CN107764816A - 纳米金固定化小球的制备方法及其在福美锌检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种纳米金固定化小球的制备方法及其在福美锌检测中的应用，该制备方法包括如下步骤：称取二碳酸二叔丁酯酪氨酸、NHS和EDC，加入MES缓冲液搅拌反应，加入壳聚糖溶液反应过夜，置于超滤管中离心超滤，得到壳聚糖接枝酪氨酸溶液；向其中加入氯金酸水溶液，并调节pH值，摇匀后静置反应，得到壳聚糖‑纳米金溶液；将得到的壳聚糖‑纳米金溶液与环氧氯丙烷混合，逐滴滴入氢氧化钠水溶液中，将溶液中的悬浮小球滤出并烘干，得到纳米金固定化小球。由该制备方法制备得到的纳米金固定化小球易于储存且稳定性强，无需现制现用、使用方便，应用于福美锌检测时，检测体系稳定性好，检测结果的重复性和可靠性好。

Description

纳米金固定化小球的制备方法及其在福美锌检测中的应用

技术领域

本发明属于农药残留检测领域，尤其涉及一种纳米金固定化小球的制备方法及其在福美锌检测中的应用。

背景技术

福美锌(即二甲基二硫代氨基甲酸锌)是一种可防治多种真菌性植物病害的二硫代氨基甲酸酯杀菌剂，其具有高效、低毒、不易诱发病原物抗药性、对人畜和植物较为安全、对植物病害具有广谱杀菌效果等特点，被广泛应用于农业生产中。然而，福美锌在土壤中移动较快，易进入地下水，其代谢物(乙撑硫脲和丙撑硫脲)还具有致癌、诱导有机体突变和致畸性的作用，因而，加强对福美锌的检测十分重要。

目前，在福美锌检测方面，色谱法、毛细管电泳法等传统方法对样品量需求大，前处理过程繁琐，耗时耗力，在农药大规模筛查和实时监测中的应用非常有限。相比之下，比色法具有原理简单、实验周期短、不需大型仪器等优点，近年来越来越多的应用到农药检测中。其中，纳米金比色法是一种以纳米金为基础的比色分析技术，通常情况下，分散良好的纳米金粒子胶体溶液呈现酒红色，其最大吸收波长在520nm处，当农药分子引发纳米金颗粒聚集时，纳米金胶体溶液变为紫色或蓝灰色，520nm处吸收逐渐减小，波峰右移。因而，通过肉眼观察纳米金颜色的变化，或通过紫外-可见分光光度计检测吸收峰的变化，即可实现农药的检测。

“Ligand-free gold nanoparticles as colorimetric probes for the non-destructive determination of total dithiocarbamate pesticides after solidphase extraction”(KM Giannoulis，Talanta，2014年第119卷，第276-283页)公开了一种用于二甲基二硫代氨基甲酸酯农药检测的纳米金比色法，其公开了福美锌可通过多重金硫键直接作用于纳米金粒子，诱导分散状态的纳米金颗粒团聚，使纳米金溶液颜色由红变紫直至蓝灰色，实现福美锌的检测。

然而，纳米金比色法在福美锌检测中仍存在一些不足之处：

(1)纳米金的储存稳定性较差，需现制现用，且其制备条件苛刻，使用不便。

纳米金粒子通常以胶体溶液的形式存在，虽然在纳米金粒子表面存在保护性配体(如柠檬酸)，但是，依然容易受到环境条件的影响发生沉淀，储存稳定性较差。有研究显示：在避光、室温(23℃)下，5天后纳米金颗粒发生聚集，14天后即可观察到黑色沉淀；在避光、4℃下，纳米金胶体溶液也只能稳定存在20天。因此，现有的纳米金比色法在应用时，都需要现制现用。

纳米金的制备一般采用还原法，制备时不仅需要多种试剂，如：原料(氯金酸)、还原剂(柠檬酸钠、抗坏血酸、硼氢化钠等)等，还需要高温条件(120℃)，反应过程较为复杂，且不具有安全性，在一定程度上限制了纳米金在现场检测中的应用，使用非常不便。

(2)检测体系稳定性较差，检测结果的重复性和可靠性有限。

在溶液环境中，纳米金与福美锌作用后形成的聚集体不能稳定存在，极易发生沉降，因此，在检测时，必须在纳米金与福美锌作用后，立即读取比色结果，否则会造成结果读取的不准确，检测结果的重复性和可靠性较差。

