CN109364263A - 一种功能化的血小板仿生智能载体及其抗缺血性脑卒中应用 - Google Patents

一种功能化的血小板仿生智能载体及其抗缺血性脑卒中应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种功能化的血小板仿生智能载体及其抗缺血性脑卒中应用。该仿生载体由血小板膜包覆的载神经保护剂ZL006e的聚合物纳米粒、Tat穿膜肽及可被thrombin剪切的底物肽段与溶栓蛋白偶联物构成。该载体系统具有良好的生物相容性、可有效延长在体内的循环时间等特点，又能靶向至缺血性脑卒中病灶部位的微血栓，并释放出溶栓药物，同时暴露的Tat穿膜肽介导神经保护剂增加血脑屏障通透性，以pH为智能释药开关，响应病灶部位pH介导的降解作用，使药物在脑缺血病灶部位速释，最大程度提高疗效，降低毒副作用。

Description

一种功能化的血小板仿生智能载体及其抗缺血性脑卒中应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种功能化的血小板仿生智能载体的构建及其抗缺血性脑卒中应用。
背景技术
随着人口老龄化和生态环境恶化的加剧，脑部疾病的发病率正呈逐年上升的趋势，成为危害人类生命和健康的重大疾病。其中，脑卒中是一种高发病、高致死、高致残、高复发的脑血管血液循环障碍性疾病，已经成为人类仅次于心血管疾病和恶性肿瘤的第三大杀手，在我国，已跃升为第二大死因。美国心脏协会2016年统计数据显示，美国平均每40秒就有1人罹患脑卒中，每4分钟有1人死于脑卒中。WHO统计，预计到2020年，全球每年死于脑卒中的人数将上升至700万。我国每年发生脑卒中病人达200万，每年因脑卒中死亡病人约130万，现幸存中风病人700万，其中450万病人不同程度丧失劳动力和生活不能自理。脑卒中给人类健康和生命造成极大威胁，给家庭及社会带来沉重的负担。临床上约87％的脑卒中属于缺血性脑卒中，所以，对缺血性脑卒中的药物研究具有重大的社会意义和临床价值。
缺血性脑卒中是各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，引起脑组织缺血缺氧性病变坏死。临床上80％的缺血性脑卒中是由于脑动脉血栓形成，使管腔狭窄甚至闭塞，导致局灶性急性脑供血不足而发病。由于脑组织结构精细复杂，对缺血缺氧损伤特别敏感且脆弱。当失去血供30min，缺血区域的脑组织即处于危险之中。如3小时后仍未恢复血供，濒临死亡但仍然可以被挽救的“缺血半暗带”将会迅速缩小，无任何侧枝循环代偿的脑组织出现代谢障碍，水肿，进而死亡，8小时后仅有缺血区边缘的脑组织存活。24小时缺血区脑组织则完全死亡。因此，尽早恢复栓塞部位的血供是治疗缺血性脑卒中的黄金法则。临床实践证明，早期溶栓治疗是最行之有效的治疗方法。然而，目前临床上的溶栓手段十分有限，持续大剂量静脉滴注组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是唯一被FDA批准的治疗方法，即便如此，tPA的使用也仅限于症状出现的3个小时之内，同时还存在并发出血的危险，尤其是对超过这个治疗时间窗的患者，出血风险将会显著增加，因而严重限制了tPA的应用。在临床上，能受益于tPA治疗的脑血栓患者不足5％。究其原因，主要是因为tPA存在以下几个方面的缺陷：1)tPA体内循环时间短，半衰期仅2-5min，所以，临床上需要持续静脉滴注大剂量的tPA方能维持有效血药浓度，这就增加了并发出血的风险；2)尽管较其他的纤溶药物相比，tPA与血栓的纤维蛋白有特异性结合力，但是，药物在血栓狭窄处受到巨大的剪切力作用，使得游离型tPA与血栓的结合力及靶向性大幅度下降，从而降低了tPA的溶栓效果；3)临床上冒然使用tPA溶栓实现血管再通，“缺血半暗带区”还会面临缺血再灌注损伤的风险，从而大大缩短了tPA的时间窗。因此，延长tPA的体内生物半衰期和提高其与血栓的亲和力是提高tPA治疗脑卒中效果及安全性的主要手段。联合应用神经保护剂对可挽救的“缺血半暗带”受损脑组织进行修复，是缺血性脑卒中治疗中不可缺少的环节，可以有效缓解脑组织缺血再灌注损伤和延长tPA的溶栓时间窗。
