MXPA03011593A - Composiciones farmaceuticas y de diagnostico que contienen nanoparticulas utilies para tratar tejidos y celulas blanco. - Google Patents

Abstract

Nanoparticulas fabricadas desde un grupo selecto de lipidos y que optativamente contienen un agente terapeuticamente activo se emplean en composiciones farmaceuticas para la administracion a tejidos y/o celulas blanco para el tratamiento o diagnostico de enfermedades tales como cancer.

Description

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y DE DIAGNÓSTICO QUE CONTIENEN NANOPARTICULAS ÚTILES PARA TRATAR TEJIDOS Y CÉLULAS BLANCO Campo de la Invención La presente invención se refiere en general a composiciones farmacéuticas útiles señalar te idos y células blanco con propósitos terapéuticos y de diagnóstico y a métodos para su preparación. Más específicamente, se refiere a partículas de tamaño nanométrico que no contienen gas que tienen capacidad mejorada de señalar células de cáncer blanco y composiciones que las contienen, optativamente con al menos un agente terapéuticamente útil o útil para diagnóstico.

Antecedentes de la Invención La capacidad de administrar agentes terapéuticamente activos a tejidos y células enfermas evitando simultáneamente dañar tejidos y células sanas, o la identificación de drogas que son farmacéuticamente selectivas para un tipo de tejido o célula sobre otro ha planteado un problema prolongado a los médicos que tratan a los pacientes . Esto es especialmente cierto para el cáncer . —~> 2 El cáncer se puede considerar el resultado de la división rápida e infinita de células enfermas y del crecimiento de grupos de células para formar tumores. Las células malignas, que se esparcen desde una masa tumorosa principal y se alojan en otro 5 lugar del cuerpo para formar una carga tumorosa secundaria. Las diferencias entre las células cancerosas y las células sanas son sutiles e históricamente la mayor parte de los agentes quimioterapéuticos han intentado destruir células tumorosas basados en la velocidad de división celular rápida y extensa 0 característica del cáncer.

Ejemplos de blancos relacionados con la división celular son agentes de intercalación o corte de ADN, replicación, transcripción y expresión y reparación o inhibidores de la 5 actividad de la enzima polimerasa y venenos para la polimerización de microbastoncitos . Tales agentes incluyen en forma no taxativa agentes de alquilación, antibióticos, antimetabolitos , agentes de intercalación de ADN, inhibidores de topoisomerasa, taxanos , alcaloides de vincapervinca, citocinas, 0 hormonas, derivados de podofilotoxina, derivados de hidrazina, derivados de triazina, sustancias radioactivas, retinoides y análogos de nucleósidos (agentes terapéuticos específicos incluyen por ejemplo, paclitaxel, camptotecina, doxorubicina, vincristina, vinblastina, bleomicina, gas mostaza, cisplatinium, 5-fluorouracil y sus análogos). Sin embargo, los tejidos sanos tales como la médula ósea y el revestimiento epitelial del intestino, por ejemplo, también tienen poblaciones de células que se dividen rápidamente y los agentes quimioterapéuticos generalmente no logran distinguir entre éstas y otras células sanas y enfermas. El resultado es la limitación de la dosis y aún efectos colaterales que amenazan la vida que se han vuelto característicos de la quimioterapia para el cáncer. Para los agentes solubles acuosos pobres tales como paclitaxel se ha sugerido el uso de agentes emulsionantes tales como Cremaphor. Cremaphor ha demostrado que contribuye adicionalmente al perfil del efecto colateral adverso del paclitaxel .

Un enfoque para hacer a la quimioterapia más selectiva para células cancerosas es el desarrollo de drogas que estén basadas en las diferencias bioquímicas y metabólicas descubiertas recientemente entre las células cancerosas y sanas. Tales diferencias por ejemplo se han descrito ahora en vías receptoras y de transducción de señales y reguladores de oncogenes y genes que controlan el crecimiento y la diferenciación o regulan la apoptosis . Otros ejemplos son los requerimientos de células tumorosas para aminoácidos específicos. Las células de leucemia linfoblástica aguda por ejemplo dependen de fuentes externas de la aminoácido asparagina. La enzima asparaginasa se ha utilizado para agotar los niveles de asparagina en circulación en un intento de tratar la enfermedad. Se están explorando clases de drogas más nuevas, tales como los inhibidores de tirosina cinasa con resultados prometedores. La actividad de la tirosina cinasa ha sido vinculada a receptores tales como el factor de crecimiento epidérmico que puede regularse hacia arriba en ciertos tipos de tumores . Los efectos colaterales incómodos y toxicidades que limitan las dosis así como la resistencia a la droga resultante han persistido como problemas aún con estos agentes selectivos.

También se han observado otras diferencias entre las células cancerosas y sanas en la expresión de antígenos de la superficie celular. Se han estudiado ampliamente anticuerpos monoclonales y sus fragmentos para el diagnóstico y la terapia selectiva del cáncer mediante la unión directa de un anticuerpo a su antígeno o la administración de radioisótopos o agentes quimioterapéuticos que se han conjugado a la cadena principal del anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales generalmente son específicos de . un número limitado de tipos de cáncer y aún no se ha identificado un anticuerpo del "pancarcinoma" . Los agentes quimioterapéuticos dirigidos a la división celular tradicionales así como los agentes dirigidos a la transducción de señales más nuevos y anticuerpos monoclonales o sus fragmentos pueden no lograr penetrar totalmente en una masa tumorosa o acumularse suficientemente en las células tumorosas para alcanzar resultados óptimos (es decir, el agente activo no se internaliza suficientemente en las células tumorosas) . Tales fallas están generalmente asociadas con las características físicas o químicas de los agentes que incluyen carga, tamaño, solubilidad, carácter hidrófilo, carácter hidrófobo, y otros factores. Los índices de cura se mantienen relativamente bajos para muchos tipos de tumores sólidos y aún mejoras modestas en la expectativa de vida se consideran significativas.

Se ha informado que la acumulación de un agente quimioterapéutico en una masa tumorosa se puede promover aumentando la masa molecular del agente quimioterapeutico . Se cree que la falta de drenaje linfático y otras características de la vasculatura asociada al tumor tales como leacinas juegan un papel en estos fenómenos . Los aumentos en la masa molecular se pueden lograr mediante la acilación de lípidos, la conjugación a polímeros inertes tales como polietilenglicol , ácido poliglutónico , dextran y similares o mediante la encapsulacion de drogas en liposomas o nanopartículas de diferentes tamaños y composiciones. Se cree que las partículas de menos de 1 micrón pasan a través de la vasculatura del tumor con derrames y se acumulan en el espacio extracelular de una masa tumorosa. La conjugación a polímeros o la encapsulación también se pueden utilizar para mejorar la solubilidad acuosa o disminuir la unión a proteínas del plasma y la acumulación en el tejido sano.

Las drogas encapsuladas en liposomas tales como doxorubicina se usan clínicamente hoy para el tratamiento del sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA y el cáncer ovárico. El paclitaxel conjugado a polietlenglicol o a ácido poliglutámico y la camptotecina conjugada a polietilenglicol están actualmente en ensayos clínicos humanos.

