CN102998298A - 表面增强拉曼光谱快速检测亚硝酸根方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及表面增强拉曼光谱快速检测亚硝酸根的方法及应用。亚硝酸根自身的拉曼信号很弱，SERS信号也很弱，在酸性或弱碱性条件下亚硝酸根离子与重氮-偶合试剂生成偶合染料，偶合染料的SERS信号强，通过SERS测定偶合染料的量间接对亚硝酸根进行定性和定量检测。本发明采用Au/SiO2作为SERS基底材料，二氧化硅壳层提高了增强粒子的稳定性，使结果重复性更好。本方法适用于食品、环境、生物样品等复杂样品中亚硝酸根的快速测定，具有简单、快速（约5min）、选择性高，适用于现场检测，有利于推广使用等优点。
Description
技术领域
本发明涉及表面增强拉曼光谱快速检测亚硝酸根方法，尤其涉及表面增强拉曼光谱快速检测亚硝酸根方法及其应用，适用于食品、环境、生物样品等复杂样品中亚硝酸根的测定。
背景技术
亚硝酸盐是自然界氮循环的中间体，不稳定，广泛存在于水体、土壤和各类食品中。据研究亚硝酸盐本身是一种剧毒物质，同时还是一种致癌物质，其机理是：在胃酸等环境下亚硝酸盐与食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反应生成强致癌物N-亚硝胺。亚硝胺还能够透过胎盘进入胎儿体内，对胎儿有致崎作用。
亚硝酸盐是肉品加工常用的添加剂，具有抑制肉毒梭状芽孢杆菌、使肉品发色以及增强风味的作用，目前尚没有理想的替代物。亚硝酸根与芳胺或苯甲胺反应生成致癌物亚硝胺已经引起国内外的普遍关注。
亚硝酸根的传统检测方法有多种，近年来国内外报道的检测方法主要有紫外可见分光光度法（比色法）、气相色谱法和高效液相色谱法、示波极谱法、荧光法和催化法等。但是这些方法存在过程繁琐、耗时、不便于现场检测等不足。因此建立简单、快速、选择性好的NO2 -检测方法有重要的意义。
发明内容
为了解决传统亚硝酸根检测方法过程繁琐、耗时和不便于现场检测等不足。本发明提供了一种表面增强拉曼光谱（SERS）快速检测亚硝酸根的方法，及其在食品、环境、生物等复杂样品中亚硝酸根测定中的应用。
本发明的原理：NO2 -自身的拉曼信号很弱，SERS信号也很弱，故不能通过SERS直接测定NO2 -。NO2 -在酸性或弱碱性条件下与重氮-偶合试剂生成重氮-偶合产物，该产物自身拉曼信号较强，且该产物的SERS得到增强，以该偶合产物作为亚硝酸根的探针，通过测定偶合产物对NO2 -进行间接的定性和定量测定。
为了实现上述发明目的，本发明采用了以下表面增强拉曼光谱快速检测亚硝酸根方法，其特征在于：表面增强拉曼光谱快速检测亚硝酸根方法，其特征在于：在酸性或弱碱性条件下使待测样品中的亚硝酸根离子与重氮化试剂和偶氮化试剂生成重氮-偶合染料，以该重氮-偶合染料作为探针分子，通过测定重氮-偶合染料间接的对亚硝酸根进行定性和定量测定。
作为优选方案，上述方法是在酸性条件下使待测样品中的亚硝酸根离子与对硝基苯胺和二苯胺生成红色的重氮-偶合染料。
具体来说，上述定性方法包括以下步骤：
a、取不同浓度的亚硝酸根溶液于离心管中，加入重氮化试剂，混和均匀使其发生重氮化反应，后加入与重氮化试剂同等摩尔比的偶氮化试剂，混和均匀使其发生偶合反应，反应液放置5min，得到重氮-偶合染料；
b、取一定体积的a步骤所得反应液于样品管内，然后加入同等体积的增强粒子混合均匀，直接用DeltaNu便携式拉曼仪检测；
c、测量并绘制出不同含量亚硝酸根溶液所对应的表面增强拉曼光谱图；
d、量取待测样品，加入重氮化试剂，混和均匀使其发生重氮化反应，后加入与重氮化试剂同等摩尔比的偶氮化试剂，混和均匀使其发生偶合反应，反应液放置5min，得到重氮-偶合染料；加入同等体积的增强粒子混合均匀，直接用拉曼仪检测该样品的表面增强拉曼光谱，根据步骤c所得拉曼光谱图中的拉曼位移对样品进行定性。
作为进一步的定性方法，所述重氮化试剂是对硝基苯胺盐酸溶液；所述偶氮化试剂是二苯胺乙醇溶液；所述步骤c还包括绘制出1395cm-1拉曼位移处的峰面积-亚硝酸根离子含量标准曲线；所述步骤d还包括根据1395cm-1拉曼位移处的峰面积-亚硝酸根离子含量标准曲线计算出样品中亚硝酸根的含量。
