CN115429774A - 一种仿生膜包裹尿酸酶纳米粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物制剂领域。本发明涉及一种仿生膜包裹尿酸酶纳米粒及其制备方法。本发明制备得到的仿生膜包裹尿酸酶纳米粒可以延长尿酸酶在体内循环半衰期,提高尿酸酶的生物利用度,降低免疫原性,可以用于高尿酸血症、痛风治疗。
Description
技术领域
本发明属于医药制剂领域,涉及一种仿生膜包裹尿酸酶纳米粒及其制备方法,包括外泌体包裹尿酸酶纳米粒、外泌体和红细胞膜的融合膜包裹尿酸酶纳米粒(本专利中以下简称为:融合膜包裹尿酸酶纳米粒)。
背景技术
尿酸是人体内嘌呤类化合物的终末代谢物,生成过多或排泄不足均会导致高尿酸血症。高尿酸血症是我国目前发病率较高的代谢性疾病,目前我国约有1.7亿高尿酸血症患者,约占总人口的12%。痛风是由于血清尿酸水平过高,导致关节、肌腱和其他组织中尿酸钠晶体沉积,引发反复发作的明显急性炎症,研究表明,高尿酸血症是痛风发生的主要危险因素,并与糖尿病、高血压、动脉粥样硬化和慢性肾脏疾病等多种代谢疾病有关。高尿酸血症通常通过改善生活方式和药物治疗来治疗。传统药物通过抑制尿酸生成或促进排泄来治疗高尿酸血症,但存在严重胃肠道反应,心血管风险和肝肾功能损害等副作用。黄嘌呤氧化酶抑制剂非布司他和别嘌醇通过抑制尿酸合成降低血尿酸浓度,但患者易存在心血管风险和肝功异常等毒副作用。丙磺舒和碳酸氢钠等药物通过抑制肾小管中尿酸重吸收或碱化尿液酸碱度而促进尿酸排泄,但会引起肾功能损害等不良反应。这些药物对体内已产生的尿酸并没有作用,对于已发展为痛风的患者这些药物收效甚微。尿酸酶可以通过将尿酸降解为5-羟基异氰酸盐,并最终转化为尿囊素来快速高效分解尿酸,降低血清尿酸水平,但包括人类在类灵长类哺乳动物因基因突变,体内并不存在尿酸酶。酶替代疗法是通过补充体内缺失的酶或替换体内缺失的酶来治疗疾病的一种方法。尿酸酶可以有效治疗高尿酸血症及其相关并发症,但存在低稳定性、低催化活性和高免疫原性等缺点,导致体内酶活性较低,易产生不良反应,极大地阻碍了其临床应用。尿酸酶用于临床多种疾病的治疗和诊断已有多年的历史,目前国内外已上市的尿酸氧化酶制品已有三代产品,但这些尿酸氧化酶制品存在的体内外稳定性差、免疫原性高、易发生过敏反应和治疗成本高的缺点局限了其广泛的推广应用。外泌体是细胞分泌的最小的细胞外囊泡,由带负电荷的脂质双层小泡、RNA、DNA和胞浆蛋白等组成,与结构类似的脂质体相比,外泌体由生物细胞分泌,具有免疫原性低,生物相容性好,毒性低等特点。外泌体在细胞间通讯和物质传递途径中发挥着积极的作用,作为药物载体外泌体具有可跨越生物膜,克服单核吞噬系统清除等优势。外泌体被证明具有良好的体外稳定性和生物相容性。仿生纳米技术通过利用天然细胞膜伪装合成的纳米颗粒使其具有免疫逃逸和良好的靶向能力,被广泛应用于药物递送系统中。仿生纳米粒子不仅保留了内部的纳米粒的物理化学特征,而且具有外面包裹的细胞膜的生物功能。近年来,利用融合细胞膜伪装纳米粒子的研究受到了广泛的关注,与单一细胞膜相比,融合膜可以使合成的纳米粒子具有不同来源细胞的多种生物功能。外泌体包裹尿酸酶纳米粒、融合膜包裹尿酸酶纳米粒,能延长尿酸酶在体内循环半衰期,提高尿酸酶的生物利用度,降低免疫原性,为治疗高尿酸血症提供新剂型,为解决递送治疗酶等生物技术药物难题提供实验参考。
经查询专利及文献,目前尚未见外泌体包裹的治疗酶纳米粒,尚未见外泌体和红细胞膜的融合膜包裹治疗酶的纳米粒。目前尚无载带尿酸酶的仿生纳米粒的任何报道,尚无外泌体包裹尿酸酶纳米粒的任何报道,当然,目前也尚无融合膜包裹尿酸酶纳米粒的任何报道。本发明制备得到的外泌体包裹尿酸酶纳米粒和融合膜包裹尿酸酶纳米粒延长尿酸酶在体内循环半衰期,提高尿酸酶的生物利用度,降低免疫原性,可以用于高尿酸血症、痛风治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供外泌体包裹尿酸酶纳米粒、外泌体和红细胞膜的融合膜包裹尿酸酶纳米粒及其制备方法。
外泌体包裹尿酸酶纳米粒、和外泌体和红细胞膜的融合膜包裹尿酸酶纳米粒克服了尿酸酶体内外稳定性差、免疫原性高、易发生过敏反应等缺点,可保持较长时间的血药浓度,具有缓释作用,可以减少给药次数,提高患者的顺应性,降低毒副作用。本发明提供的仿生膜包裹尿酸酶纳米粒制备工艺简单,成本较低,易于控制,易于工业化生产。本研究为尿酸酶提供了可供选择的新型制剂,可用于高尿酸血症、痛风治疗。
本发明提供的仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,其特征在于,包括尿酸酶纳米粒和仿生膜包裹层,所述的仿生膜包括(1)外泌体,即牛奶外泌体、羊奶外泌体、兔奶外泌体和其它哺乳动物的奶源外泌体的一种;(2)外泌体和红细胞膜的融合膜,即外泌体与红细胞膜形成的融合膜。
制剂中尿酸酶含量为0.1-10U/mL,缓冲液pH为6.5-9,制剂中其余各组分质量比为:透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇10-200份,环糊精600-1200份。本发明提供的仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,制备步骤如下:(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇可以直接从市场购买,或自己合成。透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法:将透明质酸、N-羟基琥珀酰亚胺,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入5-11mL硼酸缓冲液pH 8.5,搅拌0.5-1.5小时得到液体A;称取处方量甲氧基聚乙二醇胺基(mPEG-NH2),加入4-8mL硼酸缓冲液pH 8.5溶解后,并入液体A中,在氮气保护下反应12-16小时,然后在超纯水中透析20-26小时,冻干即得到透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇;(2)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH 6.5-9得到1%-3%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH 6.5-9得到2%-6%环糊精溶液;将处方量尿酸酶溶于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入环糊精溶液,磁力搅拌1.5-2.5小时,即得尿酸酶纳米粒;(3)外泌体的制备方法:取牛奶、羊奶、兔奶或其他哺乳动物的奶,离心20-40分钟,取上清液,离心50-70分钟,取上清液,再离心80-100分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(4)红细胞膜的制备方法:取血液,离心4-10分钟后,除去上清液后加入适量10mM磷酸盐缓冲液pH7.4,继续离心至上层血清无色透明,收集下层沉淀,洗涤后将沉淀重悬于2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中,在冰浴条件下低渗裂解20-40分钟后在低温条件下离心,直至上清液澄清透明。在使用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4进行2-4次洗涤离心循环后,收集底部沉淀即得红细胞膜;(5)融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体与步骤(4)得到的红细胞膜以质量比1:2至2:1混匀后备用;(6)仿生膜包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体或步骤(5)得到的融合膜与步骤(2)得到的尿酸酶纳米粒以体积比1:2至2:1混匀,涡旋1-5分钟,冰浴,超声10-30分钟,即得仿生膜包裹尿酸酶纳米粒。
