CN115381931A - 一种融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒及其制备方法 - Google Patents

一种融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115381931A
CN115381931A CN202211049267.0A CN202211049267A CN115381931A CN 115381931 A CN115381931 A CN 115381931A CN 202211049267 A CN202211049267 A CN 202211049267A CN 115381931 A CN115381931 A CN 115381931A
Authority
CN
China
Prior art keywords
uricase
membrane
catalase
endoplasmic reticulum
nanoparticles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211049267.0A
Other languages
English (en)
Inventor
张景勍
伯敏
钟彩铃
杨婕
袁誉铭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Medical University
Original Assignee
Chongqing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Medical University filed Critical Chongqing Medical University
Priority to CN202211049267.0A priority Critical patent/CN115381931A/zh
Publication of CN115381931A publication Critical patent/CN115381931A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5176—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5192—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01006—Catalase (1.11.1.6)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于药物制剂领域。本发明涉及融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒及其制备方法。本发明制备得到融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒可以增加尿酸酶的稳定性，提高尿酸酶抗蛋白酶水解的能力，提高生物利用度，降低毒副作用。

Description

一种融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒及其制备 方法
技术领域
本发明属于医药制剂领域，涉及融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒及其制备方法。
背景技术
高尿酸血症是嘌呤代谢紊乱，血清尿酸水平升高引起的代谢异常综合征，其在全球的发病率持续升高。目前临床上药物治疗机制主要包括抑制尿酸生成、促进尿酸排泄以及分解尿酸。黄嘌呤氧化酶抑制剂非布司他和别嘌醇通过抑制尿酸合成降低血清尿酸浓度，但存在心血管风险和肝功异常等毒副作用。丙磺舒等药物通过抑制肾小管中尿酸重吸收而促进尿酸排泄，但会引起肾功能损害等不良反应。在广泛的医学治疗中，蛋白质疗法为治疗代谢紊乱，癌症，自身免疫性疾病等提供了新的思路。尿酸酶是一种有效治疗高尿酸血症的蛋白质药物，可快速将已形成的尿酸转化为更易溶解和排泄的尿囊素和过氧化氢，其特异性强，催化效率高，但具有稳定性差、给药后易被清除、免疫原性，作用后产生有细胞毒性的过氧化氢等缺点，极大限制其临床应用。过氧化氢酶可促使过氧化氢分解为氧气和水，清除体内因尿酸降解产生的过氧化氢，从而使细胞免于遭受过氧化氢的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。过氧化氢的分解会促进尿酸酶分解尿酸的速度，同时氧气可加快尿酸酶分解尿酸的速度。
透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇和环糊精可自组装形成中空纳米粒，该自组装中空纳米粒具有生物膜相似性和生物降解性的特点，可以降低蛋白质的免疫原性，提高其生物利用度。细胞膜是细胞与外界进行频繁交互的界面，其上具有各种蛋白质、糖类和脂质等，是发挥细胞特异性功能的关键。纳米粒用两种细胞膜融合而成的融合膜包被后可同时具有两种不同细胞膜的功能，作用效果和制剂稳定性均优于单一细胞膜修饰的仿生载体。用红细胞膜与内质网膜所形成的融合膜对纳米粒进行伪装，不仅能延长纳米粒血液循环时间，且能有效促进纳米载体的细胞摄取，最终大大提高药物疗效。
经查询专利及文献，目前尚无载带复合酶的透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇和环糊精自组装中空纳米粒的任何报道，尚无红细胞膜和内质网膜的融合膜包裹载带复合酶的透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇和环糊精自组装中空纳米粒的任何报道，当然，目前也尚无载带尿酸酶和过氧化氢酶的透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇和环糊精自组装中空纳米粒的任何报道。本发明制备得到的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒可以增加尿酸酶的稳定性，提高尿酸酶抗蛋白酶水解的能力，提高生物利用度，降低毒副作用，可以用于高尿酸血症和痛风等相关疾病的治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒及其制备方法。融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒克服了尿酸酶稳定性差、易被清除、免疫原应、作用后产生有细胞毒性的过氧化氢等缺点，可保持较长时间的血药浓度，具有缓释作用，可以减少给药次数，提高患者的顺应性，降低毒副作用。本发明提供的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒制备工艺简单，成本较低，易于控制，易于工业化生产。本研究为尿酸酶提供了可供选择的新型制剂，可用于高尿酸血症和痛风等相关疾病的治疗。
本发明提供的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，其特征在于，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜仿生包裹层。制剂中尿酸酶含量5-15U/mL，过氧化氢酶含量为2-6U/mL，缓冲液pH为8-10，制剂中其余各组分重量份数比为：透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇20-58份，环糊精150-300份。本发明提供的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，制备步骤如下：(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法：将透明质酸，N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，搅拌20-40分钟得到液体A，将甲氧基聚乙二醇胺基(mPEG-NH2)溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，得到液体B，将液体B加至液体A中，氮气保护下反应15-25小时，纯水透析，将所得溶液冷冻干燥即得透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇；(2)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 8-10中，得到液体①，将环糊精溶解于碳酸盐缓冲液pH 8-10中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌1-4小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：将新鲜血液离心1-10分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4洗涤沉淀3-5次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心15-25分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得红细胞膜；(4)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，取1-5克肝脏组织或2000-4000万个肝细胞，加入内质网膜提取液A并研磨1-5分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置20-30分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置10-20分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置20-30分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(3)得到的红细胞膜和步骤(4)得到的内质网膜以质量比1:2至2:1在冰浴条件下超声10-20分钟使膜融合；(6)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(5)得到的融合膜与步骤(2)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比1:2至2:1混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数10-20次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。