具体来说，所述的盐酸溶液浓度为0.5-2.0mol L-1；所述的对硝基苯胺的盐酸溶液浓度为0.1-1.0%；所述的二苯胺的乙醇溶液浓度为0.1-1.0%。
所述的离心管体积为2mL。
所述的样品管为1mL玻璃管。
所述亚硝酸根溶液加入体积与对硝基苯胺的盐酸溶液的加入体积之比为100：（0.5~2.5）；所述待测样品加入体积与对硝基苯胺的盐酸溶液加入体积之比为100：（0.5~2.5）。
所述的亚硝酸根溶液可选用亚硝酸钠溶液。
作为可选方案，重氮化试剂可以为对硝基苯胺、磺胺和对氨基苯磺酸等，偶氮化试剂可以为二苯胺和盐酸萘乙二胺等。
所述增强粒子为Au/SiO2纳米溶胶，其中Au/SiO2为Au纳米粒子表面包被了二氧化硅壳的核壳式结构，所述增强粒子也可以是Ag纳米溶胶或Au纳米溶胶等。
所述的拉曼仪激发波长为785nm；激光功率：60mv；扫描时间：1s。
用于定性的拉曼位移分别为1106，1137,1395和1432cm-1；用于定量的拉曼位移为1395cm-1，其中1106苯环内C-C伸缩振动，1137cm-1为C-N伸缩振动，1395cm-1苯环内C-C伸缩振动，1432cm-1为N=N伸缩振动。
通过上述步骤可以发现，本发明的表面增强拉曼快速检测亚硝酸根的方法及其应用，具有简单、快速、选择性高等优点，适用于现场检测，有利于推广使用等。而且偶合产颜色的深度与亚硝酸根离子的浓度成正相关，即亚硝酸根离子浓度越大，颜色越深，可以通过肉眼观察反应体系的颜色变化来对样品中亚硝酸根含量进行估计。
附图说明：
下面结合附图和具体实施方式对本实验进行详细说明：
图1为NO2 -和重氮-偶合产物的拉曼和SERS图
其中，a为1mg L-1NO2 -偶合产物SERS；b为1000mg L-1NO2 -偶合产物拉曼图；c为1000mg L-1NO2 -SERS；d为1000mg L-1NO2 -拉曼图。
图2为不同浓度NO2 -偶合产物的SERS图，其中，
1106cm-1为苯环内C-C的伸缩振动；
1137cm-1为C-N的伸缩振动；
1395cm-1为苯环内C-C的伸缩振动；
1432cm-1为N=N的伸缩振动。
图3为1395cm-1拉曼位移处的峰面积-亚硝酸根含量标准曲线。
图4为实际样品中亚硝酸根的SERS图。
具体实施方式
本发明SERS快速检测亚硝酸根的方法及其应用基于以下化学反应：
最终生成偶氮染料的颜色为红色，而且其颜色的深度与亚硝酸根离子的浓度成正相关，即亚硝酸根离子浓度越大，颜色越深。该偶氮染料极易吸附在增强粒子表面，得到表面增强拉曼光谱，通过测定偶氮染料的量间接测定亚硝酸根的含量。
本发明的SERS快速检测亚硝酸根方法及其应用的实施例如下，但本发明的内容完全不局限于此。
实施例1SERS快速检测火腿肠中的亚硝酸根
1.1主要仪器与试剂：
DeltaNu Inspector便携式拉曼仪，电子天平；
NO2 -标准溶液：精密称取0.0150g在烘箱中干燥24h的NaNO2，用超纯水溶解移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，配制成浓度为100mg L-1NO2 -储备液，加入1滴三氯甲烷，4℃保存，使用前稀释至所需浓度；对硝基苯胺（0.3%,m/v）：称取0.3g对硝基苯胺，溶于100mL盐酸溶液（1mol L-1）中，混匀后，置棕色瓶中，4℃保存；二苯胺（0.4%,m/v）：称取0.4g二苯胺，溶于100mL乙醇溶液中，置棕色瓶中混匀，4℃保存；Au/SiO2：Au NPs半径55nm，SiO2壳层厚度1-2nm。亚铁氰化钾溶液(106g L-1)：称取10.6g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至100mL；乙酸锌溶液(220g L-1)：称取22.0g乙酸锌，先加3mL冰醋酸溶解，用水稀释至100mL；实验用水为超纯水。
1.2样品处理：
