CN105823775A - 硫代磷酸酯类有机磷农药残留检测试剂盒及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测农药残留领域,特别涉及一种硫代磷酸酯类有机磷农药残留检测试剂盒及其应用方法。所述试剂盒包括:提取剂、还原剂、前体液、pH调节剂以及滴管和反应管;所述的还原剂为2.4ng/mL~24μg/mL的酪氨酸甲酯接枝透明质酸水溶液。本发明是在纳米金粒子的形成过程中加入有机磷农药,同步化纳米金粒子的形成、聚集以及保护层的建立这三个过程,将纳米金粒子的聚集程度控制在其形成过程中,并且形成的纳米金聚集体表面具有保护层,大大提高了聚集体的稳定性,进而提高检测稳定性,检测结果不再受检测时间的限制,易于重复。
Description
技术领域
本发明涉及检测农药残留领域,特别涉及一种硫代磷酸酯类有机磷农药残留检测试剂盒及其应用方法。
背景技术
有机磷农药因其具有广谱、高效、价格低廉等特点,已成为当前世界农药三大支柱之一。其中,硫代磷酸酯类是有机磷农药中较为常用的一类,乐果、甲拌磷、马拉硫磷等毒性较强,杀虫效果好的农药都属于此类,在保证农业稳产、高产方面发挥着重要作用。然而,由于使用者缺乏科学使用农药的知识,片面追求产量,造成市场上流通的农副产品都不同程度的存在农药残留问题,成为威胁人们生命健康的隐患。为保证“舌尖上的安全”,在新修订食品安全法和食品安全国家标准的强力推动下,农产品生产基地、批发市场、各级食品检验局、监督局、工商管理、超市、商场等基层单位以及个人用户,对有机磷农药现场快速检测有很大需求。
现有检测有机磷农药多基于色谱技术,如气相色谱、高效液相色谱、超高效液相色谱、液相色谱等,虽然具有定量准确、灵敏度高等优点,却依赖于大型仪器,技术要求高,检测周期长,在现场快速检测和大批量样品筛选中具有局限性,难以满足预防和控制突发事件。
相比于色谱技术,比色法具有原理简单,实验周期短,且结果肉眼可见、无需复杂仪器测量等优点,非常适合于现场筛查和实时测定,能够满足当前社会对农药残留分析检测技术的需求。作为生化分析中应用最为广泛的标记材料,纳米金具有极高的消光系数和强烈的粒子间距效应。研究表明:当纳米金粒子间的间距明显超过其粒子平均直径时,纳米金粒子为分散状态,其可见吸收光谱谱峰在~520nm,宏观上溶液呈现红色;而当纳米金粒子间的间距小于粒子平均直径时,则纳米金粒子聚集呈团聚状态,其可见吸收光谱谱峰发生红移,溶液颜色表现为紫色或蓝色,甚至灰色。通过肉眼观测或可见吸收光谱测量,均可对纳米金变色程度进行测定。基于纳米金的这种性质,目前人们主要采用以下两种途径来建立纳米金比色法实现有机磷农药的检测:第一种是直接法,即先将纳米金进行表面功能化修饰,此时纳米金为分散状态,溶液呈红色。当加入有机磷后,有机磷直接与纳米金表面的功能配体作用,使纳米金团聚,溶液变蓝。如公开号为CN104316522A的“采用纳米金比色法快速测定蔬菜中有机磷农药的方法”专利,公开的通过镧(III)功能化的纳米金与有机磷农药含氧酸根之间的配位作用使纳米金聚集变色的比色检测方法。第二种是间接法,即有机磷不与纳米金发生直接作用,而是利用其对乙酰胆碱酯酶的抑制作用,间接抑制纳米金颗粒的聚集,从而抑制溶液的变色程度。根据抑制的程度即可测定样品中的有机磷农药含量。如公开号为CN102221529A的“金纳米粒子比色法快速检测蔬菜中有机磷农药残留的方法”专利中,公开的利用乙酰胆碱酯酶催化底物碘化乙酰硫代胆碱水解得到硫代胆碱,硫代胆碱能使金纳米粒子聚集,体系由酒红色变为灰色,当有机磷农药作用于乙酰胆碱酯酶时,会抑制乙酰胆碱酯酶活性,因而可以通过金纳米粒子聚集程度的减少来检测体系中的有机磷。
然而纳米金比色法在有机磷检测中尚存在一些不足之处:
(1)检测方法稳定性较差。