本发明提供的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒平均粒径小于600nm(图1)。本发明提供的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒提高了尿酸酶的稳定性。融合膜对纳米粒进行伪装，能够使纳米粒具有双重生物膜的表面特征蛋白和特殊功能。本发明制备的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，与内质网膜、红细胞膜和融合膜的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果均出现了清晰的不同分子量蛋白条带，在各个特征分子量上，融合膜的电泳结果出现与红细胞膜和内质网膜相同的蛋白条带，融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒与融合膜的电泳结果均出现同样的蛋白条带(图2)。
本发明提供的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒能增加尿酸酶的稳定性。4℃放置稳定性实验中，融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒中尿酸酶的活性始终高于游离尿酸酶，在贮存时间20天时，游离尿酸酶的活性仅为初始酶活性的21.33％，而融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒中尿酸酶活性还保留了约62.82％，较游离酶活性值保留更多(图3)。融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒增加酶稳定性的原因可能有：(1)尿酸酶被封装在纳米粒内，内部微环境相对稳定，受外界影响较小，因此不易被降解，从而稳定性提高；(2)融合膜包裹可使纳米粒继承红细胞和内质网生物膜的表面特异蛋白，使纳米粒子实现仿生化，使其不会在循环系统中被体内吞噬细胞吞噬，延长了纳米粒在体内的循环时间。本发明提供的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒在抗胰蛋白酶水解实验中，在胰蛋白酶处理24小时后，游离尿酸酶活性仅剩余约5.63％活性，而融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒还保留约57.29％活性(图4)。可能是因为纳米粒及融合膜的双重保护，使尿酸酶免受蛋白酶的破坏。
本发明提供的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒可降低细胞毒性。单独的尿酸不会产生细胞毒性，尿酸酶分解尿酸产生的过氧化氢使HepG2细胞的活力下降了约30％，有明显的细胞毒性，加入过氧化氢酶后，尿酸酶和过氧化氢酶组、融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒组细胞活力显著提升(图5)。融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒降低细胞毒性的原因可能是，尿酸酶分解尿酸会产生具有细胞毒性的过氧化氢，过氧化氢酶的加入可分解过氧化氢，降低毒副作用。
本发明提供的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒体内给药后，尿酸酶活性-时间曲线图下面积相对于游离酶有明显提高(图6)，为游离酶的5.46倍，活性最大值为游离酶的1.32倍。结果表明，将尿酸酶制备成融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒后，能显著提高尿酸酶的生物利用度，同等剂量下能使药物在更长时间内保持较高活性，延长药物在体内的作用时间。本发明的制剂生物利用度明显提高的原因可能包括：(1)融合膜和纳米粒的双重保护作用，使其免受蛋白酶水解和吞噬细胞清除；(2)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒能增强酶的稳定性，使其在长时间内保持较高活性；(3)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒能改善酶的体内行为，提高生物利用度；(4)酶被封装在纳米粒中后包覆生物膜，制剂内部形成了“纳米反应器”，大分子的酶不能随意进出，而小分子的底物可自由进出反应器，尿酸会从高浓度的溶液中自发进入低浓度的反应器内部，并且内部的尿酸浓度更高，增强了尿酸酶与底物的结合，二者亲和力提高，从而增大反应速率；(5)过氧化氢酶可能会增加尿酸酶的活性，尿酸酶分解尿酸会生成尿囊素和过氧化氢，过氧化氢酶可将过氧化氢分解成氧气和水，其中过氧化氢的分解会促进尿酸的分解，同时氧气可加快尿酸酶分解尿酸的速度。
本发明不同于通常研究报道的尿酸酶的递送载体和制备工艺。尿酸酶的递送载体研究报道的有：常规脂质体、微球及脂质纳米粒等。本发明中的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒是一种新型自组装纳米粒。目前尚未见透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇和环糊精自组装中空纳米粒载带复合治疗酶的研究，当然，也尚未见细胞膜包裹的透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇和环糊精自组装中空纳米粒，尚未见融合膜包裹的载复合治疗酶的透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇和环糊精自组装中空纳米粒，尚未见融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇和环糊精自组装中空纳米粒，尚未见红细胞膜和内质网膜的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇和环糊精自组装中空纳米粒。本发明首次将大分子尿酸酶和过氧化氢酶包裹于透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇和环糊精自组装中空纳米粒中，再经红细胞膜和内质网膜融合形成的融合膜包裹载尿酸酶和过氧化氢酶的透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇和环糊精自组装中空纳米粒。该自组装纳米粒能增加尿酸酶的稳定性，提高尿酸酶抗蛋白酶水解的能力，提高治疗酶的生物利用度。
附图说明
图1为本发明制得的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的粒径。
试验条件：采用马尔文激光粒度仪测定融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的粒径。
结果显示：融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的粒径为(545.07±14.91)nm。
图2为本发明制得的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒、内质网膜、红细胞膜、融合膜的表面膜蛋白表征。
试验条件：将制备所得内质网膜、红细胞膜、融合膜、融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒样品分别和蛋白上样缓冲液混合，100℃高温下加热10分钟使蛋白变性，即可制备为跑胶蛋白样品。配制12％分离胶、5％浓缩胶。蛋白上样，电泳至胶底部，取下胶板，用0.25％考马斯亮蓝染色20分钟，而后分别用纯水、脱色液反复洗涤、脱色，直至凝胶背景清晰，在凝胶成像系统下拍照。
结果显示：在各个特征分子量上，融合膜的电泳结果出现与红细胞膜和内质网膜相同的蛋白条带，融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒与融合膜的电泳结果均出现同样的蛋白条带，说明融合膜制备成功，而且制备融合膜和融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的过程中膜上蛋白均被保留。在各个特征分子量上，融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒均显示出和融合膜出现同样的蛋白特征条带，说明了融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒具有了源细胞膜上特征蛋白，即膜蛋白被较好地装饰在纳米粒表面。
