CN109765208A - 一种天然植物提取物中亚硝酸盐的测定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种天然植物提取物中亚硝酸盐的检测技术，采用表面增强拉曼光谱法测定。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与硝基苯胺和1‑苯胺发生重氮化反应，生成4‑(4‑消极苯基偶氮)‑1‑萘胺，NNA可以吸附在贵金属纳米粒子的表面，产生很强的SERS信号，间接测得亚硝酸盐含量，实现快速定性、定量、便捷、低成本。

Description

一种天然植物提取物中亚硝酸盐的测定

技术领域

本发明涉及一种天然植物提取物中亚硝酸盐的快速检测技术，尤其涉及一种采用拉曼光谱特征峰信号强度的检测方法，适用于保健食品中天然植物提取物的亚硝酸盐检测方法。

背景技术

亚硝酸盐广泛存在于土壤、水体、食品等物质中，可以作为防腐剂，对肉毒梭状芽孢杆菌具有较强的抑制作用；另一方面作为天然植物提取物中的发色剂，在加工工艺中使植物提取物呈现良好的色泽。但亚硝酸盐使用量超过一定标准会导致NO₂ ^-大量残留，残留的NO₂ ^-和蛋白质代谢产物仲胺结合可生成亚硝胺。这些亚硝基化合物均是致癌因子，能诱导实验动物发生癌变，所以国家对食品中亚硝酸盐的含量有严格的规定。

联合国世界卫生组织和粮农组织早在1973年就制定了食品中硝酸盐的限量标准，以ADI 值为基础，提出蔬菜可食部分中硝酸盐含量的卫生标准为432mg/kg(鲜样)，亚硝酸盐成人每人每日容许量为7.8mg。

目前，食品亚硝酸盐和硝酸盐的测定(GB/T5009.33-2016)两种方法：离子色谱法、分光光度计法。第一法离子色谱法，测定原理为试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，采用相应的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器检测。以保留时间定性，外标法定量。

第二法分光光度法，测定原理为：亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定，硝酸盐采用镉柱还原法测定。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐，测得亚硝酸盐总量，由此总量减去亚硝酸盐含量，即得试样中硝酸盐含量。

荧光分析法具有操作简便、灵敏、快速的特点，但干扰因素多，分析过程较长。光度法操作简便，但灵敏度欠佳等。

拉曼光谱1928年被发现，1930年获得诺贝尔物理学奖，它普遍存在于一切分子中，能够可靠地提供分子的结构信息，不受各种溶剂的影响，随着激光光源的使用，激光拉曼光谱已经成为重要化合物的分析手段，广泛应用于刑侦鉴定、矿物质分析等领域，1974年FleischmannM发现的表面增强拉曼散射使痕量物质检测成为可能。表面增强拉曼光谱技术(SERS)利用痕量分子吸附于Cu、Ag、Au等金属溶胶和电极表面，其拉曼光谱信号可增强10⁴～ 10⁶，克服了常规拉曼光谱法灵敏度低的缺点。近年来随着表面增强技术、傅里叶红外技术与表面增强拉曼光谱的结合，已开始应用于天然植物提取物安全检测。

表面增强拉曼光谱(SERS)具有快速灵敏、信息丰富、选择性高等特点，但主要用于定性检测。

本发明提供一种基于表面增强拉曼光谱试验，稳定、快速、可定性、定量的检测天然植物提取物中亚硝酸盐的方法。

发明内容

本发明涉及一种天然植物提取物中亚硝酸盐的检测技术，采用表面增强拉曼光谱法(SERS) 测定。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与硝基苯胺和1-苯胺发生重氮化反应，生成4-(4-消极苯基偶氮)-1-萘胺(简称，NNA)，NNA可以吸附在贵金属纳米粒子的表面，产生很强的SERS信号，间接测得亚硝酸盐含量，实现快速定性、定量、便捷、低成本。

其中，包括以下步骤：

(一)试剂配制

1.乙醇(10％)：吸取10mL无水乙醇，用水定容至100mL。

2.盐酸(0.1mol/L)：量取8.3mL盐酸，用水稀释至1000mL。

3.1-萘胺溶液(1g/L)：称取0.1000g 1-萘胺，溶于10％乙醇溶液中，用10％乙醇溶液定容至100mL。

4.对硝基苯胺溶液(1mol/L)：称取0.1000g 1-萘胺，溶于10％乙醇溶液中，用10％乙醇溶液定容至100mL。

(二)标准溶液配制

1.亚硝酸钠(NaNO₂，CAS号：7632-00-0)：基准试剂，或采用具有标准物质证书的亚硝酸盐标准溶液。

2.亚硝酸钠标准溶液(100mg/L，以亚硝酸钠计)：准确称取0.1000g于110℃～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解，移入1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

