CN110243815A - 基于智能设备的数字化处理检测生物样品中链霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于智能设备的数字化处理检测生物样品中链霉素的方法。利用槲皮素合成的银纳米溶液的羟基与链霉素的羟基和氨基通过氢键作用形成网状结构,导致银纳米粒子的聚集，使溶液由黄色变为樱桃红色，采用智能手机app捕获G(绿色)与B(蓝色)的颜色通道对应值，利用G/B的值对检测结果进行分析，从而实现牛奶中链霉素的定量检测。本发明利用槲皮素作为合成材料直接包覆金属纳米颗粒，绿色安全，且制备银纳米的方法简单，合成时间短，充分利用了纳米银灵敏度高的特点。通过纳米技术与智能手机平台相结合检测链霉素残留，将光学信号转换为可读信号对检测结果进行分析，所使用的分析仪器简单易得，操作方便。

Description

基于智能设备的数字化处理检测生物样品中链霉素的方法

技术领域

本发明属于小分子物质检测技术领域，具体涉及一种基于智能设备的数字化处理检测生物样品中链霉素的方法。

背景技术

链霉素是从链霉菌中析离得到的一种氨基糖苷类抗生素，对多种革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌均有较强的抗菌活性。在兽医学中，链霉素已经被广泛用于治疗各种动物的传染病，如奶牛的乳腺炎，猪、牛、羊等畜禽的肠炎和痢疾。这也就意味着在牛奶、肉类、肾脏和肝脏中均可发现不同程度的链霉素的残留，这对消费者来说无疑是一个潜在的危险。此外，链霉素对听觉神经毒性较大，长期使用引起耳聋，也可引起过敏反应，如皮疹、发烧甚至休克等，对人体健康存在极大的安全隐患。由此可见，特异性、灵敏性检测食物链中链霉素残留显得尤为重要。

目前为止，链霉素的检测已采用多种方法，包括微生物法、免疫分析法、色谱分析法、化学发光法、分光光度法等。然而，微生物学方法进展缓慢，尤其是在治疗检测方面，其可靠性、敏感性和特异性较差，而其他的常规方法虽然在痕量检测中具有较高的精度，但也存在着一些局限性，如仪器昂贵，检测时间长、需要训练有素的操作人员、需要精细的实验室设置等。此外，使用上述技术进行分析，往往需要繁琐的样品预处理程序，操作复杂，且操作难度大。因此，寻找一种简单、快速、经济、便携的检测方法来进行快速监测是十分必要的。

纳米技术是一个新兴的领域，纳米材料以其高效、表面易改性、高表面体积比等优点在许多领域得到了广泛的应用。金属纳米粒子是纳米检测技术中强有力的手段之一,尽管金属纳米颗粒的化学合成方法多种多样，但其中许多化学合成方法和合成材料都是有毒的，具有潜在的危险。且由于裸金属纳米粒子对聚集很敏感，因此为了克服聚集，金属纳米粒子需通过表面吸收具有稳定性的化合物来稳定自身形态。相比之下，基于天然生物材料的合成方法为获得这些纳米颗粒提供了另一种环保的方法。

以金属纳米粒子为基础的纳米技术发展了一种高选择性、高灵敏度的检测方法，该方法具有强稳定性和高性价比，克服了传统检测方法中存在的问题，许多新型的金属纳米粒子被用于检测技术。然而，银纳米粒子在这一领域的研究还不多。银纳米粒子与其他贵金属纳米粒子相比，它的优点包括更高的消光系数、更清晰的消光带、更高的散射消光比和极高的电场强度。纳米银的独特性质表明了它是一种高效的传感器探针，具有更高的灵敏度和选择性。本发明选用硝酸银作为银纳米粒子的合成材料，充分利用了纳米银的优点，使合成的银纳米粒子在特定抗生素的存在下呈现出明显的颜色变化，并且可以很容易地用肉眼观察到，通过颜色的变化来确定化学成分或化合物的浓度。

随着科技的发展，现代的智能手机更加小型化，并且具备了强劲的处理器，高清显示触摸屏，高像素的摄像头，无线传输模块和各种传感器元件，这都使得智能手机变得越来越完善化，自动化和智能化，并且使手机作为一种便携的分析检测设备成为了可能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于智能设备的数字化处理检测生物样品中链霉素的方法，实现了银纳米对牛奶中链霉素残留的检测。

本发明由如下技术方案实现的：一种基于智能设备的数字化处理检测生物样品中链霉素的方法，以槲皮素作为稳定剂和还原剂，将硝酸银溶液与槲皮素溶液混合，合成槲皮素包覆的银纳米溶液，合成的银纳米溶液与链霉素混合，银纳米粒子聚集，溶液由黄色变为樱桃红色，采用智能设备app捕获G与B的颜色通道对应值，利用G/B的值对检测结果进行分析，从而实现对生物样品中链霉素的定量检测。

