为N）、核酸中的核苷酸的摩尔数（记为P）与所述透明质酸中羧基的摩尔数（记为C）的比例，简称为N/P/C值，可以在较大的范围内变化，为了获得更好的细胞转染效率并兼顾细胞相容性（即降低细胞毒性），所述N/P/C值优选为2-20:1:1-20，进一步优选5-20/1/5-15，并且，在优选条件下，所述A物质带有的正电荷、B物质带有的负电荷与D物质带有的负电荷使得三元复合物的Zeta电位为-25mV到10mV。 
此外，本发明中所述阳离子聚合物还包括目前商品化的各种带有阳离子的转染试剂，如Transfectam试剂等，这里需要特别说明的是，本发明中，利用商购的阳离子脂质体和Transfectam试剂制备三元复合物的过程，所述阳离子脂质体和Transfectam试剂均按照商购的试剂盒中的操作规程，根据所带有的N原子或正电荷的数目，得到满足一定N/P/C值的三元复合物。 
根据本发明，所述带有正电荷的纳米颗粒可以为本领域各种能够在溶液中形成带有正电荷基团的纳米颗粒，如带有正电荷的金纳米颗粒和/或带有正电荷的硅胶纳米颗粒，当为金纳米颗粒和/或带有正电荷的硅胶纳米颗粒时，优选颗粒直径为10-200纳米。 
根据本发明，所述阳离子聚合物的数均分子量可以在较大范围内变化，优选地，所述阳离子聚合物的数均分子量为1000-150000KDa，进一步优选地，所述阳离子聚合物的数均分子量为5000-100000KDa。 
本发明中，阳离子聚合物沿用本领域的常规定义，指链上有阳离子基团的聚合物。常用的阳离子聚合物包括聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚脒、聚乙烯胺、阳离子聚丙烯酰胺等。 
根据本发明，所述阳离子聚合物作为核酸转染细胞的载体，所述阳离子聚合物可以为本领域各种能够作为细胞转染用载体的阳离子聚合物，优选地，所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、阳离子脂质体、聚β-氨基酯、壳聚糖、壳聚糖季铵盐、含有式（1）所示结构单元的聚合物、聚酰胺-胺型树枝状聚合物中的一种或多种。 
根据本发明，A组分优选为两亲性阳离子共聚物的自组装形成的表面正电荷的纳米粒，包括两亲性阳离子嵌段或梳形接枝共聚物，进一步优选为两亲性阳离子梳形接枝共聚物，可以为多种含有疏水性主链和亲水性聚阳离子侧链的两亲性阳离子梳形共聚物，本发明对所述两亲性阳离子梳形共聚物的制备方法没有特别的限定，优选地，所述两亲性阳离子梳形共聚 物是在原子转移自由基聚合反应条件下，将含溴官能团的聚酯与至少一个末端为烯键的物质接触得到的，所述含溴官能团的聚酯与至少一个末端为烯键的物质的摩尔比可以为本领域常规的比例，优选地，所述含溴官能团的聚酯与至少一个末端为烯键的物质的摩尔比为1:1-100，进一步优选为1:30-70。 
其中，所述至少一个末端为烯键的物质为具有式（2）所示结构的单体、含有式（1）所示结构单元的聚合物和聚乙烯亚胺中的一种或多种，即所述含溴官能团的聚酯可以与单体进行反应也可以与聚合物进行反应。 
根据本发明，所述含溴官能团的聚酯可以为本领域各种能够作为原子转移自由基聚合反应的引发剂的大分子聚酯，本发明中，所述含溴官能团的聚酯优选为γ-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)-己内酯（BMPC）的均聚物或BMPC与其它反应性单体的共聚物，优选可生物降解的共聚物，进一步优选BMPC与内酯的共聚物和BMPC与交酯的共聚物中的一种或多种，其中，所述内酯优选为β-羟基丁酯、β-羟基戊酯、1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮（TOSUO），所述交酯为乙交酯和/或丙交酯。 
根据本发明，所述两亲性阳离子共聚物在制备三元复合物的过程中，要先经过一个将其制备成为纳米颗粒的过程，由于两亲性阳离子共聚物带有亲水性和疏水性链，因此，将其溶于有机溶剂后，再缓慢滴加到水相体系中，待有机溶剂挥发完全后，即可得到具有疏水性内核和亲水性阳离子外壳的纳米颗粒。为了使配制好的两亲性阳离子共聚物能够更稳定的保存，优选将配制好的聚合物溶液用0.22微米的Millipore无菌膜过滤除菌后放于4℃保存备用。需要特别明确的是，由于两亲性梳形接枝共聚物与其他阳离子聚合物都属于聚合物类，而且需要一定的处理步骤才会成为颗粒状，因此，在本申请中仍将其划分为阳离子聚合物的类别中。此外，由于预先形成了颗粒状，能够对其颗粒的直径进行测定，因此，本申请中所述带有正电荷的纳米颗粒的颗粒直径范围包括两亲性阳离子共聚物所形成的纳米颗粒的颗粒直径。 
根据本发明，所述原子转移自由基聚合反应的条件为本领域技术人员公知，如氮气保护下，聚合温度为30-70℃，聚合时间为10-18小时。 
根据本发明，所述核酸可以为任何长度的核酸，所述核酸为本领域公知的概念，由核苷酸单体聚合而成，包括：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。本发明中所述核酸可以为寡聚核苷酸和/或多聚核苷酸，优选的所述核酸的分子量为1×103-1×108，进一步优选为5×103-1×107。根据本发明的实质，本领域技术人员可以预测，一些含有非天然碱基的核酸以及经过各种修饰的核酸，只要结构中含有至少部分解离形成负电荷的磷酸二酯键和/或其他能够在水溶液中电离形成负电荷的基团并能与Y组分通过静电相互作用结合都可以实现本发明。因此，本发明中的核酸并不局限于由天然碱基形成的核酸。 