3.亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL、10.00mL亚硝酸钠标准溶液，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，得到浓度为0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L的标准使用液。

(三)分析步骤

仪器：天平：感量为0.1mg和1mg；便携式拉曼光谱仪；漩涡混匀器。

仪器条件：功率200mW，积分时间10sec，平均次数3次，平滑参数1，定量时每个样品平行测定3次取平均值。

1.标准曲线

取7只5mL离心管，均加入适量对硝基苯胺溶液和1-苯胺溶液，用盐酸溶液稀释至3mL 混匀，室温放置10min，分别加入水、50μL亚硝酸盐标准使用液0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L，在室温条件下反应20min，得到7种浓度的重氮化反应产物。

所述加入的对硝基苯胺溶液与1-苯胺溶液体积比为1-10:1；优选1-5:1；更优选4:1；

移取一定量贵金属纳米粒子溶液于1cm石英池中，加入适量上述重氮化反应产物，混匀放置5min，在便携式拉曼光谱仪器测定SERS光谱，分别计算720、1459、1609cm^-1处的特征峰面积。以峰面积为纵坐标，亚硝酸盐浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到3个标准曲线方程。

所述贵金属纳米粒子为金纳米粒子、银纳米粒子或铜纳米粒子中的任意一种，优选银纳米粒子；

所述加入的贵金属纳米粒子溶液与重氮化反应产物体积比为1-10:1；优选1-5:1；更优选 3:1。

2.试样提取

称取一定质量的(精确至0.001g)试样，第一次加适量体积量水摇匀，依次加入适量体积量亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入适量乙酸锌溶液，加水至2.5mL，摇匀，过0.45μm的微孔膜备用。

所述第一次加入水量与试样量的比例关系为，V(水量mL):m(试样g)＝1-10:1；优选 1-5:1；更优选4:1；

所述加入的亚铁氰化钾溶液、试样量的比例关系为，V(亚铁氰化钾溶液μL):m(试样 g)＝100-500:1；优选100-250:1；更优选200:1；

所述加入的乙酸锌溶液与试样量的比例关系为，V(乙酸锌溶液μL):m(试样g)＝100-500:1；优选100-250:1；更优选200:1；

所述加入的亚铁氰化钾溶液、乙酸锌溶液比例关系为，V(乙酸锌溶液μL):V(乙酸锌溶液μL)＝1-10:1；优选1-5:1；更优选1:1；

3.重氮反应

5mL离心管中加入适量对硝基苯胺溶液和1-苯胺溶液，用盐酸溶液稀释至3.0mL，室温放置10min，加入50μL亚硝酸标准溶液或样品溶液，在室温条件下反应20min，得到重氮化反应产物，同时做空白试验。

所述加入的对硝基苯胺溶液与1-苯胺溶液体积比为1-10:1；优选1-5:1；更优选4:1；

4.SERS检测

移取一定量贵金属纳米粒子溶液于1cm石英池中，加入适量上述重氮化反应产物，混匀放置5min，在便携式拉曼光谱仪器测定SERS光谱，分别计算720、1459、1609cm^-1处的特征峰面积。以峰面积为纵坐标，亚硝酸盐浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到3个标准曲线方程。

所述贵金属纳米粒子为金纳米粒子、银纳米粒子或铜纳米粒子中的任意一种，优选银纳米粒子；

所述加入的贵金属纳米粒子溶液与重氮化反应产物体积比为1-10:1；优选1-5:1；更优选 3:1。

5.分析结果的表述

试样中亚硝酸盐(以亚硝酸钠计)的含量按式(1)计算：

式中：

X——试样中的亚硝酸盐的含量，单位为毫克/千克(mg/kg)；

m——测定用样液中亚硝酸钠的质量，单位为毫克(mg)；

2.5——转化系数；

C₇₂₀，C₁₄₉₅，C₁₆₀₉，C_0，720，C_0，1459,C_0,1609——分别为由特征峰720、1459、1609的峰面积查标准曲线得到的试样和空白试验中亚硝酸盐的浓度，单位为毫克/升(mg/L)；

C，C₀——分别为由三个特征峰曲线计算得到试样和空白试样中亚硝酸盐的平均浓度，单位为毫克/升(mg/L)；

2.5——试样处理液总体积，单位为毫升(mL)。

计算结果保留两位有效数字。

在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。

检出限为1.0mg/kg。

本发明采用专用并固化于便携式拉曼光谱仪的专用软件来实现的一种对天然植物提取物中亚硫酸盐的超快速、高灵敏、低成本、现场鉴别方法。操作简单，不需要操作人员有较强的专业背景，读数直观，可直接从仪器界面上读取数值，不用前处理样品。