裸露的纳米金粒子很容易在范德华力的作用下彼此吸引形成团聚。常规的,在制备纳米金时,一般会加入带电小分子、聚合物、聚电解质等物质作为稳定剂,以化学键、静电吸附或物理吸附的方式在纳米金粒子表面形成一层保护层,使粒子之间可以通过静电排斥、空间位阻或静电空间双重排斥的作用下,彼此保持一定的间距,从而使形成的纳米金粒子能稳定分散在溶液中。因此,粒子间的排斥力是其稳定存在于溶液中的关键。而无论是直接法还是间接法为了实现检测的目的,都采用了降低粒子间排斥力,也就是去除保护的方式,以使粒子团聚变色。固然达到了较好的变色效果,但是由于保护层遭到破坏而形成了较大聚集体(一般在200-400nm,更有微米级聚集体形成的情况)。研究表明,这种大的聚集体在溶液中的稳定性较差,几个小时内即发生沉淀,而使溶液变为无色。因此,在检测时,须在反应进行完全后,立即进行结果读取。
(2)纳米金储存稳定性较差。
在构建纳米金比色法时,都需要事先制备好纳米金溶液,以备使用。虽然在制备过程中,纳米金表面都被覆盖上了一层保护性的配体分子。但在储存时,纳米金的稳定性依然易受温度的影响。研究表明,避光条件下,4℃时,纳米金可以稳定存在20天;室温(23℃)时,纳米金在第6天即发生聚集,第15天即可看到黑色沉淀。这些都在一定程度上限制了纳米金比色法在有机磷农药残留检测中的应用。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足,提供一种检测稳定性强、储存期较长、使用方便的硫代磷酸酯类有机磷农药残留检测试剂盒及其应用方法。
本发明的技术方案是:
一种硫代磷酸酯类有机磷农药残留检测试剂盒,所述试剂盒包括:提取剂、还原剂、前体液、pH调节剂以及滴管和反应管;所述的还原剂为2.4ng/mL~24μg/mL的酪氨酸甲酯接枝透明质酸水溶液。
所述的酪氨酸甲酯接枝透明质酸既是还原剂,也是稳定剂。
其中,所述提取剂为丙酮:水按体积比为1:1混合而成的丙酮溶液;所述前体液为0.8~4mM的氯金酸水溶液;所述pH调节剂为3.875~7.75M的氢氧化钠水溶液。
本发明所使用的检测原理是:酪氨酸甲酯接枝透明质酸中的酚羟基具有还原性,可将氯金酸中的三价金离子还原成零价纳米金。另外,透明质酸不仅是一种带负电的聚电解质,而且其所含的羧基和羟基基团与金离子具有亲和作用。因此,在纳米金的形成过程中,酪氨酸甲酯接枝透明质酸倾向于结合在纳米金表面,发挥稳定剂的功能,使形成的纳米金在静电空间双重排斥作用下分散存在于溶液中,溶液呈现粉色、红色或酒红色。而当待测样品中存在硫代磷酸酯类有机磷农药时,其化学结构中含有的磷硫基团,以及在碱性条件下水解产生的巯基基团,均可以与纳米金通过金硫键相互作用。于是,在多重金硫键的作用下,纳米金粒子易于聚集,导致溶液颜色发生变化,从而实现硫代磷酸酯类有机磷农药检测的目的。
本发明的另一个目的在于公开应用上述的试剂盒检测硫代磷酸酯类有机磷农药残留的方法,包括如下步骤:
步骤1:待测样品加入到待测样品质量4~6倍体积的提取剂中,搅拌5-10min后静置3-5min;
步骤2:用滴管在反应管中依次滴加等体积的前体液、还原剂、步骤1所述的液体以及pH调节剂,混合均匀,观察颜色变化;
步骤3:若步骤2中所述的反应管中的溶液显紫色、蓝色或灰色,则样品中残留有硫代磷酸酯类有机磷农药;若步骤2中所述的反应管中的溶液显粉红、红色或酒红色,则样品中无硫代磷酸酯类有机磷农药残留。
本发明的第三个目的在于公开制备还原剂酪氨酸甲酯接枝透明质酸的方法,包括如下步骤:
步骤①:配制2-(N-吗啡啉)乙磺酸钠(MES)的水溶液;
步骤②:搅拌下向步骤①得到的水溶液中加入透明质酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),反应120~150min,得到一种混合溶液;
步骤③:搅拌下向步骤②得到的混合溶液中加入酪氨酸甲酯,反应300~480min,得到一种混合溶液;