En general, la encapsulación en liposomas o nanopartículas y la conjugación a polímeros mejorando simult neamente la acumulación de droga en una masa tumorosa puede lentificar o inhibir efectivamente la absorción o internalización de la droga en las células tumorosas. Las drogas luego se dejan difundir fuera de los liposomas o nanopartículas degradables . Para conjugación a polímeros se ha adoptado una estrategia de prodrogas. También se han informado índices de aclaración reducidos de estas formulaciones y se ha sugerido que contribuyen a aumentar la acumulación de masa tumorosa. En una estrategia de prodrogas la droga activa se libera desde un portador mientras el conjugado circula a través de la sangre. ) 7 Un esfuerzo al enfrentar el tema de la destrucción selectiva de tumores se revela en la Patente Estadounidense N° 5.215.680. Un polímero de aminoácido neutro moderadamente hidrófobo se rotula con un complejo paramagnético que comprende un ion metal y ligando quelante orgánico. El reactivo rotulado se combina en solución con una mezcla de agentes tensoactivos y luego se agita en una atmósfera gaseosa para formar un gas en' emulsión líquida o microburbu a. Aunque se emplea principalmente para la mejora de la producción de imágenes ultrasónicas de MRI, se hace mención a la agrupación o concentración de microburbu as en tumores para actuar como disipadores térmicos así como núcleos de cavitación para romper la estructura del tumor.

Otro enfoque ha sido desarrollar nanopartículas de lípidos como un sistema de administración para drogas, inclusive para formulaciones de liberación sostenida o de administración oral (Véase por ejemplo, Wolfgang Mehnert et al, "Nanopartículas de Lípidos Sólidos, Producción Caracterización y Aplicaciones", Adv. Drug Del. Reviews, Volumen 47, páginas 165-196 (2001) incorporado aquí como referencia. Sin embargo, los sistemas de administración que emplean nanopartículas de lípidos sólidas para señalar tumores blanco han sido problemáticos al menos parcialmente debido a las bajas capacidades de carga de drogas, así como a la acumulación indeseada en el hígado y en el bazo o la lixiviación de agentes tóxicos que permanecen después de la formación de la partícula .

La administración de agentes terapéuticamente activos con un vehículo de administración que limitaría la acumulación en tejidos sanos promoviendo la acumulación en una internalización de masa tumorosa y celular es altamente deseable . Con una administración más eficiente, las concentraciones en tejidos sistémicos y sanos de agentes citotóxicos vinculados a la división celular se pueden reducir alcanzando los mismos o mejores resultados terapéuticos con menos o menores efectos colaterales. Tal administración de agentes con grados de selectividad de células tumorosas implícitos ofrecerían ventajas adicionales. Además, un vehículo de administración que no se limitaría a un solo tipo de tumor pero permitiría la acumulación selectiva en una masa tumorosa y la promoción de la internalización celular en diferentes tipos de células tumorosas sería especialmente deseable y permitiría el tratamiento más seguro y eficaz del cáncer. Un vehículo de administración que también permitiría la capacidad de carga elevada para el agente terapéutico probablemente sería un avance significativo en el arte .

Por consiguiente, existe una necesidad de vehículos de administración que mejoren la eficiencia de administración de agentes terapéuticamente activos a tej idos blanco que incluyen tumores con la promoción de la internalización en las células blanco (por ejemplo, células cancerosas) preferentemente sin necesidad de la modificación química o la conjugación de la droga y que tienen altas capacidades de carga de agentes terapéuticos. Existe otra necesidad de un método de preparación y uso de tales vehículos para la administración de una amplia variedad de agentes terapéuticamente activos a tejidos y células blanco.

Extracto de la invención La presente invención se refiere en general a sistemas de administración útiles para la administración de una partícula que tiene una estructura y distribución de tamaños de las partículas deseable que puede contener un agente terapéuticamente activo para tejidos y células blanco de un animal de sangre caliente que incluye humanos para la prevención, diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades, condiciones, síndromes y/o síntomas de ellos, especialmente en el tratamiento del cáncer. En un aspecto de la invención, se prepara una composición farmacéutica incorporando partículas que no contienen gas que optativamente contienen un agente terapéuticamente activo deseable, especialmente para el tratamiento y/o diagnóstico del cáncer en donde las células tumorosas internalizan la composición en una magnitud significativamente mejorada con respecto a los sistemas de administración de partículas previos .

En un aspecto particular de la presente invención, se provee una composición farmacéutica que comprende partículas que no contienen gas en la gama de tamaños nanométricos descrita más adelante y denominadas más adelante "nanopartículas" que comprenden una mezcla de un grupo selecto de lípidos y optativamente uno o más agentes terapéuticamente activos . La concentración del agente terapéuticamente activo debe ser suficiente dentro de las nanopartículas , para proveer la internaliz ción eficaz de los agentes terapéuticamente activos selectivamente dentro de un tejido y/o célula blanco.

En otro aspecto de la presente invención, se proveen nanopartículas que no contienen gas producidas mediante un procesos que comprende : a) combinar una mezcla de un grupo selecto de lípidos y optativamente al menos un agente terapéuticamente activo en un solvente orgánico para formar una solución; b) agregar la solución a un medio acuoso para formar una suspensión acuosa; y c) perturbar la suspensión acuosa para formar nanopartículas dentro de dicho medio acuoso. En otro aspecto de la presente invención, es provee un sistema de administración de nanopartículas para la administración selectiva de las partículas que optativamente incluyen al menos un agente terapéutico y/o células que comprenden nanopartículas que no contienen gas que se internalizan eficazmente dentro de tejidos y células blanco, especialmente tejidos y células cancerosas. Las partículas pueden contener al menos un agente terapéutico en una concentración suficiente para permitir la internalización y concentración eficaz de las nanopartículas que contienen al menos un agente terapéuticamente activo en forma selectiva dentro del tejido y/o célula blanco y un portador farmacéuticamente activo.

En aún otro aspecto de la presente invención, se provee un método para administrar selectivamente las nanopartículas con o sin un agente terapéutico a tejidos y/o células blanco que comprende administrar a dichos tejidos y/o células blanco una cantidad eficaz de las nanopartículas que no contienen gas que comprenden una mezcla de lípidos con o sin dicho agente terapéuticamente activo descritas aquí .

En otro aspecto de la invención, se provee un método de tratamiento de tejidos y células seleccionadas que incluye tumores cancerosos en animales de sangre caliente que incluyen humanos administrando a dichos animales de sangre caliente la composición farmacéutica de la presente invención descrita anteriormente .

Breve Descripción de los Dibujos Los siguientes dibujos son ilustrativos de realizaciones de la invención y no intentan limitar el alcance de la solicitud comprendido por la memoria descriptiva completa y las reivindicaciones.

La Figura 1A es un gráfico que muestra una realización de la distribución de los tamaños de partículas de las nanoparticulas de acuerdo con la presente invención.

La Figura IB es un micrográfico de células de glioma de C6 cultivadas incubadas con y que muestran la intérnal zación de nanoparticulas rotuladas fluorescentes de la presente invención.

Las Figuras 2A-2D son gráficos que muestran la distribución de los tamaños de partícula de las nanoparticulas cargadas con paclitaxel, comptotecina , carmustina y etopósido, respectivamente .