称取5g（精确至0.0001g）制成匀浆的试样于25mL容量瓶内（如制备过程中加水，应按加水量折算），加入15-20mL超纯水，斡旋15min。在振荡上述提取液时加入1mL亚铁氰化钾(106g L-1)溶液，摇匀，再加入1mL乙酸锌溶液(220gL-1)，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用0.45μm滤膜过滤，弃去初滤液5mL，滤液备用。对于加标香肠样品分析，将500μL浓度为100mg L-1的NO2 -加入到5g香肠中，混合均匀，室温下放置2h再进行提取，加标浓度为10μg g-1。
1.3标准曲线的绘制
分别配制浓度为0.5,1.0,2.0,4.0和6.0mg L-1亚硝酸根溶液，依次取上述溶液200μL于2mL离心管中，加入对硝基苯胺盐酸溶液2μL，混匀后加入二苯胺乙醇溶液2μL，静置5min后。取等体积的上述反应液和Au/SiO2于样品管内，混合均匀，用DeltaNu拉曼仪直接检测，激发波长785nm，扫描时间：1s；绘制了1395cm-1拉曼位移处峰面积-亚硝酸根离子含量标准曲线，见图3。
1.4干扰离子的测定
为了评价方法的选择性，实验考察了多种常见的阳离子和阴离子对2mg L-1NO2 -测定的干扰，结果如表1所示。如加入干扰离子后峰面积(1395cm-1)的RSD在±15%内，则视为此离子不干扰NO2 -的测定。由此可见，此法对NO2 -的测定有良好的选择性。
表1
1.5火腿肠样品的测定：
量取200μL上述火腿肠提取液，依次加入2μL的对硝基苯胺和2μL的二苯胺，混合均匀后，静置5min后。取等体积的上述反应液和Au/SiO2于样品管内，混合均匀，用DeltaNu拉曼仪检测，激发波长：785nm，扫描时间：1s，读取1395cm-1拉曼位移处的峰面积，代入1395cm-1拉曼位移处的峰面积-亚硝酸根含量标准曲线，计算出火腿样品中亚硝酸根的含量。计算出火腿中亚硝酸根的含量为7.25±0.80μg g-1，加标后亚硝酸根的含量为17.30±0.23μg g-1，加标回收率为100.7%。
实施例2SERS快速检测土壤中的亚硝酸根
在该应用中，用到的主要仪器与试剂，标准曲线的绘制和干扰离子的测定与实施例1相同。
2.1土壤样品处理：
将土壤样品在室温下放置24h自然风干，干燥后的土壤用研钵磨细，0.45mm过筛。称取过筛后样品5g（精确至0.0001g），加入25mL氯化钠溶液（2mol L-1），超声提取90min，置于离心机4000rpm离心5min，收集上清液，经0.45μm滤膜过滤，备用。对于加标土壤样品分析，将500μL浓度为100mg L-1的NO2 -加入到5g土壤中，混合均匀，室温下放置2h再进行提取，加标浓度为10μg g-1。
2.2土壤样品的测定：
量取200μL上述土壤提取液和加标提取液，依次加入2μL的对硝基苯胺和2μL的二苯胺，混合均匀后，静置5min后。取等体积的上述反应液和Au/SiO2于样品管内，混合均匀，用DeltaNu拉曼仪检测，激发波长：785nm，扫描时间：1s；读取1395cm-1拉曼位移处的峰面积，代入1395cm-1拉曼位移处的峰面积-亚硝酸根含量标准曲线，计算出加标后亚硝酸根的含量为14.30±1.00μg g-1，加标回收率为112.8%。
实施例3 SERS快速检测唾液中的亚硝酸根
在该应用中，用到的主要仪器与试剂，标准曲线的绘制和干扰离子的测定与实施例1相同。
3.1唾液样品的处理：
量取一定体积的唾液，用水稀释一倍，得到唾液样品。然后用该唾液样品配制加标浓度为1.00mg L-1的加标唾液样品。
3.2唾液样品的测定：
取200μL的唾液样品和加标唾液样品，依次加入2μL的对硝基苯胺和2μL的二苯胺，混合均匀后，静置5min后。取等体积的上述反应液和Au/SiO2于样品管内，混合均匀，用DeltaNu拉曼仪检测，激发波长：785nm，扫描时间：1s，读取1395cm-1拉曼位移处的峰面积，代入1395cm-1拉曼位移处的峰面积-亚硝酸根含量标准曲线，计算出唾液中亚硝酸根的含量。得到唾液样品中亚硝酸根的含量为1.85±0.22mgL-1，加标后亚硝酸根的含量为2.74±0.22mg L-1，加标回收率为88.2%。