发明内容

本发明针对上述的纳米金比色法在福美锌检测中的不足，提出一种纳米金固定化小球的制备方法及其在福美锌检测中的应用，由该制备方法制备得到的纳米金固定化小球易于储存且稳定性强，无需现制现用、使用方便，该纳米金固定化小球应用于福美锌检测时，检测体系稳定性好，检测结果的重复性和可靠性好。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了一种纳米金固定化小球的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：称取二碳酸二叔丁酯酪氨酸、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加入2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液搅拌溶解，反应96-144min，再加入壳聚糖溶液搅拌反应过夜，将反应后的溶液置于超滤管中离心超滤，得到壳聚糖接枝酪氨酸溶液；

步骤2：向步骤1得到的壳聚糖接枝酪氨酸溶液中，加入氯金酸水溶液，并调节溶液pH值至11.5-12.5，摇匀后静置反应，得到壳聚糖-纳米金溶液；

步骤3：将步骤2得到的壳聚糖-纳米金溶液与环氧氯丙烷混合，得到混合液，将所述混合液逐滴滴入氢氧化钠水溶液中形成悬浮的小球，将所述小球滤出并烘干，得到纳米金固定化小球。

作为优选，所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液的浓度为0.87-1.31mol/L，pH值为5.5-6.6；所述壳聚糖溶液由壳聚糖、水和醋酸按照质量比(0.4-0.6):(15.5-23.3):(0.504-0.756)配制；所述氯金酸水溶液的浓度为0.45-0.55mmol/L；所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.1mol/L。

作为优选，所述的反应组分按照以下质量份数比：二碳酸二叔丁酯酪氨酸0.00613-0.0092份、N-羟基丁二酰亚胺0.0064-0.0096份、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.0272-0.0408份，2-(N-吗啡啉)乙磺酸0.875-1.312份，壳聚糖0.4-0.6份，氯金酸0.00659-0.00988份，环氧氯丙烷6.225-18.675份。

作为优选，步骤1中，所述超滤管的截留分子量为10kDa，以10000-12000r/min的速率离心超滤5-10min，并重复2-4次。

作为优选，步骤2中，静置反应具体为在37℃下静置反应24-36min。

本发明还提供了一种福美锌含量检测方法，包括如下步骤：

将系列浓度的福美锌标准溶液分别加入到pH值为2-4的盐酸溶液中，所述福美锌标准溶液与盐酸溶液的体积比为1：9；分别加入利用上述任一项技术方案所述的纳米金固定化小球的制备方法制备获得的纳米金固定化小球，反应0.5-1min，用相机采集反应后的纳米金固定化小球的彩色照片，打印并标注对应的福美锌标准溶液浓度，作为标准比色卡；

将未知浓度的福美锌样品加入到pH值为2-4的盐酸溶液中，所述福美锌样品与盐酸溶液的体积比为1：9；加入所述纳米金固定化小球反应0.5-1min，观察反应后的纳米金固定化小球的颜色，并与所述标准比色卡对比，读取对应的福美锌浓度。

作为优选，所述福美锌标准溶液的系列浓度分别为0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L、9μmol/L和10μmol/L。

本发明进一步提供了一种福美锌含量检测试剂盒，包括：纳米金固定化小球、检测液、提取剂和标准比色卡；其中，所述纳米金固定化小球采用如上述任一项技术方案所述的纳米金固定化小球的制备方法制备获得；所述检测液为pH值2-4的盐酸溶液；所述提取剂为二氯甲烷与丁醇按体积比为1:1混合而成的混合液；所述标准比色卡的制备方法为：将系列浓度的福美锌标准溶液分别加入到pH值为2-4的盐酸溶液中，所述福美锌标准溶液与盐酸溶液的体积比为1：9；分别加入所述纳米金固定化小球，反应0.5-1min，用相机采集反应后的纳米金固定化小球的彩色照片，打印并标注对应的福美锌标准溶液浓度，作为所述标准比色卡。

作为优选，所述福美锌标准溶液的系列浓度分别为0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L、9μmol/L和10μmol/L。

本发明再进一步提供了一种利用如上述任一项技术方案所述的福美锌含量检测试剂盒检测福美锌含量的方法，包括如下步骤：

待测样品加入到提取剂中，所述提取剂体积与所述待测样品质量的比值为4-6mL/g，搅拌1-3min后静置1-3min，得到待测样品的提取液；

将所述提取液加入到检测液中，所述提取液与检测液的体积比为1：9，加入纳米金固定化小球反应0.5-1min，观察反应后的纳米金固定化小球的颜色，并与标准比色卡对比，读取对应的福美锌浓度。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、本发明提供的纳米金固定化小球的制备方法，将壳聚糖与二碳酸二叔丁酯酪氨酸进行接枝，利用壳聚糖接枝酪氨酸将氯金酸还原成纳米金，同时使纳米金包裹在壳聚糖凝胶网络中，进而以环氧氯丙烷作为粘结剂使其成型固化得到纳米金固定化小球，其制备的纳米金固定化小球能够以干颗粒的形式进行储存，相比于液态储存环境，其储存稳定性显著提高，无需现制现用，使用方便，便于现场检测；