本发明提供的仿生膜包裹尿酸酶纳米粒平均粒径小于300nm(图1)。本发明提供的仿生膜包裹尿酸酶纳米粒延长了尿酸酶在体内的循环半衰期,提高了尿酸酶的生物利用度,降低了免疫原性。细胞膜对纳米粒进行伪装,能够使纳米粒具有生物膜的表面特征蛋白和特殊功能。本发明制备的外泌体包裹尿酸酶纳米粒、融合膜包裹尿酸酶纳米粒与外泌体、红细胞膜的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果均出现了清晰的不同分子量蛋白条带,在各个特征分子量上,外泌体包裹尿酸酶纳米粒与外泌体的电泳结果均出现同样的蛋白条带,融合膜包裹尿酸酶纳米粒与外泌体、红细胞膜的电泳结果均出现同样的蛋白条带(图2)。
本发明提供的仿生膜包裹尿酸酶纳米粒体内给药后,活性-时间曲线图下面积相对于游离酶有明显提高(图3),外泌体包裹尿酸酶纳米粒、融合膜包裹尿酸酶纳米粒分别为游离酶的3.35倍和5.77倍,活性最大值分别为游离酶的1.46倍和1.81倍,体内平均滞留时间为游离酶的3.26倍和7.27倍。结果表明,将尿酸酶制备成仿生膜包裹尿酸酶纳米粒后,能显著提高尿酸酶的生物利用度,同等剂量下能使药物在更长时间内保持较高活性,延长药物在体内的作用时间。本发明的制剂生物利用度明显提高的原因可能包括:(1)外泌体、融合膜和纳米粒的双重或多重保护作用,使尿酸酶免受蛋白酶水解和吞噬细胞清除;(2)仿生膜包裹尿酸酶纳米粒能增强尿酸酶的稳定性,使其在长时间内保持较高活性;(3)仿生膜包裹尿酸酶纳米粒能改善尿酸酶的体内行为,提高生物利用度。
本发明不同于通常研究报道的尿酸酶的递送载体和制备工艺。尿酸酶的递送载体研究报道的有:常规脂质体、环糊精脂质体及自组装纳米囊等。本发明中的仿生膜包裹尿酸酶纳米粒是一种新型纳米粒。目前尚未见外泌体包裹的治疗酶纳米粒,尚未见外泌体和红细胞膜的融合膜包裹的治疗酶纳米粒。本发明首次将大分子尿酸酶包裹于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇和环糊精组成的纳米粒中,再经外泌体、或外泌体和红细胞膜的融合膜包裹制备得到仿生膜包裹尿酸酶纳米粒。该仿生膜包裹尿酸酶纳米粒能延长尿酸酶在体内循环半衰期,提高尿酸酶的生物利用度,降低免疫原性。
附图说明
图1为本发明制得的仿生膜包裹尿酸酶纳米粒的粒径(A.外泌体包裹尿酸酶纳米粒的粒径;B.融合膜包裹尿酸酶纳米粒的粒径)。
试验条件:采用马尔文激光粒度仪测定仿生膜包裹尿酸酶纳米粒的粒径。
结果显示:外泌体包裹尿酸酶纳米粒、融合膜包裹尿酸酶纳米粒的粒径分别为298.8±5.34nm和181.2±16.41nm。
图2为本发明制得的仿生膜包裹尿酸酶纳米粒和膜蛋白表征。
试验条件:将制备所得外泌体、红细胞膜、外泌体包裹尿酸酶纳米粒、融合膜包裹尿酸酶纳米粒样品分别和蛋白上样缓冲液混合,100℃高温下加热10分钟使蛋白变性,即可制备为跑胶蛋白样品。配制12%分离胶、5%浓缩胶。蛋白上样,电泳至胶底部,取下胶板,用0.25%考马斯亮蓝染色40分钟,而后分别用纯水、脱色液反复洗涤、脱色,直至凝胶背景清晰,在凝胶成像系统下拍照。
结果显示:外泌体包裹尿酸酶纳米粒和融合膜包裹尿酸酶纳米粒均出现了清晰的不同分子量蛋白条带,说明制备外泌体包裹尿酸酶纳米粒、融合膜包裹尿酸酶纳米粒的过程中膜上蛋白均被保留。在各个特征分子量上,外泌体包裹尿酸酶纳米粒与外泌体的电泳结果均出现同样的蛋白条带,融合膜包裹尿酸酶纳米粒与外泌体、红细胞膜的电泳结果均出现同样的蛋白条带(图2),说明了仿生膜包裹尿酸酶纳米粒具有了源细胞膜上特征蛋白,即膜蛋白被较好地修饰在纳米粒表面。
图3为本发明制得仿生膜包裹尿酸酶纳米粒酶的活性-时间曲线图。
试验条件:18只SD大鼠(在给药前禁食24小时,但不禁水),随机分为3组,每组6只,分别尾静脉注射尿酸酶、本发明提供的外泌体包裹尿酸酶纳米粒、融合膜包裹尿酸酶纳米粒,给药剂量相同(以尿酸酶0.8mg/kg计)。给药后定时采血,进行药代动力学研究。
结果显示:给药后仿生膜包裹尿酸酶纳米粒的酶活性始终高于游离尿酸酶,外泌体包裹尿酸酶纳米粒、融合膜包裹尿酸酶纳米粒的酶活性最大值分别是游离酶的1.46倍和1.81倍,同时在大鼠体内的滞留时间也明显高于尿酸酶,分别为游离酶的3.26倍和7.27倍。活性-时间曲线图下面积相对于游离酶有明显提高,分别是游离酶的3.35倍和5.77倍,说明仿生膜包裹尿酸酶纳米粒明显提高了尿酸酶的生物利用度。
具体实施方式
为了进一步说明本发明及其优点,给出了下列特定的实施例,应理解这些实施例仅有于具体说明而不是作为本发明范围的限制。所述的仿生膜包裹尿酸酶纳米粒中尿酸酶含量为0.1-10U/mL,缓冲液pH为6.5-9,其余各组分重量比为:
透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇 10-200份,
环糊精 600-1200份,
其余条件包括制备方法见各实施例。
实施例1:
仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,包括尿酸酶纳米粒和外泌体包裹层。外泌体包裹尿酸酶纳米粒配方中各组分的重量比为:透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇10份,羟丁基-β-环糊精600份。尿酸酶含量为0.1U/mL,缓冲液的pH为6.5。