研究表明，脑组织在缺血条件下，兴奋性氨基酸(如谷氨酸)过度释放，引起N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDAR)过度激活，导致通过NMDAR-PSD-95-nNOS途径病理性一氧化氮(NO)释放增多而损伤神经元。提示缺血性脑卒中的产生可能与细胞浆内nNOS和细胞膜上新PSD95结合增多有关。针对这一损伤通路，现有技术文件【Nat Med.2010,16(12):1439-1443】公开了一种小分子nNOS-PSD-95解偶联剂(ZL006e)作为治疗缺血性脑卒中的新型神经保护剂。实验显示，ZL006e能够有效抑制nNOS从细胞浆到细胞膜的转位，抑制NO的病理性释放、对神经细胞损伤显示出明显的神经保护作用，改善中脑动脉闭塞(MCAO)再灌注动物神经缺陷症状、缩小梗死容积。同时，ZL006e避免了直接干预NMDAR、nNOS可能引起的学习记忆障碍、行为异常等副作用，具有更高的安全性。然而，ZL006e作为一种极具潜力的神经保护剂，只能修复缺血损伤的脑组织，而对脑动脉血供的恢复却毫无能力。此外，堵塞的血管也成为ZL006e向脑组织递送的一大屏障。所以，将溶栓剂tPA与ZL006e神经保护剂联合用药：tPA能够溶解血栓，疏通血管，恢复栓塞部位的血供，促进ZL006e神经保护剂向脑组织递送；ZL006e又能高效保护和修复神经元，减少tPA溶栓剂的神经毒性和颅内出血风险，延长溶栓的治疗时间窗。二者相互益彰，发挥溶栓与神经保护的协同治疗作用，提高缺血性脑卒中的治疗效果。
为了实现tPA与ZL006e的联合用药，选择适宜共递送载体至关重要。共递送载体研究是药物递送领域的研究热点，目前共递送的载体包括聚合物纳米粒、脂质体及胶束等，这些载体可实现多种药物共载并递送至同一组织或同一细胞，能显著增强多种药物联用的治疗效果。然而，由于tPA的靶点为血管中的血栓，而ZL006e的靶点为脑组织的神经元，二者靶部位不同导致现有共递释载体无法递送这两种药物至各自靶点发挥药效。因此，构建一种具有程序化释药功能的智能共递送载体，首先靶向血管中的血栓，到达血栓部位后，释放出tPA，溶解血栓，恢复血供，然后载体再携带ZL006e透过血脑屏障(BBB)进入缺血脑组织，释放出ZL006e保护和修复神经元，是噬待解决的关键问题。为了解决这一问题，该新型共递释智能载体需具备如下要求：(1)在血液循环系统中稳定性好，能够有效延长tPA的生物半衰期；(2)对血栓具有良好的亲和力和靶向性，能够将tPA定点输送到血栓部位；(3)到达血栓后能够智能性释放出tPA，发挥其溶栓效果；(4)剩下携载ZL006e的载体能够穿过BBB，到达脑组织；(5)在缺血脑组织快速释放ZL006e，发挥神经保护作用。
对血栓微环境和缺血脑组织微环境程序化响应的仿生型共递送载体，是实现智能化共递送tPA与ZL006e的有效途径。研究表明，血栓形成过程中，大量凝血酶原被激活，从而导致凝血酶(Thrombin)在血栓部位堆积。所以，可以利用Thrombin对特定底物的酶切作用，触发溶栓剂在血栓部位的智能释放。当大脑动脉血栓形成，阻断脑组织血液和氧气供应后，脑组织短时间内启动“缺血瀑布”现象。其中，能量代谢发生障碍，60s内ATP耗竭，脑组织无氧糖酵解增加，产生大量的乳酸与质子。因此，缺血部位的脑组织微环境在短时间内下降到pH<6。正是因为缺血脑组织和正常脑组织的pH不同，脑卒中也经常被用作pH响应性载体的体内评价动物模型。