2、本发明提供的福美锌含量检测方法，在检测时，纳米金固定化小球在pH值2-4的酸性环境中吸水膨胀，内部呈凝胶网络状结构，当纳米金与福美锌作用聚集后，所形成的聚集体依然包裹在壳聚糖凝胶中，不易沉降，有效提高了检测体系的稳定性和检测结果的可重复性；同时，本发明提供的福美锌含量检测方法，相比于色谱法和毛细管电泳法等传统方法，其检测步骤简单，所需样品量少，检测效率高；

3、本发明提供的福美锌含量检测试剂盒中，以二氯甲烷与丁醇按体积比为1:1混合而成的混合液作为提取剂提取待测样品中的福美锌，以pH值为2-4的盐酸溶液为检测液，采用纳米金固定化小球进行检测，相比于现有市售检测试剂盒，其使用方便，检测体系稳定性高，检测结果准确且可重复；

4、本发明提供的利用福美锌含量检测试剂盒检测福美锌含量的方法，其检测步骤简单，检测结果准确且可重复。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的壳聚糖-纳米金溶液的投射电镜照片。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种纳米金固定化小球的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：称取二碳酸二叔丁酯酪氨酸、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加入2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液搅拌溶解，反应96-144min，再加入壳聚糖溶液搅拌反应过夜，将反应后的溶液置于超滤管中离心超滤，得到壳聚糖接枝酪氨酸溶液。

在本步骤中，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)能够活化二碳酸二叔丁酯酪氨酸的羧基，2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液(即MES缓冲液)用于提供活化反应所需的偏酸性环境，经过活化的二碳酸二叔丁酯酪氨酸的羧基与壳聚糖的氨基之间通过缩合反应接枝在一起。需要说明的是，本步骤的反应在搅拌下进行，搅拌转速以1100-1300r/min为宜。此外，还需要说明的是，MES缓冲液是本领域常用的一种缓冲液，配制时可采用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值，其配制方法为本领域所熟知，因而在此不做赘述。另外，由于壳聚糖在水中的溶解度较低，而易溶于醋酸等弱酸，因而，配制壳聚糖溶液时，可加入少量醋酸以便于其溶解。

步骤2：向步骤1得到的壳聚糖接枝酪氨酸溶液中，加入氯金酸水溶液，并调节溶液pH值至11.5-12.5，摇匀后静置反应，得到壳聚糖-纳米金溶液。

在本步骤中，壳聚糖接枝酪氨酸的酚羟基具有还原性，在偏碱性环境下，可将氯金酸中的三价金离子还原成零价纳米金，同时，接枝的壳聚糖倾向于结合在纳米金表面，形成的壳聚糖凝胶网络将纳米金包裹住，起到稳定纳米金的作用。需要说明的是，氯金酸水溶液的稳定性较差，宜现用现配。此外，在本步骤中，可用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值。

步骤3：将步骤2得到的壳聚糖-纳米金溶液与环氧氯丙烷混合，得到混合液，将所述混合液逐滴滴入氢氧化钠水溶液中形成悬浮的小球，将所述小球滤出并烘干，得到纳米金固定化小球。

在本步骤中，需要说明的是，在壳聚糖-纳米金溶液与环氧氯丙烷的混合液中，环氧氯丙烷作为粘结剂，能够将壳聚糖-纳米金粘结成类似胶状物，将其逐滴滴入氢氧化钠水溶液时，液滴能够悬浮在溶液中形成半透明状宝石红色小球，将小球烘干固化后即可得到宝石红色的纳米金固定化小球。在得到的纳米金固定化小球中，纳米金呈固定化状态，这种纳米金固定化小球能够以干颗粒的形式进行储存，其稳定性显著提高。需要说明的是，在本步骤中，可采用注射器(如5mL注射器等)吸取混合液以逐滴滴入氢氧化钠水溶液中，为了使液滴悬浮以形成小球，在滴混合液时，可适当搅拌氢氧化钠水溶液，搅拌转速以160-240r/min为宜。此外，烘干时间以30-48min为宜。

本发明提供的纳米金固定化小球的制备方法，将壳聚糖与二碳酸二叔丁酯酪氨酸进行接枝，利用壳聚糖接枝酪氨酸将氯金酸还原成纳米金，同时使纳米金包裹在壳聚糖凝胶网络中，进而以环氧氯丙烷作为粘结剂使其成型固化得到纳米金固定化小球，这种纳米金固定化小球能够以干颗粒的形式进行储存，相比于液态储存环境，其储存稳定性显著提高，无需现制现用，使用方便，便于现场检测。