La Figura 3 es un gráfico que muestra la internalización celular de las nanopartículas mostradas en las Figuras 2A-2D en células de glioma de C6.

Las Figuras 4A-4D son gráficos que muestran el efecto de los agentes mej oradores de la solubilidad en agua sobre la distribución de los tamaños de partícula de las nanopartículas sin un agente terapéuticamente activo de la presente invención.

La Figura 5 es un gráfico que muestra el efecto de los agentes mej oradores de la solubilidad en agua sobre la internalización de nanopartículas sin un agente terapéuticamente activo de la presente invención.

Las Figuras 6A-6D son gráficos que muestran la distribución de tamaños de partícula de las nanopartículas que contienen un agente mej orador de la solubilidad en agua y camptotecina comparadas con las nanopartículas sin ninguno y con nanopartículas solamente con camptotecina.

La Figura 7 es un gráfico que muestra la internalización de nanopartículas que contienen camptotecina y un detergente comparadas con nanopartículas que no contienen ninguno y con nanopartículas solamente con camptotecina.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere en general a sistemas de administración para administrar eficazmente nanopartículas que no contienen gas que optativamente incluyen un agente terapéuticamente activo a tejidos y/o células blanco para la prevención, diagnóstico y/o tratamiento de una enfermedad, condición, síndrome y/o síntomas de ellos.

El . sistema de administración está principalmente compuesto de nanopartículas que no contienen gas estructuradas para alcanzar la acumulación pasiva elevada así como la internalización activa en tejidos y células tumorosas. Los tejidos y células blanco, especialmente los tejidos y células asociados con tumores cancerosos internalizan rápidamente las nanopartículas y tales niveles de internalización elevados acoplados con una alta capacidad de carga de las partículas para el agente terapéutico opcional provee un potente tratamiento para tejidos y células blanco, que incluyen aquellas asociadas con el cáncer.

El término "agente terapéuticamente activo" como se usa aquí incluye toda sustancia que incluye, en forma no limitada, drogas, hormonas, vitaminas, y agentes de diagnóstico tales como colorantes, radioisótopos (ej . P32, Te", F18, I131 y similares) y similares que son útiles en la prevención, diagnóstico y tratamiento de enfermedades, condiciones,' síndromes, y síntomas de ellos, que incluyen el cáncer. El término "partículas nanodimensionadas o nanopartículas" significa partículas que no contienen gas de la gama nanométrica (es decir, de menos de 1 micrón a varios micrones o más) que están libres de gas y en consecuencia se distinguen de las microburbujas del tipo descrito en la Patente Estadounidense N° 5.215.680.

Los agentes terapéuticos útiles para la incorporación en las nanopartículas incluyen todos los tipos de drogas y en un aspecto particular de la presente invención incluye agentes de tratamiento del cáncer tales como, por ejemplo, paclitaxel, carmustina, etopósido y camptotecina .

Las partículas nanodimensiondas se preparan primero formando una mezcla de un grupo selecto de lipidos que provee a las partículas de una estructura que facilita los altos niveles de internalización cuando se aplican a tejidos y células blanco. La mezcla de lipidos generalmente comprende: a) al menos un primer miembro seleccionado del grupo formado por monoésteres de glicerol de ácidos carboxílieos saturados que contienen de 10 a 18 átomos de carbono y alcoholes alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono; b) al menos un segundo miembro seleccionado del grupo formado por ésteres de ácidos aromáticos de esterol ; c) al menos un tercer miembro seleccionado del grupo formado por esteróles, terpenos, ácidos biliares y sales de metales alcalinos de ácidos biliares; d) al menos un cuarto miembro opcional seleccionado del grupo formado por ésteres de esterol de ácidos alifáticos que contienen de 1 a 18 átomos de carbono; ésteres de esterol de ácidos de azúcar ésteres de ácidos de azúcar y alcoholes alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono, ésteres de azúcares y ácidos alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono; ácidos de azúcar, saponinas y sapogeninas ; y e) al menos un quinto miembro opcional seleccionado del grupo formado por glicerol, di o triésteres de glicerol de ácidos alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono y alcoholes alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono.

Los cinco miembros que constituyen la mezcla de lípidos preferentemente se combinan en una razón de peso de (a) : (b) : (c) : (d) : (e) de 1-5:0,25-3:0,25-3:0-3:0-3.

En una forma particularmente preferida de la invención, la mezcla de lípidos se forma desde monolaurato de glicerol, benzoato de colesterol, colesterol, acetato de colesterol y palmitato de glicerol que está principalmente en la forma de tripalmitato de glicerol .

Si bien la mezcla de lípidos descrita anteriormente solamente requiere la presencia del primer, segundo y tercer miembros, se prefiere incorporar el cuarto y/o el quinto miembros porque su presencia puede mejorar la estabilidad y/o tamaño uniforme de las partículas .

Las nanopartículas formadas desde la mezcla de lípidos de la presente invención se internalizan en' tejidos y células blanco, que incluyen tumores cancerosos en una magnitud suficiente para tener un efecto deseado tal como detener el crecimiento, que incluye a diferenciación o eliminación de la célula. El efecto deseado también puede incluir un efecto de diagnóstico tal como colocar un marcador detectable dentro del tejido o célula.

"Internalización" como se usa aquí significa que las nanopartículas participan en la entrada activa en la célula.

Los factores que permiten que las nanopartículas sean internalizadas selectivamente por tejidos y células blanco incluyen no solamente la composición de la mezcla de lípidos y la estructura de las nanopartículas resultantes sino también el tamaño y el peso molecular de las partículas que se describe más adelante .

La mezcla de lípidos descrita anteriormente puede optativamente combinarse con una concentración deseada de un agente terapéuticamente activo. Las concentraciones típicas del agente terapéuticamen e activo pueden estar en la gama del 1% o menos al 30% o más en peso. La mezcla de lípidos y el agente terapéuticamente activo típicamente se disuelven en un solvente adecuado (por ejemplo un alcanol tal como etanol) .

La solución de lípidos con o sin el agente terapéuticamente activo luego se combina con agua para formar nanopartículas que tienen una gama de tamaños de partículas generalmente, pero no siempre, en la gama de 0,01 a 1,0 micrones . Esta gama es particularmente adecuada para el tratamiento del cáncer. Partículas de mayor tamaño pueden ser apropiadas para otros usos .

La gama provista aquí estará determinada parcialmente por la mezcla de lípidos empleada, el tipo y el tamaño del agente terapéuticamente activo opcional agregado a la mezcla de lípidos y la presencia o ausencia de un agente mej orador de la solubilidad en agua tal como un detergente que se describe más adelante . Las nanopartículas formadas dentro del medid acuoso (es decir la suspensión acuosa) pueden entonces, según las necesidades, ser tratadas para remover impurezas tales como materiales lípidos, exceso del agente terapéuticamente activo, solventes y similares para crear una suspensión acuosa purificada adecuada para su uso como una composición farmacéutica para la administración a un animal de sangre caliente que incluye humanos que necesitan el tratamiento. En una forma preferida de la invención, la suspensión acuosa cruda se dializa para remover las impurezas y el dializado se retiene para uso farmacéutico.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, las nanopartículas se producen con una distribución de los tamaños de las partículas deseable, preferentemente donde una porción principal de las partículas tienen una gama de tamaños de partículas de 0,01 a 1 micrón, preferentemente de 0,1 a 0,5 micrón con cantidades menores variables de partículas que están por encima o por debajo de la gama con algunas nanoparticulas que tienen hasta 200 micrones .