图3为本发明制得的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的4℃放置稳定性。
试验条件：将尿酸酶、融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒样品放置于4℃的冰箱中，分别于第0，4，8，12，16，20天时测定样品溶液中尿酸酶的活性。尿酸酶的初始酶活性被定为100％，计算各时间点酶的相对活性。
结果显示：随着贮存时间的延长，融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒中酶的活性始终高于游离的尿酸酶，储存20天后，尿酸酶的活性仅初始酶活性的21.33％，而融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的尿酸酶活性分别保留了62.82％。融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒中酶活性较游离尿酸酶活性保留更多。
图4为本发明制得的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的抗胰蛋白酶水解的能力。
试验条件：取尿酸酶、融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒与等体积的胰蛋白酶溶液混匀，于37℃水浴中保存，分别于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24小时测定混合溶液中尿酸酶的活性。尿酸酶的初始酶活性被定为100％，计算各时间点游离酶的相对活性。
结果显示：在胰蛋白酶处理24小时后，尿酸酶活性仅剩余约5.63％活性，而融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒还保留约57.29％活性，说明融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒显著提高了尿酸酶抗胰蛋白酶水解的能力。
图5为本发明制得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的细胞毒性。
试验条件：将HepG2细胞接种于96孔板中，37℃、5％CO2环境培养过夜。细胞贴壁后，用磷酸盐缓冲液洗涤，除对照组外，其余更换为含尿酸的培养基，并用尿酸酶、尿酸酶和过氧化氢酶、融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒样品处理细胞，在37℃下孵育3小时后，用磷酸盐缓冲液洗涤。使用MTT法测定存在尿酸时时各组细胞活力。
结果显示：单独的尿酸不会产生细胞毒性，而尿酸酶分解尿酸产生的过氧化氢使HepG2细胞的活力下降了约30％，有明显的细胞毒性。加入过氧化氢酶后，过氧化氢被分解，因此毒性明显减小异。融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒也可减小此毒性，该组细胞活力与对照组相比没有显著性差异，未产生细胞毒性。
图6为本发明制得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒中尿酸酶活性-时间曲线图。
试验条件：12只SD大鼠(在给药前禁食12小时，但不禁水)，随机分为2组，每组6只，分别注射尿酸酶、本发明提供的融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，给药剂量相同(以尿酸酶计)。给药后定时采血，进行药代动力学研究。
结果显示：给药后融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的尿酸酶活性始终高于游离尿酸酶，活性最大值是游离酶的1.32倍。尿酸酶活性-时间曲线图下面积相对于游离酶有明显提高，是游离酶的5.46倍，说明融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒明显提高了尿酸酶的生物利用度。
具体实施方式
为了进一步说明本发明及其优点，给出了下列特定的实施例，应理解这些实施例仅有于具体说明而不是作为本发明范围的限制。
实施例1：
融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜仿生包裹层。尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中各组分的重量份数比为：透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇20份，羟丙基-α-环糊精150份，尿酸酶含量为5U/mL，过氧化氢酶含量为2U/mL，缓冲液的pH为8。
制备方法：(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法：将透明质酸(12KDa)，N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，搅拌20分钟得到液体A，将甲氧基聚乙二醇1000胺基(mPEG1000-NH2)溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，得到液体B，将液体B加至液体A中，氮气保护下反应15小时，纯水透析，将所得溶液冷冻干燥即得透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇；(2)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 8中，得到液体①，将羟丙基-α-环糊精溶解于碳酸盐缓冲液pH 8中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌1小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：将4mL人的新鲜血液离心1分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH7.4洗涤沉淀3次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心15分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得红细胞膜；(4)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，如取1克肝脏组织，加入内质网膜提取液A并研磨1分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置20分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置10分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置20分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(3)得到的红细胞膜和步骤(4)得到的内质网膜以质量比1:2在冰浴条件下超声10分钟使膜融合；(6)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(5)得到的融合膜，与步骤(2)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比1:2混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数10次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。
实施例2：
融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜仿生包裹层。尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中各组分的重量份数比为：透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇32.2份，磺丁基-β-环糊精和羟丙基-β-环糊精的混合物(质量比2:1)491份，尿酸酶含量为3.4U/mL，过氧化氢酶含量为3U/mL，缓冲液的pH为8.4。