制备方法:(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法:将透明质酸(10KDa)、N-羟基琥珀酰亚胺,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入10mL硼酸缓冲液pH 8.5,搅拌0.5小时得到液体A;称取处方量甲氧基聚乙二醇600胺基(mPEG600-NH2),加入4mL硼酸缓冲液pH 8.5溶解后,并入液体A中,在氮气保护下反应12小时,然后在超纯水中透析26小时,冻干即得到透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇;(2)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH 6.5得到2%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量羟丁基-β-环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH 6.5得到4%环糊精溶液;将处方量尿酸酶溶于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入溶液,磁力搅拌1.6小时,即得尿酸酶纳米粒;(3)外泌体的制备方法:取10mL羊奶,离心20分钟,取上清液,离心70分钟,取上清液,再离心80分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(4)外泌体包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体与步骤(2)得到的尿酸酶纳米粒以体积比为1:2混匀,涡旋1分钟,冰浴,超声30分钟,即得外泌体包裹尿酸酶纳米粒。
实施例2:
仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,包括尿酸酶纳米粒和融合膜包裹层。融合膜包裹尿酸酶纳米粒配方中各组分的重量比为:透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇63.5份,磺丁基-γ-环糊精和磺丁基-β-环糊精的混合物854.7份(质量比为1:1),尿酸酶含量为0.3U/mL,缓冲液的pH为6.8。
制备方法:(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法:将透明质酸(50KDa)、N-羟基琥珀酰亚胺,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入5-11mL硼酸缓冲液pH 8.5,搅拌0.5-1.5小时得到液体A;称取处方量甲氧基聚乙二醇1000胺基(mPEG1000-NH2),加入8mL硼酸缓冲液pH 8.5溶解后,并入液体A中,在氮气保护下反应13小时,然后在超纯水中透析25小时,冻干即得到透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇;(2)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH6.8得到1%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量磺丁基-γ-环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH 6.8得到2%环糊精溶液;将处方量尿酸酶溶于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入环糊精溶液,磁力搅拌1.8小时,即得尿酸酶纳米粒;(3)外泌体的制备方法:取6mL兔奶,离心25分钟,取上清液,离心55分钟,取上清液,再离心90分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(4)红细胞膜的制备方法:取5mL大鼠血液,离心6分钟后,除去上清液后加入适量10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4,继续离心至上层血清无色透明,收集下层沉淀,洗涤后将沉淀重悬于2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中,在冰浴条件下低渗裂解30分钟后在低温条件下离心,直至上清液澄清透明。在使用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4进行2次洗涤离心循环后,收集底部沉淀即得红细胞膜;(5)融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体与步骤(4)得到的红细胞膜以质量比3:5混匀后备用;(6)融合膜包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(5)得到的融合膜与步骤(2)得到的尿酸酶纳米粒以体积比4:5混匀,涡旋2分钟,冰浴,超声15分钟,即得融合膜包裹尿酸酶纳米粒。
实施例3:
仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,包括尿酸酶纳米粒和外泌体包裹层。外泌体包裹尿酸酶纳米粒配方中各组分的重量比为:透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇87.6份,羟丙基-γ-环糊精,羟丙基-β-环糊精混合物702.8份(质量比为2:3),尿酸酶含量为0.5U/mL,缓冲液的pH为7.8。
制备方法:(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法:将透明质酸(15KDa)、N-羟基琥珀酰亚胺,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入9mL硼酸缓冲液pH 8.5,搅拌0.7小时得到液体A;称取处方量甲氧基聚乙二醇3400胺基(mPEG3400-NH2),加入4mL硼酸缓冲液pH 8.5溶解后,并入液体A中,在氮气保护下反应13小时,然后在超纯水中透析25小时,冻干即得到透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇。(2)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH 7.8得到1.8%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH7.8得到5%环糊精溶液;将处方量尿酸酶溶于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入环糊精溶液,磁力搅拌1.7小时,即得尿酸酶纳米粒;(3)外泌体的制备方法:取20mL牛奶,离心35分钟,取上清液,离心55分钟,取上清液,再离心85分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(4)红细胞膜的制备方法:取5mL人血液,离心6分钟后,除去上清液后加入适量10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4,继续离心至上层血清无色透明,收集下层沉淀,洗涤后将沉淀重悬于2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中,在冰浴条件下低渗裂解30分钟后在低温条件下离心,直至上清液澄清透明。在使用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4进行2次洗涤离心循环后,收集底部沉淀即得红细胞膜;(5)融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体与步骤(4)得到的红细胞膜以质量比1:2混匀后备用;(6)融合膜包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(5)得到的融合膜与步骤(2)得到的尿酸酶纳米粒以体积比3:2混匀,涡旋2分钟,冰浴,超声15分钟,即得融合膜包裹尿酸酶纳米粒。