Se hace referencia a la Figura 1A que muestra una distribución de tamaños de partícula típica de las nanoparticulas producidas de acuerdo con la presente invención de acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos 1 y 2. Como se muestra específicamente en la Figura 1 A, la vasta mayoría de las nanoparticulas de esta realización están en la gama de 0,1 a 1,0 micrones aunque cantidades menores de tales nanoparticulas tienen hasta 30 micrones. Como se muestra en la Figura IB, las nanoparticulas que tienen la distribución de tamaños de partículas mostradas en la Figura 1A parecen ser internalizadas dentro de células de glioma de C6 como lo demuestra la apariencia de las nanoparticulas en toda la célula excepto en el núcleo de la célula y como lo confirma el análisis de rotaciones planares de las células usando el microscopio confocal .

Como se indicó anteriormente, la distribución de los tamaños de las nanoparticulas depende parcialmente de si un agente terapéuticamente activo está presente y el tipo de agente terapéuticamente activo que se incorpora en ellas . Haciendo referencia a las Figuras 2 A-2D en ellas se muestra la distribución de tamaños de partículas de las nanoparticulas de acuerdo con la presente invención que contienen paclitaxel, camptotecina, carmustina y etopósido, respectivamente. En cada caso, la vasta mayoría de las nanopartículas están en la gama de 0,1 a 1,0 micrón con cantidades menores variables de nanopartículas de hasta y que incluyen 200 micrones.

Como se indicó previamente, la solución de la mezcla de lxpidos y el agente terapéuticamente activo se combina con agua y luego se perturba para producir nanopartículas dentro del medio acuoso. La suspensión acuosa puede tratarse para producir un medio líquido purificado que contiene las nanopartículas que pueden usarse para la administración a animales de sangre caliente. En algunos casos, puede ser deseable remover partículas indebidamente grandes, de manera de controlar mejor la distribución de los tamaños de las partículas dentro de una gama deseada. Los sistemas de filtración adecuados tales como los de Millipore Corporation de Waltham, Massachussets están disponibles con este propósito. La selección de un sistema de filtro adecuado en consecuencia es un factor en el control de la distribución de los tamaños de las partículas dentro de una gama deseable para las nanopartículas .

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, las nanopartículas poseen una capacidad elevada para recibir el agente terapéuticamente activo (es decir la capacidad de carga) que hace a las partículas particularmente adecuadas para la administración selectiva y la concentración eficaz dentro de tejidos y células cancerosas.

Las nanopartículas producidas como se describió, cuando se purifican por ejemplo por diálisis para remover la droga no particulada, pueden caracterizarse para determinar la magnitud en la cual las nanopartículas pueden internalizarse en células blanco tales como por ejemplo células de glioma de Cs.

Haciendo referencia a la Figura 3, las nanopartículas de acuerdo con la presente invención expuestas en el Ejemplo 2 que contienen una de las cuatro drogas, paclitaxel, carmustina, etopósido y camptotecina se prepararon como se describió anteriormente con una droga no incorporada removida mediante diálisis contra agua destilada. Las nanopartículas se incubaron entonces con células de glioma de Cs, se cultivaron en placas de 96 receptáculos a una densidad de germinación de 104 células por receptáculo de acuerdo con el Ejemplo 4. Después de un tiempo de incubación apropiado las muestras de las nanopartículas se aspiraron desde cada receptáculo y se gráfico la magnitud de la absorción celular (es decir la internalización) .

Como se muestra en la Figura 3 , cada una de las muestras que incluyen la muestra sin ninguna droga se internalizó dentro de las células de glioma de Cs y en consecuencia está presente en las células blanco para romper y posiblemente eliminar las células blanco. Cuando las nanopartículas se preparan con un agente terapéuticamen e activo, la cantidad del agente que puede cargarse en las partículas es un factor adicional en alcanzar un efecto deseable sobre el tejido y/o las células blanco. Haciendo referencia a las Tablas I-IV, la cantidad de cada uno de paclitaxel, carmustina, etopósido y camptotecina agregada a las mezclas de lipidos y la cantidad retenida (capacidad de carga) después de la preparación descrita anteriormente se calculó en función del peso de la mezcla de lipidos de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 3. Aquellos resultados se comparan favorablemente con sistemas de administración conocidos del arte previo . Tabla I. Carga de Paclitaxel en Nanopartículas de Lipidos Paclitaxel agregado Cantidad de Carga de paclitaxel (porcentaje en peso Paclitaxel en (porcentaje en peso de lipidos) nanopartículas de lipidos) (|xg/ml) 1% ND* ND 5% ND ND 10% 20, 84 10 , 2% 20% 37, 35 18, 67% 30% 53,31 26 , 65% *El Nivel de droga estuvo por debajo de los límites de detección Tabla II. Carga de Carmustina en Nanopartículas de Lípidos Carmustina agregada Cantidad de Carga de carmustina (porcentaje en peso carmustina en (porcentaje en peso de lípidos) nanopartículas de lípidos) 1% 3, 13 1, 57% 5% 3,46 1, 73% 10% 4, 84 2,42% 20% 14, 60 7,30% 30% 25, 41 12, 71$ Tabla III. Carga de Etoposido en Nanopartículas de Lípidos Etoposido agregado Cantidad de Carga de etoposido (porcentaje en peso etoposido en (porcentaje en peso de lípidos) nanopartículas de lípidos) ^g/ml) 1% 1, 08 0,54% 5% 2, 29 1, 14% 10% 2,68 1, 34% 20% 3 , 79 1, 89% 30% 4, 61 2,30% Tabla IV. Carga de Campototecina en Nanopartxculas de Lipidos Camptotecina Cantidad de Carga de agregado (porcenta e camptotecina en camptotecina en peso de lipidos) nanopartículas (porcentaje en peso ^g/ml) de lipidos) 1% 0, 05 0, 02% 5% 3,18 1,59% 10% 9, 51 4, 75% 20% 21, 05 10, 53% 30% 32 , 20 16, 10% Las células preparadas como se describió anteriormente y después de la determinación de la capacidad de carga de droga expuesta en las Tablas I-IV se midieron para determinar la internalización celular de las nanopartículas en relación con las nanopartículas en las cuales no se incorporó ninguna droga.

Como se muestra .en la Figura 3 , comparado con el control en el cual no se incorpora ninguna droga, la cantidad de nanopartículas internalizadas en células de glioma de C6 fue similar o excedió realmente (es decir paclitaxel y camptotecina) la internalización de las nanopartículas que no incorporan ninguna droga. Por lo tanto, las nanopartículas de la presente invención parecen proveer una internalización dramáticamente mejorada cuando se cargan con droga y en consecuencia proveen un sistema eficaz para la administración de agentes terapéuticamente activos para el tratamiento de tejidos blanco tales como tejidos y células tumorosas.