另外，所述三元复合物中的D物质，即聚乙二醇接枝的透明质酸，其中聚乙二醇侧链可采用不同制备方法通过不同化学键或结构单元键接到透明质酸上，如酯键、二硫键、酰胺键、腙键等。聚乙二醇接枝的透明质酸的接枝率为2-20%，进一步优选为5-15%。其中，所述透明质酸主链的数均分子量优选为5000-1000000，进一步优选为5000-300000，最优选为10000-100000；每个聚乙二醇侧链的数均分子量优选为200-30000，进一步优选为800-10000， 最优选为2000-5000。 
根据本发明，所述一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇为一个末端被靶向性物质修饰了的聚乙二醇，所述靶向性沿用本领域常规的定义，是指把治疗作用、药物效应等限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响其他正常的细胞、组织或器官的功能，所述靶向性物质可以通过例如共价键与具有治疗作用、药物效应或具备其他功能的组分连接，从而实现将所连接的组分限定在特定的靶细胞、组织或器官内，所述靶向性基团即靶向性物质连接到所述组分上所形成的基团。所述连接的方式可以为各种能够实现上述目的方式，只要满足所述靶向性物质形成的靶向性基团不影响被连接的组分的生物活性，被连接的组分也不影响靶向性基团的定位功能，同时，靶向性基团与被连接的组分在制备和使用过程中能够以稳定的形式结合在一起即可，因此，不同的靶向性物质可以根据各自的结构特征选择用不同的方式将其与所述具有治疗作用或药物效应的组分连接，目前，由于靶向性基团在科研和临床中的广泛应用，很多带有常规的靶向性基团的化合物已经实现了商品化，如本发明中使用的各种一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇，就是通过商购得到的。这些商品化的带有靶向性基团的化合物可以满足上述对带有靶向性基团的化合物的要求。 
由靶向性的定义可以看出，所述靶向性物质的选择取决于作为靶点的细胞、组织或器官，目前，已经研究出多种针对不同的细胞、组织和器官具有靶向性作用的物质，包括小分子化合物，具有导向作用的短肽，如特异性靶向内皮细胞的RGD短肽（精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸），适配子等，所述适配子沿用本领域公知的定义，即通过配体指数级富集系统进化（SELEX）技术得到的对于特定的细胞、蛋白、核酸或小分子等靶点具有高特异性结合能力的寡聚核苷酸。 
根据本发明，所述靶向性物质可以为上述任何一种靶向性物质，优选地，所述靶向性物质为叶酸、甘露糖、半乳糖、具有导向作用的短肽和适配子中的一种或多种。尽管如此，根据本发明的发明实质，本领域技术人员可以确定，任何对特定的靶点（如器官、组织、细胞等）具备靶向能力的靶向性物质都可以应用于本发明，本发明并不局限于上述的靶向性物质。 
本发明提供一种含有以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物的液体，其特征在于，该含有三元复合物的液体含有水和上述三元复合物。优选地，所述三元复合物中还含有其他离子，如磷酸缓冲液中各种形式的磷酸根离子，碱金属离子等，且所述含有三元复合物的液体的pH值为5.0-9，优选为6.0-7.4，进一步优选为7.2-7.4。 
本发明对所述含有三元复合物的液体中三元复合物的浓度没有特别的限定，在以细胞转染为目的应用中，优选地，以满足细胞转染需要的最低浓度为下限，以特定体积液体中所能容纳的三元复合物的总量为上限，进一步优选地，所述含有三元复合物的液体中三元复合物的浓度为0.001-4.0克/升，进一步优选为0.01-3克/升，最优选为0.02-1克/升；在用于细胞转染实验时，由于所需核酸的量较低，可以直接制备较低浓度的含有三元复合物的液体，也可以将制备好的含有三元复合物的液体进行稀释，以核酸的浓度为标准，所述含有三元复合物的液体的浓度优选为0.001-0.25毫克核酸/毫升，进一步优选为0.005-0.1毫克核酸/毫升。在上述各组分的优选条件下，所述含有三元复合物的液体中的三元复合物为颗粒状且平均颗粒 直径为20-500纳米，进一步优选为50-400纳米，最优选为50-300纳米。 
本发明提供了一种含有三元复合物的液体的制备方法，其特征在于，该方法包括使A物质的水溶液与B物质的水溶液混合，并将所得的混合物与D物质的水溶液混合；所述A物质、B物质和D物质的水溶液中各种物质的浓度可以在很大范围内变化，制备过程中对各种物质浓度的选择取决于所需最终产物的浓度，在本发明中，所述A物质的水溶液中A物质的浓度为0.001-2克/升，进一步优选为0.005-1克/升，最优选为0.01-0.5克/升；所述B物质的水溶液中B物质的浓度为0.001-1克/升，进一步优选为0.005-0.1，最优选为0.01-0.04克/升；D物质的水溶液中D物质的浓度为0.001-1克/升，进一步优选为0.01-0.5克/升，最优选为0.02-0.3克/升。 
所述混合的条件为常规的混合条件，温度和时间都可以在很大范围内变化，两次混合的温度和时间可以相同或不同，优选为相同，所述温度例如可以为4℃-50℃，优选为15℃-40℃，时间可以为5分钟以上，考虑到节约时间与混合效果的平衡，优选混合的时间为10分钟-60分钟，进一步优选为15-30分钟。 