步骤④:将步骤③得到的混合溶液置于透析袋中,并将透析袋置于超纯水中,透析2~3d;
步骤⑤:将步骤④得到的透析袋中的溶液,置于-80℃冰箱中,快速冷冻后,放入真空冷冻干燥器中,真空干燥2~3d,制得酪氨酸甲酯接枝透明质酸。
为考察酪氨酸甲酯是否成功接枝到透明质酸上,使用赛默飞世尔(ThermoScientific)Nicolet6700傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)对酪氨酸甲酯接枝透明质酸官能团进行表征。
如图1所示,纯透明质酸光谱a显示,其羧基伸缩振动峰在1610cm-1处,固有酰胺键伸缩振动峰在1560cm-1处。羧基是其氨基酸甲酯的作用位点。在酪氨酸甲酯接枝透明质酸光谱b中,1610cm-1处的羧基伸缩振动峰依然存在,表明有剩余羧基存在。另外,在1660cm-1处出现一新峰,文献显示,这是酰胺键的特征峰,表明酪氨酸甲酯与透明质酸之间形成新的酰胺键。并且,1560cm-1处的酰胺键红外峰进一步增强,亦印证了这一观点。不仅如此,与酪氨酸甲酯光谱c对比,酪氨酸甲酯中的1250cm-1处的羟基伸缩峰和1515cm-1处的芳香环红外峰均出现在光谱b中,进一步证实了酪氨酸甲酯接枝透明质酸的形成。
在以上方案的基础上,所述的组分按照以下重量份数比:2-(N-吗啡啉)乙磺酸钠(MES)0.041份、透明质酸钠0.8~1.6份、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)4.2~8.4份和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)1~2份,酪氨酸甲酯1~2份。
优选的,所述的透明质酸钠的分子量66kDa-99kDa。
优选的,所述透析袋的截留分子量为10kDa。
本发明的有益效果是:
(1)提高检测方法的稳定性。
本发明在纳米金粒子的形成过程中加入有机磷农药,同步化纳米金粒子的形成、聚集以及保护层的建立这三个过程,将纳米金粒子的聚集程度控制在其形成过程中,并且形成的纳米金聚集体表面具有保护层,大大提高了聚集体的稳定性,进而提高检测稳定性,检测结果不再受检测时间的限制。
(2)提高检测试剂盒的储存稳定性。
本发明的检测试剂盒中无提前制备好的纳米金溶液,而是一些制备纳米金所需的有机溶剂(提取剂)、高分子(还原剂)、强酸(前体液)、强碱(pH调节剂)等化学试剂,这些试剂的性质稳定,可长期储存。
附图说明
图1为纯透明质酸、酪氨酸甲酯接枝透明质酸和酪氨酸甲酯的FTIR图谱对比图。
其中,(a)纯透明质酸,(b)酪氨酸甲酯接枝透明质酸,(c)酪氨酸甲酯。
图2空白对照溶液、样品检测溶液、放置两天后的样品检测溶液以及储存三个月后的检测试剂盒应用时获得的样品检测溶液的可见吸收光谱图;
图3透射电镜表征图;
其中,(a)为空白对照溶液;(b)为样品检测溶液。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。但本发明并不仅限于下述实施例。所述实施例中所涉及的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1:
一种有机磷农药残留检测试剂盒,包括提取剂、还原剂、前体液、pH调节剂以及1mL滴管和5mL反应管。其中,提取剂为5~10mL丙酮:水按体积比为1:1混合而成的丙酮溶液;还原剂为2.4ng/mL~24μg/mL的酪氨酸甲酯接枝透明质酸水溶液;前体液为0.8~4mM的氯金酸水溶液;pH调节剂为3.875~7.75M的氢氧化钠水溶液。
其中,酪氨酸甲酯接枝透明质酸的制备方法为:①先在反应容器中,加入超纯水4.2份,加入0.041份2-(N-吗啡啉)乙磺酸钠(MES),充分溶解后,得到一种水溶液;
