CN114028547A - 一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：将具有损伤血管靶向能力的血小板膜，包裹pH响应的溶栓纳米颗粒，来构建智能纳米药物递送系统。该系的纳米药物表面的血小板膜可以靶向心肌梗死的损伤区域，继而对心肌梗死区域酸性微环境敏感的内部纳米颗粒发生崩解并释放出溶栓药物。此智能纳米药物进入循环后通过血小板膜的主动靶向作用和局部PH响应的药物释放，提高了药物的生物利用率，延长了药物的循环时间，并减少了药物的使用剂量，从而降低rt‑PA可能带来的全身出血风险。
Description
技术领域
本发明提供一种智能纳米药物，具体的，涉及一种靶向心肌梗死局部并响应局部微环境释放溶栓药物及制备方法。
背景技术
急性心肌梗死发生率高，是目前全球导致死亡的主要原因之一。尽管经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)显著降低了急性心肌梗死的死亡率，但是由于PCI依赖于手术者的技术、设备未能全面普及以及治疗窗口短等问题，仍有很大一部分急性心肌梗死患者未能获得有效的治疗。溶栓治疗是最普及的血流重建方法，急性胸痛发病不超过12小时，无溶栓禁忌症的患者均可进行溶栓治疗，是没有PCI条件时的首选治疗方式。目前，阿替普酶(rt-PA)是目前FDA唯一批准的可用于急性缺血性卒中的药物，也是急性心肌梗死最主流的溶栓药物。但是，传统的阿替普酶仍然存在许多不足，包括①治疗时间窗窄②药物清除速度快，半衰期短以及在体内容易受到纤溶酶原激活物抑制剂等导致灭活③短时间内大剂量用药可能导致全身的出血风险。因此，设计改进新的溶栓药物，解决目前阿替普酶的不足，从而改善急性心肌梗死患者的治疗与预后是重症心血管领域的热点与难点问题。
目前，利用生物膜的特性提高药物靶向能力的方法在生物材料以及新药开发方面获得了快速的发展，并且在动物以及临床前期研究中或显示出卓越的性能。因此，针对梗死心肌局部代谢异常，乳酸堆积导致的酸性微环境，我们设计了一种对酸性PH值敏感，并主动靶向缺血心肌的纳米生物材料，可以有效的将阿替普酶递送至缺血心肌，减少药物剂量降低药物副作用。
发明内容
本发明通过具有损伤血管靶向能力的血小板膜包裹PH响应的溶栓纳米颗粒构建智能纳米药物递送系统。该递送系统通过血小板膜表面的膜蛋白受体在体内主动靶向至损伤部位，同时该系统具有PH响应的特性，可以在心肌梗死局部弱酸性微环境中发生崩解进而释放溶栓药，从而实现药物在心肌梗死局部区域的定点释放，可以在实现再灌注治疗的同时，有效降低大剂量药物使用带来的全身出血风险。
本发明提供了一种具有PH响应能力并能靶向缺血心肌的智能纳米药物的制备方法，其特征在于：将血小板膜包裹具有PH响应能力的溶栓纳米药物。
本发明提供了一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：
将具有损伤血管靶向能力的血小板膜，包裹pH响应的溶栓纳米颗粒，来构建智能纳米药物递送系统。
进一步地，本发明提供的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于，其制备方法为：
将pH响应的溶栓纳米颗粒和血小板膜溶液，按蛋白浓度5：0.1-1，通过脂质体挤出器，获得最终的靶向缺血心肌的智能溶栓系统。
进一步地，本发明提供的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于上述pH响应的溶栓纳米颗粒的制备方法为：
步骤1.冻干得到BPAU；
步骤2.冻干得到BPAU-NH2胶束；
步骤3.在pH为7.4环境下，将BPAU-NH2与溶栓混合制备pH响应的溶栓纳米颗粒。
进一步地，本发明提供的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：上述pH响应的溶栓纳米颗粒的具体制备方法为：
S1.将mPEG-NH2，5-氨基-1-戊醇以及1，4-丁二醇二丙烯酸酯BUDA溶于DMSO 中，并在常温反应24-48小时；
S2.加入1,3-二氨基戊烷，在40-80℃下，反应12-36小时后冻干得到BPAU；
S3.将氨基苯硼酸APBA与BPAU溶解于DMSO中，在40-80℃下，反应12-36 小时，并添加1,3-二氨基戊烷消耗过量的BUDA，用去离子水洗涤一遍以上，除去过量的1,3-二氨基戊烷，冻干得到BPAU-NH2胶束；
S4.将BPAU-NH2胶束和rt-PA溶于pH为7.4的PBS中，室温超声处理6-24 小时后，在去离子水中通过8000MW的透析袋透析12-36小时，冻干得到rt-PA 的纳米颗粒TPN。