以上是本发明的SERS快速检测亚硝酸根在唾液、土壤和火腿肠中等样品中的应用，从具体实施方式可以看出，本发明的这种测定亚硝酸根的方法具有简单、快速、选择性好等优点。
本领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，并非作为对发明的限制，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变性都将落在本发明的权力要求范围内。
Claims (9)
1.表面增强拉曼光谱快速检测亚硝酸根方法，其特征在于：在酸性或弱碱性条件下使待测样品中的亚硝酸根离子与重氮化试剂和偶氮化试剂生成重氮-偶合染料，以该重氮-偶合染料作为探针分子，通过测定重氮-偶合染料间接的对亚硝酸根进行定性和定量测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：是在酸性条件下使待测样品中的亚硝酸根离子与对硝基苯胺和二苯胺生成红色的重氮-偶合染料。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、取不同浓度的亚硝酸根溶液于离心管中，加入重氮化试剂，混和均匀使其发生重氮化反应，后加入与重氮化试剂同等摩尔比的偶氮化试剂，混和均匀使其发生偶合反应，反应液放置5min，得到重氮-偶合染料；
b、取一定体积的a步骤所得反应液于样品管内，然后加入同等体积的增强粒子混合均匀，直接用DeltaNu便携式拉曼仪检测；
c、测量并绘制出不同含量亚硝酸根溶液所对应的表面增强拉曼光谱图；
d、量取待测样品，加入重氮化试剂，混和均匀使其发生重氮化反应，后加入与重氮化试剂同等摩尔比的偶氮化试剂，混和均匀使其发生偶合反应，反应液放置5min，得到重氮-偶合染料；加入同等体积的增强粒子混合均匀，直接用拉曼仪检测该样品的表面增强拉曼光谱，根据步骤c所得拉曼光谱图中的拉曼位移对样品进行定性。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述重氮化试剂是对硝基苯胺盐酸溶液；所述偶氮化试剂是二苯胺乙醇溶液；所述步骤c还包括绘制出1395cm-1拉曼位移处的峰面积-亚硝酸根离子含量标准曲线；所述步骤d还包括根据1395cm-1拉曼位移处的峰面积-亚硝酸根离子含量标准曲线计算出样品中亚硝酸根的含量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：盐酸溶液浓度为0.5-2.0mol L-1；所述的对硝基苯胺的盐酸溶液浓度为0.1-1.0%；所述的二苯胺的乙醇溶液浓度为0.1-1.0%。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述亚硝酸根溶液加入体积与对硝基苯胺的盐酸溶液的加入体积之比为100：（0.5~2.5）；所述待测样品加入体积与对硝基苯胺的盐酸溶液加入体积之比为100：（0.5~2.5）。
7.根据权利要求1所述的方法，重氮化试剂可以为对硝基苯胺、磺胺和对氨基苯磺酸等，偶氮化试剂可以为二苯胺和盐酸萘乙二胺等。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述增强粒子为Au/SiO2纳米溶胶，其中Au/SiO2为Au纳米粒子表面包被了二氧化硅壳的核壳式结构，所述增强粒子也可以是Ag纳米溶胶或Au等纳米溶胶等。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：用于定性的拉曼位移分别为1106，1137,1395和1432cm-1；用于定量的拉曼位移为1395cm-1，其中1106苯环内C-C伸缩振动，1137cm-1为C-N伸缩振动，1395cm-1苯环内C-C伸缩振动，1432cm-1为N=N伸缩振动。
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