制备方法：(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法：将透明质酸(40KDa)，N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，搅拌23分钟得到液体A，将甲氧基聚乙二醇5000胺基(mPEG5000-NH2)溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，得到液体B，将液体B加至液体A中，氮气保护下反应16小时，纯水透析，将所得溶液冷冻干燥即得透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇；(2)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 8.4中，得到液体①，将环糊精磺丁基-β-环糊精和羟丙基-β-环糊精的混合物(质量比2:1)溶解于碳酸盐缓冲液pH 8.4中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌1.1小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：将4.5mL小鼠的新鲜血液离心2分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4洗涤沉淀4次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心16分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH7.4中，即得红细胞膜；(4)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，如取3.5克肝脏组织，加入内质网膜提取液A并研磨3分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置21分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置15分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置22分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(3)得到的红细胞膜和步骤(4)得到的内质网膜以质量比9:10在冰浴条件下超声11分钟使膜融合；(6)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(5)得到的融合膜，与步骤(2)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比2:3混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数13次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。
实施例3：
融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜包裹层。尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中各组分的重量份数比为：透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇40.8份，羟丙基-γ-环糊精和磺丁基-β-环糊精的混合物(质量比4:1)382份，尿酸酶含量为4.7U/mL，过氧化氢酶含量为3.4U/mL，缓冲液的pH为9.7。
制备方法：(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法：将透明质酸(40KDa)，N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，搅拌30分钟得到液体A，将甲氧基聚乙二醇3400胺基(mPEG3400-NH2)溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，得到液体B，将液体B加至液体A中，氮气保护下反应19小时，纯水透析，将所得溶液冷冻干燥即得透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇；(2)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 9.7中，得到液体①，将羟丙基-γ-环糊精和磺丁基-β-环糊精的混合物(质量比4:1)溶解于碳酸盐缓冲液pH 9.7中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌1.5小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：将5mL大鼠的新鲜血液离心5分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4洗涤沉淀3次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心19分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得红细胞膜；(4)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，如取3000万个肝细胞，加入内质网膜提取液A并研磨5分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置23分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置18分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置23分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(3)得到的红细胞膜和步骤(4)得到的内质网膜以质量比3:5在冰浴条件下超声14分钟使膜融合；(6)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(5)得到的融合膜，与步骤(2)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比9:10混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数17次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。
实施例4：
融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜包裹层。尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中各组分的重量份数比为：透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇49.9份，羟丙基-γ-环糊精、磺丁基-α-环糊精、羟丙基-γ-环糊精的混合物(质量比1:2:1)410份，尿酸酶含量为11.2U/mL，过氧化氢酶含量为4.8U/mL，缓冲液的pH为8.7。
制备方法：(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法：将透明质酸(30KDa)，N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，搅拌28分钟得到液体A，将甲氧基聚乙二醇10000胺基(mPEG10000-NH2)溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，得到液体B，将液体B加至液体A中，氮气保护下反应20小时，纯水透析，将所得溶液冷冻干燥即得透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇；(2)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 8.7中，得到液体①，将羟丙基-γ-环糊精、磺丁基-α-环糊精和羟丙基-γ-环糊精的混合物(质量比1:2:1)溶解于碳酸盐缓冲液pH 8.7中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌2.5小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：将9.5mL兔子的新鲜血液离心9分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4洗涤沉淀5次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心19分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得红细胞膜；(4)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，如取2.4克肝脏组织，加入内质网膜提取液A并研磨4分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置27分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置15分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置24分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(3)得到的红细胞膜和步骤(3)得到的内质网膜以质量比7:10在冰浴条件下超声15分钟使膜融合；(6)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(5)得到的融合膜，与步骤(2)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比8:5混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数20次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。