本研究将该技术应用到天然植物提取物中亚硫酸盐的定量检测，通过对亚硫酸盐的特性拉曼光谱分析，检测天然植物提取物中亚硫酸盐含量情况，试验在15min内完成，检出限达到1.0mg/kg，完全满足国家标准要求，具有准确、快速、无损、低成本的明显特点，适用于现场应急检测、企业自控检测和大批量样品筛查检测等，有效辨别问题天然植物提取物，保护消费者权益。

本发明的优点：

1、简单方便，不需要繁琐的前处理样品的时间，成本低廉，利于现场操作，快速给出检测结果；

2、同时实现定性分析和定量检测；

3、大大减少前处理时大量溶剂的使用，减少对操作人员的危害，同时减少废弃物对环境的污染。

附图说明

图1天然植物提取物中含亚硝酸盐的特征峰(表面增强拉曼光谱)

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细描述。但不以此限制本发明。

(一)试剂配制

1.乙醇(10％)：吸取10mL无水乙醇，用水定容至100mL。

2.盐酸(0.1mol/L)：量取8.3mL盐酸，用水稀释至1000mL。

3. 1-萘胺溶液(1g/L)：称取0.1000g 1-萘胺，溶于10％乙醇溶液中，用10％乙醇溶液定容至100mL。

4.对硝基苯胺溶液(1mol/L)：称取0.1000g 1-萘胺，溶于10％乙醇溶液中，用10％乙醇溶液定容至100mL。

(二)标准溶液配制

1.亚硝酸钠(NaNO₂，CAS号：7632-00-0)：基准试剂，或采用具有标准物质证书的亚硝酸盐标准溶液。

2.亚硝酸钠标准溶液(100mg/L，以亚硝酸钠计)：准确称取0.1000g于110℃～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解，移入1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

3.亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL、10.00mL亚硝酸钠标准溶液，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，得到浓度为0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L的标准使用液。

下述实施例中(一)试剂配制、(二)标准溶液配制中一致，不再分别描述。

实施例1甘草提取物中的亚硝酸盐的含量

(三)分析步骤

仪器：天平：感量为0.1mg和1mg；便携式拉曼光谱仪；漩涡混匀器。

仪器条件：功率200mW，积分时间10sec，平均次数3次，平滑参数1，定量时每个样品平行测定3次取平均值。

1.标准曲线

取7只5mL离心管，均加入340μL的对硝基苯胺溶液和86μL的1-苯胺溶液，用盐酸溶液稀释至3.0mL混匀，室温放置10min，分别加入水、50μL亚硝酸盐标准使用液0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L，在室温条件下反应20min，得到7 种浓度的重氮化反应产物。

移取300μL银胶溶液于1cm石英池中，加入100μL上述重氮化反应产物，混匀放置5min，在便携式拉曼光谱仪器测定SERS光谱，分别计算720、1459、1609cm^-1处的特征峰面积。以峰面积为纵坐标，亚硝酸盐浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到3个标准曲线方程。

2.试样提取

称取0.501g(精确至0.001g)试样，加2.0mL水摇匀，依次加入100μL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入100μL乙酸锌溶液，加水至2.5mL，摇匀，过0.45μm的微孔膜备用。

3.重氮反应

5mL离心管中加入340μL的对硝基苯胺溶液和86μL的1-苯胺溶液，用盐酸溶液稀释至 3.0mL，室温放置10min，加入50μL亚硝酸标准溶液或样品溶液，在室温条件下反应20min，得到重氮化反应产物，同时做空白试验。

4. SERS检测

移取300μL银胶溶液于1cm石英池中，加入100μL重氮化反应产物，混匀放置5min后测定SERS光谱，分别计算720、1459、1609cm^-1处的峰面积。

分析结果的表述

试样中亚硝酸盐(以亚硝酸钠计)的含量按式(1)计算：

式中：

X——试样中的亚硝酸盐的含量，单位为毫克/千克(mg/kg)；

m——测定用样液中亚硝酸钠的质量，单位为毫克(mg)；

2.5——转化系数；

C₇₂₀，C₁₄₉₅，C₁₆₀₉，C_0，720，C_0，1459,C_0,1609——分别为由特征峰720、1459、1609的峰面积查标准曲线得到的试样和空白试验中亚硝酸盐的浓度，单位为毫克/升(mg/L)；