在一优选实施例中，所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液的浓度为0.87-1.31mol/L，pH值为5.5-6.6；所述壳聚糖溶液由壳聚糖、水和醋酸按照质量比(0.4-0.6):(15.5-23.3):(0.504-0.756)配制；所述氯金酸水溶液的浓度为0.45-0.55mmol/L；所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.1mol/L。在本优选实施例中，进一步限定了2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液的浓度和pH值、壳聚糖溶液各组分的配比、氯金酸水溶液的浓度以及氢氧化钠水溶液的浓度，其均为最优选择，本领域技术人员可根据实际制备需要进行调整。

在进一步优选实施例中，所述的反应组分按照以下质量份数比：二碳酸二叔丁酯酪氨酸0.00613-0.0092份、N-羟基丁二酰亚胺0.0064-0.0096份、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.0272-0.0408份，2-(N-吗啡啉)乙磺酸0.875-1.312份，壳聚糖0.4-0.6份，氯金酸0.00659-0.00988份，环氧氯丙烷6.225-18.675份。本优选实施例中限定的各反应组分的配比为最优配比范围，在该配比范围内，纳米金能够很好地分散包裹于壳聚糖凝胶网络中，制备获得的纳米金固定化小球具有最优的稳定性。

在一优选实施例中，为了得到纯度较高的壳聚糖接枝酪氨酸溶液，步骤1中，所述超滤管的截留分子量为10kDa，以10000-12000r/min的速率离心超滤5-10min，并重复2-4次。

在一优选实施例中，步骤2中，静置反应具体为在37℃下静置反应24-36min。需要说明的是，本优选实施例中限定的静置反应条件为最优条件，当静置反应温度较低，例如室温时，其反应速率较慢、反应时间较长，不利于纳米金固定化小球的制备。

本发明实施例还提供了一种福美锌含量检测方法，包括如下步骤：

步骤①：将系列浓度的福美锌标准溶液分别加入到pH值为2-4的盐酸溶液中，所述福美锌标准溶液与盐酸溶液的体积比为1：9；分别加入利用上述任一项实施例所述的纳米金固定化小球的制备方法制备获得的纳米金固定化小球，反应0.5-1min，用相机采集反应后的纳米金固定化小球的彩色照片，打印并标注对应的福美锌标准溶液浓度，作为标准比色卡；

步骤②：将未知浓度的福美锌样品加入到pH值为2-4的盐酸溶液中，所述福美锌样品与盐酸溶液的体积比为1：9；加入所述纳米金固定化小球反应0.5-1min，观察反应后的纳米金固定化小球的颜色，并与所述标准比色卡对比，读取对应的福美锌浓度。

需要说明的是，纳米金固定化小球在pH值2-4的酸性环境中吸水膨胀，内部呈凝胶网络状结构，其中的纳米金与福美锌作用而聚集，使纳米金固定化小球颜色改变，且随着福美锌浓度的增加，纳米金固定化小球的颜色由宝石红色向蓝色逐渐改变。因而，通过系列浓度的福美锌标准溶液与纳米金固定化小球作用，并采集反应后的纳米金固定化小球的颜色，即可得到标准比色卡，以此标准比色卡为对比标准，即可实现对未知浓度福美锌样品的检测。

本发明提供的福美锌含量检测方法，在检测时，纳米金固定化小球在pH值2-4的酸性环境中吸水膨胀，内部呈凝胶网络状结构，当纳米金与福美锌作用聚集后，所形成的聚集体依然包裹在壳聚糖凝胶中，不易沉降，有效提高了检测体系的稳定性和检测结果的可重复性。同时，本发明提供的福美锌含量检测方法，相比于色谱法和毛细管电泳法等传统方法，其检测步骤简单，所需样品量少，检测效率高。

在一优选实施例中，所述福美锌标准溶液的系列浓度分别为0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L、9μmol/L和10μmol/L。在本优选实施例中，进一步限定了福美锌标准溶液的系列浓度，该系列浓度为最优浓度，采用该系列浓度的福美锌标准溶液建立标准比色卡，其检测限为0.01μmol/L，远低于我国最大农药残留限量5mg/Kg(即1.63μmol/L)，检测的灵敏度和准确性较高。可以理解的是，本领域技术人员也可以根据检测需要，选择合适浓度的福美锌标准溶液。