实施例4:
仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,包括尿酸酶纳米粒和融合膜包裹层。融合膜包裹尿酸酶纳米粒配方中各组分的重量比为:透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇143.6份,磺丁基-β-环糊精、磺丁基-γ-环糊精、羟丙基-β-环糊精的混合物1109.3份(质量比为1:1:3),尿酸酶含量为0.7U/mL,缓冲液的pH为6.7。
制备方法:(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法:将透明质酸(50KDa)、N-羟基琥珀酰亚胺,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入8mL硼酸缓冲液pH 8.5,搅拌1.2小时得到液体A;称取处方量甲氧基聚乙二醇5000胺基(mPEG5000-NH2),加入8mL硼酸缓冲液pH 8.5溶解后,并入液体A中,在氮气保护下反应14小时,然后在超纯水中透析22小时,冻干即得到透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇;(2)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH 6.7得到3%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH 6.7得到5%环糊精溶液;将处方量尿酸酶溶于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入环糊精溶液,磁力搅拌2.2小时,即得尿酸酶纳米粒;(3)外泌体的制备方法:取10mL牛奶,离心26分钟,取上清液,离心65分钟,取上清液,再离心70分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(4)红细胞膜的制备方法:取4mL兔血液,离心8分钟后,除去上清液后加入适量10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4,继续离心至上层血清无色透明,收集下层沉淀,洗涤后将沉淀重悬于2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中,在冰浴条件下低渗裂解35分钟后在低温条件下离心,直至上清液澄清透明。在使用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4进行4次洗涤离心循环后,收集底部沉淀即得红细胞膜;(5)融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体与步骤(4)得到的红细胞膜以质量比1:2混匀后备用;(6)融合膜包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(5)得到的融合膜与步骤(2)得到的尿酸酶纳米粒以体积比3:5混匀,涡旋5分钟,冰浴,超声10分钟,即得融合膜包裹尿酸酶纳米粒。
实施例5:
仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,包括尿酸酶纳米粒和融合膜包裹层。融合膜包裹尿酸酶纳米粒配方中各组分的重量比为:透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇22.4份,磺丁基-β-环糊精751.7份,尿酸酶含量为0.8U/mL,缓冲液的pH为7.4。
制备方法:(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法:将透明质酸(30KDa)、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入5-11mL硼酸缓冲液pH 8.5,搅拌1.5小时得到液体A;称取处方量甲氧基聚乙二醇10000胺基(mPEG10000-NH2),加入4mL硼酸缓冲液pH 8.5溶解后,并入液体A中,在氮气保护下反应16小时,然后在超纯水中透析22小时,冻干即得到透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇;(2)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH 7.4得到1.3%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH 7.4得到2.8%环糊精溶液;将处方量尿酸酶溶于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入环糊精溶液,磁力搅拌1.5小时,即得尿酸酶纳米粒;(3)外泌体的制备方法:取10mL羊奶,离心40分钟,取上清液,离心50分钟,取上清液,再离心90分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(4)红细胞膜的制备方法:取10mL兔血液,离心8分钟后,除去上清液后加入适量10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4,继续离心至上层血清无色透明,收集下层沉淀,洗涤后将沉淀重悬于2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中,在冰浴条件下低渗裂解25分钟后在低温条件下离心,直至上清液澄清透明,再使用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4进行2次洗涤离心循环后,收集底部沉淀即得红细胞膜;(5)融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体与步骤(4)得到的红细胞膜以质量比4:5混匀后备用;(6)融合膜包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(5)得到的融合膜与步骤(2)得到的尿酸酶纳米粒以体积比6:5混匀,涡旋4分钟,冰浴,超声26分钟,即得融合膜包裹尿酸酶纳米粒。
实施例6:
仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,包括尿酸酶纳米粒和外泌体包裹层。外泌体包裹尿酸酶纳米粒配方中各组分的重量比为:透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇100份,羟丙基-β-环糊精900份,尿酸酶含量为1U/mL,缓冲液的pH为7.3。