将ZL006e包封于由具有pH响应特性的以2-乙氧基丙烯修饰的葡聚糖(m-Dextran)为载体材料制备的聚合物纳米载体(NP)，由于该聚合物纳米载体极易响应于pH介导的降解作用，可使其在脑缺血病灶部位速释药物同时减少在非病灶区释放，从而更加有效的速释药物。然而，作为外来物质，高分子纳米材料进入人体循环系统时，难免诱发机体排异反应。纳米粒表面修饰神经节苷酯，聚乙二醇等虽能一定程度上减缓机体网状内皮系统的清除，仍然难以解决该问题。近年来，来源于自体的血小板膜(platelet membrane)仿生载体系统备受瞩目。血小板是血液中固有成分，其血小板膜具有不可比拟的生物相容性、可降解性，避免网状内皮系统的吞噬作用，而且具有长循环寿命。因此采用血小板膜包裹聚合物纳米载体的联合体系(PM-NP)，构建血小板膜仿生的脑卒中智能递药系统。此体系由作为内核的pH敏感纳米粒和外层的红细胞膜构成，这种联合体系能同时发挥两种载体的各自优势。
许多神经保护剂在体外显示出很好的神经修复作用，但是往往体内或者临床试验结果却令人失望，主要原因是血脑屏障(BBB)的存在。所以，提高神经保护剂的BBB渗透是急需要解决的重要问题。近年来发现，通过转铁蛋白受体介导、低密度脂蛋白受体介导、葡萄糖转运体介导、白介素13α2受体介导、穿膜肽介导等手段可以显著提高药物的BBB靶向能力。Tat肽是一个被广泛用于增强递药系统脑靶向的高效穿膜肽，但是由于其富含精氨酸和赖氨酸，带有很强正电荷，所以在体内的摄取与分布没有特异性。为了降低Tat电荷，减少非特异性摄取，本发明采用Tat作为BBB靶向功能分子，将Tat肽串联在tPA和血小板膜包被的纳米粒之间。到达脑血栓之前，由于tPA与血小板膜的负电荷与空间位阻，Tat被很好的屏蔽其中，降低了在血液循环中的非特异性摄取和穿膜。到脑达血栓后，tPA与Tat连接分子(LTPRGWRLGGC)被Thrombin剪切，tPA从系统中离去，失去屏蔽保护的Tat“原位暴露”，此时正好处于缺血脑组织的脑血管中，Tat发挥其高效穿膜功能，携带载有ZL006e的载体穿过BBB，进入缺血脑组织，完成其脑靶向的功能，继而在损伤脑组织酸性微环境下，系统pH响应性解聚，迅速释放ZL006e，修复受损神经元。达到血管疏通与神经修复并策，协同提高缺血性脑卒中的治疗效果。
发明内容
本发明的目的是，利用缺血性脑卒中病灶部位形成的血栓及酸性pH等特殊微环境条件，以及血小板膜优越的生物相容性及免疫逃逸能力，设计构建一种治疗缺血性脑卒中的功能化的血小板仿生智能载体。该仿生载体具有良好的生物相容性、显著延长在体内的循环时间等优点，又能靶向至缺血性脑卒中病灶部位的微血栓处，并释放出溶栓蛋白，同时暴露的Tat穿膜肽增加载神经保护剂纳米粒的血脑屏障通透性，在缺血半暗带，以pH为智能释药开关，响应病灶部位pH介导的降解作用，使药物在脑缺血病缺血半暗带部位速释神经保护剂，达到血管疏通与神经修复并策，协同提高缺血性脑卒中的治疗效果。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种功能化的血小板仿生智能载体是由血小板膜包覆的载ZL006e的聚合物纳米粒、Tat穿膜肽及可被thrombin剪切的多肽与溶栓蛋白药物偶联物构成，所述的载ZL006e的聚合物纳米粒和外层的血小板膜通过静电吸附作用实现包裹融合。