本发明实施例进一步提供了一种福美锌含量检测试剂盒，包括：纳米金固定化小球、检测液、提取剂和标准比色卡；其中，所述纳米金固定化小球采用如上述任一项实施例所述的纳米金固定化小球的制备方法制备获得；所述检测液为pH值2-4的盐酸溶液；所述提取剂为二氯甲烷与丁醇按体积比为1:1混合而成的混合液；所述标准比色卡的制备方法为：将系列浓度的福美锌标准溶液分别加入到pH值为2-4的盐酸溶液中，所述福美锌标准溶液与盐酸溶液的体积比为1：9；分别加入所述纳米金固定化小球，反应0.5-1min，用相机采集反应后的纳米金固定化小球的彩色照片，打印并标注对应的福美锌标准溶液浓度，作为所述标准比色卡。

本发明提供的福美锌含量检测试剂盒中，以二氯甲烷与丁醇按体积比为1:1混合而成的混合液作为提取剂提取待测样品中的福美锌，以pH值为2-4的盐酸溶液为检测液，采用纳米金固定化小球进行检测，相比于现有市售检测试剂盒，其使用方便，检测体系稳定性高，检测结果准确且可重复。

在一优选实施例中，所述福美锌标准溶液的系列浓度分别为0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L、9μmol/L和10μmol/L。在本优选实施例中，进一步限定了福美锌标准溶液的系列浓度，该系列浓度为最优浓度，采用该系列浓度的福美锌标准溶液建立标准比色卡，其检测限为0.01μmol/L，远低于我国最大农药残留限量5mg/Kg(即1.63μmol/L)，检测的灵敏度和准确性较高。可以理解的是，本领域技术人员也可以根据检测需要，选择合适浓度的福美锌标准溶液。

本发明实施例再进一步提供了一种利用上述任一项实施例所述的福美锌含量检测试剂盒检测福美锌含量的方法，包括如下步骤：

步骤Ⅰ：待测样品加入到提取剂中，所述提取剂体积与所述待测样品质量的比值为4-6mL/g，搅拌1-3min后静置1-3min，得到待测样品的提取液；

步骤Ⅱ：将所述提取液加入到检测液中，所述提取液与检测液的体积比为1：9，加入纳米金固定化小球反应0.5-1min，观察反应后的纳米金固定化小球的颜色，并与标准比色卡对比，读取对应的福美锌浓度。

本发明提供的利用福美锌含量检测试剂盒检测福美锌含量的方法，其检测步骤简单，检测结果准确且可重复。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的纳米金固定化小球的制备方法及其在福美锌检测中的应用，下面将结合具体实施例进行描述。

需要说明的是，2-(N-吗啡啉)乙磺酸的分子量为195.24g/mol；氯金酸的分子量为411.85g/mol。

实施例1

一种纳米金固定化小球的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：称取0.5g壳聚糖，加入19.4g水和0.63g醋酸，混合均匀，得到壳聚糖溶液；称取7.67mg二碳酸二叔丁酯酪氨酸、8mg N-羟基丁二酰亚胺和34mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加入5.6mL 1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液搅拌溶解，以1200r/min转速搅拌反应120min，再加入配制的壳聚糖溶液搅拌反应过夜，将反应后的溶液置于超滤管(截留分子量为10kDa)中，以11000r/min的速率离心超滤7min，并重复2-4次，得到壳聚糖接枝酪氨酸溶液。

步骤2：向步骤1得到的壳聚糖接枝酪氨酸溶液中，加入40mL 0.5mmol/L氯金酸水溶液，并调节溶液pH值至12，摇匀后，在37℃下静置反应30min，得到壳聚糖-纳米金溶液，其透射电镜图如图1所示，可见纳米金分散良好，直径约为13nm。

步骤3：将步骤2得到的壳聚糖-纳米金溶液与12.45g环氧氯丙烷混合，得到混合液，用5mL注射器吸取所述混合液，并逐滴滴入30mL 0.1mmol/L的氢氧化钠水溶液中，滴混合液时，以200r/min的转速搅拌氢氧化钠水溶液，以使滴入的混合液形成悬浮的小球，将所述小球滤出并烘干39min，得到纳米金固定化小球1。

实施例2

步骤1：称取0.4g壳聚糖，加入15.5g水和0.504g醋酸，混合均匀，得到壳聚糖溶液；称取6.13mg二碳酸二叔丁酯酪氨酸、6.4mg N-羟基丁二酰亚胺和27.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加入5.15mL0.87mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液搅拌溶解，以1100r/min转速搅拌反应96min，再加入配制的壳聚糖溶液搅拌反应过夜，将反应后的溶液置于超滤管(截留分子量为10kDa)中，以10000r/min的速率离心超滤5min，并重复2-4次，得到壳聚糖接枝酪氨酸溶液。