制备方法:(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法:将透明质酸(12KDa)、N-羟基琥珀酰亚胺,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入8mL硼酸缓冲液pH 8.5,搅拌1小时得到液体A;称取处方量甲氧基聚乙二醇2000胺基(mPEG2000-NH2),加入6mL硼酸缓冲液pH 8.5溶解后,并入液体A中,在氮气保护下反应12小时,然后在超纯水中透析24小时,冻干即得到透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇;(2)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH 7.3得到1%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH 7.3得到6%环糊精溶液;将尿酸酶溶于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入环糊精溶液,磁力搅拌2小时,即得尿酸酶纳米粒;(3)外泌体的制备方法:取20mL牛奶,离心30分钟,取上清液,离心60分钟,取上清液,再离心90分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(4)外泌体包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体与步骤(2)得到的尿酸酶纳米粒以体积比1:1混匀,涡旋3分钟,冰浴,超声10分钟,即得外泌体包裹尿酸酶纳米粒。
实施例7:
仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,包括尿酸酶纳米粒和融合膜包裹层。融合膜包裹尿酸酶纳米粒配方中各组分的重量比为:透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇100份,羟丙基-β-环糊精900份,尿酸酶含量为1U/mL,缓冲液的pH为7.3。
制备方法:(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法:将透明质酸(12KDa)、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入8mL硼酸缓冲液pH 8.5,搅拌1小时得到液体A;称取处方量甲氧基聚乙二醇15000胺基(mPEG15000-NH2),加入6mL硼酸缓冲液pH 8.5溶解后,并入液体A中,在氮气保护下反应12小时,然后在超纯水中透析24小时,冻干即得到透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇;(2)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH 7.3得到1%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH 7.3得到6%环糊精溶液;将处方量尿酸酶溶于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入环糊精溶液,磁力搅拌2小时,即得尿酸酶纳米粒;(3)外泌体的制备方法:取16mL牛奶,离心30分钟,取上清液,离心60分钟,取上清液,再离心90分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(4)红细胞膜的制备方法:取10mL鼠血液,离心8分钟后,除去上清液后加入适量10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4,继续离心至上层血清无色透明,收集下层沉淀,洗涤后将沉淀重悬于2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中,在冰浴条件下低渗裂解30分钟后在低温条件下离心,直至上清液澄清透明。在使用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4进行3次洗涤离心循环后,收集底部沉淀即得红细胞膜;(5)融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体与步骤(4)得到的红细胞膜以质量比1:1混匀后备用;(6)融合膜包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(5)得到的融合膜与步骤(2)得到的尿酸酶纳米粒以体积比1:1混匀,涡旋3分钟,冰浴,超声20分钟,即得融合膜包裹尿酸酶纳米粒。
实施例8:
仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,包括尿酸酶纳米粒和融合膜包裹层。融合膜包裹尿酸酶纳米粒配方中各组分的重量比为:透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇39.6份,甲基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精的混合物808.6份(质量比为1:3),尿酸酶含量为2.5U/mL,缓冲液的pH为7。
制备方法:(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法:将透明质酸(40KDa)、N-羟基琥珀酰亚胺,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入9mL硼酸缓冲液pH 8.5,搅拌0.6小时得到液体A;称取处方量甲氧基聚乙二醇3500胺基(mPEG3500-NH2),加入7mL硼酸缓冲液pH 8.5溶解后,并入液体A中,在氮气保护下反应13小时,然后在超纯水中透析25小时,冻干即得到透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇。(2)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH 7得到2.5%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH 7得到4.5%环糊精溶液;将尿酸酶溶于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入环糊精溶液,磁力搅拌1.5小时,即得尿酸酶纳米粒;(3)外泌体的制备方法:取8mL兔奶,离心20分钟,取上清液,离心50分钟,取上清液,再离心80分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(4)红细胞膜的制备方法:取8mL兔血液,离心9分钟后,除去上清液后加入适量10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4,继续离心至上层血清无色透明,收集下层沉淀,洗涤后将沉淀重悬于2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中,在冰浴条件下低渗裂解35分钟后在低温条件下离心,直至上清液澄清透明。