CN110702654A - 一种基于点击反应荧光传感器用于快速检测含有末端炔基结构农药 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于点击反应荧光传感器用于快速检测含有末端炔基结构农药，所述的荧光传感器由一探针组成，所述的探针是由叠氮基修饰的硫、氮元素掺杂的碳量子点。本发明方法首次以叠氮基修饰的硫、氮元素掺杂的碳量子点体系作为探针，并且将其应用于快速检测三种含有末端炔基的农药炔草酯、炔咪菊酯、炔苯酰草胺，与传统的方法对比，所述方法通过荧光分光光度计能同时对三种农药得出更精密的定量分析结果，降低分析时间及成本，适宜普通民众使用。还可以通过手机等移动终端的取色软件实现对三种农药在现场的快速检测，得出更精密的定量分析结果，该方法为环境中含有末端炔基农药的定量分析提供了广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于农业技术领域，特别涉及一种基于点击反应含有叠氮基荧光传感器的制备与应用方法。
背景技术
农药在农业生产中起到了至关重要的作用。然而农业工作者为了追求更大的利益，农药滥用的现象也会层出不穷，造成不同程度的环境污染，影响人类健康。炔草酯作为一种除草剂，广泛用于一年生牧草的防治。有不同文献指出，炔草酯的滥用不仅会产生致畸作用，还会产生一定的遗传毒性。还有文献指出重复不连续的吸入含有炔咪菊酯的杀虫剂，可引起各种免疫毒性作用。因此，为了减轻环境污染，确保食品安全，开发出一套完善的农药检测体系是至关重要的。
目前已经开发出很多炔草酯、炔咪菊酯、炔苯酰草胺的检测方法，例如气相色谱、高效液相色谱、气相色谱/高效液相色谱串联质谱法，针对炔苯酰草胺还开发出了通过加速溶剂萃取法(ASE)提取，气相色谱电子捕获检测器检测的定量分析方法。但这些方法很多需要大型而昂贵的仪器，专业技术人员进行复杂操作，产生大量溶剂的消耗，并不适用于实际检测过程。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供了一种基于点击反应快速检测含有末端炔基结构农药荧光传感器的制备与应用方法。
根据本发明的第一方面，提供一种含有叠氮基荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将柠檬酸和L-半胱氨酸溶解于去离子水中，放在烘箱里蒸发至粘稠状；
(2)然后将粘稠状液体置于高压反应釜中，升温至180-240℃反应2-4小时，自然冷却后得到黑色粘稠状产物；
(3)用去离子水溶解，并用碱溶液调节pH至7-8；
(4)最后将溶液置于透析袋中，透析后得到碳量子点溶液；
(5)取上述碳量子点溶液于容器中，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，常温剧烈搅拌，使催化剂活化；然后迅速加入叠氮基-PEG4-胺，剧烈搅拌，常温反应；
(6)反应结束后，将产物置于透析袋中，透析后得到含有叠氮基荧光传感器。
优选情况下，步骤(1)中柠檬酸和L-半胱氨酸的质量配比为1.5～3:1。步骤(5)中碳量子点溶液与EDC、NHS三者的质量比为500～600:1:1，叠氮基-PEG4-胺与碳量子点溶液的质量比为1:5000。
优选情况下，步骤(4)中的透析操作为：将溶液置于3500Da的透析袋中，透析72小时，每隔6小时换一次水；步骤(6)中的透析操作为：将产物置于3500Da的透析袋中，透析24小时，每隔6小时换一次水。这种透析操作的优点可以很简便的把分子量小于3500Da的化合物分离出去，起到了对产物的净化作用。
根据本发明的第二方面，提供一种含有叠氮基荧光传感器，由本发明第一方面所述的制备方法制得。所述的荧光传感器由一探针组成，所述的探针是由叠氮基修饰的硫、氮元素掺杂的碳量子点。
根据本发明的第三方面，提供一种基于点击反应快速检测含有末端炔基结构农药的方法，包括以下步骤：
(1)提供本发明第二方面所述的含有叠氮基荧光传感器。
(2)取含有叠氮基荧光传感器溶液于反应管中，加入二价铜离子溶液，形成荧光探针系统；
(3)配置一系列浓度的农药标准液，分别加入到荧光探针系统中，加入还原剂用于启动点击反应，振荡一定时间后，分别采用荧光光谱仪检测一定波长下的荧光强度，经线性拟合后得到标准方程；
(4)将待检测样品液加入到荧光探针系统中，加入还原剂用于启动点击反应，振荡一定时间后，采用荧光光谱仪检测一定波长下的荧光强度，与标准方程比对后得出样品液中农药的含量。
根据本发明的第四方面，提供一种基于点击反应快速检测含有末端炔基结构农药的方法，包括以下步骤：
(1)提供本发明第二方面所述的含有叠氮基荧光传感器；
(2)取含有叠氮基荧光传感器溶液于反应管中，加入二价铜离子溶液，形成荧光探针系统；