步骤2：向步骤1得到的壳聚糖接枝酪氨酸溶液中，加入35.56mL 0.45mmol/L氯金酸水溶液，并调节溶液pH值至11.5，摇匀后，在37℃下静置反应24min，得到壳聚糖-纳米金溶液。

步骤3：将步骤2得到的壳聚糖-纳米金溶液与6.225g环氧氯丙烷混合，得到混合液，用5mL注射器吸取所述混合液，并逐滴滴入25mL 0.1mmol/L的氢氧化钠水溶液中，滴混合液时，以160r/min的转速搅拌氢氧化钠水溶液，以使滴入的混合液形成悬浮的小球，将所述小球滤出并烘干30min，得到纳米金固定化小球2。

实施例3

步骤1：称取0.6g壳聚糖，加入23.3g水和0.756g醋酸，混合均匀，得到壳聚糖溶液；称取9.2mg二碳酸二叔丁酯酪氨酸、9.6mg N-羟基丁二酰亚胺和40.8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加入5.13mL1.31mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液搅拌溶解，以1300r/min转速搅拌反应144min，再加入配制的壳聚糖溶液搅拌反应过夜，将反应后的溶液置于超滤管(截留分子量为10kDa)中，以12000r/min的速率离心超滤10min，并重复2-4次，得到壳聚糖接枝酪氨酸溶液。

步骤2：向步骤1得到的壳聚糖接枝酪氨酸溶液中，加入43.62mL 0.55mmol/L氯金酸水溶液，并调节溶液pH值至12.5，摇匀后，在37℃下静置反应36min，得到壳聚糖-纳米金溶液。

步骤3：将步骤2得到的壳聚糖-纳米金溶液与18.675g环氧氯丙烷混合，得到混合液，用5mL注射器吸取所述混合液，并逐滴滴入45mL 0.1mmol/L的氢氧化钠水溶液中，滴混合液时，以240r/min的转速搅拌氢氧化钠水溶液，以使滴入的混合液形成悬浮的小球，将所述小球滤出并烘干48min，得到纳米金固定化小球3。

在避光、室温(23℃)条件下，将实施例1-3制备得到的纳米金固定化小球存放60天，观察其状态和颜色的变化情况，以测试其储存稳定性，测试结果如表1所示。

表1实施例1-3制备得到的纳米金固定化小球的储存稳定性

	刚制备完成时的颜色	60天后的颜色
			实施例1	宝石红色	宝石红色
实施例2	宝石红色	宝石红色
			实施例3	宝石红色	宝石红色

由表1可知，采用本发明提供的制备方法制备获得的纳米金固定化小球在存放60天后，其状态和颜色均未发生变化，由此说明其中的纳米金并未发生聚集，储存稳定性好。

实施例4

利用实施例1制备的纳米金固定化小球1检测福美锌含量的检测方法，包括如下步骤：

步骤①：将100μL系列浓度(0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L、9μmol/L和10μmol/L)的福美锌标准溶液分别加入到900μL的pH值为3的盐酸溶液中，分别加入制备的纳米金固定化小球1，反应0.7min，用相机采集反应后的纳米金固定化小球1的彩色照片，打印并标注对应的福美锌标准溶液浓度，作为标准比色卡，该标准比色卡中，随着福美锌浓度的增加，对应颜色由宝石红色到蓝色逐渐改变。

步骤②：将100μL未知浓度的福美锌样品1加入到900μL pH值为3的盐酸溶液中，加入制备的纳米金固定化小球1反应0.7min，观察反应后的纳米金固定化小球1的颜色，并与所述标准比色卡对比，读取对应的福美锌浓度。

实施例5

利用实施例2制备的纳米金固定化小球2检测福美锌含量的检测方法，包括如下步骤：

步骤①：将100μL系列浓度(0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L、9μmol/L和10μmol/L)的福美锌标准溶液分别加入到900μL的pH值为2的盐酸溶液中，分别加入制备的纳米金固定化小球2，反应0.5min，用相机采集反应后的纳米金固定化小球2的彩色照片，打印并标注对应的福美锌标准溶液浓度，作为标准比色卡，该标准比色卡中，随着福美锌浓度的增加，对应颜色由宝石红色到蓝色逐渐改变。

步骤②：将100μL未知浓度的福美锌样品2加入到900μL pH值为2的盐酸溶液中，加入制备的纳米金固定化小球2反应0.5min，观察反应后的纳米金固定化小球2的颜色，并与所述标准比色卡对比，读取对应的福美锌浓度。