实施例5：
融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜包裹层。尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中各组分的重量份数比为：透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇43.8份，磺丁基-α-环糊精和磺丁基-γ-环糊精的混合物(质量比1:1)545份，尿酸酶含量为7.4U/mL，过氧化氢酶含量为5.2U/mL，缓冲液的pH为8.6。
制备方法：(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法：将透明质酸(45KDa)，N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，搅拌33分钟得到液体A，将甲氧基聚乙二醇8000胺基(mPEG8000-NH2)溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，得到液体B，将液体B加至液体A中，氮气保护下反应23小时，纯水透析，将所得溶液冷冻干燥即得透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇；(2)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 8.6中，得到液体①，将磺丁基-α-环糊精和磺丁基-γ-环糊精的混合物(质量比1:1)溶解于碳酸盐缓冲液pH 8.6中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌3小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：将6mL兔子的新鲜血液离心9分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4洗涤沉淀4次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心21分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH7.4中，即得红细胞膜；(4)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，如取3500万个肝细胞，加入内质网膜提取液A并研磨3分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置23分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置20分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置20分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(3)得到的红细胞膜和步骤(4)得到的内质网膜以质量比2:3在冰浴条件下超声20分钟使膜融合；(6)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(5)得到的融合膜，与步骤(2)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比4:5混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数20次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。
实施例6：
融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜包裹层。尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中各组分的重量份数比为：透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇38份，磺丁基-β-环糊精225份，尿酸酶含量为10U/mL，过氧化氢酶含量为4U/mL，缓冲液的pH为9。
制备方法：(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法：将透明质酸(12KDa)，N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，搅拌30分钟得到液体A，将甲氧基聚乙二醇2000胺基(mPEG2000-NH2)溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，得到液体B，将液体B加至液体A中，氮气保护下反应20小时，纯水透析，将所得溶液冷冻干燥即得透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇；(2)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 9中，得到液体①，将磺丁基-β-环糊精溶解于碳酸盐缓冲液pH 9中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌2小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：将8mL大鼠的新鲜血液离心5分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH7.4洗涤沉淀4次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心20分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得红细胞膜；(4)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，如取4克肝脏组织，加入内质网膜提取液A并研磨4分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置25分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置15分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置25分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(2)得到的红细胞膜和步骤(3)得到的内质网膜以质量比1:1在冰浴条件下超声15分钟使膜融合；(6)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(5)得到的融合膜，与步骤(2)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比1:1混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数20次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。
实施例7：
融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜包裹层。尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中各组分的重量份数比为：透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇29.1份，磺丁基-α-环糊精和磺丁基-β-环糊精的混合物(质量比3:5)355份，尿酸酶含量为13.9U/mL，过氧化氢酶含量为5.7U/mL，缓冲液的pH为9.2。
制备方法：(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇的合成方法：将透明质酸(30KDa)，N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，搅拌35分钟得到液体A，将甲氧基聚乙二醇8000胺基(mPEG8000-NH2)溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，得到液体B，将液体B加至液体A中，氮气保护下反应16小时，纯水透析，将所得溶液冷冻干燥即得透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇；(2)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 9.2中，得到液体①，将磺丁基-α-环糊精和磺丁基-β-环糊精的混合物(质量比3:5)溶解于碳酸盐缓冲液pH 9.2中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌3小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：将10.5mL牛的新鲜血液离心5分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4洗涤沉淀5次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心20分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得红细胞膜；(4)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，如取2.7克肝脏组织，加入内质网膜提取液A并研磨5分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置23分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置18分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置25分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(3)得到的红细胞膜和步骤(4)得到的内质网膜以质量比19:10在冰浴条件下超声15分钟使膜融合；(6)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(5)得到的融合膜，与步骤(2)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比17:10混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数18次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。