具体步骤如下：

（1）槲皮素包覆的银纳米溶液的制备：以槲皮素作为稳定剂和还原剂，将硝酸银溶液与槲皮素溶液的体积比为AgNO _3: Qt (v/v)=4:1混合，50℃搅拌，5min后逐滴滴加1mL浓度为15mmol/L的Na₂CO₃溶液，继续搅拌1h，溶液由无色变为黄色，继续颜色变暗后即为形成了槲皮素包覆的银纳米粒子；

（2）链霉素与银纳米溶液的反应：反应环境用NaOH和HCl来调节溶液的pH，控制反应环境pH值为7~7.5；将10µL链霉素样品与1mL所制备的银纳米粒子溶液混合反应；其中：链霉素样品溶液浓度为10-150µmol/L；

（3）智能设备定量分析结果：裸眼观察溶液颜色变化，定性分析检测结果；然后用智能设备的图像应用程序捕获相应的银纳米溶液的RGB值，以链霉素的浓度为横坐标，G/B的比值为纵坐标作图对检测结果进行准确定量分析,建立对应的检测标准曲线；

（4）实际样品的处理与检测：实际样品5mL,置于离心管中，分别加入100µL乙酸锌溶液和100µL亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀后在5000r/min下离心5min，最后取上层清液并通过0.22µm的膜进行过滤，滤液收集起来备用；

反应条件为：AgNO _3: Qt (v/v)=4:1、反应体系pH=7~7.5，进行实际样品检测，对其进行加标回收实验，链霉素加标浓度分别为30µmol/L、70µmol/L或130µmol/L；分别取10µL滤液与1mL的银纳米溶液混合，先用裸眼观察溶液颜色的变化定性分析检测结果，再用智能设备对反应现象拍照记录并对检测结果准确定量。

所述智能设备为智能手机，智能手机的图像应用程序为取色器app；反应结果用智能手机拍照记录。

步骤（2）中链霉素与银纳米溶液的反应环境pH值为7.5。

步骤（3）中所述检测标准曲线为：线性回归方程为y=-0.0018x+1.265，其相关系数R²= 0.997，检出限为0.63µmol/L，定量限为2.08µmol/L。

步骤（4）中所述实际样品为牛奶。

与现有技术相比，本发明有益效果为：

本发明首次利用槲皮素作为合成银纳米的稳定剂和还原剂，绿色安全。

本发明利用合成的银纳米溶液与链霉素在中性条件下反应产生具有一定颜色的产物，且该产物呈现出明显的从黄色到红色的颜色变化并能够长时间稳定存在，故可以直接肉眼判读检测结果，实现了对待测样品中链霉素残留的快速检测。

本发明首次通过纳米技术与智能手机平台相结合检测链霉素残留，将光学信号转换为可读信号，利用智能手机的数字化处理功能，依据G/B值对检测结果进行分析，根据显色程度的不同实现对链霉素含量的快速检测，且在实际样品检测中结果准确误差小。

整个检测过程操作简单、快速灵敏。利用绿色安全的材料合成银纳米，检测试剂用量少，并结合智能手机的数字化处理功能，具有灵敏度高、检测速度快、绿色安全、重现性好等显著优势。相比于传统的分析方法，具有检测高效、成本低廉、耗时短的等优点，且该检测方法具有便携性和实用性，应用范围更为广泛。

本发明首次利用槲皮素作为合成材料直接包覆金属纳米颗粒，槲皮素（3,3',4',5,7-五羟基黄酮，Qt）是自然界拥有多种生物活性的一种黄酮醇类化合物，它具有较高的超离域度，完整的大π键共轭体系，强配位氧原子和独特的空间构型，故可作为金属离子良好的空间配体。以槲皮素作为合成材料来稳定金属纳米颗粒，更加绿色环保。

本发明通过纳米技术与智能手机平台相结合检测链霉素残留，将光学信号转换为可读信号，利用智能手机的数字化处理功能，依据G/B值对检测结果进行分析，根据显色程度的不同实现对链霉素含量的快速检测。与传统分析平台相比，本发明在快速分析、易于操作、低成本和便携的设备方面提供了显著的优势。此外，本发明将纳米技术的高灵敏度与智能手机快速便捷的特点相结合创建了一种智能类型的纳米检测方法。

本发明在槲皮素包覆的银纳米溶液中加入链霉素后，链霉素的羟基和氨基与槲皮素包覆的银纳米的羟基通过氢键作用形成网状结构,导致银纳米粒子的聚集，使溶液由黄色变为樱桃红色。