实施例6

利用实施例3制备的纳米金固定化小球3检测福美锌含量的检测方法，包括如下步骤：

步骤①：将100μL系列浓度(0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L、9μmol/L和10μmol/L)的福美锌标准溶液分别加入到900μL的pH值为4的盐酸溶液中，分别加入制备的纳米金固定化小球3，反应1min，用相机采集反应后的纳米金固定化小球3的彩色照片，打印并标注对应的福美锌标准溶液浓度，作为标准比色卡，该标准比色卡中，随着福美锌浓度的增加，对应颜色由宝石红色到蓝色逐渐改变。

步骤②：将100μL未知浓度的福美锌样品3加入到900μL pH值为4的盐酸溶液中，加入制备的纳米金固定化小球3反应1min，观察反应后的纳米金固定化小球3的颜色，并与所述标准比色卡对比，读取对应的福美锌浓度。

对比例1

与实施例4的区别在于：加入的纳米金固定化小球为在避光、室温(23℃)条件下存放60天后的纳米金固定化小球1。

将实施例4-6、对比例1的检测结果与现有方法的检测结果进行比较，结果如表2所示。

表2实施例4-6、对比例1的检测结果与色谱法的检测结果比较

由表2可见，本发明提供的福美锌含量检测方法的检测结果与色谱法的检测结果一致，说明本发明提供的福美锌含量检测方法的检测准确度高。同时，根据实施例4和对比例1的检测结果可知，采用长期存放后的纳米金固定化小球进行检测，其检测结果与未存放的一致，说明纳米金固定化小球的储存稳定性好，采用这种纳米金固定化小球检测时，无需现制现用。

以实施例4为例，说明本发明提供的福美锌含量检测方法的检测稳定性：纳米金固定化小球1与福美锌样品1反应后立即呈红蓝色，48小时后仍呈红蓝色，未发生明显的颜色变化，说明检测体系的稳定性好。

实施例7

一种福美锌含量检测试剂盒1，包括：实施例1制备的纳米金固定化小球1，检测液、提取剂和标准比色卡；其中，所述检测液为pH值3的盐酸溶液；所述提取剂为二氯甲烷与丁醇按体积比为1:1混合而成的混合液；所述标准比色卡的制备方法与实施例4的步骤①相同。

利用福美锌含量检测试剂盒1检测福美锌含量的方法，包括如下步骤：

取1g西红柿样品，用清水洗去表面泥土，加入到5mL提取剂中，搅拌1-3min后静置1-3min，得到待测样品的提取液；

取100μL所述提取液加入到900μL检测液中，加入纳米金固定化小球1反应0.7min，观察反应后的纳米金固定化小球的颜色，并与标准比色卡对比，读取对应的福美锌浓度。

实施例8

一种福美锌含量检测试剂盒2，包括：实施例2制备的纳米金固定化小球2，检测液、提取剂和标准比色卡；其中，所述检测液为pH值2的盐酸溶液；所述提取剂为二氯甲烷与丁醇按体积比为1:1混合而成的混合液；所述标准比色卡的制备方法与实施例5的步骤①相同。

利用福美锌含量检测试剂盒2检测福美锌含量的方法，包括如下步骤：

取1g苹果样品，用清水洗去表面泥土，加入到4mL提取剂中，搅拌1-3min后静置1-3min，得到待测样品的提取液；

取100μL所述提取液加入到900μL检测液中，加入纳米金固定化小球2反应0.5min，观察反应后的纳米金固定化小球的颜色，并与标准比色卡对比，读取对应的福美锌浓度。

实施例9

一种福美锌含量检测试剂盒3，包括：实施例3制备的纳米金固定化小球3，检测液、提取剂和标准比色卡；其中，所述检测液为pH值4的盐酸溶液；所述提取剂为二氯甲烷与丁醇按体积比为1:1混合而成的混合液；所述标准比色卡的制备方法与实施例6的步骤①相同。

利用福美锌含量检测试剂盒3检测福美锌含量的方法，包括如下步骤：

取1g大米样品，用清水洗去表面泥土，加入到6mL提取剂中，搅拌1-3min后静置1-3min，得到待测样品的提取液；

取100μL所述提取液加入到900μL检测液中，加入纳米金固定化小球3反应1min，观察反应后的纳米金固定化小球的颜色，并与标准比色卡对比，读取对应的福美锌浓度。

将实施例7-9的检测结果与现有市售农药检测试剂盒比较，结果如表3所示，采用的现有市售农药检测试剂盒为北京诺亚威科技有限公司的农药残留速测试剂盒。

表3实施例7-9的检测结果与现有市售农药检测试剂盒比较

由表3可见，本发明提供的福美锌含量检测试剂盒的检测结果与现有市售农药检测试剂盒的检测结果相同，其检测结果可靠性高。

Claims (10)