En una forma preferida de la presente invención, puede ser deseable incorporar un agente mej orador de la solubilidad en agua y/o un solvente en el proceso de preparación de las nanopartículas para garantizar que la mezcla de lípidos dispersada en el medio acuoso no tienda indeseablemente a precipitar, reduciendo entonces el rendimiento y posiblemente, la eficacia de la administración del agente terapéuticamente activo.

Para impedir o minimizar la formación de un precipitado cuando se producen nanopartículas que contienen un agente terapéuticamente activo, el agente mej orador de la solubilidad en agua se puede incorporar cuando la mezcla de lípidos se combina con el agente terapéuticamente activo. Como resultado de esto, se pierde menos agente terapéuticamente activo debido a. la precipitación. Más aún, la maximización de la solubilidad en agua puede mejorar la capacidad de carga de la mezcla de lípidos manteniendo simultáneamente la capacidad deseable de señalar tumores blanco del producto resultante en el cuerpo de un paciente .

El agente mej orador de la solubilidad en agua opcional puede seleccionarse, por ejemplo, de solventes tales como etanol, acetonitrilo, sulfóxido de dimetilo, cloroformo, tetrahidrofurano, éter, dimetilformamida, éter dietílico y combinaciones de ellos. Otros agentes mej oradores de la solubilidad en agua incluyen detergentes (no iónicos, aniónicos y catiónicos) , ésteres de ácidos grasos de polioxietileno sorbitan o polisorbatos tales como mono-oleato de sorbitan de óxido de polietieleno, fosfolípidos tales como fosfotidilcolina, fosfotidiletanolamina, y fosfotidilserina .¦ Otros agentes me oradores de la solubilidad en agua adecuados incluyen alcoholes de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de polioxietileno, polietilenglicol , grupos hidrófobos conjugados a polietilenglicol , lípidos conjugados a polietilenglicol, ceramidas, dextran, colatos, desoxicolatos , y similares y mezclas de ellos.

El agente mej orador de' la solubilidad en agua cuando está presente puede afectar la distribución de los tamaños de partículas de las nanopartículas generalmente, pero no necesariamente, aumentando la distribución de los tamaños de partículas. Haciendo referencia a las Figuras 4A-4D, las nanopartículas preparadas de acuerdo con la presente invención mediante el método descrito en el Ejemplo 5 (sin el agente terapéuticamente activo) . Las nanopartículas que se muestran en la Figura 4A, se prepararon sin un agente mej orador de la solubilidad en agua mientras que las nanopartículas que se muestran en las Figuras 4B-4D incluyeron agentes mej oradores de la solubilidad en agua específicos (es decir detergentes; desoxicolato, dodecil sulfato de sodio y T een 80, respectivamente) .

Como se muestra en la Figura 4A, el tamaño de partícula medio de las nanopartículas preparadas sin el detergente fue de 0,29 mícrones. Cuando se agrega el detergente el tamaño de partícula medio de las nanopartículas aumentó a una de 0,43 - 0,46 micrones .

La presencia de un agente mejorador de la solubilidad en agua tal como un detergente no afecta en forma advers la internalización de las nanopartículas. Como se muestra en la Figura 5, la internalización de las nanopartículas dentro de las células de glioma de C6 con detergente de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 6 fue igual o similar a las nanopartícul s preparadas sin detergente.

La capacidad de carga de las nanopartículas producidas de acuerdo con la presente invención no se ve afectada en forma adversa por la presencia de un agente mej orador de la solubilidad en agua. Como se muestra en la Tabla V, las nanopartículas se prepararon incorporando el 30% en peso de camptotecina sola o en la presencia de un detergente (es decir 0,1% de desoxicolato y 0,1% de Tween 80) . Como se muestra en la Tabla V, la capacidad de carga se mejoró para las partículas que contienen detergente comparada con las nanopartículas que no contienen detergente.

Tabla V. Carga de Campototecina en Nanopartículas de Lípidos en la Presencia de Detergentes Camptotecina Detergente Cantidad de Carga de agregado agregado (% camptotecina en camptotecina (porcentaj e en en p/v) nanopartículas (porcentaje en peso de {µ3/ta1) peso de lípidos) lípidos) 30% Ninguno 21,34 10,67% 30% 0,1% de 31,25 15, 62% descocícolato 30% 0,1% de 30,59 15, 30% Tween 80 Las nanopartículas producidas con un agente mej orador de la solubilidad en agua (por ejemplo un detergente) tienen una distribución de los tamaños de partículas que provee la internalización eficaz dentro de los tejidos y células blanco.

Haciendo referencia a las Figuras 6A-6D en ellas se muestra una distribución de tamaños de partícula de las nanopartículas producidas de acuerdo con el Ejemplo 5. Como se muestra específicamente en las Figuras 6C y 6D, la mayor parte de las nanopartículas que contienen tanto un agente terapéuticamente activo (camptotecina) como un detergente (desoxicolato y Tween 80, respectivamente) están en la gama de 0,1 a 1,0 micrón. Las cantidades de tales nanopartículas fuera de la gama de 0,1 a 1 micrón tienen tamaños de partículas de hasta 80 a 100 micrones . Estos resultados son similares a las nanopartículas que tienen la distribución de tamaños de partículas que se muestran en la Figura 6A (sin detergente y sin camptotecina) y 6B (sin detergente) .

Las nanopartlculas que se describieron con referencia a las Figuras 6A-6D se incubaron con células de glioma de C6 de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 6. La internalización celular de las nanopartículas en las células de glioma de C6 fue eficaz para cada tipo de nanopartícula que incluye aquellas que contienen camptotecina y detergentes . También se pueden emplear agentes mej oradores de la emulsión en la presente invención para garantizar la formación de una emulsión deseable y la suspensión de las nanopartículas que no contienen gas en los medios acuosos. Tales agentes mejoradores de la emulsión incluyen, en forma no taxativa, tricaprina, trilaurina, trimirstina, tripalmitina, triestearina, Sofistan 142 así como grasas duras, glicerol, monoestearato, glicerolbehenato, glicerolpalmitoestearato, cetilpalmitato, ácido decanoico, ácido behénico, y Acidin 12. Otros agentes mejoradores de la emulsión incluyen lecitina de soja, lecitina de huevo, compuestos Poloxymer (188, 182, 407 y 908), Tyloxapol, Polisorbato 20, 60 y 80, glicolato de sodio, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, butanol, ácido butírico, dioctil sodio sulfosuccinato, ácido monooctilfosfórico y dodecil sulfato de sodio .

Cuando se emplea un agente mej orador de la emulsión, se prefiere combinar el agente mej orador de la emulsión con la mezcla de llpidos y el agente terapéuticamente activo opcional en la preparación inicial de las nanopartículas. En particular, la mezcla de lípidos se mezcla totalmente con el agente mej orador de la solubilidad en agua opcional tal como etanol y luego se agita por ejemplo mediante sonicación o calefacción. El agente terapéuticamente activo luego se agrega a la emulsión que se ha combinado con el agente mejorador de la emulsión bajo agitación adicional durante un tiempo suficiente para completar la disolución o solvatación.