附图说明

图1为实施例1中紫外可见光谱对银纳米合成的表征结果；

图2为实施例2中AgNO₃和Qt的不同配比对合成银纳米的影响；图中：2:1、3:1、5:1呈现淡黄色,4:1呈现亮黄色；

图3为实施例2中不同pH值对银纳米溶液以及G/B的影响；图中：加链霉素前：pH=2时呈现无色，随pH的增大黄色逐渐加深；加链霉素后，pH<5时溶液呈现无色；pH=6时呈现紫红色；pH=7-7.5时呈现樱桃红色；pH=8-9时呈现橙红色；pH=10时呈现黄色；

图4为实施例2中不同pH对∆(G/B)的影响；

图5为实施例3中银纳米与链霉素反应的线性关系。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述说明，下面描述的实施例仅用于解释本发明，并非对本发明的保护范围进行限制。

实施例中所需试剂：槲皮素、硝酸银、硫酸链霉素、乙酸锌、亚铁氰化钾、氢氧化钠、碳酸钠均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

实施例1：槲皮素包覆银纳米溶液的制备

制备方法：以槲皮素作为稳定剂和还原剂，所有溶液均在去离子水中制备。将100µmol/L的硝酸银溶液(AgNO₃)与100µmol/L槲皮素溶液(Qt)按不同比例(AgNO₃:Qt,v/v)混合，混合溶液在50℃的温度下搅拌，5分钟后，逐滴滴入1mL Na₂CO₃溶液（15mmol/L)，继续搅拌1小时，混合溶液在搅拌几分钟后由无色变为黄色，并随时间变暗，表明形成了槲皮素包覆的银纳米粒子。

实验结果如图1所示，结果显示：只有硝酸银溶液或槲皮素溶液存在时，在410nm处并没有特征峰出现，而槲皮素溶液与碳酸钠溶液混合存在时，在320nm和370nm处出现最大光吸收，但410nm处仍未出现，即只有硝酸银溶液与槲皮素溶液混合后且加入一定量的碳酸钠溶液搅拌一段时间后，才会在410nm处出现特征峰，特征峰的出现意味着银纳米粒子的形成。

实施例2：反应条件的优化

槲皮素和硝酸银溶液的最适配比：将硝酸银溶液和槲皮素溶液(v/v）分别按2:1,3:1,4:1,5:1的比例混合，按照实施例1的方法合成银纳米粒子，用智能手机分别对每个比例下的银纳米粒子溶液拍摄照片记录下来。

实验结果如图2所示，结果显示：随着硝酸银体积的增加，银纳米的颜色由淡黄色逐渐变成深黄色，当AgNO _3: Qt (v/v)=4:1时，G/B的结果最大，说明此时银纳米的颜色最深，吸光度最大，继续增加硝酸银的体积时，G/B值降低，这可能是由于银离子的聚集使得纳米银的合成减少，颜色变浅。因此，制备槲皮素包覆的银纳米粒子的最适比例为4:1，根据该比例制备银纳米粒子并用于进一步的实验研究。

pH的影响：利用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节反应体系的pH，分别探究不同的pH对反应体系的影响，用智能手机对反应现象拍照记录。

实验结果如图3~4所示，结果显示：随着pH值的增加，银纳米溶液的颜色逐渐加深。根据G/B的数据结果可知，pH为7左右时，G/B值最大并逐渐趋于平稳，这表明，银纳米溶液的颜色随pH的增加在pH=7时，颜色趋于稳定。其中，在pH=2极酸的环境条件下，纳米银溶液的颜色褪为无色，G/B值最小，这可能是因为槲皮素化合物在酸性条件下闭环，从而恢复完整的黄酮醇结构，以及槲皮素化合物的羟基被质子化，导致银纳米粒子聚集，从而使溶液颜色由黄色变为无色。

当pH=7.5时，溶液颜色变化最明显，且∆(G/B)的值最大。当pH>7.5时，∆(G/B)的值显著降低，说明银纳米溶液的碱性越强，加入链霉素后溶液颜色的变化程度不明显，特别是在pH=10时，裸眼观察即可知银纳米溶液颜色与加药前溶液颜色相差不大，这可能是因为银纳米溶液在碱性条件下稳定，而链霉素在强碱性条件下易水解失效，导致溶液颜色不发生改变。因此，选择pH=7.5作为实验的最佳反应条件。

实施例3：链霉素定量检测的线性范围和检出限

在最优的实验条件下，通过改变链霉素的浓度（10-200µmol/L），分别取10µL不同浓度的链霉素标准样品与1mL的银纳米溶液混合，裸眼观察溶液颜色的变化定性分析检测结果，并用智能手机的应用程序捕获了相应的银纳米溶液的RGB值，以链霉素的浓度为横坐标，G/B的比值为纵坐标作图对检测结果准确定量。