本发明提供的三元复合物和含有三元复合物的液体作为一种核酸传递方式，与其他的载体或传递方式同样的能够在细胞转染、疾病的预防、诊断和基因治疗中应用。同时，也能够在制备细胞转染试剂，制备疾病的预防、诊断或基因治疗的药物中应用。如通过向机体细胞中转染本发明的三元复合物和/或含有三元复合物的液体，所述三元复合物中的核酸与要检测的从机体分化分离出的遗传信息存在特异性的结合，从而能够鉴定疾病病因和种类，特别是对那些只有一个基因异常引起的疾病，检测出基因缺陷或异常就可获得最终诊断，因此可以在制备疾病的诊断药物中得以应用。由于本发明中的三元复合物和/或含有三元复合物的液体能够有效的递送DNA和siRNA，因此，还可以用于制备基因治疗药物。并且，由于本发明中的三元复合物和/或含有三元复合物的溶液兼具低毒性和高转染效率，因此，相比现有技术的载体和方法，能够更好的应用于上述各种领域之中。 
下面，通过实施例对本发明的内容进行更详细的描述。 
检测和计算方法： 
1、琼脂糖凝胶延滞实验，用于证明三元复合物中核酸的负载 
将制备得到的5μL含有三元复合物的液体（浓度为1μg/50μL）和1μL的5×核酸上样缓冲液充分混合，然后用0.8重量%的琼脂糖（含0.5μg/mL溴化乙锭）凝胶电泳进行检测，电压120V，电泳时间为40分钟，在紫外下观察DNA电泳图谱并照相。 
2、粒径及Zeta电位测定 
三元复合物粒径、纳米颗粒的粒径和Zeta电位测量所用仪器为美国Brookhaven公司BI90Plus/Zetaplus型激光粒度仪，测量温度为25℃，角度为90°，入射光波长为618nm。 
3、透射电镜（TEM）实验，用于检测三元复合物的粒子形态 
所用透射电镜为荷兰JEM-100CXⅡ型透射电镜。首先将铜网浸入待测样品溶液中，然后用0.1重量%磷钨酸溶液进行染色，大约3分钟后，将多余液体用滤纸滤去，于室温下晾干。然后 用透射电镜观察，并拍摄体系中粒子的形态。 
4、核磁共振谱仪检测，用于确定接枝共聚物的接枝率。所用核磁共振谱仪为Bruker400M核磁共振谱仪。 
5、体外转染实验 
（1）在24孔板中接种5×104个293T细胞（或HeLa细胞）/孔，DMEM培养基体积为0.5mL，培养过夜； 
（2）在转染前，将培养基换成无血清无抗生素的DMEM，每孔0.5mL； 
（3）将0.1毫升浓度为0.01毫克DNA/毫升的含有三元复合物的液体加入24孔板中； 
（4）在37℃及5体积%CO2浓度下培养4小时，然后将孔中液体吸出，换为含2重量%的FBS（Gibico）的DMEM维持培养液（Gibico），培养液体积为0.5mL/孔； 
（5）在37℃的5体积%CO2培养箱（Thermo Scientific Heraeus,HERAcell150）中继续培养48小时后进行流式检测（BD FACSAria，美国BD公司），并根据各孔的数值做出柱状图（Origin6.0软件）。 
其中，EGFP-N1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 
6、细胞毒性检测 
利用MTT法（四唑盐比色法）对三元复合物的细胞毒性进行检测，具体方法如下： 
（1）在96孔板中接种1×104个HeLa细胞/孔，每孔培养基体积为100μL，在5体积%CO2，37℃条件下孵育过夜。 
（2）加入0.02毫升浓度为0.01毫克DNA/毫升的含有三元复合物的液体，同时设置调零孔（培养液、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、与含有三元复合物的液体体积相同的pH值为7.4的PBS、培养液、MTT、二甲基亚砜），在5体积%CO2，37℃条件下孵育48小时。 
（3）每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），继续在5体积%CO2，37℃条件下孵育4小时。 
（4）小心弃去孔内上清培养液，每孔加入100μL二甲基亚砜，置低速振荡仪上振荡10分钟，使结晶物充分溶解。在连续光谱多功能酶标仪（TECAN Infinite200）490nm处测量各孔的吸光值。 
（5）计算各个样品孔细胞相对活力，将各孔吸光值减去调零孔吸光值，得到修正后吸光值OD490’。计算对照孔修正后吸光值的平均值avg(OD490C’)，并根据各孔的吸光值的平均值做出柱状图。 
7、siRNA干扰实验步骤 
（1）在24孔板中接种5×104个HeLa-Luc细胞/孔，DMEM培养基体积为0.5mL，培养过夜； 
（2）在转染前，将培养基换成无血清无抗生素的DMEM，每孔0.5mL； 
（3）将0.1毫升浓度为0.01毫克siRNA/毫升的含有三元复合物的液体加入24孔板中； 
（4）在37℃及5体积%CO2浓度下培养4小时后将孔中液体吸出，换为含2重量%的FBS的DMEM维持培养液，培养液体积为0.5mL/孔； 
（5）在37℃的5体积%CO2培养箱中继续培养48小时后进行荧光素酶蛋白检测，用BCA（Pierce,USA）试剂盒测定总蛋白的浓度。通过与空白对照组对比，计算得出siRNA的抑制效率。 
8、DNA转染实验步骤 
转染前24h，在24孔板中以3×104的密度接种HepG2细胞，培养液体积为0.5mL。培养16-20h后，细胞融合率达到70-80%。转染前，将培养基换成无血清的Opti-MEM，培养液体积0.5mL。将含0.5μg EGFP-N1质粒的NP-D-GP三元复合物溶液加入24孔板中，每样设3个平行孔。37℃及5%CO2浓度下培养4h后将孔中液体吸出，换为含10%FBS的高糖完全DMEM培养基。培养24h后，用倒置荧光显微镜(Olympus IX70,Olympus,Tokyo,Japan)检测绿色荧光蛋白的表达情况。 
9、N/P/C值确定 