在使用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4进行2次洗涤离心循环后,收集底部沉淀即得红细胞膜;(5)融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体与步骤(4)得到的红细胞膜以质量比1:1混匀后备用;(6)融合膜包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(5)得到的融合膜与步骤(2)得到的尿酸酶纳米粒以体积比7:10混匀,涡旋4分钟,冰浴,超声26分钟,即得融合膜包裹尿酸酶纳米粒。
实施例9:
仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,包括尿酸酶纳米粒和外泌体包裹层。外泌体包裹尿酸酶纳米粒配方中各组分的重量比为:透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇193.5份,羟丙基-α-环糊精、羟丁基-β-环糊精的混合物1156.5份(质量比2:1),尿酸酶含量为3.8U/mL,缓冲液的pH为7.2。
制备方法:(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法:将透明质酸(22KDa)、N-羟基琥珀酰亚胺,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入5mL硼酸缓冲液pH 8.5,搅拌0.8小时得到液体A;称取处方量甲氧基聚乙二醇20000胺基(mPEG20000-NH2),加入6mL硼酸缓冲液pH 8.5溶解后,并入液体A中,在氮气保护下反应13小时,然后在超纯水中透析23小时,冻干即得到透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇;(2)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH 7.2得到2%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH 7.2得到5%环糊精溶液;将处方量尿酸酶溶于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入环糊精溶液,磁力搅拌2小时,即得尿酸酶纳米粒;(3)外泌体的制备方法:取20mL牛奶,离心18分钟,取上清液,离心70分钟,取上清液,再离心70分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(4)外泌体包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体与步骤(2)得到的尿酸酶纳米粒以体积比9:10混匀,涡旋2分钟,冰浴,超声11分钟,即得外泌体包裹尿酸酶纳米粒。
实施例10:
仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,包括尿酸酶纳米粒和外泌体包裹层。外泌体包裹尿酸酶纳米粒配方中各组分的重量比为:透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇156.2.5份,羟丙基-α-环糊精、甲基-β-环糊精的混合物1001.8份(质量比1:2),尿酸酶含量为5.7U/mL,缓冲液的pH为8.8。
制备方法:(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法:将透明质酸(61KDa)、N-羟基琥珀酰亚胺,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入10mL硼酸缓冲液pH 8.5,搅拌1小时得到液体A;称取处方量甲氧基聚乙二醇8000胺基(mPEG8000-NH2),加入8mL硼酸缓冲液pH 8.5溶解后,并入液体A中,在氮气保护下反应13小时,然后在超纯水中透析22小时,冻干即得到透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇;(2)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH 8.8得到1.5%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH8.8得到3%环糊精溶液;将处方量尿酸酶溶于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入环糊精溶液,磁力搅拌1.8小时,即得尿酸酶纳米粒;(3)外泌体的制备方法:取18mL兔奶,离心30分钟,取上清液,离心65分钟,取上清液,再离心65分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(4)外泌体包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体与步骤(2)得到的尿酸酶纳米粒以体积比为9:5混匀,涡旋1.5分钟,冰浴,超声13分钟,即得外泌体包裹尿酸酶纳米粒。
实施例11:
仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,包括尿酸酶纳米粒和融合膜包裹层。融合膜包裹尿酸酶纳米粒配方中各组分的重量比为:透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇178.1份,磺丁基-α-环糊精、羟丙基-β-环糊精的混合物1058.6份(质量比1:2),尿酸酶含量为8.3U/mL,缓冲液的pH为8。