Como se indicó anteriormente, la composición farmacéutica de la presente invención se obtiene removiendo impurezas por ejemplo mediante diálisis. El medio líquido resultante (por ejemplo dializado) provee un medio favorable para administrar las nanopartículas a un animal de sangre caliente. La diálisis es un método preferido de remoción de todos los componentes de la mezcla de lípidos no particulados, droga y/o solventes y para alcanzar cualquier intercambio o concentración de tampón deseada. Se pueden usar cortes de peso molecular nominales de la membrana de diálisis de 5.000-500.000, prefiriéndose de 10.000-300.000.

Los medios líquidos adecuados incluyen soluciones o emulsiones inyectables u otros de tales medios líquidos adecuados para la administración por otras vías de administración farmacéuticamente aceptables que pueden contener, por ejemplo, diluyentes o solventes no tóxicos adecuados o aceptables, tales como manitol, 1 , 3-butanodiol , agua, solución tampón, solución de alcohol y agua con bajo contenido de carbono, solución de Ringer, solución de dextrosa o sucrosa, una solución de cloruro de sodio isotónica, soluciones en solución salina que contienen, por ejemplo, alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para mejorar la biodisponibilidad y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son generalmente adecuadas como vehículos para la incorporación de agentes terapéuticamente activos sustancialmente solubles en lípidos .

Por consiguiente, se contemplan tratamientos mejorados del cáncer que incluyen el tratamiento de tumores principales mediante el control de la proliferación de las células tumorosas, angiogénesis , crecimiento metastásico, o apoptosis, y el tratamiento del desarrollo de la micrometástasis posterior o concurrente con la remoción quirúrgica, el tratamiento radiológico u otro tratamiento quimioterapéutico de un tumor principal .

La composición farmacéutica de la presente invención aumenta la selectividad y especificidad de la administración de agentes terapéuticamente activos a una masa tumorosa a través de la acumulación pasiva en la vasculatura del tumor y la internalización activa en las células tumorosas.

La invención provee métodos para tratar a un paciente con agentes terapéuticamente activos y para administrar agentes terapéuticamente activos a una célula para la prevención, el diagnóstico y/o el tratamiento de enfermedades, condiciones, síndromes y/o síntomas de ellos. Los agentes terapéuticamente activos empleados en la presente invención pueden ser no cargados , o cargados , no polares o polares , naturales o sintéticos, y similares. En realizaciones preferidas de la presente invención, los agentes terapéuticamente activos se pueden seleccionar de polipéptidos lipófilos, citotoxinas , oligonucleótidos, agentes antineoplásticos citotóxicos, antimetabolitos , hormonas, moléculas radioactivas, y similares.

Los oligonucleótidos citados anteriormente incluyen oligonucleótidos contrasentido y oligonucleótidos de sentido (por ejemplo, ácidos nucleicos conocidos convencionalmente como vectores) . Los oligonucleótidos pueden ser "naturales" o "modificados" con respecto a las subunidades o enlaces entre las subunidades . En realizaciones preferidas, el oligonucleótido es un oligonucleótido capaz de administrar un beneficio terapéutico.

Los agentes antineoplásticos son conocidos e incluyen, por ejemplo, los siguientes agentes y sus congéneres o análogos; camptotecina y sus análogos tales como topotecan e irinotecan, altretamina, aminoglutetimida, azatioprina, ciclosporina, dacarbazina, dactinomicina, daunoru icina, docetaxel, doxorubicina, gemcitabina, etoposido, hidroxiurea, irinotecan, interferón, metilmelaminas , mitotano, paclitaxel y análogos tales como docetaxel, procarbazina HCl , teniposido, topotecan, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina y vinorelbina.

Otros agentes antineoplásticos además incluyen antibióticos y sus congéneres y análogos tales como actinomicina, sulfato de bleomicina, idarubicina, plicamicina, mitomicina C, pentostatina, y mitoxantrona; antimetabolitos tales como citarabina, fludarabina, flurouracil, floxuridina, cladribina, metotrexato, mercaptopurina, y tioguanina; algentes de alquilacion tales como busulfan, carboplatin, cisplatin, y tiotepa; gases mostaza tales como melfalan, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucil y mecloretamina; nitrosureas tales como carmustina, lomustina, y estreptomicina; y toxinas tales como ricina.

Como se usa aquí, una "cantidad eficaz de agentes terapéuticamente activos" significa la dosificación o dosificaciones múltiples a las cuales se logra el efecto terapéutico o de diagnóstico deseado. Generalmente, una cantidad eficaz de un agente terapéuticamente activo puede variar con la edad, condición, condición dietaria, peso y sexo del sujeto, así como con la magnitud de la condición que se está tratando, y la potencia de la droga que se está utilizando. La dosificación precisa puede ser determinada por un conocedor ordinario del arte. La dosificación puede ser ajustada por cada médico en el caso de cualquier complicación. En general, las nanopartículas se, administran en una forma suficiente para administrar una cantidad eficaz al paciente. La cantidad de la dosificación puede administrarse en una sola dosis o en la forma de dosis divididas individuales, por ejemplo de 1 a 4 o más veces por día.

La dosificación se puede ajusfar apropiadamente para lograr un efecto terapéutico deseado. Se entiende que el nivel de la dosis específica y la frecuencia de la dosificación para cualquier sujeto particular se puede variar y depende de una variedad de factores que incluyen la actividad del agente' terapéuticamente activo específico empleado, la estabilidad metabólica y duración de la acción de ese agente, la especie, edad, peso corporal, salud general, condición dietaria, sexo y dieta del sujeto, el modo y tiempo de administración, el índice de excreción, la combinación de drogas, y la severidad de la condición particular. Generalmente, las dosis diarias de los agentes terapéuticamente activos pueden ser determinadas por un conocedor ordinario del arte sin experimentación indebida, en una o varias administraciones por día, para dar los resultados deseados.

En el caso de que la respuesta en el sujeto sea insuficiente a una cierta dosis, se pueden emplear aún dosis más altas (o dosis más altas eficaces por una vía de administración diferente, más localizada) en la medida en que lo permita la tolerancia del paciente. Se contemplan múltiples dosis diarias para alcanzar niveles sistémicos o banco apropiados de los compuestos terapéuticos .

Los sujetos preferidos para el tratamiento incluyen animales, más preferentemente especies de mamíferos tales como humanos, y animales domésticos tales como perros, gatos y similares, sujeto a la enfermedad y otras condiciones patológicas .

Existe una variedad de vías de administración para la composición farmacéutica de la presente invención. El modo particular seleccionado depende, naturalmente, del agente terapéuticamente activo particular seleccionado, si la administración es para prevención, diagnóstico o tratamiento de una enfermedad, la severidad del trastorno médico que se " está tratando y la dosificación requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos de esta invención se pueden practicar usando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable y produzca niveles eficaces de los compuestos activos sin producir efectos adversos clínicamente inaceptables. Tales modos de administración incluyen, en forma no taxativa, oral, inhalación, mucosal, rectal, tópico, nasal, transdérmico, subcutáneo, intravenoso, intramuscular o metodologías de infusión.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden habitualmente contener sales, agentes tampones, conservantes, portadores compatibles, y optativamente otros ingredientes terapéuticos. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamene aceptables, pero las sales no aceptables farmacéuticamente pueden usarse convenientemente para preparar sales aceptables de ellos y no están excluidas del alcance de la invención. Tales sales farmacológica y farmacéuticamente aceptables incluyen, en forma no taxativa, aquellas preparadas desde los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, palicílico, p-tolueno sulfónico, tartárico, cítrico, metano sulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftaleno- 2-sulfónico, y bencensulfónico . Además, las sales farmacéuticamente aceptables pueden prepararse como sales de metales alcalinos o alcalinotérreos , tales como las sales de sodio, potasio o calcio del grupo de los ácidos carboxílicos .