进一步地，本发明提供的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：在S1中，上述mPEG-NH2、5-氨基-1-戊醇、1，4-丁二醇二丙烯酸酯的摩尔比为：1：0.1-1：3-20：3-20；
在S2中，上述1,3-二氨基戊烷的添加摩尔量为mPEG-NH2的3-20倍；
在S3中，上述氨基苯硼酸与BPAU的摩尔比为1：3-20；
上述1,3-二氨基戊烷的添加摩尔量为mPEG-NH2的3-20倍；
在S4中，上述BPAU-NH2胶束与rt-PA的质量比为：1：0.1-1。
进一步地，本发明提供的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：上述具有损伤血管靶向能力的血小板膜的制备方法为：
步骤1.离心后，取全血的最上层；
步骤2.用含PGE1和EDTA的PBS重悬沉淀；
步骤3.在-80℃和室温下，反复冻融一次以上；
步骤4.用含EDTA和PGE1的PBS离心洗涤一次以上后，用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的PBS重悬沉淀；
步骤5.超声样品后，使用不同大小的脂质体挤出器进行挤出分散。
进一步地，本发明提供的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：用于制备通过血小板膜表面的膜蛋白受体在体内主动靶向至损伤部位的药物。
进一步地，本发明提供的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：用于制备具有pH响应的特性的药物。
进一步地，本发明提供的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：用于制备体外可以有效地靶向损伤的血管内皮细胞并被细胞摄取的药物。
进一步地，本发明提供的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：用于制备靶向血栓形成部位，并对缺血再灌注损伤具有明显的保护作用的药物。
本发明的作用和效果：
本发明提供一种能够靶向心肌梗死区域，并响应局部酸性微环境释放溶栓药的智能纳米药物制备方法。其特征在于纳米药物表面的血小板膜可以靶向心肌梗死的损伤区域，继而对心肌梗死区域酸性微环境敏感的内部纳米颗粒发生崩解并释放出溶栓药物(重组人组织型纤溶酶原激活物,rt-PA)。此智能纳米药物进入循环后通过血小板膜的主动靶向作用和局部PH响应的药物释放，提高了药物的生物利用率，延长了药物的循环时间，并减少了药物的使用剂量，从而降低rt-PA可能带来的全身出血风险。
附图说明
图1.PTPN的结构示意图；
其中，1：血小板膜糖蛋白IIIa；
2：血小板板膜磷脂双分子层；
3：PH敏感的纳米溶栓药物TPN；
4：血小板膜糖蛋白Ib；
5：血小板膜糖蛋白VI；
6：血小板膜糖蛋白V；
图2.靶向缺血心肌智能溶栓药物的合成方法；
图3.不同pH环境下的粒径分布图；
图4.智能纳米溶栓药物在体外的溶栓能力；
图5.体外吞噬试验结果；
图6.小鼠体内靶向血栓形成实验结果；
图7.共聚焦显微镜观察细胞ROS的产生以及线粒体的形态图。
具体实施方式
实施例1.靶向缺血心肌智能溶栓药物的合成
如图2所示的方法进行靶向缺血心肌智能溶栓药物的合成，具体步骤如下所示：
1.称取0.08mmol的mPEG-NH2，0.03mmol的5-氨基-1-戊醇以及1.2 mmol的1，4-丁二醇二丙烯酸酯(BUDA)溶于DMSO，并在常温反应36小时。
2.加入过量的1,3-二氨基戊烷(1.4mmol)与上述溶液反应在60℃下反应 24小时后冻干得到BPAU。
3.将0.08mmol氨基苯硼酸(APBA)与1.2mmol BPAU溶解于2ml DMSO，60℃下连续搅拌24h，并添加1,3-二氨基戊烷消耗过量的BUDA，去离子水洗涤2遍，出去过量的1,3-二氨基戊烷，冻干得到BPAU-NH2胶束。
4.将BPAU胶束(20mg)和10mg rt-PA溶于PH为7.4的PBS中，室温超声处理12小时后，在去离子水中通过8000MW的透析袋透析24小时，冻干得到rt-PA的纳米颗粒(TPN)。
5.采用HPLC测定TPN颗粒中rt-PA的载药量。
6.含EDTA采血管收集大鼠全血，室温下以200g离心20分钟
7.取最上层，室温，800g离心15分钟
8.用含PGE1和EDTA的PBS(1mM EDTA和2mM PGE1)重悬沉淀