制备方法:(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法:将透明质酸(72KDa)、N-羟基琥珀酰亚胺,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入6mL硼酸缓冲液pH 8.5,搅拌0.9小时得到液体A;称取处方量甲氧基聚乙二醇12000胺基(mPEG12000-NH2),加入5mL硼酸缓冲液pH 8.5溶解后,并入液体A中,在氮气保护下反应13小时,然后在超纯水中透析20小时,冻干即得到透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇;(2)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH 8得到1.8%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH 8得到4%环糊精溶液;将处方量尿酸酶溶于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入环糊精溶液,磁力搅拌1.8小时,即得尿酸酶纳米粒;(3)外泌体的制备方法:取20mL羊奶,离心20分钟,取上清液,离心70分钟,取上清液,再离心100分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(4)红细胞膜的制备方法:取20mL人血液,离心8分钟后,除去上清液后加入适量10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4,继续离心至上层血清无色透明,收集下层沉淀,洗涤后将沉淀重悬于2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中,在冰浴条件下低渗裂解20分钟后在低温条件下离心,直至上清液澄清透明。在使用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4进行3次洗涤离心循环后,收集底部沉淀即得红细胞膜;(5)融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体与步骤(4)得到的红细胞膜以质量比3:2混匀后备用;(6)融合膜包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(5)得到的融合膜与步骤(2)得到的尿酸酶纳米粒以体积比8:5混匀,涡旋5分钟,冰浴,超声10分钟,即得融合膜包裹尿酸酶纳米粒。
实施例12:
仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,包括尿酸酶纳米粒和融合膜包裹层。融合膜包裹尿酸酶纳米粒配方中各组分的重量比为:透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇200份,磺丁基-γ-环糊精、甲基-β-环糊精、羟丙基-α-环糊精的混合物1200份(质量比1:1:1),尿酸酶含量为10U/mL,缓冲液的pH为9。
制备方法:(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法:将透明质酸(80KDa)、N-羟基琥珀酰亚胺,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入8mL硼酸缓冲液pH 8.5,搅拌0.8小时得到液体A;称取处方量甲氧基聚乙二醇2000胺基(mPEG2000-NH2),加入8mL硼酸缓冲液pH 8.5溶解后,并入液体A中,在氮气保护下反应15小时,然后在超纯水中透析24小时,冻干即得到透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇;(2)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH 9得到1.2%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH 9得到5.8%环糊精溶液;将尿酸酶溶于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入环糊精溶液,磁力搅拌1.7小时,即得尿酸酶纳米粒;(3)外泌体的制备方法:取10mL牛奶,离心25分钟,取上清液,离心60分钟,取上清液,再离心85分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(4)红细胞膜的制备方法:取10mL人血液,离心6分钟后,除去上清液后加入适量10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4,继续离心至上层血清无色透明,收集下层沉淀,洗涤后将沉淀重悬于2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中,在冰浴条件下低渗裂解30分钟后在低温条件下离心,直至上清液澄清透明。在使用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4进行3次洗涤离心循环后,收集底部沉淀即得红细胞膜;(5)融合膜的制备方法:将步骤(3)得到的外泌体与步骤(4)得到的红细胞膜以质量比2:1混匀后备用;(6)融合膜包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(5)得到的融合膜与步骤(2)得到的尿酸酶纳米粒以体积比2:1混匀,涡旋4分钟,冰浴,超声16分钟,即得融合膜包裹尿酸酶纳米粒。
Claims (1)
1.一种仿生膜包裹尿酸酶纳米粒,其特征在于,包括尿酸酶纳米粒和仿生膜包裹层;
所述的仿生膜包裹尿酸酶纳米粒中尿酸酶含量为0.1-10U/mL,缓冲液pH为6.5-9,其余各组分质量比为:
透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇 10-200份,
环糊精 600-1200份;
所述的仿生膜包括外泌体、或者外泌体和红细胞膜的融合膜,即:(1)外泌体,即牛奶外泌体、羊奶外泌体、兔奶外泌体和其它哺乳动物的奶源外泌体的一种;(2)外泌体和红细胞膜的融合膜,即外泌体与红细胞膜形成的融合膜;
所述的环糊精包括:羟丙基-α-环糊精、磺丁基-α-环糊精、羟丙基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、羟丁基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、磺丁基-γ-环糊精的一种或几种的混合物;
所述的一种仿生膜包裹尿酸酶纳米粒的制备包括下列步骤:(1)尿酸酶纳米粒的制备方法:将处方量透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶于Tris-HCl缓冲液pH 6.5-9得到1%-3%透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液;将处方量环糊精溶于Tris-HCl缓冲液pH 6.5-9得到2%-6%环糊精溶液;将尿酸酶溶于1-5mL的透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶液中,然后将其缓慢滴加入环糊精溶液,磁力搅拌1.5-2.5小时,即得尿酸酶纳米粒;(2)外泌体的制备方法:取牛奶、羊奶、兔奶或其他哺乳动物的奶,离心20-40分钟,取上清液,离心50-70分钟,取上清液,再离心80-100分钟,收集沉淀,分散于磷酸盐缓冲液pH 7.4,即得外泌体;(3)红细胞膜的制备方法:取血液离心4-10分钟后,除去上清液后加入适量10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4,继续离心至上层血清无色透明,收集下层沉淀,洗涤后将沉淀重悬于2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中,在冰浴条件下低渗裂解20-40分钟后在低温条件下离心,直至上清液澄清透明。在使用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4进行2-4次洗涤离心循环后,收集底部沉淀即得红细胞膜;(4)融合膜的制备方法:将步骤(2)得到的外泌体与步骤(3)得到的红细胞膜以质量比1:2至2:1混匀后备用;(5)仿生膜包裹尿酸酶纳米粒的制备方法:将步骤(2)得到的外泌体或步骤(4)得到的融合膜与步骤(1)得到的尿酸酶纳米粒以体积比1:2至2:1混匀,涡旋1-5分钟,冰浴,超声10-30分钟,即得仿生膜包裹尿酸酶纳米粒。