La discusión precedente revela y describe solamente ejemplos de realizaciones de la presente invención. Un experto en el arte reconocerá rápidamente a partir de tal discusión, y a partir de las reivindicaciones anexas, que se pueden hacer diferentes cambios, modificaciones y variaciones en ella sin apartarse del espíritu y alcance de la invención definidos en las siguientes reivindicaciones .

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación de Nanopartículas sin Agente Terapéutico 10 mg de una mezcla de lipidos que contiene un lípido seleccionado de cada uno de los miembros de lipidos especificados aquí en una cantidad que cumple con los requisitos de relación de peso se suspendió en 1 mi de etanol absoluto. La suspensión resultante se agregó a 50 mi de agua destilada y se procesó a través de un Microfluidizador Microfluidcs 110 Y (Microfluidics Inc, Newton, Massachussets) ajustado a 85 psi de presión de aire a 25 °C y cuatro pasadas.

Se recogieron las nanopartículas y se examinó la distribución de tamaños de partícula de una alícuota usando un Analizador de la Distribución de Tamaños de Partículas de Difusión Láser Horiba LA-910. EJEMPLO 2 Preparación de Nanopartículas con Agente Terapéutico 10 mg de una mezcla de lípidos que contiene un lípido seleccionado de cada uno de los miembros de lípidos especificados aquí en una cantidad que cumple con los requisitos de relación de peso se suspendió en 1 mi de etanol absoluto . Una solución de material que contiene una de las cuatro drogas paclitaxel , carmustina, camptotecina y etoposido y etanol absoluto se preparó y se combinó con la mezcla de lípidos. La suspensión resultante se agregó a 50 mi de agua destilada y se procesó a través de un Microfluidizador Microfluidcs 110 Y (Microfluidics Inc, Newton, Massachussets) ajustado a 85 psi de presión de aire a 25 °C y cuatro pasadas .

Se recogieron las nanopartículas y se examinó la distribución de tamaños de partícula de una alícuota usando un Analizador de la Distribución de Tamaños de Partículas de Difusión Láser Horiba LA-910. 15 mi de cada preparación se concentraron, se lavaron dos veces con agua y se disolvieron en etanol .

EJEMPLO 3 Capacidad de Carga de Nanopartículas Se midió la capacidad de carga de droga de las nanopartículas producidas de acuerdo con el Ejemplo 2, de la siguiente manera.

Se establecieron curvas de calibración basado en la absorbencia de radiación ultravioleta o emisión de fluorescencia para cada droga blanqueada contra nanopartículas disueltas en etanol. Más específicamente: Etoposido, paclitaxel y carmustina se monitorearon mediante absorbencia de radiación ultravioleta a 254 nm, 230 nm, y 237 nm, respectivamente, usando un fotoespectrofotómetro Spectronic Genesys 5. Se determinaron los niveles de camptotecina mediante monitoreo de fluorescencia a excitación 390 y emisión 460 usando un fluorímetro de microplaca (FLUOstar Optima, BM Lab Technologies, Durham, NC) .

Se prepararon nanopartículas que contienen droga y se disolvieron en etanol después de la remoción de cualquier droga no particulada mediante centrifugación de desalación y lavado usando Millipore Ultrafree 2BHK40 con 100.000 membrana de corte de peso molecular nominal y Eppendorf 5810R usando el rotor A-4-62 a la fijación de 3100 RPM durante 90' por lavado.

EJEMPLO 4 Internalización de Nanopartículas en Células de Glioma de C6 Las nanopartículas preparadas de acuerdo con el Ejemplo 2 se proveyeron además con 0,01% p/p de colesterilo de lípidos BoPy FL C12 (Molecular Probes, Eugene, Oregon) .

Se dializaron (30 minutos) muestras (5 mi) para remover cualquier droga ¾o incorporada y colorante contra agua destilada (1,2 L) con dos cambios . Las células de glioma de Cs cultivadas en placas de 96 receptáculos a una densidad de germinación de 104 células por receptáculo se germinaron un día antes de cada experimento y crecieron en el medio completo que consiste en DMEM y 10% de suero bovino fetal.

Las muestras se diluyeron en medios completos a 50 µg/ml y se agregaron a las células de glioma de Cs . Las células se incubaron con muestras diluidas a 37°C durante 30 minutos. Después del tiempo de incubación apropiado, las muestras de nanopartículas se aspiraron desde cada receptáculo. Los receptáculos luego se lavaron una vez agregando 100 µ? o PBS seguida por la aspiración y reemplazo del mismo volumen de PBS .

La intensidad de la fluorescencia de las células se cuantificaron usando un fluorímetro de microplaca (FLUOstar Optima, BMG Labtechnologies , Inc., Durham, NC) .

EJEMPLO 5 Preparación de Nanopartículas que Contienen Detergente Se prepararon nanopartículas de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2, excepto que 200 µg/ml de lípidos con la concentración de camptotecina y detergentes que se muestra en la Figura 6 se combinaron en un volumen total de 50 mi, en agua destilada. Las muestras se prepararon pasando las mezclas cuatro veces a través del Microfluidizador (Modelo 110 Y, Microfluidics , Inc., Newton, MA) . Los productos recogidos se analizaron en un analizador de la distribución de partículas de difusión láser (Modelo LA-910, Horiba, Inc., Ann Arbor, MI) .

EJEMPLO 6 Internalización de Nanopartículas en Células de Glioma de C6 Las muestras de nanopartículas se prepararon cada una con 200 µg/ml de lípidos, con las concentraciones apropiadas de camptotecina y detergentes, y 0,01% de colesterilo BODIP Y-FL C12 (p/p de lípidos), en un volumen total de 50 mi de agua destilada. Se prepararon muestras pasando las mezclas cuatro veces a través del Microfluidizador (Modelo 110 Y, Microfluidics , Inc., Newton, MA) . Los productos recogidos se analizaron en un analizador de la distribución de tamaños de partículas de difusión de láser (Modelo LA-910, Horiba Inc., Ann Arbor, MI) . Se agregaron muestras de nanopartículas de lípidos fluorescentes a las células de glioma de Cs, se cultivaron en placas de 96 receptáculos, a una concentración de 50 µg/ml en un medio completo y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. Las muestras posteriormente se removieron, y la monocapas de células se lavaron una vez con PBS . Se agregaron 100 µ? de PBS a cada receptáculo, y se cuantificó la absorción de nanopartículas midiendo la intensidad de la fluorescencia de cada receptáculo en un fluorímetro de microplaca (FLUOstar Optima, BMG Labtechnologies , Durham, NC) . Cada muestra se leyó en seis receptáculos separados y los resultados fueron promedio. Los valores promediados para cada muestra que contiene detergente se normalizaron a valores promediados de muestras que no contienen ningún detergente. La absorción de células de cada muestra que contiene detergente, cuantificada mediante la intensidad de fluorescencia, se expresó en relación con la de la muestra sin ningún detergente.