结果如图5所示：该检测方法在链霉素含量为10-150µmol/L的浓度梯度范围内存在良好的线性关系，线性回归方程为y=-0.0018x+1.265，其相关系数R²= 0.997，通过计算11次空白样品的标准偏差确定该检测方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)：LOD(LOQ)=F×SD/b,其中F为LOD和LOQ的因子，分别为3和10，SD是指空白样品的标准偏差，b是指回归方程的斜率，经计算得检出限为0.63µmol/L，定量限为2.08µmol/L。

实施例4 ：实际牛奶样品的处理与检测

样品的预处理：称取牛奶样品5mL,置于10mL离心管中，然后分别加入100µL乙酸锌溶液和100µL亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀后在5000r/min下离心5min，最后取上层清液并通过0.22µm的膜进行过滤，滤液收集起来备用。

反应条件：在最适的反应条件下（AgNO _3: Qt (v/v)=4:1、反应体系pH=7~7.5），进行实际样品检测以及对其进行了加标回收实验（链霉素加标浓度分别为30µmol/L、70µmol/L、130µmol/L）

在优化条件下，分别取10µL滤液与1mL的银纳米溶液混合，先用裸眼观察溶液颜色的变化定性分析检测结果，再用智能手机对反应现象拍照记录并处理对检测结果准确定量。

检测结果如表1所示，结果显示：三种浓度的链霉素在牛奶样品中的回收率分别为104.0%，101.3%，98.9%，RSD的范围为1.4%--3.0%（n=3)，这些结果表明，该检测方法准确可靠，可用于实际牛奶样品中抗生素残留的测定。

表1 牛奶样品中链霉素的检测

Claims (6)

1.一种基于智能设备的数字化处理检测生物样品中链霉素的方法，其特征在于：以槲皮素作为稳定剂和还原剂，将硝酸银溶液与槲皮素溶液混合，合成槲皮素包覆的银纳米溶液，合成的银纳米溶液与链霉素混合，银纳米粒子聚集，溶液由黄色变为樱桃红色，采用智能设备app捕获G与B的颜色通道对应值，利用G/B的值对检测结果进行分析，从而实现对生物样品中链霉素的定量检测。

2.根据权利要求1所述的一种基于智能设备的数字化处理检测生物样品中链霉素的方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）槲皮素包覆的银纳米溶液的制备：以槲皮素作为稳定剂和还原剂，将硝酸银溶液与槲皮素溶液的体积比为AgNO _3: Qt (v/v)=4:1混合，50℃搅拌，5min后逐滴滴加1ml浓度为15mmol/L的Na₂CO₃溶液，继续搅拌1h，溶液由无色变为黄色，继续颜色变暗后即为形成了槲皮素包覆的银纳米粒子；

（2）链霉素与银纳米溶液的反应：反应环境用NaOH和HCl来调节溶液的pH，控制反应环境pH值为7~7.5；将10µL链霉素样品与1ml所制备的银纳米粒子溶液混合反应；其中：链霉素样品溶液浓度为10-150µmol/L；

（3）智能设备定量分析结果：裸眼观察溶液颜色变化，定性分析检测结果；然后用智能设备的图像应用程序捕获相应的银纳米溶液的RGB值，以链霉素的浓度为横坐标，G/B的比值为纵坐标作图对检测结果进行准确定量分析,建立对应的检测标准曲线；

（4）实际样品的处理与检测：实际样品5mL,置于离心管中，分别加入100µL乙酸锌溶液和100µL亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀后在5000r/min下离心5min，最后取上层清液并通过0.22µm的膜进行过滤，滤液收集起来备用；

反应条件为：AgNO _3: Qt (v/v)=4:1、反应体系pH=7~7.5，进行实际样品检测，对其进行加标回收实验，链霉素加标浓度分别为30µmol/L、70µmol/L或130µmol/L；分别取10µL滤液与1mL的银纳米溶液混合，先用裸眼观察溶液颜色的变化定性分析检测结果，再用智能设备对反应现象拍照记录并对检测结果准确定量。

3.根据权利要求2所述的一种基于智能设备的数字化处理检测生物样品中链霉素的方法，其特征在于：所述智能设备为智能手机，智能手机的图像应用程序为取色器app；反应结果用智能手机拍照记录。

4.根据权利要求2所述的一种基于智能设备的数字化处理检测生物样品中链霉素的方法，其特征在于：步骤（2）中链霉素与银纳米溶液的反应环境pH值为7.5。

5.根据权利要求2所述的一种基于智能设备的数字化处理检测生物样品中链霉素的方法，其特征在于：步骤（3）中所述检测标准曲线为：线性回归方程为y=-0.0018x+1.265，其相关系数R²= 0.997，检出限为0.63µmol/L，定量限为2.08µmol/L。

6.根据权利要求2所述的一种基于智能设备的数字化处理检测生物样品中链霉素的方法，其特征在于：步骤（4）中所述实际样品为牛奶。