根据加入A物质的重量结合A物质的结构式，计算A物质中的基团Z的总摩尔数，对于商品化的转染试剂，根据试剂盒提供的信息进行计算，得到N值；根据加入的B物质的重量结合B物质的核苷酸的数目，计算B物质中的核苷酸的总摩尔数，得到P值；根据加入的D物质的重量结合D物质中透明质酸部分的含量，计算出D物质中羧基的摩尔数，得到C值，继而得到N/P/C值。本发明中可以通过改变A物质、D物质和M物质的投料比例得到所需N/P/C值的三元复合物和/或含有三元复合物的液体。 
10、本发明中使用的D物质 
本发明中所述D物质均为自制，各项参数列于表1中。制备方法参照文献（Macromolecular Chemistry and Physics,2010.211(14):p.1572-1578.），不同的是把聚谷氨酸换成透明质酸。简要地，将透明质酸、一端带氨基聚乙二醇和NHS溶解在pH=8.5的硼酸缓冲液中。搅拌条件下，将EDC加到混合物室温下反应6h后，停止反应。产物在2L0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4，Na2HPO4/NaH2PO4)中透析，截留分子量为MW=8000～14000。24h后，透析液替换为2L去离子水。继续透析24h后，冻干，得到产物，并在-20°C保存。 
表1中，HgP-F则是采用一端带有叶酸靶向基团、一端氨基的聚乙二醇（购自北京键凯科技有限公司），按上述方法制备的叶酸修饰的聚乙二醇接枝的透明质酸（HgP-F）。 
HgP-G表示末端为半乳糖修饰的聚二乙醇接枝的透明质酸，HgP-S表示末端为甘露糖修饰的聚二乙醇接枝的透明质酸，HgP-RGD末端为RGD修饰的聚二乙醇接枝的透明质酸。其中，一端带有甘露糖、半乳糖、RGD靶向基团的聚乙二醇购自北京键凯科技有限公司。 
HgP-Apt是末端为Aptamer修饰的聚二乙醇接枝的透明质酸。一端带有Aptamer靶向性基团的聚乙二醇通过下述方法自制得到：Aptamer的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，为5′-ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT GTC ACA(A)10-3′，为了能使Aptamer连接到聚乙二醇的末端，商购3′带有氨基修饰的具有上述核酸序列的Aptamer，即结构为5′-ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT GTC ACA(A)10-NH2-3′（北京键凯科技有限公司），使其 与一个末端为羧基修饰的聚乙二醇（北京键凯科技有限公司）进行反应，参照文献方法制备Aptamer-PEG（S.Dhar,F.X.Gu,R.Langer,et al.,Targeted delivery of cisplatin to prostate cancer cells by aptamer functionalized Pt(IV)prodrug-PLGA-PEG nanoparticles,Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105(45):17356-17361.）。 
11、本发明中使用的两亲性阳离子聚合物及其自组装纳米粒 
本发明中制备的两亲性阳离子共聚物及其纳米粒的各项参数列于表2中。 
(1)聚己内酯(PCL)接枝聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯(PDMAEMA)（PCL-g-PDMAEMA）: 
PCL-g-PDMAEMA接枝共聚物,按照文献(S.Guo,W.Wang,L.Deng,et al.,Poly(ε-caprolactone)-graft-poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate)Amphiphilic Copolymers Prepared via a Combination of ROP and ATRP:Synthesis,Characterization,and Self-Assembly Behavior,Macromolecular Chemistry and Physics,2010,211(14):1572-1578.)的方法自制。N原子含量根据各接枝共聚物中PDMAEMA的相对含量进行计算 
PCL-g-PDMAEMA纳米粒的制备：称取0.020克PCL-g-PDMAEMA接枝共聚物（N原子含量根据各接枝共聚物中PDMAEMA的相对含量进行计算）溶于1mL的四氢呋喃中。充分溶解后，在搅拌条件下将聚合物溶液缓慢滴加到10mL的去离子水中。室温下在通风橱中通过搅拌让四氢呋喃缓慢挥发。待溶剂挥发完全后，用稀盐酸调节聚合物溶液至pH值为7.2。配制好的聚合物溶液用0.22微米的Millipore无菌膜过滤除菌后放于4℃保存备用。按照上述方法制备其它PCL-g-PDMAEMA接枝共聚物纳米粒的水溶液，PCL-g-PDMAEMA以纳米粒形式存在在水溶液中，PCL-g-PDMAEMA的结构性质及水溶液纳米粒粒径列于表2中。 
（2）PCT-g-PDHMA：主链是摩尔比为32/32/5的CL/TOSUO/BMPC共聚物，PDHMA是摩尔比40/5的DMAEMA与甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)的无规共聚物；制备方法与PCL-g-PDMAEMA相同，不同的是主链共聚单体是CL、TOSUO和BMPC，侧链单体聚合单体是DMAEMA与HEMA。 