1.一种纳米金固定化小球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：称取二碳酸二叔丁酯酪氨酸、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加入2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液搅拌溶解，反应96-144min，再加入壳聚糖溶液搅拌反应过夜，将反应后的溶液置于超滤管中离心超滤，得到壳聚糖接枝酪氨酸溶液；

步骤2：向步骤1得到的壳聚糖接枝酪氨酸溶液中，加入氯金酸水溶液，并调节溶液pH值至11.5-12.5，摇匀后静置反应，得到壳聚糖-纳米金溶液；

步骤3：将步骤2得到的壳聚糖-纳米金溶液与环氧氯丙烷混合，得到混合液，将所述混合液逐滴滴入氢氧化钠水溶液中形成悬浮的小球，将所述小球滤出并烘干，得到纳米金固定化小球。

2.根据权利要求1所述的纳米金固定化小球的制备方法，其特征在于：所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液的浓度为0.87-1.31mol/L，pH值为5.5-6.6；所述壳聚糖溶液由壳聚糖、水和醋酸按照质量比(0.4-0.6):(15.5-23.3):(0.504-0.756)配制；所述氯金酸水溶液的浓度为0.45-0.55mmol/L；所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.1mol/L。

3.根据权利要求1或2所述的纳米金固定化小球的制备方法，其特征在于：所述的反应组分按照以下质量份数比：二碳酸二叔丁酯酪氨酸0.00613-0.0092份、N-羟基丁二酰亚胺0.0064-0.0096份、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.0272-0.0408份，2-(N-吗啡啉)乙磺酸0.875-1.312份，壳聚糖0.4-0.6份，氯金酸0.00659-0.00988份，环氧氯丙烷6.225-18.675份。

4.根据权利要求1所述的纳米金固定化小球的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述超滤管的截留分子量为10kDa，以10000-12000r/min的速率离心超滤5-10min，并重复2-4次。

5.根据权利要求1所述的纳米金固定化小球的制备方法，其特征在于：步骤2中，静置反应具体为在37℃下静置反应24-36min。

6.一种福美锌含量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

将系列浓度的福美锌标准溶液分别加入到pH值为2-4的盐酸溶液中，所述福美锌标准溶液与盐酸溶液的体积比为1：9；分别加入利用权利要求1-5任一项所述的纳米金固定化小球的制备方法制备获得的纳米金固定化小球，反应0.5-1min，用相机采集反应后的纳米金固定化小球的彩色照片，打印并标注对应的福美锌标准溶液浓度，作为标准比色卡；

将未知浓度的福美锌样品加入到pH值为2-4的盐酸溶液中，所述福美锌样品与盐酸溶液的体积比为1：9；加入所述纳米金固定化小球反应0.5-1min，观察反应后的纳米金固定化小球的颜色，并与所述标准比色卡对比，读取对应的福美锌浓度。

7.根据权利要求6所述的福美锌含量检测方法，其特征在于：所述福美锌标准溶液的系列浓度分别为0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L、9μmol/L和10μmol/L。

8.一种福美锌含量检测试剂盒，其特征在于，包括：纳米金固定化小球、检测液、提取剂和标准比色卡；

其中，所述纳米金固定化小球采用如权利要求1-5任一项所述的纳米金固定化小球的制备方法制备获得；

所述检测液为pH值2-4的盐酸溶液；

所述提取剂为二氯甲烷与丁醇按体积比为1:1混合而成的混合液；

所述标准比色卡的制备方法为：将系列浓度的福美锌标准溶液分别加入到pH值为2-4的盐酸溶液中，所述福美锌标准溶液与盐酸溶液的体积比为1：9；分别加入所述纳米金固定化小球，反应0.5-1min，用相机采集反应后的纳米金固定化小球的彩色照片，打印并标注对应的福美锌标准溶液浓度，作为所述标准比色卡。

9.根据权利要求8所述的福美锌含量检测试剂盒，其特征在于：所述福美锌标准溶液的系列浓度分别为0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L、9μmol/L和10μmol/L。

10.一种利用如权利要求8或9所述的福美锌含量检测试剂盒检测福美锌含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

待测样品加入到提取剂中，所述提取剂体积与所述待测样品质量的比值为4-6mL/g，搅拌1-3min后静置1-3min，得到待测样品的提取液；

将所述提取液加入到检测液中，所述提取液与检测液的体积比为1：9，加入纳米金固定化小球反应0.5-1min，观察反应后的纳米金固定化小球的颜色，并与标准比色卡对比，读取对应的福美锌浓度。