②搅拌下向步骤①得到的水溶液中加入透明质酸(分子量66kDa-99kDa)1.2份、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)6.8份和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)1.5份,反应130min,得到一种混合溶液;
③搅拌下向步骤②得到的混合溶液中加入酪氨酸甲酯1.5份,反应420min,得到一种混合溶液;
④将步骤③得到的混合溶液置于透析袋(截留分子量为10kDa)中,并将透析袋置于超纯水中,透析2.5d;
⑤将步骤④得到的透析袋中的溶液,置于-80℃冰箱中,快速冷冻后,放入真空冷冻干燥器中,真空干燥2~3d,制得酪氨酸甲酯接枝透明质酸。
应用上述的试剂盒检测硫代磷酸酯类有机磷农药残留的方法,包括如下步骤:
步骤1:1g油菜用清水洗去表面泥土,加入5mL的提取剂,搅拌5-10min后静置3-5min;
步骤2:用滴管在反应管中依次滴加等体积的前体液、还原剂、步骤1所述的液体以及pH调节剂,混合均匀,观察颜色变化;
步骤3:若步骤2中所述的反应管中的溶液显紫色、蓝色或灰色,则样品中残留有硫代磷酸酯类有机磷农药;若步骤2中所述的反应管中的溶液显粉红、红色或酒红色,则样品中无硫代磷酸酯类有机磷农药残留。
结果发现,混合均匀的瞬间,样品检测溶液即开始从无色,逐渐显现红色,并逐渐加深;反应进行5min后,溶液开始呈现蓝色;10min后,溶液依然为蓝色,颜色不再发生变化。
说明:该检测油菜中残留有硫代磷酸酯类有机磷农药。
实施例2:
一种有机磷农药残留检测试剂盒,包括提取剂、还原剂、前体液、pH调节剂以及1mL滴管和5mL反应管。其中,提取剂为5~10mL丙酮:水按体积比为1:1混合而成的丙酮溶液;还原剂为2.4ng/mL~24μg/mL的酪氨酸甲酯接枝透明质酸水溶液;前体液为0.8~4mM的氯金酸水溶液;pH调节剂为3.875~7.75M的氢氧化钠水溶液。
其中,酪氨酸甲酯接枝透明质酸的制备方法为:
①先在反应容器中,加入超纯水4.2份,加入0.041份2-(N-吗啡啉)乙磺酸钠(MES),充分溶解后,得到一种水溶液;
②搅拌下向步骤①得到的水溶液中加入透明质酸钠(分子量66kDa-99kDa)0.8份、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)4.2份和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)1份,反应130min,得到一种混合溶液;
③搅拌下向步骤②得到的混合溶液中加入酪氨酸甲酯1份,反应420min,得到一种混合溶液;
④将步骤③得到的混合溶液置于透析袋(截留分子量为10kDa)中,并将透析袋置于超纯水中,透析2.5d;
⑤将步骤④得到的透析袋中的溶液,置于-80℃冰箱中,快速冷冻后,放入真空冷冻干燥器中,真空干燥2~3d,制得酪氨酸甲酯接枝透明质酸。
应用上述的试剂盒检测硫代磷酸酯类有机磷农药残留的方法,包括如下步骤:
步骤1:1g苹果皮,加入样品质量6mL提取剂,搅拌5-10min后静置3-5min;
步骤2:用滴管在反应管中依次滴加等体积的前体液、还原剂、步骤1所述的液体以及pH调节剂,混合均匀,观察颜色变化;
步骤3:若步骤2中所述的反应管中的溶液显紫色、蓝色或灰色,则样品中残留有硫代磷酸酯类有机磷农药;若步骤2中所述的反应管中的溶液显粉红、红色或酒红色,则样品中无硫代磷酸酯类有机磷农药残留。
结果发现,混合均匀的瞬间,样品检测溶液即开始从无色,逐渐显现红色,并逐渐加深;反应进行5min后,溶液开始呈现蓝色;10min后,溶液依然为蓝色,颜色不再发生变化。
说明:该检测苹果皮中残留有硫代磷酸酯类有机磷农药。
实施例3:
一种有机磷农药残留检测试剂盒,包括提取剂、还原剂、前体液、pH调节剂以及1mL滴管和5mL反应管。其中,提取剂为5~10mL丙酮:水按体积比为1:1混合而成的丙酮溶液;还原剂为2.4ng/mL~24μg/mL的酪氨酸甲酯接枝透明质酸水溶液;前体液为0.8~4mM的氯金酸水溶液;pH调节剂为3.875~7.75M的氢氧化钠水溶液。
其中,酪氨酸甲酯接枝透明质酸的制备方法为:
①先在反应容器中,加入超纯水4.2份,加入0.041份2-(N-吗啡啉)乙磺酸钠(MES),充分溶解后,得到一种水溶液;
②搅拌下向步骤①得到的水溶液中加入透明质酸钠(分子量66kDa-99kDa)1.6份、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)8.4份和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)2份,反应130min,得到一种混合溶液;
③搅拌下向步骤②得到的混合溶液中加入酪氨酸甲酯2份,反应420min,得到一种混合溶液;
④将步骤③得到的混合溶液置于透析袋(截留分子量为10kDa)中,并将透析袋置于超纯水中,透析2.5d;
⑤将步骤④得到的透析袋中的溶液,置于-80℃冰箱中,快速冷冻后,放入真空冷冻干燥器中,真空干燥2~3d,制得酪氨酸甲酯接枝透明质酸。
应用上述的试剂盒检测硫代磷酸酯类有机磷农药残留的方法,包括如下步骤:
步骤1:1g菠菜,加入4mL的提取剂,搅拌5-10min后静置3-5min;
步骤2:用滴管在反应管中依次滴加等体积的前体液、还原剂、步骤1所述的液体以及pH调节剂,混合均匀,观察颜色变化;
步骤3:若步骤2中所述的反应管中的溶液显紫色、蓝色或灰色,则样品中残留有硫代磷酸酯类有机磷农药;若步骤2中所述的反应管中的溶液显粉红、红色或酒红色,则样品中无硫代磷酸酯类有机磷农药残留。
结果发现,混合均匀的瞬间,样品检测溶液即开始从无色,逐渐显现粉色,并逐渐加深;反应进行5min后,溶液开始呈现红色;10min后,溶液依然为红色,颜色不再发生变化。
说明:该检测菠菜中无残留硫代磷酸酯类有机磷农药。
以本发明实施例1的检测试剂盒为例,
为了证实这种颜色变化来自纳米金聚集体的形成,做进一步表征分析:
首先,使用岛津(SHIMADZU)UV-2450紫外可见分光光度计采集其吸收光谱信息。如图2所示,样品检测溶液的吸收光谱整体较为平缓,且最大吸收已偏离520nm发生红移,且在650-800nm具有较强吸收,表明存在纳米金聚集体的可能性。
使用日本电子(JEOL)JEM2100-UHR透射电子显微镜进行纳米结构形貌表征,进一步印证了纳米金聚集体的形成,如图3a所示。并且,由于聚集发生在纳米金形成过程中,聚集体并不大,其直径不超过50nm,易于稳定存在于溶液中。
不仅如此,为了证实纳米金聚集的原因来自样品,做了如下空白对照试验:即直接在5mL反应管中,用1mL滴管依次滴加一滴前体液、还原剂、提取剂以及pH调节剂,混合均匀,即开始观察颜色变化。
结果发现,混合均匀的瞬间,反应管中的空白对照溶液即开始从无色,逐渐显现红色;10min后,溶液依然为红色,并不再发生变化。
对此空白对照溶液依然进行吸收光谱和透射电镜表征。从其吸收光谱(图2)上看,空白对照溶液在519nm处形成一明显吸收峰,而在650-800nm吸收非常弱。参考文献报道,猜测空白对照溶液中可能有纳米金粒子形成,其尺寸约13nm,且呈分散状态。透射电镜表征图(图3b)进一步印证了这一结果。
图2空白对照溶液、样品检测溶液、放置两天后的样品检测溶液以及储存三个月后的检测试剂盒应用时获得的样品检测溶液的可见吸收光谱图。
图3空白对照溶液(a)和样品检测溶液(b)的透射电镜表征图。
综上所述,本发明的检测试剂盒及其应用方法实现了通过纳米金分散-聚集状态的改变而引起的颜色变化进行硫代磷酸酯类农药残留检测的目的。