上述由血小板膜包覆的载ZL006e的聚合物纳米粒内核是由以2-乙氧基丙烯缩合葡聚糖(m-Dextran)为载体材料包载神经保护剂ZL006e；该纳米智能载体具有规整的球形外观，平均粒径在167nm左右。2-乙氧基丙烯缩合葡聚糖可以市售获得，也可以按照文献如J.AM.CHEM.SOC.2008,130,10494–10495公开的方法制备得到。
上述葡聚糖重均分子量为9000～11000。
所述血小板膜为人或啮齿类动物全血，经低渗提取法[1]破膜释放内含物，得到空白血小板膜，再超声处理得到的均匀的纳米级血小板膜囊泡。
所述连接的溶栓蛋白包括链激酶(SK)、尿激酶(uPA)、阿替普酶(rtPA)中一种或多种混合物。
所述的Tat穿膜肽及可被thrombin剪切的多肽与溶栓蛋白偶联物中Tat穿膜肽与溶栓蛋白是通过与thrombin底物肽段连接，上述thrombin底物肽段的氨基酸序列为LTPRGWRLGGC。
所述包载在纳米粒表面的血小板膜与多肽-蛋白偶联物是通过N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-叠氮化合物(NHS-PEG-N3)为linker连接起来的，所述NHS-PEG-N3的PEG分子量为500-5000Da。
载ZL006e的聚合物纳米粒制备方法包括以下步骤：以2-乙氧基丙烯缩合葡聚糖(m-Dextran)为载体材料，将神经保护剂ZL006e和m-Dextran溶于二氯甲烷，涡旋至完全溶解，加入3％1X PBS(pH7.4)配制的PVA溶液。超声波细胞粉碎仪冰浴超声。将超声后的白色乳液缓慢导入，高速搅拌中的0.3％1X PBS(pH7.4)配制的PVA溶液中。持续搅拌约1-2h后，二氯甲烷挥发完全，溶液澄清透明，呈蓝色纳米粒乳光。高速离心，弃上清，加水复溶，重复2-3次以洗去乳化剂，最终分散于去离子水中，得到包封ZL006e聚合物纳米载体溶液。
血小板膜包覆的载ZL006e的聚合物纳米粒制备过程包括以下步骤：在载ZL006e的聚合物纳米粒溶液中加入血小板膜，缓慢搅拌8～10h，得到包覆血小板膜的包膜聚合物纳米载体；然后加入NHS-PEG-N3，快速搅拌2～3h。高速离心，弃上清，加水复溶，重复2-3次以洗去多余的血小板膜和NHS-PEG-N3，最终分散于去离子水中，得到由血小板膜包覆的载ZL006的聚合物纳米粒。
溶栓蛋白药物和Tat穿膜肽及thrombin底物多肽-蛋白偶联物的合成包括以下步骤：取溶栓蛋白药物溶解于去离子水中，加入Sulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)，溶栓蛋白:SMCC的摩尔比为1:15～20，搅拌反应(2-3h，800rpm)，加入过量Thrombin响应剪切断裂的Pro-Tat-LTPRGWRLGGC多肽(购自于GLBiochem Ltd Shanghai,China，溶栓蛋白：肽段的摩尔比为1：20～30)，4℃，继续搅拌反应(2-3h，800rpm)，反应液经MidiTrapTMG-25脱盐柱洗脱除去未反应的SMCC及多肽，分散于HEPES缓冲液(Ph7.2-7.4)中(每1mg溶栓蛋白药物分散于2ml HEPES缓冲液)，得到Tat穿膜肽及可被thrombin剪切的多肽与溶栓蛋白偶联物(Pro-Tat-LTPRGWRLGGC-蛋白)。
血小板膜包覆的ZL006e的聚合物纳米粒与Tat穿膜肽及可被thrombin剪切的多肽与溶栓蛋白偶联物的连接包括以下步骤：取硫酸铜和抗坏血酸钠，分别用去离子水溶解作为催化剂，加入到NHS-PEG-N3化血小板膜包覆的包封ZL006e的聚合物纳米载体溶液中，再加入上述Pro-Tat-LTPRGWRLGGC-蛋白偶联物溶液，避光，氮气保护，4℃保护下搅拌进行click反应6-8h。反应液经高速离心(4℃，12000rpm，40min)去除未反应的Pro-Tat-LTPRGWRLGGC-蛋白偶联物，水洗2-3次后，即得治疗缺血性脑卒中Thrombin/pH程序化响应释药的血小板膜仿生共递送智能载体。