其纳米粒的制备方法与PCL-g-PDMAEMA纳米粒的制备方法相似。 
（3）PCD-g-PDVP：PCD是摩尔比为40/40/4的CL/丙交酯（DLLA）/BMPC共聚物，PDVP是摩尔比70/10的DMAEMA与乙烯基吡咯烷酮(PVP)的无规共聚物；制备方法与PCL-g-PDMAEMA相同，不同的是主链共聚单体是CL、DLLA和BMPC，侧链单体聚合单体是DMAEMA与PVP。 
其纳米粒的制备方法与PCL-g-PDMAEMA纳米粒的制备方法相似。 
（4）PLGA-g-PDCBM:PLGA是摩尔比为34/34/4的DLLA/乙交酯(GA)/BMPC共聚物，PDCBM是摩尔比70/10的DMAEMA与CBM的无规共聚物；制备方法与PCL-g-PDMAEMA相同，不同的是主链共聚单体是DLLA、GA和BMPC，侧链聚合单体是DMAEMA与PVP。 
其纳米粒的制备方法与PCL-g-PDMAEMA纳米粒的制备方法相似。 
(5)PCL-g-SS-PDMAEMA:是主链为CL与BMPC共聚物，侧链是二硫键键接的PDMAEMA，制备方法参照(Daoshu Lin,Qian Jiang,Qiang Cheng,et al.,Polycation-Detachable Nanoparticles Self-assembled From mPEG-PCL-g-SS-PDMAEMA for siRNA Delivery,Act Biomatrerials,2013) 方法，结构如式(3): 
Figure BDA00003136656700111
其纳米粒的制备方法与PCL-g-PDMAEMA纳米粒的制备方法相似。 
（6）PCL(15000)-g-PEI(800)：按照文献方法自制(L.Y.Qiu,Y.H.Bae,Self-assembled polyethylenimine-graft-poly([epsilon]-caprolactone)micelles as potential dual carriers of genes and anticancer drugs,Biomaterials,2007,28(28):4132-4142.） 
其纳米粒的制备方法与PCL-g-PDMAEMA纳米粒的制备方法相似。 
（7）PCL(5000)-b-PDMAEMA(10000)：按照文献方法自制（L.Mespouille,M.Vachaudez,F.Suriano,et al.,One-Pot Synthesis of Well-Defined Amphiphilic and Adaptative Block Copolymers via Versatile Combination of“Click”Chemistry and ATRP,Macromolecular Rapid Communications,2007,28(22):2151-2158.） 
其纳米粒的制备方法与PCL-g-PDMAEMA纳米粒的制备方法相似。 
本发明中得到的含有三元复合物的液体的各项参数列于表3中，具体实施例如下： 
实施例1 
将EGFP-N1质粒DNA（购自Invitrogen公司，质粒DNA的核苷酸数目为4.7kb）用PBS（组成为NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L，pH值为7.4）溶解（浓度为1μg/50μL），将50μL的PEI（25kDa，购自Sigma-Aldrich公司，每克聚合物中含有0.0222mol N原子）的PBS（与上述PBS组成和pH值相同）溶液（1.35μg/50μL）逐滴加入到50μL的EGFP-N1质粒的PBS溶液中，边加入边振荡，使之充分混匀，室温25℃放置20分钟；再加入50μL的HgP-5（具体见表1）的水溶液（5.715μg/50μL），充分混合，在25℃下，孵育20分钟，即得N/P/C值为10/1/5的含有三元复合物的液体P1。 
实施例2 
将EGFP-N1质粒DNA用PBS（组成为NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L，pH值为7.2）溶解（浓度为1.8μg/50μL），将50μL的PEI（与实施例1相同）的PBS溶液（2.5μg/50μL，与上述PBS组成相同）逐滴加入到50μL的EGFP-N1质粒DNA的PBS溶液中，边加入边振荡，使之充分混匀，15℃放置30分钟；再加入50μL的HgP-5的水溶液（12μg/50μL），充分混合，在15℃下，孵育15分钟，即得N/P/C为10/1/8的含有三元复合物的液体P2。 
实施例3-4 
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P4-P5，不同的是，将PEI替换为壳聚糖（CS，50KDa，脱乙酰度为95%，购自山东奥康生物科技有限公司，氮原子含量为0.0061mol/克壳聚糖）或壳聚糖季铵盐（NCS，按照文献方法自制（M.Thanou,B.I.Florea,M.Geldof,et al.,Quaternized chitosan oligomers as novel gene delivery vectors in epithelial cell lines,Biomaterials,2002,23(1):153-159.），GPC测定分子量为7×104g/mol，1H NMR测定季铵化程度为35%，氮原子含量为0.0045mol/克碘甲烷季铵化壳聚糖），A物质和D物质的选择具体如表3所示，并按照表3中的各种N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。 