Claims (35)

REIVINDICACIONES

1. Nanopartículas que no contienen gas que comprenden: una mezcla de lípidos selectos capaces de ser internalizados dentro de un tejido o célula blanco suficiente para alcanzar un efecto deseado.

2. Las nanopartículas que no . contienen gas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la mezcla de lípidos selectos comprende : a) al menos un primer miembro seleccionado del grupo formado por monoéteres de glicerol de ácidos carboxílicos saturados que contienen de 10 a 18 átomos de carbono y alcoholes alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono; b) al menos un segundo miembro seleccionado del grupo formado por esteres de ácidos aromáticos de esterol; y c) al menos un tercer miembro seleccionado del grupo formado por esteróles, terpenos, ácidos biliares y sales de metales alcalinos de los ácidos biliares.

3. Las nanopartículas que no contienen gas de la reivindicación 2 que además comprenden al menos un lípido seleccionado del grupo formado por : a) al menos un cuarto miembro seleccionado del grupo formado por esteres de esterol de ácidos alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono; esteres de esterol de ácidos de azúcares ; esteres de ácidos de azúcares y alcoholes alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono, esteres de azúcares y ácidos alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono; ácidos de azúcares, saponinas ; y sapogeninas; y b) al menos un quinto miembro seleccionado del grupo formado por glicerol, di o triésteres de glicerol de ácidos alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono y alcoholes alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono.

4. Las nanopartículas que no contienen gas de la reivindicación 3 en donde la mezcla de lipidos tiene una razón de peso de (a) : (b) : (C) : (d) : (e) de 1-5 : 0 , 25-3 : 0 , 25-3 : 0-3 : 0-3.

5. Las nanopartículas que no contienen gas de la reivindicación 1, en donde una porción principal de las nanopartículas está en la gama de 0,01 a 10 micrones.

6. Las nanopartículas que no contienen gas de la reivindicación 5 en donde la porción principal de las partículas nanodimensionadas están en la gama de 0,1 a 5 micrones.

7. Las nanopartículas que no contienen gas de la reivindicación 1 que además comprenden al menos un agente mej orador de la solubilidad en agua.

8. Las nanopartículas que no contienen gas de la reivindicación 7, en donde el agente mejorador de la solubilidad en agua es un detergente .

9. Las nanopartículas que no contienen gas de la reivindicación 1 que además comprenden al menos un agente mej orador de la emulsión .

10. Las nanopartículas que no contienen gas de la reivindicación 1 en donde el tejido o célula blanco es un tejido o célula cancerosa.

11. Las nanopartículas que no contienen gas de la reivindicación 1 que además comprenden al menos un agente terapéutico.

12. Las nanopartículas que no contienen gas de la reivindicación 10 en donde al menos un agente terapéutico es un agente terapéutico para tratar el cáncer.

13. Las nanopartlculas que no contienen gas de la reivindicación 12 en donde el agente terapéutico para el tratamiento del cáncer se selecciona del grupo formado por paclitaxel, carmustina, etoposido y camptotecina o sus congéneres o análogos y combinaciones de ellos .

1 . Una composición farmacéutica que comprende nanopartlculas que no contienen gas que comprende: una mezcla de lípidos selectos capaces de ser internalizados dentro de un tejido o célula blanco para lograr un efecto deseado en un tejido o célula blanco, y un portador farmacéuticamente aceptable .

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, en donde la mezcla de lipidos selectos comprende: a) al menos un primer miembro seleccionado del grupo formado por monoésteres de glicerol de ácidos carboxílicos saturados que contienen de 10 a 18 átomos de carbono y alcoholes alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono; b) al menos un segundo miembro seleccionado del grupo formado por ésteres de ácidos aromáticos de esterol; y c) al menos un tercer miembro seleccionado del grupo formado por esteróles, terpenos, ácidos biliares y sales de metales alcalinos de ácidos biliares.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15 en donde las nanopartxculas además comprenden al menos un lípido seleccionado del grupo formado por: a) al menos un cuarto miembro seleccionado del grupo formado por esteres de esterol de ácidos alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono; esteres de esterol de ácidos de azúcares ; esteres de ácidos de azúcares y alcoholes alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono, esteres de azúcares y ácidos alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono; ácidos de azúcares, saponinas y sapogeninas; y b) al menos un quinto miembro seleccionado del grupo formado por glicerol, di o triésteres de glicerol de ácidos alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono y alcoholes alifáticos que contienen de 10 a 18 átomos de carbono.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 15 en donde la mezcla de lípidos tiene una relación de peso de (a) : (b) : (c) : (d) : (e) de 1-5:0,25-3:0,25-3:0-3:0-3.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 14 en donde una porción principal de las nanopartículas están en la gama de 0,01 a 10 micrones .

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, en donde la porción principal de las partículas nanodimensroñadas están en la gama de 0,1 a 5 micrones.

20. La composición farmacéutica de la reivindicación 14 en donde las nanopartículas además comprenden al menos un agente mej orador de la solubilidad en agua.

21. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, en donde el agente mej orador de la solubilidad en agua es un detergente.

22. La composición farmacéutica de la reivindicación 14 que además comprende al menos un agente mej orador de la emulsión.

23. La composición farmacéutica de la reivindicación 14 en donde el tejido o célula blanco es un tejido o célula cancerosa.

24. La composición f rmacéutica de la reivindicación 14 que además comprende al menos un agente terapéuticamente activo.

25. La composición farmacéutica de la reivindicación 24 en donde al menos un agente terapéuticamente activo es un agente terapéuticamente activo que trata el cáncer.

26. La composición farmacéutica de la reivindicación 25 en donde el agente terapéutico que trata el cáncer se selecciona del grupo formado por paclitaxel, carmustina, etoposido, y camptotecina -y sus congéneres y análogos y combinaciones de ellos .

27. Un método de producción de nanopartículas que no contienen gas , sólidas que comprende : a) combinar una mezcla de Ixpidos para formar una solución; y b) combinar la solución formada en el paso (a) con un medio acuoso para formar una suspensión acuosa; y c) perturbar la suspensión acuosa para formar nanopartículas dentro de dicho medio acuoso.

28. El método de la reivindicación 27, que además comprende remover impurezas del medio acuoso que contiene dichas nanopartículas en el paso (c) .

29. El método de la reivindicación 28 en donde una de las impurezas son partículas indeseables.

30. Un método de tratamiento de un tejido o célula blanco que comprende administrar a dicho tejido o célula blanco una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 14.

31. Un método de tratamiento de un tejido o célula blanco que comprende administrar a dicho tejido o célula blanco una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 24.

32. Un método de tratamiento de un tejido o célula blanco que comprende administrar a dicho tejido o célula blanco una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 25.

33. Un método de tratamiento de un tejido o célula blanco que comprende administrar a dicho tejido o célula blanco una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 26.

34. El producto producido mediante el método de la reivindicación 27.

35. El producto producido mediante el proceso de la reivindicación 28.