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Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103255174A (zh) * | 2013-05-02 | 2013-08-21 | 天津大学 | 以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物及三元复合物的液体与应用 |
CN104338124A (zh) * | 2014-09-19 | 2015-02-11 | 重庆医科大学 | 载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒 |
CN112089704A (zh) * | 2020-09-27 | 2020-12-18 | 中国药科大学 | 一种仿生纳米载体及其制备方法和应用 |
US20210246426A1 (en) * | 2020-02-10 | 2021-08-12 | Rubius Therapeutics, Inc. | Engineered Erythroid Cells Including HLA-G Polypeptides and Methods of Use Thereof |
CN113648405A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-11-16 | 重庆医科大学 | 一种口服重组幽门螺杆菌蛋白疫苗纳米粒及其制备方法 |
CN113648289A (zh) * | 2021-08-29 | 2021-11-16 | 重庆医科大学 | 一种肺癌细胞膜包裹精氨酸脱亚胺酶脂质纳米粒及其制备方法 |
CN113750232A (zh) * | 2021-09-12 | 2021-12-07 | 重庆医科大学 | 一种巨噬细胞膜包覆精氨酸脱亚胺酶/过氧化氢酶/ir780纳米粒、制备方法和应用 |
CN114306581A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-04-12 | 重庆医科大学 | 一种融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒及其制备方法 |
-
2022
- 2022-08-30 CN CN202211070399.1A patent/CN115429774B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103255174A (zh) * | 2013-05-02 | 2013-08-21 | 天津大学 | 以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物及三元复合物的液体与应用 |
CN104338124A (zh) * | 2014-09-19 | 2015-02-11 | 重庆医科大学 | 载天门冬酰胺酶的自组装聚乙二醇-透明质酸/环糊精纳米粒 |
US20210246426A1 (en) * | 2020-02-10 | 2021-08-12 | Rubius Therapeutics, Inc. | Engineered Erythroid Cells Including HLA-G Polypeptides and Methods of Use Thereof |
CN112089704A (zh) * | 2020-09-27 | 2020-12-18 | 中国药科大学 | 一种仿生纳米载体及其制备方法和应用 |
CN113648405A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-11-16 | 重庆医科大学 | 一种口服重组幽门螺杆菌蛋白疫苗纳米粒及其制备方法 |
CN113648289A (zh) * | 2021-08-29 | 2021-11-16 | 重庆医科大学 | 一种肺癌细胞膜包裹精氨酸脱亚胺酶脂质纳米粒及其制备方法 |
CN113750232A (zh) * | 2021-09-12 | 2021-12-07 | 重庆医科大学 | 一种巨噬细胞膜包覆精氨酸脱亚胺酶/过氧化氢酶/ir780纳米粒、制备方法和应用 |
CN114306581A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-04-12 | 重庆医科大学 | 一种融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒及其制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
NGU ALICE: "Milk exosomes in nutrition and drug delivery", 《AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY. CELL PHYSIOLOGY》, pages 1 - 12 * |
SHUYUAN LI: "The Potential of Milk-Derived Exosomes for Drug Delivery", 《CURRENT DRUG DELIVERY》, vol. 18, no. 6, pages 688 - 699 * |
曹鑫: "尿酸酶纳米粒在大鼠体内的药代动力学及生物等效性研究", 《中国临床药理学杂志》, vol. 37, no. 18, pages 2486 - 2489 * |
田然: "基于"肿瘤外泌体-同源红细胞"的仿生纳米囊泡在肿瘤治疗中的初步应用", 《中国优秀博士学位论文 医药卫生科技辑》, pages 1 - 108 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN115429774B (zh) | 2023-07-14 |
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