实施例5 
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P5，不同的是，将PEI替换为阳离子脂质体（Lip，即N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate (DOTAP),购自Sigma-Aldrich公司，每克Lip含有0.0013mol的N原子），D物质的选择具体如表3所示，并按照表3中的N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。 
实施例6 
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P6，不同的是，将PEI替换为Transfectam试剂（Tra，按试剂盒说明书操作，购自Promega公司，每克Tra中含有0.0051mol正电荷），D物质的选择具体如表3所示，并按照表3中的N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。 
实施例7 
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P7，不同的是，将PEI替换为聚酰胺-胺型树枝状聚合物（PAMAM，N原子含量为0.0177mol/克PAMAM，数均分子量为14270g/mol，购自Sigma-Aldrich公司），D物质的选择具体如表3所示，并按照表3中的N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。 
实施例8 
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P8，不同的是，将PEI替换为聚β-氨基酯（PBAEs，按照文献方法自制(D.M.Lynn,R.Langer,Degradable Poly(β-amino esters):Synthesis,Characterization,and Self-Assembly with Plasmid DNA,Journal of the American  Chemical Society,2000,122(44):10761-10768.)，每克聚合物中含N的摩尔数=（重复单元中N原子的个数）/（重复单元的分子量），数均分子量为14000g/mol），D物质的选择具体如表3所示，并按照表3中的N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。 
实施例9 
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P9，不同的是，将PEI替换为甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯（PDMAEMA，N原子含量为0.0064mol/克PDMAEMA（每个DMAEMA重复单元上含有一个N原子），按照文献(J.-Y.Cherng,P.van de Wetering,H.Talsma,et al.,Effect of Size and Serum Proteins on Transfection Efficiency of Poly((2-dimethylamino)ethyl Methacrylate)-Plasmid Nanoparticles,Pharmaceutical Research,1996,13(7):1038-1042.)的方法制备，数均分子量为40000g/mol），D物质的选择具体如表3所示，并按照表3中的N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。 
实施例10-20 
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P10-P20，不同的是，将PEI替换为表2中的两亲性阳离子嵌段或接枝聚合物纳米粒，D物质的选择具体如表3所示，并按照表3中的各种N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。 
实施例21 
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P21，不同的是，将PEI替换为PCL-g-PDMAEMA1，B物质为siRNA1，D物质的选择具体如表2所示，并按照表2中的各种N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，加入50μl浓度为1μg/50μL的siRNA1。 
所述siRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。 
正义链：5′-UUGUUUUGGAGCGAAAdTdT-3′（SEQ ID NO.3）， 
反义链：5′-UUUCCUUCCAAAACAAdTdT-3′（SEQ ID NO.4）。 
实施例22-37 
按照实施例21所述的方法制备含有三元复合物的液体P21-P35，不同的是，将PCL-g-PDMAEMA1纳米粒替换为其它阳离子聚合物或带正电荷的纳米粒，A和D物质的选择见表2，按照表2中的N/P/C值确定加入的三种物质的比例。 