(3)配置一系列浓度的农药标准液，分别加入到荧光探针系统中，加入还原剂用于启动点击反应，振荡一定时间后，分别采用移动终端中“F取色器”软件对不同混合液进行取色，记录软件输出的“R”、“G”、“B”值，并计算G值与B值的比值“G/B”，经线性拟合后得到标准方程；
(4)将待检测样品液加入到荧光探针系统中，加入还原剂用于启动点击反应，振荡一定时间后，分别采用移动终端中“F取色器”软件对不同混合液进行取色，记录软件输出的“R”、“G”、“B”值，并计算G值与B值的比值“G/B”，与标准方程比对后得出样品液中农药的含量。
本发明第三和第四方面所述方法中，所述含有末端炔基结构农药具体包括炔草酯、炔咪菊酯和炔苯酰草胺。
本发明第三和第四方面所述方法中，步骤(2)中含有叠氮基荧光传感器溶液的浓度优选为80～100mg L-1。
本发明第三和第四方面所述方法的步骤(2)中，所述二价铜离子溶液具体可以为硫酸铜溶液、碳酸铜溶液等。
本发明第三和第四方面所述方法的步骤(3)中，由于抗坏血酸具有很强的还原性，易溶于水，环境友好，使用方便，故所述还原剂优选采用抗坏血酸钠溶液。
本发明第四方面所述方法的步骤(4)中，所述移动终端为手机、PAD或笔记本电脑等。
本发明的有益效果为：
本发明方法首次以叠氮基修饰的硫、氮元素掺杂的碳量子点体系作为探针，并且将其应用于快速检测三种含有末端炔基的农药炔草酯、炔咪菊酯、炔苯酰草胺，与传统的方法对比，所述方法通过荧光分光光度计能同时对三种农药得出更精密的定量分析结果，降低分析时间及成本，适宜普通民众使用。还可以通过手机等移动终端的取色软件实现对三种农药在现场的快速检测，得出更精密的定量分析结果，该方法为环境中含有末端炔基农药的定量分析提供了广阔的应用前景。
附图说明
图1-3为探针中加入不同浓度含有末端炔基结构农药的荧光光谱(图1-3对应的目标物分别为炔草酯、炔咪菊酯和炔苯酰草胺，荧光曲线从上至下对应的目标物浓度分别为0,0.02,0.1,0.5,1,5mg L-1)。
图4为通过手机取色软件对不同浓度的含有末端炔基结构农药数据结果。
具体实施方式
本发明提供了一种快速检测含有末端炔基结构农药荧光传感器的制备与应用方法，下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明。
一、仪器与试剂
瓦里安Cary Eclipse荧光分光光度计。
柠檬酸、L-半胱氨酸、叠氮基-PEG4-胺、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、五水硫酸铜、抗坏血酸钠以及氢氧化钠这些试剂纯度均为分析纯，购买自百灵威科技有限公司。甲醇纯度为色谱纯，购买自上海安普实验科技股份有限公司。炔草酯(95％)、炔咪菊酯(97％)以及炔苯酰草胺(95％)原药均由药检所提供，用时用色谱纯甲醇稀释成所需浓度的工作溶液。
二、基于点击化学荧光传感器的设计及识别机理
“点击化学”是指通过Cu(I)催化，炔基与叠氮基发生环加成反应生成区域选择性的1,4-二取代-1,2,3-三氮唑，2001年由夏普莱斯教授发现，具有反应时间短，成本低，操作简便，产率高以及绿色环保的优点。
因为硫、氮元素掺杂碳量子点的制备方法简单，成本较低，所以选定柠檬酸为碳源和L-半胱氨酸为硫源和氮源，通过水热法一步合成。选用叠氮基-PEG4-胺作为修饰叠氮基的衍生化试剂，通过简单的酰胺化反应，其中EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)作为酰胺化反应的催化剂，合成叠氮基修饰的硫、氮元素掺杂的碳量子点，作为荧光探针。在Cu(I)的催化下，含有末端炔基结构的农药(炔草酯、炔咪菊酯、炔苯酰草胺)与功能化碳量子点发生点击反应，由于1,2,3-三唑环结构，发生了分子内电子转移过程，量子点的荧光产生了淬灭效果。目标物的引入，正是将点击反应产生的化学信号转化为荧光强度的信号，实现了对目标物的定量分析，一种新型的农药检测策略构建出来。
三、基于点击化学荧光传感器制备及应用
取2g柠檬酸、1g L-半胱氨酸溶解于5mL去离子水中，置于聚四氟乙烯的内胆里，放在烘箱里70℃蒸发12小时至粘稠状。然后将粘稠状液体置于高压反应釜中，以10℃min-1升温至200℃反应3小时，自然冷却后得到黑色粘稠状产物，并用200mL去离子水溶解，并用1M的NaOH溶液调节pH至7。最后将溶液置于3500Da的透析袋中，透析72小时，每隔6小时换一次水，得到碳量子点溶液；取30mL上述碳量子点溶液于100mL单口烧瓶中，先加入42mg的EDC以及50mg的NHS，常温剧烈搅拌5分钟，使催化剂活化。然后迅速加入20μL的叠氮基-PEG4-胺，剧烈搅拌，常温反应12小时。反应结束后，将产物置于3500Da的透析袋中，透析24小时，每隔6小时换一次水，最后得到探针溶液。