本发明的有益效果：本发明构建的功能化的血小板仿生智能载体，因外层包裹的血小板膜，具有良好的生物相容性、可降解性，避免网状内皮系统的吞噬作用，而且具有长循环特性。同时内层的聚合物纳米载体对神经保护剂ZL006e具有很好的包封作用，又能靶向至缺血性脑卒中病灶部位的微血栓处，并释放出溶栓药物tPA，同时暴露的Tat穿膜肽增加载神经保护剂纳米粒的血脑屏障通透性，在缺血半暗带，以pH为智能释药开关，响应病灶部位pH介导的降解作用，使药物在脑缺血病缺血半暗带部位速释神经保护剂，达到血管疏通与神经修复并策，协同提高缺血性脑卒中的治疗效果。
附图说明
图1血小板膜仿生智能药物载体的透射电镜图(左图为普通纳米粒，右图为血小板膜包裹后的纳米粒标尺：200nm)
图2血小板膜仿生智能药物载体体外释放图，左图为rtPA释放曲线，右图为ZL006e释放曲线
图3ZL006e体内药时曲线
图4血小板膜仿生智能药物载体体外动脉血栓结合图
图5为本发明血小板膜仿生智能药物载体治疗缺血性脑卒中脑切片染色图
图6为本发明血小板膜仿生智能药物载体的治疗缺血性脑卒中梗死面积定量图
图7为本发明血小板膜仿生智能药物载体的治疗缺血性脑卒中行为学评分图
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的阐述，具体实施例是在本发明的优选条件下进行。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
实施例1
载ZL006e的聚合物纳米粒的制备：
取神经保护剂ZL006e 2mg和m-Dextran 20mg于15ml离心管内，加入2ml二氯甲烷，涡旋至完全溶解，加入3％1X PBS(pH7.4)配制的PVA溶液4ml。超声波细胞粉碎仪冰浴超声(35％功率，超声2s/停2s，5min)。将超声后的白色乳液缓慢导入，高速搅拌(800rpm)中的0.3％1X PBS(pH7.4)配制的PVA溶液15ml中。持续搅拌约1-2h后，二氯甲烷挥发完全，溶液澄清透明，呈蓝色纳米粒乳光。高速离心(12000rpm，40min)，弃上清，加水复溶，重复2-3次以洗去乳化剂，最终分散于1ml去离子水中，得到载ZL006e的聚合物纳米粒溶液。
实施例2
血小板膜包覆的载ZL006e的聚合物纳米粒制备
取新鲜血液500g离心，取上层血浆于2000g离心，再弃上层物，得到下层红细胞，然后加入去离子水与红细胞混合，室温静置1-2h；再21000g离心洗涤，弃上清(重复3～5次)，保存于1X PBS(pH7.4)中，超声波细胞粉碎仪超声粉碎，得到血小板膜储备液。
在实施例1中制备的载ZL006e聚合物纳米粒溶液中加入所述血小板膜储备液(每20mg载ZL006e聚合物纳米粒溶液加入4ml血小板膜储备液)，缓慢搅拌8～10h，得到包覆血小板膜的包膜聚合物纳米载体。然后加入NHS-PEG3500-N3(每20mg载ZL006e聚合物纳米粒溶液加入10mg NHS-PEG3500-N3)，快速搅拌2～3h。高速离心，弃上清，加去离子水复溶，重复2-3次以洗去多余的血小板膜和NHS-PEG3500-N3，最终分散于去离子水中(每20mg载ZL006e聚合物纳米粒溶液加入2ml去离子水)，得到PEG化血小板膜包覆的包封ZL006e的聚合物纳米载体，即血小板膜包覆的载ZL006e的聚合物纳米粒。