其中阳离子金纳米颗粒C-Au为羧基化金纳米颗粒与PEI（25KD）复合而成的（按照文献方法自制(S.Guo,Y.Huang,Q.Jiang,et al.,Enhanced Gene Delivery and siRNA Silencing by Gold Nanoparticles Coated with Charge-Reversal Polyelectrolyte,ACS Nano,2010,4(9):5505-5511.)，金纳米颗粒的颗粒直径为10-40nm，可通过三硝基苯磺酸滴定PEI的方法确定N原子的含量，N原子的含量为0.0089mol/克阳离子金纳米颗粒）。 
其中，PDMAEMA表面修饰的介孔硅纳米粒CP-MSNs(按照文献DS Lin,Q Cheng,Q Jiang,YY Huang,Z Yang,YL Shia,YN Zhao,ZC Liang*,AJ Dong*，Intracellular cleavable  poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)functionalized mesoporoussilica nanoparticles for efficient siRNAdelivery in vitro and in vivo,Nanoscale,2013,DOI:10.1039/C3NR00294B制备)，氮原子含量为0.02mol/克NCS纳米粒)，平均粒径125nm，孔径9.8nm。 
发明人前期报道的工作中，研发了PCL-g-PDMAEMA/DNA(或siRNA)的二元复合物以及采用聚乙二醇接枝的聚谷氨酸复合二元复合物PCL-g-PDMAEMA/DNA(或siRNA)，形成三元复合物，促进了核酸递送效果。本发明则是在上述工作基础上的进一步改进，进一步提高了三元复合物的细胞相容性，也提高了DNA转染效果和siRNA的基因沉默效率。因此，为对比说明本发明中的三元复合物的优良性能，还给出了对比例： 
对比例1： 
按照实施例10所述的方法制备复合物的液体，不同的是，不加入D物质，得到含有二元复合物PCL-g-PDMAEMA1/DNA(NP-D)的液体，NP-D的N/P值为10:1。 
对比例2： 
实施例27所述的方法制备复合物的液体，不同的是，不加入D物质，得到含有二元复合物PCL-g-PDMAEMA1/siRNA(NP-siRNA)的液体，NP-siRNA的N/P值为10:1，性能列于表2中。 
对比例3 
按照实施例11所述的方法制备三元复合物（NP-D-PGgP）的溶液，不同的是，把HgP-5换成聚乙二醇接枝的聚谷氨酸PGgP（结构性质见表1），按照文献（Guo S,Huang Y,Zhang W,Wang W,et al.Ternary complexes of amphiphilic polycaprolactone-graft-poly(N,N-dimethylaminoethyl methacrylate),DNA and polyglutamic acid-graft-poly(ethylene glycol)for gene delivery.Biomaterials2011;32:4283-92）方法制备。NP-D-PGgP性能列于表2。 
对比例4 
按照实施例27所述的方法制备三元复合物（NP-siRNA-PGgP-F）的溶液，不同的是，把HgP-5换成叶酸修饰的聚乙二醇接枝的聚谷氨酸PGgP-F（结构性质见表1）。NP-siRNA-PGgP-F性能列于表2中。 
测定P1-P37中三元复合物的颗粒直径、Zeta电位、细胞毒性、DNA转染效率或siRNA基因沉默效率，结果列于表3中。部分结果示于图1-5中。 
从表3及图1-5可以看出，本发明的含有三元复合物的液体的呈现较高的细胞相容性及细胞转染效率或RNA干扰活性（即siRNA1的基因沉默效率），且效果好于用聚乙二醇接枝的聚谷氨酸PGgP为外层的三元复合物。 
表1本发明实施例所用D物质 
Figure BDA00003136656700151
表2本发明所用两亲性阳离子聚合物及其纳米粒 
Figure BDA00003136656700161
PCL-g-PDMAEMA1-4主链是己内酯(CL)与BMPC共聚物，每个主链上BMPC单元数与PDMAEMA支链数相同（制备方法详见ZL200910143234.0）；PCT-g-PDHMA中的主链是摩尔比为32/32/5的CL/TOSUO/BMPC共聚物，PDHMA是摩尔比40/5的DMAEMA与甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)的无规共聚物；PDLLA-g-PDVP中PCD是摩尔比为70/4的丙交酯（DLLA）/BMPC共聚物，PDVP是摩尔比70/10的DMAEMA与乙烯基吡咯烷酮(PVP)的无规共聚物；PLGA-g-PDCBM中PLGA是摩尔比为34/34/4的DLLA/乙交酯(GA)/BMPC共聚物，PDCBM是摩尔比70/10的DMAEMA与两性单体羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(CBM)无规共聚物。 
表3本发明实施例P1-P37及对比例组成、性能 
Figure BDA00003136656700162

Claims (10)