在检测稳定性方面,用本发明实施例1的检测试剂盒,按照其应用方法进行试验所得到的含有纳米金聚集体的检测溶液,在避光、室温(23℃)条件下,放置两天后,溶液依然呈现蓝色,且未发现任何沉淀产生。测量其可见吸收光谱,如图2所示,该样品检测溶液放置两天后,吸收光谱基本不变。相比现有技术中形成的较大聚集体在几个小时内即发生沉淀,使溶液变无色。本发明提供的检测试剂盒及其应用方法大大提高了检测稳定性。
在储存稳定性方面,将本发明实施例1中的检测试剂盒,在避光、4℃条件下,储存三个月后。再按照其应用方法进行试验。结果显示,与不经储存检测试剂盒的样品检测溶液的可见吸收光谱相比,储存三个月后的检测试剂盒应用时获得的样品检测溶液,其吸收光谱基本不变(如图2所示)。这说明本发明检测试剂盒在储存过程中性质稳定,储存三个月后仍能有效应用。
Claims (9)
1.一种硫代磷酸酯类有机磷农药残留检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:提取剂、还原剂、前体液、pH调节剂以及滴管和反应管;所述的还原剂为2.4ng/mL~24μg/mL的酪氨酸甲酯接枝透明质酸水溶液。
2.根据权利要求1所述的硫代磷酸酯类有机磷农药残留检测试剂盒,其特征在于,所述提取剂为丙酮:水按体积比为1:1混合而成的丙酮溶液。
3.根据权利要求1硫代磷酸酯类有机磷农药残留检测试剂盒,其特征在于,所述前体液为0.8~4mM的氯金酸水溶液。
4.根据权利要求1硫代磷酸酯类有机磷农药残留检测试剂盒,其特征在于,所述pH调节剂为3.875~7.75M的氢氧化钠水溶液。
5.一种应用权利要求1所述的试剂盒检测硫代磷酸酯类有机磷农药残留的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:待测样品加入到所述待测样品质量4~6倍体积的提取剂中,搅拌5-10min后静置3-5min;
步骤2:用滴管在反应管中依次滴加等体积的前体液、还原剂、步骤1所述的液体以及pH调节剂,混合均匀,观察颜色变化;
步骤3:若步骤2中所述的反应管中的溶液显蓝色,则样品中残留有硫代磷酸酯类有机磷农药;若步骤2中所述的反应管中的溶液显粉红、红色或酒红色,则样品中无硫代磷酸酯类有机磷农药残留。
6.一种制备还原剂酪氨酸甲酯接枝透明质酸的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤①:配置2-(N-吗啡啉)乙磺酸钠MES的水溶液;
步骤②:搅拌下向步骤①得到的水溶液中加入透明质酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS,反应120~150min,得到一种混合溶液;
步骤③:搅拌下向步骤②得到的混合溶液中加入酪氨酸甲酯,反应300~480min,得到一种混合溶液;
步骤④:将步骤③得到的混合溶液置于透析袋中,并将透析袋置于超纯水中,透析2~3d;
步骤⑤:将步骤④得到的透析袋中的溶液,-80℃快速冷冻,真空冷冻干燥器,制得酪氨酸甲酯接枝透明质酸。
7.根据权利要求6所述的制备还原剂酪氨酸甲酯接枝透明质酸的方法,其特征在于,所述的组分按照以下重量份数比:2-(N-吗啡啉)乙磺酸钠MES0.041份、透明质酸钠0.8~1.6份、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC4.2~8.4份和N-羟基琥珀酰亚胺NHS1~2份,酪氨酸甲酯1~2份。
8.根据权利要求6所述的制备还原剂酪氨酸甲酯接枝透明质酸的方法,其特征在于,所述的透明质酸钠的分子量66kDa-99kDa。
9.根据权利要求6所述的制备还原剂酪氨酸甲酯接枝透明质酸的方法,其特征在于,所述透析袋的截留分子量为10kDa。
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