实施例3
连接有溶栓药物rtPA和Tat穿膜肽及thrombin底物肽段的多肽-蛋白偶联物的制备：
取1mg tPA蛋白溶解于去离子水中，加入Sulfo-SMCC，tPA:SMCC的摩尔比为1：15～20，800rpm搅拌反应2-3h，加入过量可被Thrombin响应剪切断裂的Pro-Tat-LTPRGWRLGGC多肽(tPA:肽段的摩尔比为1：20～30)，4℃条件下，800rpm继续搅拌反应2-3h，反应液经MidiTrapTMG-25脱盐柱洗脱除去未反应的SMCC及多肽，分散于20mmol HEPES缓冲液(Ph7.2-7.4)中，得到连接有溶栓药物tPA和Tat穿膜肽及可被thrombin剪切的多肽-蛋白偶联物(Pro-Tat-LTPRGWRLGGC-tPA)。
实施例4
功能化的血小板仿生智能载体的制备：
取0.6uM硫酸铜和6uM抗坏血酸钠，分别用去离子水溶解作为催化剂，加入到实施例2制备的PEG化血小板膜包覆的包封ZL006e的聚合物纳米载体中，再加入实施例3制备的Pro-Tat-LTPRGWRLGGC-tPA多肽-蛋白偶联物(每20mg载ZL006e聚合物纳米粒溶液相应加入1mg Pro-Tat-LTPRGWRLGGC-tPA多肽-蛋白偶联物)，避光，氮气保护，4℃保护下搅拌进行click反应6-8h。反应液在4℃条件下经12000rpm高速离心40min去除未反应的Pro-Tat-LTPRGWRLGGC-tPA多肽-蛋白偶联物，水洗2-3次后，经0.45μm微孔滤膜过滤，即得功能化的血小板仿生智能载体。用透射电镜表征其形态见图2左。图中可观察该仿生载体具有规整的球形外观，大小均匀，粒径在190nm左右。细微观察可见其内核165nm左右，表面覆盖的一层约15nm厚度的脂质层。结果见图1
实施例5
血小板膜仿生智能药物载体的体外释放
精密移取按照实施例制备的血小板膜仿生智能药物载体溶液2mL(含ZL006e2.5mg)于已处理好的透析袋中，两端用绳子系紧后放入装有50mL释放介质(加入0.5％吐温80醋酸盐缓冲液，pH为5.6以及pH为7.4)的锥形瓶中，摇床37℃条件下恒温振荡，转速为160rpm，分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24h取介质0.5mL，同时补加相同温度相同体积的新鲜释放介质。取出的介质经0.22μm的微孔滤膜过滤后，采用HPLC测定。
计算累积释放量(Qn)：
计算累积释放百分率(F％)：
F％＝Qn/C0×100％
式中Qn为各时间点的累积释放量；F％为各时间点的累积释放百分率；Cn为第n个取样时间点的实测药物浓度；V0为溶出介质总体积；Vi为每次取样体积；Ci为第i个取样时间点实测药物浓度；C0为总药物浓度。
以时间t(h)为横坐标，释放百分率F(％)为纵坐标，作出ZL006e聚合物纳米粒在两种pH介质中的释放曲线。见图2。
体系中tPA的Thrombin响应释放，通过罗丹明荧光标记tPA，在0，0.1,0.5,1U/ml的Thrombin溶液中进行，采用高速离心法进行测定，结果见图2
实施例6
血小板膜仿生智能药物载体的大鼠体内药动学
取健康雄性SD大鼠12只，随机分为2组，分别尾静脉注射给药剂量为4mg/kg的游离ZL006e，tP-NP-tPA/ZL006e,于给药后2，5，10，15，30min和1，2，6，12，24h分别眼眶采血0.5mL，6000rpm离心10min血浆分离后，保存在肝素化离心管中，-20℃冻存。采用蛋白沉淀法进行血浆样品的处理。血浆样品200μL与1500μL冰冻甲醇溶液12000rpm离心30min沉淀蛋白。离心后，吸取1500μL上清液真空干燥，200ul甲醇复溶，用高效液相色谱进行含量测量。由图4可知，给药后各处方直接进入血液循环不存在吸收过程，血药浓度持续降低，而tP-NP-tPA/ZL006e组的血药浓度下降趋势与ZL006e组相比，可见明显减缓。由上述结果可知，本发明制备的血小板膜仿生智能药物载体可有效避免网状内皮系统的吞噬作用，延长了药物在体内的滞留时间，具有明显的长循环作用，见图3。