四、通过基于点击化学荧光传感器的检测炔草酸、炔咪菊酯和炔苯酰草胺
取200μL的探针溶液(80～100mg L-1)于2mL离心管中，加入100μL五水硫酸铜溶液(15mg mL-1)以及100μL的目标物溶液，最后加入100μL抗坏血酸钠溶液(20mg mL-1)用于启动点击反应。整个体系在25℃状态下孵育40分钟，然后取250μL混合液于“96孔板”中。
(1)配置一系列浓度的农药标准液，其浓度分别为0,0.02,0.1,0.5,1,5mg L-1，分别加入到荧光探针系统中，振荡一定时间后，分别采用荧光光谱仪检测一定波长下的荧光强度，经线性拟合后得到标准方程。
表1不同农药的标准线性方程
y：淬灭效率，(F0-F)/F0
x：农药浓度(mg/L)
(2)将待检测样品液加入到荧光探针系统中，振荡一定时间后采用荧光光谱仪检测一定波长下的荧光强度，与标准方程比对后得出样品液中农药的含量。
五、通过手机取色软件快速现场检测炔草酸、炔咪菊酯和炔苯酰草胺：
取200μL的探针溶液(80～100mg L-1)于2mL离心管中，加入100μL五水硫酸铜溶液(15mg mL-1)以及100μL的目标物溶液，最后加入100μL抗坏血酸钠溶液(20mg mL-1)用于启动点击反应，整个体系在25℃状态下孵育40分钟。
(1)配置一系列浓度的农药标准液，其浓度分别为0,0.02,0.1,0.5,1,5mg L-1，分别加入到探针系统中，振荡一定时间后，分别采用手机中“F取色器”软件对不同混合液进行取色，记录软件输出的“R”、“G”、“B”值，并计算G值与B值的比值“G/B”。经线性拟合后得到标准方程。
(2)将待检测样品液加入到探针系统中，振荡一定时间后，分别采用手机中“F取色器“软件对不同混合液进行取色，记录软件输出的“R”、“G”、“B”值，并计算G值与B值的比值“G/B”，与标准方程比对后得出样品液中农药的含量。
本领域技术人员应该理解，上文所述具体实施方式仅为了更好地理解本发明，并不用于对本发明进行限制，本发明的保护范围应以权利要求书的限定为准。
Claims (4)
1.一种含有叠氮基荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将柠檬酸和L-半胱氨酸溶解于去离子水中，放在烘箱里蒸发至粘稠状；
(2)然后将粘稠状液体置于高压反应釜中，升温至180-240℃反应2-4小时，自然冷却后得到黑色粘稠状产物；
(3)用去离子水溶解，并用碱溶液调节pH至7-8；
(4)最后将溶液置于透析袋中，透析后得到碳量子点溶液；
(5)取上述碳量子点溶液于容器中，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，常温剧烈搅拌，使催化剂活化；然后迅速加入叠氮基-PEG4-胺，剧烈搅拌，常温反应；
(6)反应结束后，将产物置于透析袋中，透析后得到含有叠氮基荧光传感器。
2.一种含有叠氮基荧光传感器，由权利要求1所述的制备方法制得。
3.一种基于点击反应快速检测含有末端炔基结构农药的方法，包括以下步骤：
(1)提供如权利要求2所述的含有叠氮基荧光传感器；
(2)取含有叠氮基荧光传感器溶液于反应管中，加入二价铜离子溶液，形成荧光探针系统；
(3)配置一系列浓度的农药标准液，分别加入到荧光探针系统中，加入还原剂用于启动点击反应，振荡一定时间后，分别采用荧光光谱仪检测一定波长下的荧光强度，经线性拟合后得到标准方程；
(4)将待检测样品液加入到荧光探针系统中，加入还原剂用于启动点击反应，振荡一定时间后，采用荧光光谱仪检测一定波长下的荧光强度，与标准方程比对后得出样品液中农药的含量。
4.一种基于点击反应快速检测含有末端炔基结构农药的方法，包括以下步骤：
(1)提供如权利要求2所述的含有叠氮基荧光传感器；
(2)取含有叠氮基荧光传感器溶液于反应管中，加入二价铜离子溶液，形成荧光探针系统；
(3)配置一系列浓度的农药标准液，分别加入到荧光探针系统中，加入还原剂用于启动点击反应，振荡一定时间后，分别采用移动终端中“F取色器”软件对不同混合液进行取色，记录软件输出的“R”、“G”、“B”值，并计算G值与B值的比值“G/B”，经线性拟合后得到标准方程；
(4)将待检测样品液加入到荧光探针系统中，加入还原剂用于启动点击反应，振荡一定时间后，分别采用移动终端中“F取色器”软件对不同混合液进行取色，记录软件输出的“R”、“G”、“B”值，并计算G值与B值的比值“G/B”，与标准方程比对后得出样品液中农药的含量。
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