1.一种以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物，其特征在于，该三元复合物含有A物质，B物质和D物质，A物质为带有正电荷的载体，B物质为带有负电荷的核酸，D物质为聚乙二醇接枝的透明质酸。
2.根据权利要求1所述的三元复合物，其特征是：A物质为带有氨基基团的纳米颗粒和/或带有氨基基团的阳离子聚合物和/或阳离子脂质分子，所述的氨基为伯氨基、仲氨基和叔氨基中的一种或多种；D物质中透明质酸为主链，聚乙二醇为侧链，接枝率为2-20%；透明质酸的数均分子量为5000-1000000，聚乙二醇的数均分子量为800-10000；A物质中的氨基摩尔数N、B物质核酸中的核苷酸的摩尔数P与D物质中的羧基摩尔数C的比值为2-20:1:1-20；所述A物质带有的正电荷、B物质带有的负电荷与D物质带有的负电荷使得三元复合物的Zeta电位为-25mV到15mV；所述的三元复合物的粒径为20-400纳米。
3.根据权利要求2所述的三元复合物，其特征是：所述的氨基基团的纳米颗粒为直径10-200纳米的带氨基基团的金纳米颗粒、或10-200纳米的硅胶纳米颗粒、或直径10-600纳米的两亲性阳离子聚合物纳米粒，所述的两亲性阳离子聚合物是疏水性聚合物与聚阳离子形成的嵌段或接枝共聚物。
4.根据权利要求2所述的三元复合物，其特征是：所述的带有氨基基团的阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、聚β-氨基酯、壳聚糖、壳聚糖季铵盐、含有式（1）所示结构单元的聚合物、聚酰胺-胺型树枝状聚合物中的一种或多种或它们的共聚物；
Figure FDA00003136656600011
其中，R1为H或C1-C4的烷基，R2为C1-C4的亚烷基，R3和R4各自独立地为C1-C4的烷基。
5.根据权利要求3所述的三元复合物，其特征是：所述的两亲性阳离子聚合物是阳离子聚合物为侧链接枝到疏水性聚合物主链上形成的两亲性阳离子接枝共聚物；主链数均分子量2000-30000，侧链数均分子量300-15000，每个大分子主链上接枝的侧链数为2-50。
6.根据权利要求5所述的三元复合物，其特征是：所述的两亲性阳离子梳型接枝共聚物是由含溴官能团的聚酯为大分子引发剂引发阳离子烯类单体聚合，或引发阳离子烯类单体与其它非阳离子烯类单体聚合制备的；其中，含溴官能团的聚酯选自γ-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)-己内酯（BMPC）与内酯的共聚物、BMPC与交酯的共聚物中的一种或多种；其中，所述内酯为β-羟基丁酯、β-羟基戊酯、1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮和己内酯中的一种或多种，所述交酯为乙交酯和/或丙交酯。
7.根据权利要求6所述的三元复合物，其特征是：所述的阳离子烯类单体为式（2）所示结构的单体中的一种或多种；所述的非阳离子烯类单体选自丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、乙烯基吡咯烷酮、两性单体羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯、酯基含有1～18个碳原子的(甲基)丙烯酸酯、苯乙烯、醋酸乙烯；
Figure FDA00003136656600021
其中，R1为H或C1-C4的烷基，R2为C1-C4的亚烷基，R3和R4各自独立地为H或C1-C4的烷基。
8.根据权利要求1所述的三元复合物，其特征是：所述聚乙二醇为一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇，所述靶向性物质为叶酸、甘露糖、半乳糖、具有导向作用的短肽和适配子中的一种或多种。
9.一种含有以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物的液体，其特征在于，该含有三元复合物的液体含有权利要求1-8中任意一项所述的三元复合物中的一种或多种和水；这种含有三元复合物的液体的制备方法是：使A物质的水溶液与B物质的水溶液混合，并将所得的混合物与D物质的水溶液混合，形成粒径在20-400纳米的三元复合物的水分散液。
10.权利要求1-8中任意一项所述的三元复合物或权利要求9所述的含有三元复合物的液体在细胞转染、疾病的预防、诊断和基因治疗中的应用，以及在制备细胞转染试剂、制备疾病的预防、诊断或基因治疗的药物中的应用。
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Application publication date: 20130821

Assignee: TIANJIN TIAN YUAN ELECTRICAL MATERIALS CO.,LTD.

Assignor: Tianjin Bohua Xinchuang Technology Co.,Ltd.

Contract record no.: X2024980003329

Denomination of invention: Liquid and application of ternary composites with polyethylene glycol grafted hyaluronic acid as outer layer and ternary composites

Granted publication date: 20151028

License type: Common License

Record date: 20240322