试验例1
血小板膜仿生智能药物载体体外动脉血栓结合评价
罗丹明标记的血小板膜仿生智能药物载体制备方式同实施例。大鼠全麻后，手术分离并暴露出左颈动脉，将吸有50μl 10％三氯化铁溶液的滤纸覆盖在左颈动脉30min，生理盐水清洗手术创面。1小时后，处死大鼠，分离剥取形成血栓的动脉，放入经罗丹明标记tPA的tP-NP-tPA/ZL006e溶液中孵育5min后，PBS清洗6次，冰冻切片，荧光显微镜观察并拍照，定性结果见图4。
试验例2
血小板膜仿生智能药物载体的体内药效学研究
健康雄性SD大鼠，随机分为5组：假手术组(Sham)、模型组(Model)、游离ZL006e+tPA组、脑卒中智能递药系统thrombin响应组(tP-NP-tPA/ZL006e)，thrombin不响应对照组(nP-NP-tPA/ZL006e)。每组分别于脑损伤后，尾静脉注射相应处方。在脑缺血再灌注24h后，根据Zea-Longa建立的神经功能缺损程度的五级四分法标准系统地评分。缺血再灌注24h后，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，立刻断头取脑，横断面由前向后，取视交叉前4mm及其后大脑做连续冠状切片(层厚2mm)，共取5片。将切片置于2％(质量浓度)TTC染色液中，干燥箱内37℃避光孵育3h，肉眼观察正常脑组织呈玫红色，梗死区脑组织呈白色，见图5。计算梗死灶面积百分比：梗死区面积Sn/梗死区所在半脑面积S’n×100％。Sn表示每单个闹切片上梗死面积之和，S’n表示每单个梗死区所在的半脑面积之和(n＝1～5)。见图6，TTC染色结果脑中玫红色部位为正常脑组织，白色部位为梗死区域。图中可知，假手术组未见梗死区域，模型组有较大程度的损伤，而tP-NP-tPA/ZL006e组的梗死面积可见明显减小，说明tP-NP-tPA/ZL006e对脑损伤的保护作用明显。由大脑梗死灶面积对比图可见，tP-NP-tPA/ZL006e组较MCAO组可以明显减少缺血梗死面积，统计学差异显著(P<0.001)。由神经功能评分结果，见图7，可以看出tP-NP-tPA/ZL006e组的大鼠较MCAO组有较轻的神经功能损伤，统计学差异显著(P<0.01)。以上结果均表明本发明的血小板膜智能药物载体tP-NP-tPA/ZL006e可以安全有效地将ZL006e递送到大脑卒中部位，使其发挥治疗作用。
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Claims (10)

1.一种功能化的血小板仿生智能载体，其特征在于：该仿生载体由血小板膜包覆的载ZL006e的聚合物纳米粒、Tat穿膜肽及可被thrombin剪切的多肽与溶栓蛋白偶联物构成，所述的载ZL006e的聚合物纳米粒和外层的血小板膜通过静电吸附作用实现包裹融合。
2.根据权利要求1所述的功能化的血小板仿生智能载体，其特征在于：所述的由血小板膜包覆的载ZL006e的聚合物纳米粒是以2-乙氧基丙烯缩合葡聚糖为载体材料包载神经保护剂ZL006e。
3.根据权利要求1所述的功能化的血小板仿生智能载体，其特征在于：所述血小板膜为人或啮齿类动物全血，经低渗提取法破膜释放内含物，得到空白血小板膜，再超声处理得到的均匀的纳米级血小板膜囊泡；所述的溶栓蛋白为链激酶、尿激酶、阿替普酶中一种或多种混合物。