9.再-80℃和室温下反复冻融3次
10.用含EDTA和PGE1的PBS在4℃，4000g，离心3min，洗涤3次，最后用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的PBS(购自罗氏制药，cOmpleteTM蛋白酶抑制剂Cocktail(11697498001)和PHOSS-RO磷酸酶抑制剂片剂(4906845001)，用法是每一片/50ml的PBS)重悬沉淀。
11.用100W，53KHZ的功率对样品超声5min
12.将血小板膜溶液依次使用400nm和200nm的脂质体挤出器进行挤出分散
13.对血小板膜进行蛋白定量
14.将tPA纳米颗粒(TPN)和血小板膜(PLTM)溶液按浓度：蛋白浓度5：1通过200nm的脂质体挤出器，获得最终的靶向缺血心肌的智能溶栓药物 PTPN。
15.动态光散射仪(DLS)检测PTPN在不同PH下的粒径大小，如图3 所示，该智能纳米溶栓药物在PH为7.4时(A)，粒径为127nm，但是当PTPN 溶于PH为6.4的PBS中时(B)，PTPN的粒径明显减小，为17.23nm。提示 PTPN颗粒在酸性环境中发生崩解并释放出溶栓药物rt-PA。
实施例2.性能实验
性能验证试验一、该智能纳米溶栓药物在体外的溶栓能力
实验方法：
1.对ICR小鼠眼眶采血，每1.5ml离心管中一滴小鼠全血，室温静置30 min；
2.向各离心管中分别加入PBS，PH为6.4含纳米溶栓药物的PBS(TPN， PH＝6,4)，PH为7.4含纳米溶栓药物的PBS(TPN，PH＝7.4)，血小板膜(PLTM)，血小板膜包覆的TPN颗粒(PTPN)和rt-PA溶液200ul，各溶液中含rt-PA的浓度均为20ug/ml。
3.将离心管倒置，室温观察3小时。
结论：
如图4所示，在体外溶栓实验中，PH敏感的纳米溶栓药物TPN在PH为6.4 时可以有效地释放并溶解血栓。同时，包覆血小板膜的智能PH敏感纳米溶栓药物(rt-PA浓度均为20ug/ml)同样可以有效地溶解管底已形成的血栓。
性能验证试验二、体外人脐静脉内皮细胞对该智能溶栓药物的摄取情况
实验方法：
1.分别用FITC和DiL标记rt-PA纳米颗粒(TPN)和和血小板膜(PLTM)；
2.将荧光标记好的TPN和PLTM依次通过200nm脂质体挤出器，获得血小板膜包覆的智能纳米溶栓药物(PTPN)；
3.向正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和1％O2缺氧培养的HUVEC中分别加入TPN，PLTM以及PTNP，37℃，5％CO2培养一小时；
4.共聚焦显微镜观察细胞对药物的吞噬情况。
结果：
如图5所示，在体外吞噬试验中，与正常的HUVEC相比，经过缺氧1小时的HUVEC对该智能纳米溶栓药物(PTPN)的摄取显著提高，说明PTPN在体外可以有效地靶向损伤的血管内皮细胞并被细胞摄取。
性能验证试验三、智能纳米溶栓药物靶向小鼠颈动脉血栓的能力
实验方法：
1.分别用FITC和DiL标记rt-PA纳米颗粒(TPN)和和血小板膜(PLTM)；
2.将荧光标记好的TPN和PLTM依次通过200nm脂质体挤出器，获得血小板膜包覆的智能纳米溶栓药物(PTPN)；
3.构建小鼠颈动脉血栓模型，具体为小鼠经腹腔注射30ul/g，1％的戊巴比妥钠，于显微镜下分离小鼠颈动脉，将含10％FeCl3的滤纸贴片包裹颈动脉2 min，用于有道颈动脉血栓模型。
4.小鼠经尾静脉分别注射200ul生理盐水(NS)，PH敏感的纳米溶栓药物(20ug/mlTPN)或包裹血小板膜的智能纳米溶栓药物(20ug/ml PTPN)。
结果：
如图6所示，相比于生理盐水组以及TPN组，包裹了血小板膜的PTPN颗粒在给药后15分钟即可到达颈动脉损伤部位，并在给药后3小时内在血栓部位显著蓄积。结果提示该智能纳米溶栓药物PTPN可以有效的在小鼠体内靶向血栓形成部位。
性能验证试验四、智能纳米溶栓药物体外抗活性氧产生的能力
实验方法：
1.将大鼠心肌细胞H9C2接种至共聚焦皿，过夜贴壁。
2.移去原有培养基，更换含5ug/ml的PTPN的不完全培养液预处理H9C2 半小时。
3.移去上述培养液，使用500um/ml的H2O2刺激H9C23小时
4.使用MitoTracker对细胞线粒体进行染色，37℃，30min,新鲜培养基清洗
5.使用DCFH对细胞内活性氧ROS进行染色，37℃，10min，新鲜培养基清洗；
6.使用DAPI对细胞核进行染色，37℃，10min，新鲜培养基清洗；