实施例8：
融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜包裹层。尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中各组分的重量份数比为：透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇46.9份，磺丁基-β-环糊精573份，尿酸酶含量为6.1U/mL，过氧化氢酶含量为4.4U/mL，缓冲液的pH为9.8。
制备方法：(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇：将透明质酸(40KDa)，N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，搅拌28分钟得到液体A，将甲氧基聚乙二醇2000胺基(mPEG2000-NH2)溶解于硼酸盐缓冲液pH8.5中，得到液体B，将液体B加至液体A中，氮气保护下反应18.5小时，纯水透析，将所得溶液冷冻干燥即得明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇；(2)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 9.8中，得到液体①，将磺丁基-β-环糊精溶解于碳酸盐缓冲液pH 9.8中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌2小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：将11mL羊的新鲜血液离心5分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4洗涤沉淀4次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心10分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得红细胞膜；(4)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，如取3.2克肝脏组织，加入内质网膜提取液A并研磨3分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置23分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置14分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置24分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(3)得到的红细胞膜和步骤(4)得到的内质网膜以质量比4:5在冰浴条件下超声13分钟使膜融合；(6)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(5)得到的融合膜，与步骤(2)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比3:5混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数15次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。
实施例9：
融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜包裹层。尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中各组分的重量份数比为：透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇23.1份，磺丁基-α-环糊精和磺丁基-β-环糊精的混合物(质量比1:2)464份，尿酸酶含量为16.7U/mL，过氧化氢酶含量为2.5U/mL，缓冲液的pH为8.2。
制备方法：(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇：将透明质酸(45KDa)，N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，搅拌35分钟得到液体A，将甲氧基聚乙二醇15000胺基(mPEG15000-NH2)溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，得到液体B，将液体B加至液体A中，氮气保护下反应20小时，纯水透析，将所得溶液冷冻干燥即得明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇；(2)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 8.2中，得到液体①，将磺丁基-α-环糊精和磺丁基-β-环糊精的混合物(质量比1:2)溶解于碳酸盐缓冲液pH 8.2中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌1.5小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：将6mL狗的新鲜血液离心5分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4洗涤沉淀4次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心18分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得红细胞膜；(4)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，如取2800万个肝细胞，加入内质网膜提取液A并研磨4分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置23分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置16分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置24分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(3)得到的红细胞膜和步骤(4)得到的内质网膜以质量比17:10在冰浴条件下超声13分钟使膜融合；(6)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(5)得到的融合膜，与步骤(2)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比19:10混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数20次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。
实施例10：
融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜包裹层。尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中各组分的重量份数比为：透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇26.1份，甲基-β-环糊精和羟丙基-β-环糊精的混合物(质量比1:1)327份，尿酸酶含量为15.3U/mL，过氧化氢酶含量为3.8U/mL，缓冲液的pH为9.9。