C，C₀——分别为由三个特征峰曲线计算得到试样和空白试样中亚硝酸盐的平均浓度，单位为毫克/升(mg/L)；

2.5——试样处理液总体积，单位为毫升(mL)。

根据上述分析过程，计算所得甘草提取物中亚硝酸盐的含量

X＝(2.15-0.55)*2.5/0.501＝7.98mg/kg

对比实验

根据(GB/T5009.33-2016)亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。

仪器：日本岛津2700分光光度计

实验步骤：1)试样处理。称样0.500g(精确至0.001g)试样，加3.5mL水和0.6mL氢氧化钠溶液，搅拌均匀，用氢氧化钠调样品pH＝8，定量转移至5mL容量瓶中，加入0.5mL硫酸锌，混匀，如不产生白色沉淀，再补加0.1～0.25mL氢氧化钠，混匀。置于60℃水浴中加热10min，取出后冷至室温，加水定容至刻度，摇匀，过滤，弃去1mL初滤液，滤液备用。

2)标准曲线的绘制。取0.00mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL亚硝酸钠标准使用液，分别置于10mL带塞比色管中。于标准管中分别加入0.225mL氯化铵缓冲溶液，加0.125mL、60％乙酸后立即加入0.25mL显色剂，加水至刻度、混匀，在暗处放置25min，用1cm比色杯，以零管调节零点，于波长550nm处测吸光度，绘制标准曲线。3)亚硝酸盐的测定。吸取0.50mL上述滤液于10mL带塞比色管中，于标准管中分别加入0.3mL氯化铵缓冲溶液，依法操作，同时做空白试验。

数据处理

亚硝酸盐标准曲线应用。试样溶液吸光度0.33，查标准曲线相当于0.85mL标准溶液。

结果计算:X＝(0.85*5*1000)/(0.500*0.5/5*1000)＝8.50mg/kg。

3结论

实施例1与对比实验的检测结果差值为6％，满足要求。

实施例2白术提取物中亚硝酸盐的含量

样品：取自市售白术提取物。

(三)分析步骤

仪器：天平：感量为0.1mg和1mg；便携式拉曼光谱仪；漩涡混匀器。

仪器条件：功率200mW，积分时间10sec，平均次数3次，平滑参数1，定量时每个样品平行测定3次取平均值。

1.标准曲线

取7只5mL离心管，均加入100μL的对硝基苯胺溶液和50μL的1-苯胺溶液，用盐酸溶液稀释至3.0mL混匀，室温放置10min，分别加入水、50μL亚硝酸盐标准使用液0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L，在室温条件下反应20min，得到7 种浓度的重氮化反应产物。

移取250μL银胶溶液于1cm石英池中，加入50μL上述重氮化反应产物，混匀放置5min，在便携式拉曼光谱仪器测定SERS光谱，分别计算720、1459、1609cm^-1处的特征峰面积。以峰面积为纵坐标，亚硝酸盐浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到3个标准曲线方程。

2.试样提取

称取0.478g(精确至0.001g)试样，加1.8mL水摇匀，依次加入90μL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入90μL乙酸锌溶液，加水至2.5mL，摇匀，过0.45μm的微孔膜备用。

3.重氮反应

5mL离心管中加入100μL的对硝基苯胺溶液和50μL的1-苯胺溶液，用盐酸溶液稀释至 3.0mL，室温放置10min，加入50μL亚硝酸标准溶液或样品溶液，在室温条件下反应20min，得到重氮化反应产物，同时做空白试验。

4. SERS检测

移取250μL银胶溶液于1cm石英池中，加入50μL重氮化反应产物，混匀放置5min后测定SERS光谱，分别计算720、1459、1609cm^-1处的峰面积。

分析结果的表述

试样中亚硝酸盐(以亚硝酸钠计)的含量按式(1)计算：

X＝1.0mg/kg。

Claims (5)

1.一种天然植物提取物中亚硝酸盐的测定，其中：包括以下步骤：

(一)试剂配制

a.乙醇：吸取10mL无水乙醇，用水定容至100mL；

b.盐酸：量取8.3mL盐酸，用水稀释至1000mL；

c.1-萘胺溶液：称取0.1000g 1-萘胺，溶于10％乙醇溶液中，用10％乙醇溶液定容至100mL；

d.对硝基苯胺溶液：称取0.1000g 1-萘胺，溶于10％乙醇溶液中，用10％乙醇溶液定容至100mL；

(二)标准溶液配制

a.亚硝酸钠：基准试剂，或采用具有标准物质证书的亚硝酸盐标准溶液；

b.亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.1000g于110℃～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解，移入1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀；

c.亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL、10.00mL亚硝酸钠标准溶液，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，得到浓度为0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L的标准使用液；