7.通过共聚焦显微镜观察细胞ROS的产生以及线粒体的形态。
结果：
如图7所示，过氧化氢刺激H9C2可以诱发明显的活性氧产生和线粒体形态的改变。而经过PTPN预处理的细胞，在经受过氧化氢刺激后，ROS产生明显减少，并且线粒体形态未发生明显改变，说明了PTPN对缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。
Claims (10)
1.一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：
将具有损伤血管靶向能力的血小板膜，包裹pH响应的溶栓纳米颗粒，来构建智能纳米药物递送系统。
2.如权利要求1所述的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于，其制备方法为：
将pH响应的溶栓纳米颗粒和血小板膜溶液，按蛋白浓度5：0.1-1，通过脂质体挤出器，获得最终的靶向缺血心肌的智能溶栓系统。
3.如权利要求1所述的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：
所述pH响应的溶栓纳米颗粒的制备方法为：
步骤1.冻干得到BPAU；
步骤2.冻干得到BPAU-NH2胶束；
步骤3.在pH为7.4环境下，将BPAU-NH2胶束与溶栓混合制备pH响应的溶栓纳米颗粒。
4.如权利要求1所述的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：
所述pH响应的溶栓纳米颗粒的具体制备方法为：
S1.将mPEG-NH2，5-氨基-1-戊醇以及1，4-丁二醇二丙烯酸酯BUDA溶于DMSO中，并在常温反应24-48小时；
S2.加入1,3-二氨基戊烷，在40-80℃下，反应12-36小时后冻干得到BPAU；
S3.将氨基苯硼酸APBA与BPAU溶解于DMSO中，在40-80℃下，反应12-36小时，并添加1,3-二氨基戊烷消耗过量的BUDA，用去离子水洗涤一遍以上，除去过量的1,3-二氨基戊烷，冻干得到BPAU-NH2胶束；
S4.将BPAU-NH2胶束和rt-PA溶于pH为7.4的PBS中，室温超声处理6-24小时后，在去离子水中通过8000MW的透析袋透析12-36小时，冻干得到rt-PA的纳米颗粒TPN。
5.如权利要求4所述的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：
在S1中，所述mPEG-NH2、5-氨基-1-戊醇、1，4-丁二醇二丙烯酸酯的摩尔比为：1：0.1-1：3-20：3-20；
在S2中，所述1,3-二氨基戊烷的添加摩尔量为mPEG-NH2的3-20倍；
在S3中，所述氨基苯硼酸与BPAU的摩尔比为1：3-20；
所述1,3-二氨基戊烷的添加摩尔量为mPEG-NH2的3-20倍；
在S4中，所述BPAU-NH2胶束与rt-PA的质量比为：1：0.1-1。
6.如权利要求1所述的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：
所述具有损伤血管靶向能力的血小板膜的制备方法为：
步骤1.离心后，取全血的最上层；
步骤2.用含PGE1和EDTA的PBS重悬沉淀；
步骤3.在-80℃和室温下，反复冻融一次以上；
步骤4.用含EDTA和PGE1的PBS离心洗涤一次以上后，用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的PBS重悬沉淀；
步骤5.超声样品后，使用不同大小的脂质体挤出器进行挤出分散。
7.如权利要求1所述的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：
用于制备通过血小板膜表面的膜蛋白受体在体内主动靶向至损伤部位的药物。
8.如权利要求1所述的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：
用于制备具有pH响应的特性的药物。
9.如权利要求1所述的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：
用于制备体外可以有效地靶向损伤的血管内皮细胞并被细胞摄取的药物。
10.如权利要求1所述的一种靶向梗死心肌的pH智能响应型纳米溶栓系统，其特征在于：
用于制备靶向血栓形成部位，并对缺血再灌注损伤具有明显的保护作用的药物。
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