制备方法：(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇：将透明质酸(12KDa)，N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，搅拌38分钟得到液体A，将甲氧基聚乙二醇800胺基(mPEG800-NH2)溶解于硼酸盐缓冲液pH8.5中，得到液体B，将液体B加至液体A中，氮气保护下反应17小时，纯水透析，将所得溶液冷冻干燥即得明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇；(2)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 9.9中，得到液体①，将甲基-β-环糊精和羟丙基-β-环糊精的混合物(质量比1:1)溶解于碳酸盐缓冲液pH 9.9中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌2小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：将10mL兔子的新鲜血液离心5分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4洗涤沉淀5次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心19分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得红细胞膜；(4)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，如取1.9克肝脏组织，加入内质网膜提取液A并研磨4分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置20分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置18分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置24分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(3)得到的红细胞膜和步骤(4)得到的内质网膜以质量比9:5在冰浴条件下超声20分钟使膜融合；(6)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(5)得到的融合膜，与步骤(2)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比9:5混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数20次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。
实施例11：
融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜包裹层。尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中各组分的重量份数比为：透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇53份，羟丙基-γ-环糊精382份，尿酸酶含量为12.6U/mL，过氧化氢酶含量为5.5U/mL，缓冲液的pH为9.5。
制备方法：(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇：将透明质酸(45KDa)，N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，搅拌39分钟得到液体A，将甲氧基聚乙二醇13500胺基(mPEG13500-NH2)溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，得到液体B，将液体B加至液体A中，氮气保护下反应19小时，纯水透析，将所得溶液冷冻干燥即得明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇；(2)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 9.5中，得到液体①，将羟丙基-γ-环糊精溶解于碳酸盐缓冲液pH 9.5中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌3小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：将5mL小鼠的新鲜血液离心9分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4洗涤沉淀5次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心23分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得红细胞膜；(4)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，如取3.7克肝脏组织，加入内质网膜提取液A并研磨5分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置23分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置17分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置20分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(3)得到的红细胞膜和步骤(4)得到的内质网膜以质量比8:5在冰浴条件下超声13分钟使膜融合；(6)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(5)得到的融合膜，与步骤(2)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比7:10混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数19次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。
实施例12：
融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜包裹层。尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒配方中各组分的重量份数比为：透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇56份，磺丁基-γ-环糊精和羟丙基-α-环糊精的混合物(质量比2:3)600份，尿酸酶含量为18U/mL，过氧化氢酶含量为6U/mL，缓冲液的pH为10。
制备方法：(1)透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇：将透明质酸(30KDa)，N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，搅拌40分钟得到液体A，将甲氧基聚乙二醇20000胺基(mPEG20000-NH2)溶解于硼酸盐缓冲液pH 8.5中，得到液体B，将液体B加至液体A中，氮气保护下反应25小时，纯水透析，将所得溶液冷冻干燥即得明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇；(2)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶和透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 10中，得到液体①，将磺丁基-γ-环糊精和羟丙基-α-环糊精的混合物(质量比2:3)溶解于碳酸盐缓冲液pH 10中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌4小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(3)红细胞膜的制备方法：将12mL人的新鲜血液离心10分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4洗涤沉淀5次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心25分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得红细胞膜；(4)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，如取5克肝组织，加入内质网膜提取液A并研磨5分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置30分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置20分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置30分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(5)融合膜的制备方法：将步骤(3)得到的红细胞膜和步骤(4)得到的内质网膜以质量比2:1在冰浴条件下超声20分钟使膜融合；(6)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(5)得到的融合膜，与步骤(2)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比2:1混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数20次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。