(三)分析步骤

仪器：天平：感量为0.1mg和1mg；便携式拉曼光谱仪；漩涡混匀器；

仪器条件：功率200mW，积分时间10sec，平均次数3次，平滑参数1，定量时每个样品平行测定3次取平均值；

a.标准曲线

取7只5mL离心管，均加入适量对硝基苯胺溶液和1-苯胺溶液，用盐酸溶液稀释至3mL混匀，室温放置10min，分别加入水、50μL亚硝酸盐标准使用液0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L、10.00mg/L，在室温条件下反应20min，得到7种浓度的重氮化反应产物；

移取一定量贵金属纳米粒子溶液于1cm石英池中，加入适量上述重氮化反应产物，混匀放置5min，在便携式拉曼光谱仪器测定SERS光谱，分别计算720、1459、1609cm^-1处的特征峰面积；以峰面积为纵坐标，亚硝酸盐浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到3个标准曲线方程；

b.试样提取

称取一定质量的试样，第一次加适量体积量水摇匀，依次加入适量体积量亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入适量乙酸锌溶液，加水至2.5mL，摇匀，过0.45μm的微孔膜备用；

c.重氮反应

5mL离心管中加入适量对硝基苯胺溶液和1-苯胺溶液，用盐酸溶液稀释至3.0mL，室温放置10min，加入50μL亚硝酸标准溶液或样品溶液，在室温条件下反应20min，得到重氮化反应产物，同时做空白试验；

d.SERS检测

移取一定量贵金属纳米粒子溶液于1cm石英池中，加入适量上述重氮化反应产物，混匀放置5min，在便携式拉曼光谱仪器测定SERS光谱，分别计算720、1459、1609cm^-1处的特征峰面积；以峰面积为纵坐标，亚硝酸盐浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到3个标准曲线方程；

e.分析结果的表述

试样中亚硝酸盐的含量按式(1)计算：

式中：

X——试样中的亚硝酸盐的含量，单位为毫克/千克；

m——测定用样液中亚硝酸钠的质量，单位为毫克；

2.5——转化系数；

C₇₂₀，C₁₄₉₅，C₁₆₀₉，C_0，720，C_0，1459,C_0,1609——分别为由特征峰720、1459、1609的峰面积查标准曲线得到的试样和空白试验中亚硝酸盐的浓度，单位为毫克/升；

C，C₀——分别为由三个特征峰曲线计算得到试样和空白试样中亚硝酸盐的平均浓度，单位为毫克/升；

2.5——试样处理液总体积，单位为毫升。

2.根据权利要求1所述一种天然植物提取物中亚硝酸盐的测定，其特征在于标准曲线中，所述加入的对硝基苯胺溶液与1-苯胺溶液体积比为1-10:1；优选1-5:1；更优选4:1；

所述贵金属纳米粒子为金纳米粒子、银纳米粒子或铜纳米粒子中的任意一种，优选银纳米粒子；

所述加入的贵金属纳米粒子溶液与重氮化反应产物体积比为1-10:1；优选1-5:1；更优选3:1。

3.根据权利要求1所述一种天然植物提取物中亚硝酸盐的测定，其特征在于试样提取过程中，所述第一次加入水量与试样量的比例关系为，V:m＝1-10:1；优选1-5:1；更优选4:1；

所述加入的亚铁氰化钾溶液、试样量的比例关系为，V:m＝100-500:1；优选100-250:1；更优选200:1；

所述加入的乙酸锌溶液与试样量的比例关系为，V:m＝100-500:1；优选100-250:1；更优选200:1；

所述加入的亚铁氰化钾溶液、乙酸锌溶液比例关系为，V:V＝1-10:1；优选1-5:1；更优选1:1。

4.根据权利要求1所述一种天然植物提取物中亚硝酸盐的测定，其特征在于重氮反应过程中，所述加入的对硝基苯胺溶液与1-苯胺溶液体积比为1-10:1；优选1-5:1；更优选4:1。

5.根据权利要求1或4所述一种天然植物提取物中亚硝酸盐的测定，其特征在于SERS检测过程中，所述贵金属纳米粒子为金纳米粒子、银纳米粒子或铜纳米粒子中的任意一种，优选银纳米粒子；

所述加入的贵金属纳米粒子溶液与重氮化反应产物体积比为1-10:1；优选1-5:1；更优选3:1。