4.根据权利要求1所述的功能化的血小板仿生智能载体，其特征在于：所述的Tat穿膜肽及可被thrombin剪切的多肽与溶栓蛋白偶联物中Tat穿膜肽与溶栓蛋白是通过与thrombin底物肽段连接；所述thrombin底物肽段的氨基酸序列为LTPRGWRLGGC。
5.根据权利要求4所述的功能化的血小板仿生智能载体，其特征在于：所述Tat穿膜肽及可被thrombin剪切的多肽与溶栓蛋白偶联物的合成具体包括以下步骤：取溶栓蛋白药物溶解于去离子水中，加入Sulfo-SMCC，其中，蛋白:SMCC的摩尔比为1:15～20，在800rpm条件下搅拌反应2-3h，加入过量Thrombin响应剪切断裂的Pro-Tat-LTPRGWRLGGC多肽，其中，溶栓蛋白：肽段的摩尔比为1：20～30，在4℃条件下，继续在800rpm条件下搅拌反应2-3h，反应液经MidiTrapTMG-25脱盐柱洗脱除去未反应的SMCC及多肽，分散于20mmol HEPES pH7.2-7.4的缓冲液中，得到连接有溶栓蛋白药物和Tat穿膜肽及thrombin底物的多肽-蛋白偶联物。
6.根据权利要求1所述的功能化的血小板仿生智能载体，其特征在于：所述载ZL006e的聚合物纳米粒的制备方法包括以下步骤：将神经保护剂ZL006e和m-Dextran溶于二氯甲烷，涡旋至完全溶解，加入3％1X PBS(pH7.4)配制的PVA溶液。超声波细胞粉碎仪冰浴超声。将超声后的白色乳液缓慢导入，高速搅拌中的0.3％1X PBS(pH7.4)配制的PVA溶液中；持续搅拌约1-2h后，二氯甲烷挥发完全，溶液澄清透明，呈蓝色纳米粒乳光；高速离心，弃上清，加水复溶，重复2-3次以洗去乳化剂，最终分散于去离子水中，得到载ZL006e的聚合物纳米粒。
7.根据权利要求1所述功能化的血小板仿生智能载体，其特征在于：所述由血小板膜包覆的载ZL006e的聚合物纳米粒制备过程包括以下步骤：在载ZL006e的聚合物纳米粒溶液中加入血小板膜，缓慢搅拌8～10h，得到包覆血小板膜的包膜聚合物纳米载体；然后加入NHS-PEG-N3，快速搅拌2～3h。高速离心，弃上清，加水复溶，重复2-3次以洗去多余的血小板膜和NHS-PEG-N3，最终分散于去离子水中，得到由血小板膜包覆的载ZL006的聚合物纳米粒。
8.根据权利要求1所述功能化的血小板仿生智能载体，其特征在于：所述的由血小板膜包覆的载ZL006e的聚合物纳米粒中包覆在纳米粒外层的血小板膜与Tat穿膜肽及可被thrombin剪切的多肽与溶栓蛋白偶联物是通过NHS-PEG-N3为linker连接起来的，所述NHS-PEG-N3的PEG分子量为500-5000Da。
9.根据权利要求8所述的功能化的血小板仿生智能载体，其特征在于：所述由血小板膜包覆的ZL006e的聚合物纳米粒与Tat穿膜肽及可被thrombin剪切的多肽与溶栓蛋白偶联物的连接包括以下步骤：取硫酸铜和抗坏血酸钠，分别用去离子水溶解作为催化剂，加入到NHS-PEG-N3化血小板膜包覆的包封ZL006e的聚合物纳米载体溶液中，再加入Pro-Tat-LTPRGWRLGGC-蛋白偶联物溶液，避光，氮气保护，4℃保护下搅拌进行click反应6-8h；反应液在4℃条件下，经12000rpm高速离心40min，去除未反应的Pro-Tat-LTPRGWRLGGC-蛋白偶联物，水洗2-3次后，即得功能化的血小板仿生智能载体。
10.一种权利要求1所述的功能化的血小板仿生智能载体在抗缺血性脑卒中的应用。
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