Claims (1)

1.一种融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒，其特征在于，包括：尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒、红细胞膜和内质网膜的融合膜仿生包裹层；
所述的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒中尿酸酶含量为5-15U/mL，过氧化氢酶含量为2-6U/mL，缓冲液pH为8-10，其余各组分质量份数比为：
透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇 20-56份，
环糊精 150-300份；
所述的环糊精包括：羟丙基-α-环糊精、磺丁基-α-环糊精、磺丁基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、羟丁基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、磺丁基-γ-环糊精的一种或几种的混合物。
所述的一种融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备包括下列步骤：(1)尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒的制备方法：将处方量的尿酸酶、过氧化氢酶、透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇溶解于碳酸盐缓冲液pH 8-10中，得到液体①，将环糊精溶解于碳酸盐缓冲液pH 8-10中，得到液体②，将液体②加至液体①中，搅拌1-4小时，即得尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒；(2)红细胞膜的制备方法：将新鲜血液离心1-10分钟，收集沉淀，用10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4洗涤沉淀3-5次，加入2.5mM磷酸盐缓冲液pH 7.4使红细胞破裂，离心15-25分钟，收集沉淀，分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得红细胞膜；(3)内质网膜的制备方法：按细胞和组织内质网膜提取试剂盒说明书操作，取肝脏组织或肝细胞，加入内质网膜提取液A并研磨1-5分钟，离心，将沉淀重新分散于内质网膜提取液A中，离心，将上清液转移到微量离心管中，离心，收集上清液，向上清液中加入内质网膜提取液B，搅拌后于4℃放置20-30分钟，离心收集沉淀并加入内质网膜提取液A，再向管中加入内质网膜提取液C，混合均匀，放置10-20分钟，离心，向上清液中加入内质网膜提取液D，混合均匀，4℃放置20-30分钟，收集沉淀，将其分散于10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，即得内质网膜；(4)融合膜的制备方法：将步骤(2)得到的红细胞膜和步骤(3)得到的内质网膜以质量比1:2至2:1在冰浴条件下超声10-20分钟使膜融合；(5)融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒的制备：将步骤(4)得到的融合膜，与步骤(1)得到的尿酸酶和过氧化氢酶纳米粒以体积比1:2至2:1混合均匀，使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，来回挤出次数10-20次，即得融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒。
CN202211049267.0A 2022-08-30 2022-08-30 一种融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒及其制备方法 Pending CN115381931A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211049267.0A CN115381931A (zh) 2022-08-30 2022-08-30 一种融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211049267.0A CN115381931A (zh) 2022-08-30 2022-08-30 一种融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115381931A true CN115381931A (zh) 2022-11-25

Family

ID=84124087

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211049267.0A Pending CN115381931A (zh) 2022-08-30 2022-08-30 一种融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115381931A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. Drug delivery system in the treatment of diabetes mellitus
Kwon et al. L-Asparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL)
US6242230B1 (en) Process for microencapsulating cells
CN109364263A (zh) 一种功能化的血小板仿生智能载体及其抗缺血性脑卒中应用
CN103781489A (zh) 用于基于血红蛋白的氧载体的口服递送
CN111388450B (zh) Co气体协同化学动力疗法抗肿瘤纳米递送载体、制备方法及抗肿瘤药物中的应用
Chen et al. ROS-scavenging biomaterials for periodontitis
CN114306581B (zh) 一种融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒及其制备方法
Çelik et al. Preparation of superoxide dismutase loaded chitosan microspheres: characterization and release studies
CN114767655A (zh) 一种两性离子功能化的生物可降解口服纳米载药系统及应用
Ma et al. Crosslinked zwitterionic microcapsules to overcome gastrointestinal barriers for oral insulin delivery
Zhao et al. Cargo‐Templated Crosslinked Polymer Nanocapsules and Their Biomedical Applications
Yang et al. Engineering Cell Membrane‐Cloaked Catalysts as Multifaceted Artificial Peroxisomes for Biomedical Applications
Chae et al. Effect of cross-linked hemoglobin on functionality and viability of microencapsulated pancreatic islets
CN115444834B (zh) 一种融合细胞膜包裹尿酸酶和超顺磁性氧化铁纳米酶脂质纳米粒及其制备方法
Chang Artificial cell biotechnology for medical applications
CN109078184A (zh) 负载双药纳米颗粒及其制备方法与应用
CN115381931A (zh) 一种融合膜包裹尿酸酶和过氧化氢酶的仿生纳米粒及其制备方法
CN112741903A (zh) 一种dna/纳米复合物及其制备方法与应用
CN109662956B (zh) 一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒的应用
US8263752B2 (en) Methods for separating soluble selenoglycoproteins
CN113769112B (zh) 一种基于GOQDs的pH响应型仿生纳米制剂及其制备方法、应用
CN115429774B (zh) 一种仿生膜包裹尿酸酶纳米粒及其制备方法
CN114533883A (zh) 一种靶向肝部位的大分子一氧化氮供体纳米药物的制备方法及应用
CN115531346B (zh) 一种仿生融合膜包裹尿酸酶、铂纳米粒和白藜芦醇脂质纳米粒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination