KR100809402B1 - 나노 입자 표지, 나노 입자 표지를 이용하는 진단 키트, 및진단 방법 - Google Patents

나노 입자 표지, 나노 입자 표지를 이용하는 진단 키트, 및진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 진단 키트는 나노 입자-생체 물질 복합체, 추출 용액, 포집 전극, 및 전류 피크 측정부를 포함한다. 나노 입자-생체 물질 복합체는 아연, 카드늄, 납, 구리, 갈륨, 비소, 탈륨, 니켈, 망간 및 창연으로 이루어진 메탈 군으로부터 하나 이상 선택되는 나노 입자, 나노 입자와 결합 안정화 물질을 통해 결합되며, 검출하고자 하는 생체 물질과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 생체 결합 물질, 상기 나노 입자와 상기 생체 결합 물질의 결합을 구성하는 결합 안정화 물질을 포함한다. 추출 용액은 나노 입자-생체 물질 복합체로부터 나노 입자를 분리 추출한다. 포집 전극은 추출 용액에서 나노 입자를 포집한다. 전류 피크 측정부는 포집 전극으로부터 포집된 나노 입자로부터 대응하는 전류 피크를 측정한다.
나노 입자, 진단 키트

Description

나노 입자 표지, 나노 입자 표지를 이용하는 진단 키트, 및 진단 방법{NANOPARTICLE MARK, DIAGNOSIS KIT USING THE SAME AND DIAGNOSIS METHOD USING THE SAME}
도 1a는 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자 표지를 이용하여 DNA 를 검출하는 방법을 개략적으로 보여주는 개념도이다.
도 1b는 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자 표지를 이용하여 항원을 검출하는 방법을 개략적으로 보여주는 개념도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자의 제조 방법을 개략적으로 보여주는 개념도이다.
도 3a는 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자-항체 복합체의 제조 방법의 개념도이다.
도 3b는 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자-DNA 복합체의 제조 방법의 개념도이다.
도 4a 는 본 발명의 실시예에 따른 ZnS-anti-β2-MG, CdS-anti-Mb, PbS-anti-HSA 및 CuS-anti-CRP이 질산에 용해시켜 수득되는 전류 피크 및 해당 전류 피크 신호를 디지털 신호로 변환하여 구현된 바코드를 보여주는 그래프이다.
도 4b 는 검출 대상 시료내에 항원이 없는 경우 전류 피크 신호를 보여주는 그래프이다.
도 4c 내지 도 4f 는 검출 대상 시료에 하나의 항원 타겟이 각각 있는 경우의 전류 피크 신호 및 해당 전류 피크 신호를 디지털 신호로 변환하여 구현된 바코드를 보여주는 그래프이다.
도 4g 는 검출 대상 시료에 4 종의 항원 타겟이 있는 경우 전류 피크 신호 및 해당 전류 피크 신호를 디지털 신호로 변환하여 구현된 바코드를 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자 표지를 이용하는 진단 방법을 보여주는 순서도이다.
본 발명은 나노 입자 표지, 나노 입자 표지를 이용하는 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 나노 입자 표지의 산화/환원 능력을 이용하는 전기 화학적 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
최근 프로테오믹(proteomic) 센싱 장치를 이용하여 다양한 질병 상태를 진단하려는 시도가 있어 왔다. 이를 위해 프로테오믹 센싱 장치는 사용자 위주의 간편한 조작, 저렴한 비용의 달성 뿐만 아니라, 우수한 민감도, 선택성 및 재현성을 달성해야 한다.
프로테오믹 센싱 장치는 주로 진단 장치로 이용되며, 그 대표적인 예로 항원 또는 항체를 인지하는 면역 센서가 있다.
이러한 진단 장치는 진단을 위해 소정의 생체 물질(단백질 또는 DNA 등)을 검출할 수 있는 방법을 확립해야 한다. 종래의 생체 물질의 검출 방법으로 유기 염료 등을 이용하는 형광 표지 방법이 알려져 왔다. 형광 표지는 종류에 따라 다양한 색을 발광하여, 목적 생체 물질에 대한 검출 수단을 제공한다.
한편, 다수의 생체 물질을 동시에 검출하고자 하는 경우, 각각 다른 색상으로 발광하는 다수의 형광 표지가 필요하게 된다. 그런데, 이렇게 다수의 색상이 동시에 발광하는 경우, 포토 블리칭(photobleaching) 현상이 발생할 수 있다. 또한, 종래의 형광 표지는 광학적으로 협소한 익사이테이션(excitation)과 에미션 밴드 (emission band)를 갖는 단점이 있고, 생체 물질과 결합하는 경우, 생체 물질의 활성에 부정적인 영향을 끼치기도 하는 등 많은 한계를 갖고 있는 실정이다.
따라서, 이러한 종래의 표지 방법의 문제점을 극복하고, 물리적으로 보다 안정하고 기능적인 표지 방법이 요구되고 있다. 또한, 동시에 다수의 생체 물질을 검출하는 보다 안정적이고 정확한 방법이 요구되고 있다.
한편, 이러한 요구에 따라 최근 반도체 퀀텀닷(semiconductor quantum dot; 이하 'QD'라 함) 나노 입자들을 이용한 표지 방법이 알려지고 있다. 그러나, 종래의 QD 나노 입자들은 형광 표지 물질에 비해 물리적으로는 안정하더라도 표지하고자 하는 생체 물질과의 결합성이 낮고, QD 나노 금속 입자의 표면 가공 상 제약을 극복하지 못하고 있는 형편이다. 따라서 또한 종래의 QD 나노 입자들은 광학 분석법을 위한 표지원으로만 사용되고 있었다.
따라서, 생체 물질과 성공적인 결합이 가능하고, 생체 물질을 용이하게 검출 가능한 신규한 나노 입자를 이용한 표지 방법이 요구된다.
이와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 생체 물질과 결합성이 뛰어나고, 순도가 높으며 물리적으로 안정한 신규한 나노 입자 표지를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 생체 물질과 결합성이 뛰어나고, 물리 화학적으로 안정한 신규한 나노 입자 표지를 이용하는 진단 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 생체 물질과 결합성이 뛰어나고, 물리 화학적으로 안정한 신규한 나노 입자 표지를 이용하는 진단 방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 기술적 과제의 해결을 위한, 본 발명의 한 특징에 따른 나노 입자-생체 물질 복합체는 아연, 카드늄, 납, 구리, 갈륨, 비소, 탈륨, 니켈, 망간 및 창연으로 이루어진 메탈 군으로부터 하나 이상 선택되는 나노 입자, 소정의 생체 물질, 및 일측에 상기 나노 입자와 결합 가능한 전하 특성의 치환기를 가지며, 반대측에 복수의 수용성 치환기를 갖는 고분자 사슬을 가지며, 일측의 치환기를 통해 나노 입자와 결합하고, 반대측의 복수의 수용성 치환기를 통해 나노 입자를 안정화하고, 복수의 수용성 치환기를 통해 상기 생체 물질과 결합을 구성하는 결합 안정화 물질을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 나노 입자를 제조하는 나노 입자 제조 방법은 헥사데칸올, 수산화 칼륨 및 카본 디설파이드를 반응시켜, 헥사데실싼테이트(hexadecyl xanthate; 이하 'HDX'라 함) 칼륨 염을 제조하는 단계, 아연, 카드늄, 납, 구리, 갈륨, 비소, 탈륨, 니켈, 망간 및 창연으로 이루어진 메탈 군으로부터 하나 이상 선택되는 나노 입자를 수득된 HDX 칼륨 염과 반응시켜 HDX 메탈 설파이드 나노 입자를 제조하는 단계, HDX 메탈 설파이드 나노 입자에 소정의 알킬 아민 도판트를 반응 시켜, 메탈 설파이드 나노 입자를 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 진단 키트는 나노 입자-생체 물질 복합체, 추출 용액, 포집 전극, 및 전류 피크 측정부를 포함한다. 나노 입자-생체 물질 복합체는 아연, 카드늄, 납, 구리, 갈륨, 비소, 탈륨, 니켈, 망간 및 창연으로 이루어진 메탈 군으로부터 하나 이상 선택되는 나노 입자, 나노 입자와 결합 안정화 물질을 통해 결합되며, 검출하고자 하는 생체 물질과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 생체 결합 물질, 상기 나노 입자와 상기 생체 결합 물질의 결합을 구성하는 결합 안정화 물질을 포함한다. 추출 용액은 나노 입자-생체 물질 복합체로부터 나노 입자를 분리 추출한다. 포집 전극은 추출 용액에서 나노 입자를 포집한다. 전류 피크 측정부는 포집 전극으로부터 포집된 나노 입자로부터 대응하는 전류 피크를 측정한다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 진단 방법은 검출하고자 하는 하나 이상의 생체 물질과 특이적으로 결합 가능한 하나 이상의 생체 결합 물질을 결정하는 단계, 아연, 카드늄, 납, 구리, 갈륨, 비소, 탈륨, 니켈, 망간 및 창연으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 나노 입자를 선택하여 하나 이상의 생체 결합 물질과 각각 결합하여 하나 이상의 나노 입자-생체 물질 복합체를 형성하는 단계, 하나 이상의 나노 입자-생체 물질 복합체를 진단하고자 하는 시료내에 넣고 혼합하여 검출하고자하는 하나 이상의 생체 물질과 하나 이상의 나노 입자-생체 물질의 결합을 유도하는 단계, 생체 물질과 특이적으로 결합한 나노 입자-생체 물질 복합체를 분리하는 단계, 분리된 나노 입자-생체 물질 복합체로부터 나노 입자를 분리하여 포집하는 단계, 및 포집된 나노 입자에 대응하는 고유한 전류 피크를 측정하는 단계를 포함한다.
아래에서는 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명은 생체 물질에 대한 신호 발생 표지로 사용될 수 있는 신규한 나노 입자 표지를 제공하고자 한다.
본 발명에서 '생체 물질'은 생물체 내에 존재하는 물질로서, 특정 표지로 검출되는 경우 생물학적 용도로 이용가능한 물질을 의미한다. 구체적으로, DNA 또는 RNA와 같은 핵산, 아미노산, 또는 핵산-아미노산의 복합체, 또는 항체 등을 포함한다.
본 발명의 실시예에서는 생체 물질로서, 신장 및 심장 질환 관련 조기 임상 마커(marker)인 인간 혈청 알부민(human serum albumin (HSA)), 인간 마이크로 글로불린 (human β2-microglobulin (MG)), 인간 미오 글로빈 (human myoglobin (Mb)), C-반응성 단백질 (CRP) 등을 포함한다.
본 발명의 실시예에 따른 나노 입자의 검출 방법에 따라, 위와 같은 생체 물질의 농도는 정밀하게 측정될 수 있다. 한편, 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자의 검출 방법을 이용하는 경우, 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자의 검출 방법의 사용자는 측정된 생체 물질의 농도가 소정의 범위를 초과하는지 여부에 따라 소정의 질병의 감염 여부를 검출 대상에게 경고하거나, 소정의 질병에 대한 진단 근거로 사용할 수 있다. 구체적으로, 당뇨병이나 고혈압 등의 특정 질병과 관련된 특정 생체 물질을 본 발명의 나노 입자를 표지로 사용하여 검출할 수 있으며, 이러한 검출 경과는 해당 특정 질병의 진단 자료로서 사용될 수 있음은 자명하다.
본 발명의 실시예에서, 나노 입자 표지로 사용되는 나노 입자는 금속계 나노 입자로서, 해상도 및 신호 선택성이 우수한 금속의 나노 입자이다. 본 발명의 실시예에서 사용되는 나노 입자는 해상도 및 신호 선택성이 우수한 금속이면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 실시예에서 해상도는 금속으로부터 발생되는 신호의 피크 폭이 좁아 다른 신호의 피크와 중첩없이 구별되는 특성을 의미하며, 신호 선택성은 해당 금속으로부터 생성되는 신호 피크가 다른 금속들로부터 생성되는 신호 피크와 구별이 용이하게 나타내어 지는 정도를 의미한다. 즉 해상도가 높은 경우 신호 선택성이 증가된다.
본 발명의 실시예에 따른 금속 나노 입자는 후술되는 본 발명의 실시예에 따른 나노 결정 합성법에 따라 수득되는 금속 설파이드(metal sulfide; 이하 'MS'라 함)이다. 금속 설파이드에 사용되는 금속으로는 본 발명의 실시예에서는 아연(Zn), 카드늄(Cd), 납(Pb), 구리(Cu), 갈륨(Ga), 비소(As), 탈륨(Tl), 니켈(Ni), 망간(Mn) 또는 창연(Bi)이 바람직하게 사용된다. 특히, 아연, 카드뮴, 납, 또는 구리가 보다 우수한 해상도를 갖는 선택적 신호를 생성하므로 바람직하게 사용된다.
이러한 본 발명의 실시예에 따른 금속 나노 입자의 크기는 대부분의 생체 물질들과의 크기 범위와 흡사하여 생체 물질과의 '나노 입자-생체 물질 복합체'의 형성이 용이하다.
본 발명의 실시예에 따른 나노 입자 표지는 생체 물질과 안정적으로 공유 결합을 형성할 수 있다. 이때, 생체 물질로서 인체의 질병 징후를 나타내는 원인 단백질을 탐지하는 특이 항체가 사용될 수 있다. 그후, 금속 나노 입자 표지의 전기 화학적 특성을 이용하여 해당 나노 입자를 검출한다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자 표지를 사용하는 경우, 전기 화학 분석 방법을 통해 수신되는 해당 나노 입자 표지의 신호를 분석하여, 나노 입자 표지와 결합한 특이 항체의 존재를 감지하고, 그에 따라 원인 단백질을 탐지할 수 있게 된다. 이러한 분석의 결과에 따라 원인 단백질을 감지하게 되고, 그 감지 결과에 따라 특정 질병에 대한 징후를 진단하는 것이 가능해진다.
이하 도 1a 및 도 1b를 참조하여, 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자를 표지로 사용하여 특정 생체 물질을 검출하는 방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
도 1a 는 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자 표지를 이용하여 DNA 를 검출하는 방법을 개략적으로 보여준다. 도 1a는 검출 대상이 4 종류의 DNA 절편인 경우 본 발명의 나노 결정 표지를 이용하여 검출하는 방법을 설명한다.
먼저, 검출 대상인 4 종의 DNA 절편(T1, T2, T3 및 T4)에 각각 상보적인 4 종류의 DNA 절편을 구하고, 구해진 4 종류의 DNA 절편에 각각 본 발명의 MS 나노 입자를 각각 결합하였다. 이 때, DNA 절편(T1)에 상보적인 DNA 절편에 ZnS 나노 입자를, DNA 절편(T2)에 상보적인 DNA 절편에 CdS 나노 입자를, DNA 절편(T3)에 상보적인 DNA 절편에 PbS 나노 입자를, 그리고 DNA 절편(T4)에 상보적인 DNA 절편에 CuS 나노 입자를 각각 결합하였다.
다음으로 검출 대상인 4 종의 DNA 절편(T1, T2, T3 및 T4)을 포함하는 시료에 제조된 본 발명의 나노 입자로 표지된 DNA 절편을 첨가하여 DNA 혼성화(hybridization) 반응을 수행시켰다(S100).
이때, 혼성화 되지 않은 DNA 절편을 제거 한 후, 혼성화 된 DNA 절편을 질산 용액에 용해시킨다. 그 후, 질산 용액에 전극을 넣고, 특정 음 전위를 인가하여 양이온의 특성을 갖는 본 발명의 나노 입자들을 포집하였다. 만일 본 발명의 나노 입자로서 음이온 특성을 갖는 나노 입자를 사용하는 경우에는 양 전위를 인가하여 나노 입자를 포집할 수 있다.
이렇게 전극에 포집된 나노 입자들에 나노 입자 검출 방법의 하나로서 전압 스트리핑법을 수행하여, 각 나노 입자에 대응하는 전류 피크를 측정하였다(S200).
다음으로, 각 나노 입자에 대응하는 측정된 전류 피크를 샘플링하여, 디지털 신호로 변환하여 출력하였다(S300).
도 1a 에서는 디지털 신호로서 바코드를 이용한 결과를 보여준다. 이러한 디지털 신호를 해석하여, 해당 디지털 신호에 대응하는 나노 결정을 파악하고, 파악된 나노 결정이 결합한 DNA 절편, 그리고 그에 상보적으로 결합가능한 DNA 절편을 차례로 파악할 수 있다. 따라서, 디지털 신호의 해석으로 검출하고자 하는 DNA 절편이 검출 대상 시료에 해당 디지털 신호가 의미하는 양만큼 존재함을 알 수 있다.
다음으로, 도 1b 는 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자 표지를 이용하여 항원을 검출하는 방법을 개략적으로 보여준다.
먼저, 검색하고자 하는 4 종의 항원(Ag1, Ag2, Ag3, Ag4)과 각각 특이적으로 결합 가능한 4 종의 항체들(Ab1, Ab2, Ab3, Ab4)에 각각 본 발명의 MS 나노 입자를 각각 결합하였다. 이때, 항체(Ab1)에 ZnS 나노 입자를, 항체(Ab2)에 CdS 나노 입자를, 항체(Ab3)에 PbS 나노 입자를, 그리고 항체(Ab4)에 CuS 나노 입자를 각각 결합하였다.
다음으로 검출 하고자 하는 항원을 포함하는 시료에 제조된 본 발명의 나노 입자로 표지된 항체를 첨가하여 샌드위치 면역 반응을 수행하였다(S400).
이때, 항원과 특이적 결합을 수행하지 않은 본 발명의 나노 입자로 표지된 항체들을 제거한 뒤, 결합된 항원-항체 복합체를 질산 용액에 용해시켰다. 그 후, 질산 용액에 전극을 넣고, 특정 음 전위를 인가하여 양이온의 특성을 갖는 본 발명의 나노 입자들을 포집하고, 포집된 나노 입자들에 대하여 특정 벗김 전압을 인가하여 나노 입자별로 고유한 신호 피크를 측정하였다 (S500).
다음으로, 각 나노 입자에 대응하는 측정된 전류 피크를 샘플링하여, 디지털 신호로 변환하여 출력하였다(S600).
이러한 디지털 신호를 해석하여, 해당 디지털 신호에 대응하는 나노 결정을 파악하고, 파악된 나노 결정이 결합한 항체, 그리고 그에 특이적으로 결합가능한 항원을 차례로 파악할 수 있다. 따라서, 디지털 신호의 해석으로 검출하고자 하는 항원이 검출 대상 시료에 해당 디지털 신호가 의미하는 양만큼 존재함을 알 수 있다.
이하, 도 2를 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자의 제조방법을 하여 구체적으로 설명한다. 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자는 높은 수용성을 가지며, 물리 화학적인 안정성을 가지며, 생체 물질과의 높은 생물 호환성을 나타낸다.
본 발명의 실시예에 따른 나노 입자의 제조 방법은 금속의 헥사데실싼테이트 (hexadecyl xanthate; 이하 'HDX'라 함) 칼륨 염 제조 단계(S700), 메탈 설파이드 나노 입자 합성 단계(S800) 및 나노 입자의 표면 안정화 캡핑(capping) 단계(S900)를 포함한다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자의 제조 방법을 개략적으로 보여주는 개념도이다.
먼저, HDX 칼륨 염 제조 단계(S700)에 대하여 설명한다. 본 실시예에서HDX 는 금속 나노 입자들을 안정적으로 캡핑하여, 메탈 설파이드를 생성케한다. 도 2 에서는 나노 입자를 위한 금속으로 아연, 카드뮴, 납 및 구리를 사용하였다.
먼저, 동일 농도 0.04 몰의 헥사데칸올 (hexadecanol) 9.69 g과 수산화 칼륨 (KOH) 2.24 g을 혼합하고, 혼합된 용액이 전부 용해될 때까지 150 ℃의 온도에서 가열하였다. 혼합 용액을 100 ℃의 온도에서 25 ml의 톨루엔에 넣고 균일하게 교반하였다. 그 후, 카본 디설파이드(carbon disulfide) 4.41 g을 상온에서 미량으로 조금씩 첨가하여 노란색 용액을 수득하였다. 그 후, 다시 1 시간 동안 강하게 교반시킨 후, 용액을 100 ml의 페트로리움 에테르(petroleum ether)에 넣고 2 시간 동안 추가 교반하였다. 그 후, 용액을 유리필터 (glass funnel)로 필터링하고, 에테르로 세척하는 단계를 수회 반복하여 최종 산물로서 HDX 칼륨염을 수득하였다. 구체적으로, HDX 칼륨염을 진공 오븐에서 완전히 건조시키고 다시 20 ml의 차가운 증류수로 세척한 후, 다시 유리필터로 필터링하고 다시 건조하고, 에테르로 세척한 후, 메탄올로 3번 세척하고 다시 건조하여 최종 산물로서 HDX 칼륨염을 수득하였다.
본 실시예에서는 앞서 서술한 바와 같은 다단계의 필터링 및 세척 과정을 통하여 그 입자가 균일하고, 용해도와 순도가 높은 HDX 칼륨 염(C16CH2CH2OCS2 -)을 수득할 수 있었다.
다음으로, 메탈 설파이드 나노 입자의 합성(S800) 및 표면 안정화 단계(S900)에 대하여 설명한다.
앞서 수득된 HDX 칼륨염(C16CH2CH2OCS2 -)을 저온 침적 (decomposition)하였다.그후, HDX 칼륨염 3.56 g을 5 ml의 메탄올에 용해시키고, HDX 칼륨염을 동일량의 몰의 CdCl2, PbCl2, ZnCl2, CuCl2 수용액과 각각 2분간 반응시켰다. 반응 후, 혼합 용액을 원심분리한 후, 상층액을 제거하여 금속 HDX 형의 메탈 설파이드 나노 입자를 수득하였다(S800). 수득된 금속 HDX를 메탄올로 세척한 후, 진공 오븐에서 건조하였다.
그 후, 수득된 금속 HDX를 알킬 아민 도판트(alkyl amine dopants)와 혼합시켰다. 알킬 아민 도판트는 강력한 전자 기여 능력을 갖고, 금속 HDX 단일층을 안정화시키는 것으로 생각된다. 본 발명의 실시예에서 사용되는 알킬 아민 도판트로는 강력한 전자 기여 능력을 갖고 금속 HDX를 안정화시킬 수 있는 것이면 크게 제한되지 않으나, 헥사데실아민 (Hexadecylamine, 이하 'HDA'라 함), 데실아민 (decylamine, 이하 'DA'라 함), 트리옥틸아민(trioctylamine, 이하 'TOA'라 함)이 바람직하게 사용된다. 구체적으로 본 실시예에서는 Zn-HDX, 및 Cd-HDX에 대해서는 HDA가 사용되고, Pb-HDX 에 대해서는 TOA 및 DA가 사용되고, Cu-HDX 에 대해서는 TOA 및 HDA가 사용되었다.
알킬 아민 도판트는 금속 HDX과의 혼합 이전에 먼저, 120 ℃까지 가열되고 50 ℃까지 냉각시켰다. 그 후, 균일하게 교반하면서 금속-HDX 분말 0.05 g을 첨가하였다. 그 후, 100 ℃로 가열하면서 30 분간 교반한 후, 온도를 서서히 120 ℃까지 올리고 1.5 시간 동안 반응을 지속시켰다. 140 ℃에서 2분간 최종반응을 마친 후, 서서히 70 ℃까지 온도를 하강시켰다.
얻어진 최종 금속 결정입자들은 각각 흰색의 ZnS 나노 결정 입자, 황색의 CdS 나노 결정 입자, 검정색의 PbS 나노 결정 입자, 그리고 청록 색의 CuS 나노 결정 입자이며, 이들은 메탄올에 의해 프로컬레이션 (flocculation) 되어 손쉬운 추출을 위해 시험관 바닥에 침전되었다. 그후, 원심 분리 및 상층액 제거 과정을 여러 번 수행하고, 상온에서 건조하여 고운 분말형태의 최종 나노결정입자를 수득하였다.
다음으로, 도 3을 참조하여 수득된 나노 입자을 표지로 사용하여 소정의 생체물질과 결합시켜 수득되는 나노 입자-생체 물질 복합체의 제조 방법을 구체적으로 설명한다. 본 실시예에서는 생체물질로서 anti-Mb, anti-HSA, anti-β2-MG, anti-CRP 항체를 이용하였다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자-생체 물질 복합체의 제조 방법을 개념적으로 보여주는 개념도이다.
도 3a는 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자-항체 복합체의 제조 방법을 개념적으로 보여준다. 도 3b는 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자-DNA 복합체의 제조 방법을 개념적으로 보여준다.
나노 입자-생체 물질 복합체의 제조 방법은 앞에서 수득한 금속 나노 입자(MS)들을 안정화 물질과 함께 반응시켜 안정화 하고, 활성화 물질로 활성화한 후 생체 물질을 반응 시켜 나노 입자-생체 물질 복합체를 수득한다.
본 발명의 실시예에서 사용되는 안정화 물질은 나노 입자를 화학적 물리적으로 안정화시키고, 나노 입자의 용해도를 증진시켜 생체 물질에 대한 생체 호환성을 증가시켜, 나노 입자-생체 물질 복합체를 안정화에 기여한다. 구체적으로 안정화 물질은 일측에 나노 입자와 결합 가능한 화학적 치환기를 가지며, 반대측의 복수의 수용성 치환기를 갖는 고분자 물질로 구성되며, 일측의 화학적 치환기로 나노 입자를 둘러싸 결합하고, 반대측의 수용성 치환기를 통해 수용성 매질로부터 나노 입자를 보호하여 나노 입자의 안정성을 담보한다. 또한, 반대측의 수용성 치환기 중 일부를 통해 생체 물질과 공유 결합을 이루어 나노 입자와 생체 물질간의 결합을 촉진한다.
본 발명의 실시예에서 안정화 물질은 바람직하게는 다이티올쓰레이톨 (dithiolthreitol, 이하 'DTT'라 함) 또는 다이하드로 리포익산(dihydrolipoic acid; 이하 'DHLA'라 함)를 사용한다. 이와 같은 DTT나 DHLA 는 그 표면 화학적 특성 및 높은 수용액에 대한 용해도로 나노 입자를 현저히 안정화시킨다. 구체적으로 DTT 는 그 분자 구조상의 티올(-SH) 화학 그룹에 의해 나노 입자 표면을 나노 수준에서 강하고 균일하게 둘러싸, 나노 입자의 안정적인 구조를 유지하는 동시에, 나노 입자 표면에 히드록실 (hydroxyl) 그룹을 생성시켜, 나노 입자의 수용성을 증진 시킨다. 여기서, 안정화 물질은 티올(-SH) 기의 음 전하적 특성을 이용하여 양 전하적 특성을 갖는 나노 입자를 균일하게 둘러싸 결합하는 것으로 생각된다. 따라서, 안정화 물질로서 일측에 음 전하적 특성을 갖는 치환기가 다수 존재하여 나노 입자를 균일하게 감싸 나노 입자를 안정화하고, 타측에 수용성 치환기를 다수 존재하여 나노 입자의 수용성을 증진시키는 물질이 바람직하게 사용된다. 본 발명의 실시예에서는 음 전하적 특성을 가지는 치환기로서 티올(-SH)기를 예로 들었으나, 기타 음 전하적 특성을 가지는 치환기도 사용될 수 있으며, 구체적인 예로서 수산화기(-OH)도 사용될 수 있다고 생각된다. 본 실시예는 양 전하 특성을 가지는 나노 입자를 사용하고 있으므로, 음 전하적 특성을 가지는 안정화 물질이 바람직하나, 음 전하적 특성을 가지는 나노 입자를 사용하는 경우에는 양 전하 특성을 가지는 치환기를 가지는 안정화 물질이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에서 사용되는 활성화 물질은 안정화 물질의 활성화를 유도하여 생체 물질의 아미노 그룹과 카바메이트 (carbamate) 결합을 형성할 수 있게한다. 본 발명의 실시예에서 활성화 물질은 바람직하게는 카보닐 다이이미다졸 (1,1-carbonyl diimidazole, 이하 'CDI'라 함)을 사용하였다.
도 3a를 참조하여 나노 입자-항체 복합체의 제조 방법을 살펴보면, 나노 입자를 DTT와 함께 12 시간 동안 교반하여 수산화(hydroxylated)한 후(S1000), CDI로 활성화하였다(S1100). 이렇게 활성화된 금속 나노 입자(CdS, PbS, ZnS, CuS)들을 각각 100 ㎕ 의 anti-Mb, anti-HSA, anti-β2-MG, ant-CRP (240 M in 20 mM 인산수용액 (PBS), pH 7.4)과 상온에서 24 시간 동안 교반하여 반응시켰다(S1200). 반응 후, 미반응 항체들을 다이옥산(dioxane)으로 제거하였다. 최종 결과물을 0.1 M PBS (pH 7.4, 0.05% Tween 20)에 분산 시켰다.
도 3a 에서, MS QD-Ab는 메탈 설파이드 퀀텀 닷 나노 입자가 DTT를 통해, 항체와 결합한 모양을 개념적으로 보여준다.
도 3b를 참조하여 나노 입자-DNA 복합체의 제조 방법을 살펴보면, 나노 입자를 DTT와 함께 12 시간 동안 교반하여 수산화(hydroxylated)한 후(S1300), CDI로 활성화하였다(S1400). 이렇게 활성화된 금속 나노 입자(CdS, PbS, ZnS, CuS)들을 각각 100 ㎕ 의 4 종류의 아미노-DNA와 상온에서 24 시간 동안 교반하여 반응시켰다(S1500). 반응 후, 미반응 DNA 절편들을 제거하여 나노 입자-DNA 복합체를 수득하였다.
도 3b 에서, MS QD-DNA는 메탈 설파이드 퀀텀 닷 나노 입자가 DTT를 통해, DNA와 결합한 모양을 개념적으로 보여준다.
도 3a 및 3b 에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자는 CDI를 통해 활성화된 DTT를 통해 항체 또는 DNA와 같은 생체 물질과 안정적으로 결합한다.
이하, 본 발명의 실시예에 따른 생체 물질과 결합한 나노 입자 표지를 검출할 수 있는 검출 방법에 대하여 설명한다.
본 발명의 실시예에서는 나노 입자 표지의 검출 방법으로 전기 화학적 분석 방법을 이용한다. 본 발명에서 사용되는 전기 화학적 분석 방법은 수용액 상에서 수행되어, 전위, 전류, 전기 전도도, 임피던스, 커패시턴스 또는 저항등을 측정하는 것으로서, 소형화 및 신속한 신호처리가 가능하여 소규모 어레이 분석에 유용하다.
본 발명의 실시예에서는 전기 화학적 분석 방법 중에서 특히 스퀘어 웨이브 음극 스트리핑 전압법을 이용하였다.
본 발명의 실시예서 사용된 스트리핑 전압법은 크게 두 단계로 구성된다. 먼저, 나노 입자 표지로 표지된 생체 물질들을 소정의 수용액에 넣고, 전극을 위치시키고, 전극을 통해 특정 전위를 인가한다. 인가된 전위에 따라 나노 입자 금속들은 해당 전극 방향으로 이동하여 해당 전극 표면에 포집된다. 다음으로, 해당 전극에 포집된 나노 입자 금속에 소정의 전위를 가하여 특정 전류를 도통하게 한다. 이때, 각 나노 입자 금속들은 산화 및 환원 반응에 의해 각 나노 입자의 금속의 종류에 따라 특정 피크의 전류를 발생하게 되는데, 이러한 특정 피크의 전류를 측정하여, 나노 입자 표지의 존재 및 그 농도를 측정한다.
본 발명의 실시예에 따른 스트리핑 전압법에 의한 나노 입자 표지 검출 방법은 피코몰(picomolar) 수준의 높은 측정 한계를 제공한다. 이러한 측정한계는 본 발명의 실시예에 따른 고순도의 나노 입자를 사용함으로써 달성된다. 또한, 본 발명의 실시예에 따른 나노결정 입자의 크기를 촉매적으로 조절하여 센서 신호의 민감도를 월등히 향상시키는 것이 가능하다.
본 발명의 실시예에 따른 나노 입자를 이용하여 다수의 생체 물질을 동시에 검출하고자 하는 경우, 각 생체 물질에 대하여 각각 상이한 금속 나노 입자를 사용한다. 이 경우, 각 나노 입자는 금속의 종류에 따라 특정한 전류 피크를 나타내어, 다수의 생체 물질을 동시에 검출할 수 있게 한다.
본 발명의 실시예에서 전기 화학적 검출 방법으로 사용된 스퀘어 웨이브 음전극 스트리핑 전압법은 GPES 소프트웨어로 운용되는 Autolab 12 (Eco Chemie, Netherlands)에서 수행되었다. 분석을 위해, 1.5 ml 유리셀(glass cell)에서 2×4mm 크기의 스크린 프린팅 카본 작업전극 (Acheson-ink), Ag/AgCl 기준 전극(CH Instruments, Austin, TX), 및 백금 카운터 전극(CH Instruments, Austin, TX)을 사용하였다. 구체적으로, 검출 프린팅 카본 전극으로 수은(II)이온이나 비스무스 이온이 코팅된 전극을 이용하였다. 모든 원심분리 과정은 Micromax centrifuge (Thermo IEC, MA)을 이용하여 수행되었다.
본 발명의 실시예에 적용되는 스퀘어 웨이브 음전극 스트리핑 전압법을 구체적으로 설명한다.
먼저, 나노 입자 표지로 표지된 생체 물질들을 질산 수용액에 녹인 후, 질산 수용액에 전극을 위치한다.
그 후, 전극을 통해 1분간 0.6 V를 인가하여 전처리하고, 2 분 동안 음 전위로서 -1,4 V를 인가하여 전극 측으로 금속 나노 입자들을 포집한다. 이때 1ml 의 0.1M 아세테이트 버퍼 (pH4.5)를 사용한다. 그후, 5 초 휴지기 후에 스트리핑 전압을 인가하여 각 금속 나노 입자로부터 생성되며, 각 금속 입자에 고유한 전류 피크를 측정한다. 스트리핑 전압 인가는 구체적으로 1.2 V ~ 0.12 V의 전위범위에서 스텝 전위 (step potential) 50 mV, 크기 20 mV 그리고 주파수 25 Hz로 수행한다. 얻어진 커브들의 베이스라인의 교정은 GPES 소프트웨어의 'moving average' 모드에서 전환된다. 모든 최종 결과들은 소프트웨어 자체내의 'background subtraction' 옵션을 통해 저장된다.
도 4a 내지 4g 는 본 발명의 실시예에 따라, 전기 화학적 검출 방법으로 4 종의 항원을 검출하는 과정을 보여준다.
도 4a는 본 발명의 실시예에 따른 ZnS-anti-β2-MG, CdS-anti-Mb, PbS-anti-HSA 및 CuS-anti-CRP을 질산에 용해시켜 수득되는 전류 피크를 나타내며, 이러한 도 4a 의 전류 피크는 전기 화학적 검출 방법으로 수득된 전류 피크를 해석하는 기준이 된다.
도 4b 는 검출 대상 시료내에 항원이 없는 경우 전류 피크 신호 및 해당 전류 피크 신호를 디지털 신호로 변환하여 구현된 바코드를 나타낸다.
도 4c 내지 도 4f 는 검출 대상 시료에 하나의 항원 타겟이 각각 있는 경우 전류 피크 신호 및 및 해당 전류 피크 신호를 디지털 신호로 변환하여 구현된 바코드를 나타낸다.
도 4g 는 검출 대상 시료에 4 종의 항원 타겟이 있는 경우 전류 피크 신호 및 해당 전류 피크 신호를 디지털 신호로 변환하여 구현된 바코드를 나타낸다.
도 4c 내지 도 4g 바코드 및 바코드 밑의 숫자는 항원 타겟의 농도를 나타낸다.
도 4a에서 볼 수 있는 바와 같이, 각 나노 입자(ZnS, CdS, PbS 및 CuS)로 표지된 항체는 서로 확연히 구별되는 전류 피크를 갖으며, 각 항원(Ag1, Ag2, Ag3, Ag4)에 각각 결합된 후에도 그 전류 피크가 변하지 않음을 알 수 있다. 따라서, 수득되는 전류 피크로부터 검출 대상 시료내에 포함된 각 항원을 정량적으로 검출할 수 있다. 이때, 각 항원에 결합한 각 금속 이온들에 의한 전류 피크들은 아연-항원(Ag1)(ZnS-anti-β2-MG)의 경우 -1.12V, 카드뮴-항원(Ag2) (CdS-anti-Mb)의 경우 -0.68V, 납-항원(Ag3)(PbS-anti-HSA)의 경우 -0.53V, 그리고 구리-항원(Ag4)(CuS-anti-CRP)의 경우 -0.13V 의 전압범위에서 나타났다.
이와 같은 본 발명의 실시예에서 적용된 음극 스트리핑을 이용하는 전압 스트리핑법에서는 나노 입자로서 전위 금속을 이용한 나노 입자들이 선택적 분석이 용이한 전류 피크 신호를 도출하였다. 본 발명의 실시예에 적합한 나노 입자로서 적합한 전위 금속의 선정은 음극 전압 구간에서 서로 중첩되지 않으며 현저한 전류 피크를 갖는 금속을 선정하였다. 음극 스트리핑 법을 이용하기 위해서는 양극성 전위 금속이 바람직하였다. 그러나, 양극 스트리핑 법을 이용하는 경우, 음극성 전위 금속이 바람직하게 사용할 수 있게 된다.
이렇게 양극 및 음극을 동시에 이용하여 각 전극마다 고유의 전류 피크를 생성하는 나노 금속을 이용하는 경우 더욱 많은 금속을 나노 입자으로 이용할 수 있게 된다. 결과적으로 더 많은 수의 생체 물질을 동시에 검출하는 것이 가능하게 된다.
이렇게 수득된 전류 피크는 아날로그 디지털 변환부에서 소정의 디지털 변환 방법에 따라 디지털화될 수 있다. 구체적으로, 수득된 아날로그 타입의 전류 피크는 샘플링되어 대응하는 디지털 신호로 출력된다. 디지털 변환 방법으로 전류 피크 신호들의 신호 값의 대입을 통한 디지털화(digitization) 과정과 노말리제이션(normalization) 과정을 포함한다. 디지털화는 통계적 다봉 분할(statistical optimal threshold)과 피스와이스 선형 인터폴레이션(piecewise linear interpolation)에 의해 수행된다.
그 결과 획득된 전류 피크 신호들은 그 크기와 트렌드에 따라 디지털 신호로 변환되어, 유선 또는 무선 통신 수단을 통해 원격지로 전송되거나, 소정의 디지털 문자로 저장될 수 있다. 이러한 디지털 문자의 구체적인 예로서 바코드를 들 수 있다.
도 4b 내지 4g 는 전류 피크 신호가 변환된 바코드를 보여준다. 도 4b는 전류 피크가 검출되지 않을 때, 바코드를 보여주며, 도 4c 내지 4f는 각각 나노 입자-항체 복합체인 ZnS-Ag1, CdS-Ag2, PbS-Ag3 및 CuS-Ag4가 검출되었을 때, 측정된 전류 피크 신호를 바코드로 변환한 예를 보여준다. 도 4g는 4 종류의 나노 입자-항체 복합체 ZnS-Ag1, CdS-Ag2, PbS-Ag3 및 CuS-Ag4 모두가 동시에 검출되었을 때 측정된 전류 피크 신호를 바코드로 변환한 예를 보여준다. 도 4b 내지 4g 에서 도시된 바코드에서 4 자리 숫자는 각각 Zn, Cd, Pb 및 Cu 의 고유 전류 피크에 대응하며, 그 크기는 측정된 전류 피크의 크기에 대응한다. 따라서, 도 4b 내지 4g 에서 도시된 바코드로부터 해당 하는 나노 입자의 존재 및 그 함량을 알 수 있으며, 그로부터 해당 나노 입자와 복합체를 형성한 항체의 존재 및 그 함량을 측정할 수 있다.
이렇게 디지털화된 신호는 소정의 디지털 리더장치 또는 바코드 리더장치에 의해 읽혀지고 소정의 저장 매체에 저장될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 진단 키트가 병원에서 사용되는 경우, 각 환자에 대한 진단 결과는 디지털 화되어 병원의 환자 샘플 데이터베이스에 저장될 수 있다.
게다가 각 생체분자 (단백질, DNA, RNA, cells) 마커 개체들의 바코드 밴드 폭은 최근 각광받는 무선 IT 기술인 부호 다중화(Code Division Multiple Access; 이하 'CDMA'라 함)나 유비쿼터스 기술에 접목시켜 무선 의료 진단 통신기기와 합체될 수 있다.
이와 같은 본원 발명의 전기 화학적 분석법은 안정적인 결과를 보여준다. 전기 화학적 분석 법의 안정성을 5번에 걸친 반복 테스트를 통해 평가하였다. 하기 표 1에서 도시된 바와 같이, 100 ng/ml (level 4) 의 농도로 서로 다른 4개의 항원을 포함한 시료에서 매우 높은 재현성을 나타내었다.
Figure 112007008799790-pat00001
표 1 은 아연 나노 입자, 카드뮴 나노 입자, 납 나노 입자, 및 구리 나노 입자에 각각 결합한 항원(Ag1, Ag2, Ag3, Ag4)들이 각각 9.3 %, 7.1%, 11.2%, 및 10.3%의 상대 기준 변이(relative standard deviation; 이하 'R.S.D'라 함)를 나타냄을 보여준다.
이하, 도 5를 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자 표지를 이용하는 진단 방법에 대하여 설명한다.
도 5는 본 발명의 실시예에 다른 나노 입자 표지를 이용하는 진단 방법의 순서도를 보여준다.
먼저, 진단하고자 하는 목적에 맞도록 검출하고자 하는 생체 물질을 선정한다(S2100). 예를 들어, 특정 질병을 진단하고자 하는 경우, 해당 특정 질병으로 인해 발생하는 특이 단백질을 선정한다.
다음으로, 검출하고자 하는 생체 물질과 특이적으로 결합 가능한 생체 결합 물질을 선정한다(S2200). 예를 들어, 특정 항원을 검출하고자 하는 경우 해당 특정 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 생체 결합 물질로 선정한다.
그후, 생체 결합 물질에 본 발명의 실시예에 따라 수득된 나노 입자를 결합시켜, 나노 입자-생체 물질 복합체를 형성한다(S2300). 이러한 나노 입자-생체 물질 복합체의 형성 방법은 앞서 상세히 기재되었으므로 여기서는 생략한다.
형성된 나노 입자-생체 물질 복합체를 생체 물질을 검출하고자 하는 시료내에 혼합하여 검출하고자 하는 생체 물질과 나노 입자-생체 물질 복합체의 결합 반응을 유발한다(S2400).
결합 반응 후, 검출하고자 하는 생체 물질과 특이적으로 결합한 나노 입자-생체 물질 복합체를 분리 동정한다(S2500).
분리된 나노 입자-생체 물질 복합체를 질산 수용액등의 용액에 용해시켜, 나노 입자를 분리하고(S2600), 전기 화학적 분석 방법을 통해 나노 입자에 대해 고유한 전류 피크를 측정한다(S2700). 이러한 전기 화학적 분석 방법은 앞서 상세히 기재되었으므로 여기서는 생략한다.
그후, 측정된 나노 입자에 대응하는 전류 피크를 분석하여, 해당 나노 입자의 정체를 추정하고(S2800), 추정된 나노 입자로부터 나노 입자와 결합한 생체 물질을 추정한다(S2900). 추정된 생체 물질의 유무 및 생체 물질의 농도등을 이용하여 특정 질병등의 발명 여부를 진단한다.
이하, 본 발명의 실시예에 따른 진단 방법의 한 구현예로서, 다수의 항체 및 각각의 항체에 대응하는 나노 입자 표지를 사용하여 수행한 마이크로 어레이 면역 분석법을 구체적으로 설명한다.
먼저, BD BioCoat streptavidin 분석 플레이트가 평형에 도달할 때까지 PBST (phosphate buffer saline containing 0.05 (v/v) Tween 20, pH 7.2) 버퍼 100 ㎕ 을 각 웰(well)에 약 15 분 동안 분주하였다. 그 후, 각 웰들을 100 ㎕의 TTL 버퍼(100 mM TrisHCl, pH 8.0, 0.1% Tween and 1 M LiCl)로 세척하였다. 앞서 수득된 나노 입자 표지 항체들을 각각 1000 mg/l 농도로 4 ㎕씩 준비하여 84 ㎕ TTL 버퍼와 혼합시키고 30 분 동안 상온에서 쉐이킹(100 rpm)하며 인큐베이션시켰다. 그 후, 상등액을 흡출(aspiration)하여 제거하고, 각 웰들을 100 ㎕ TTL 버퍼 (250 mM TrisHCl, 0.1% Tween 20)로 두번 세척하였다.
다음, 상이한 농도의 4 종의 항원을 5 ㎕ 씩 취하여 80 ㎕ TTL 버퍼 (750 mM NaCl, 150 mM sodium citrate)에 첨가하고 캡쳐 항체가 고정된 마이크로웰에 분주한 후, 30분 동안 인큐베이션시켜, 각 항원을 대응하는 캡쳐 항체와 반응시킨 후, 각 웰들을 다시 100 ㎕ TTL 버퍼로 세척하였다.
그 후, 앞서 전처리된 나노 입자 표지된 항체들을 100 ㎕ TTL 버퍼에 용해시키고, 나노 입자 표지 용액을 항원들이 캡쳐된 웰에 첨가하고, 30 분 동안 인큐베이션 하여 항원 항체 반응시킨 후, 100 ㎕ TTL 버퍼로 세척하였다.
하기 표2는 사용된 각 항원( β2-MG, Mb, HSA, CRP)에 각각 대응하는 캡쳐 항체(anti-β2-MG, anti-Mb, anti-HSA, anti-CRP) 및 나노 입자 표지 항체(ZnS-anti-β2-MG, CdS-anti-Mb, PbS-anti-HSA, CuS-anti-CRP)를 나타낸다. 여기서 캡쳐 항체(anti-β2-MG, anti-Mb, anti-HSA, anti-CRP)들은 바이오티닐화 되었다.
Figure 112007008799790-pat00002
그 후, 20 ㎕, 1 M 질산 수용액을 이용하여 3 분간 교반하여, 웰에 결합된 나노 입자 항체들을 용해시킨 후, 용출된 나노 입자 표지에 10ppm의 본 실시예에서 사용되는 4 가지 금속 모두를 측정할 수 있는 수은 원자 흡광 기준 용액을 포함 하는 1ml 아세테이트 버퍼(0.1 M, pH 4.5,)를 첨가하고, 앞서 설명한 전기 화학 법을 이용하여 각 금속 나노 입자로부터 각 나노 입자에 고유한 전류 피크를 각각 측정하였다.
앞서 표1로부터 알 수 있는 바와 같이, ZnS-anti-β2-MG의 검출 한계는 10.6ng/ml, CdS-anti-Mb의 검출 한계는 9.5 ng/ml, PbS-anti-HSA의 검출 한계는 9.8 ng/ml, 그리고 CuS-anti-CRP의 검출 한계는 12.1 ng/ml로서 본 발명의 실시예에 따른 전기 화학 분석법의 검출 한계가 매우 낮음을 알 수 있다.
따라서, 전형적인 프로테인유리아 (Proteinuria) 환자의 소변에서 검출되는 단백질 농도범위인 40-120 mg/l 가 진단에 있어 위험수위를 경고하는 범위라고 볼 때, 본 발명의 나노 입자 표지를 사용하는 경우 그 측정 한계는 상기 농도 범위 보다 훨씬 아래 이므로, 아주 미세한 농도의 질병인자까지도 검출가능함을 알 수 있다.
이와 같은 센서성능은 DNA를 분석 물질로 하였을 경우에도 거의 유사하게 나타난다. 즉, 방광암, 유방암 등을 유발하는 암유전자를 검출가능한 프로브에 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자를 표지로 결합시킨 후 사용하는 경우, 높은 수준으로 진단할 수 있다.
한편, 더욱 높은 민감도를 위해 크기와 모양이 좀더 크게 조절된 바이메탈(bimetallic) 나노 입자 (예, CdS/ZnS core/shell 구조)를 사용할 수 있다. 바이 메탈 나노 입자는 두 종류의 나노 입자들이 서로 결합하여 이루어지며, 구체적으로 하나의 나노 입자들의 표면(core)에 다른 종류의 나노 입자들을 첨가적으로 도포(shell) 함으로써 확장된 크기의 합금 입자 구조를 형성한다. 바이 메탈 나노 입자로는 CdS/ZnS, CdS/Pbs, 또는 CuS/ZnS 를 포함하며 모두 core/shell 구조를 형성한다.
앞서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 나노 입자 표지를 신호 발생 표지로 이용하여 검출 하고자 하는 생체 물질을 정량 분석하는 방법을 제공한다. 이렇게 특정 시료 내에서 항체 또는 DNA와 같은 특정 생체 물질을 정량적으로 검출함으로써 검출 대상에 특정 질병의 존재 유무를 진단하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명의 나노 입자 표지, 나노 입자 측정 수단 및 측정 결과 디지털 변환 수단을 포함하는 특정 질병에 대한 진단 키트를 구성할 수 있다. 이때, 앞서 소개한 바와 같이, 바코드 등과 같은 디지털 수단을 이용하는 경우, 이러한 질병 진단이 보다 용이하게 수행될 수 있다.
본 발명의 진단 키트의 나노 입자 표지는 특정 생체 물질을 검출 하기 위한 또 다른 생체 물질에 결합되어진 나노 입자를 의미한다. 구체적으로 특정 DNA 절편을 검출하기 위해, 그 특정 DNA 절편과 상보적인 DNA 서열을 갖는 DNA 절편과 결합된 나노 입자를 의미한다. 또다른 예로서, 특정 항원을 검출하기 위해, 그 특정 항원과 특이적으로 결합하는 특정 항체에 결합된 나노 입자를 의미한다.
이러한 본 발명의 진단 키트의 나노 입자 표지는 측정하고자 하는 생체 물질의 종류에 따라 교체되어 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 진단 키트에서, 나노 입자 표지의 교체만으로, DNA 및 RNA 분자 (염기서열분석을 통한 돌연변이예측), 펩티드, 암 마커(cancer marker), 약물 (마약), 미생물 (O157균, 식중독균, 매독균) 등의 다양한 의학/생물학적 진단이 가능하다.
본 발명의 진단 키트의 나노 입자 측정 수단은 앞서 설명한 전기 화학적 분석 방법을 구현할 수 있는 수단이면 크게 제한되지 않는다.
그리고, 본 발명의 진단 키트의 측정 결과의 디지털 변환 수단은 앞서 설명한 바와 같이 바코드로 출력하는 수단일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, GSM(Global System for Mobile), 블루투스, 유비쿼터스, CDMA(Code Division Multiple Access) 등의 첨단 무선 모바일 IT 기술에 통합될 수 있다.
이와 같이 특정 시료에 대한 진단 결과가 바코드로 출력되는 경우, 진단 키트의 이용자는 출력된 바코드를 병원 등에 설치되어진 바코드 리더기로 읽어 진단 결과를 신속하게 알 수 있다. 이렇게 진단 결과가 디지털로 출력되는 경우, 진단 결과는 유선 통신 또는 무선 통신을 통해 원격지로 송신될 수 있다. 따라서, 진단 결과를 평가할 수 있는 시스템을 갖는 원격지는 진단 키트으로부터 출력된 진단 결과를 수신하여 특정 시료에 대한 진단 결과를 평가하고, 그 평가 결과를 다시 진단 키트 사용자에게 송신하도록 구현될 수 있다. 이렇게 되는 경우, 본 발명의 진단 키트는 의학적, 임상적 응용뿐만 아니라, 다양한 프로브의 교체를 통해 수질, 식품 등의 환경모니터링 및 생물학전, 테러(TNT) 와 범죄(마약) 등의 분야에서 감시 시스템에 적용될 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자 표지는 합성이 간편하고 각 금속 나노 입자 마다 고유한 산화 환원 전위를 갖고 있어 동시에 다수의 나노 입자 표지를 검출이 가능하다. 따라서, 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자 표지를 이용하는 경우 다수의 생체 물질 검출 및 진단 키트의 소형화가 가능하게 된다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
이렇게 본 발명의 나노 입자 표지를 이용한 생체 물질 검출 및 진단 키트는 각 나노 입자의 금속에 고유한 전류 피크를 해석하여 검출하고자 하는 생체 물질을 간편하고, 정량적으로 정확하게 측정하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 나노 입자 진단 키트는 신속, 간편한 검출 결과 및 진단 결과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명의 나노 입자 표지를 이용한 생체 물질 검출 및 진단 키트의 검출 한계는 매우 낮아, 미량의 환자시료 (소변, 혈액, 체액) 에 함유된 생체 물질(항원 또는 DNA)라도 정확하게 측정할 수 있어 진단 키트의 소형화가 가능하다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 나노 입자를 표지로 사용하는 진단 키트는 인체의 질병 (당뇨병, 신장병, 심장질환, 암 등)을 전기화학적으로 신속하고 간편하게 진단할 수 있다.

Claims (24)

  1. 나노 입자 표지를 이용하여 소정의 생체물질을 검출하는 진단키트에 있어서,
    아연, 카드뮴, 납, 구리, 갈륨, 비소, 탈륨, 니켈, 망간 및 창연으로 이루어진 메탈군으로부터 하나 이상 선택되는 나노 입자, 상기 소정의 생체물질과 특이적으로 결합하기 위한 생체결합물질 및 일측으로 전하 특성의 치환기로 나노입자와 결합하며 반대측으로 복수의 수용성 치환기를 가지는 고분자 사슬로 상기 생체결합물질과 결합하는 결합안정화물질을 포함하는 나노 생체 물질 복합체;
    추출용액에 의해 상기 나노 생체 물질 복합체로부터 분리되어진 나노입자와 대항되는 전하적 특성으로 포집하는 포집전극;
    포집된 상기 나노 입자에 대응하는 전류 피크를 아날로그로 측정하는 전류 피크 측정부;
    을 포함하는 진단 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노 입자가 메탈 설파이드 형인 진단 키트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 나노 입자가 아연, 카드뮴, 납 및 구리로 이루어진 메탈 군으로부터 하나 이상 선택되는 진단 키트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 생체 결합 물질이 핵산 또는 항체인 진단 키트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 결합 안정화 물질이 다이티올쓰레이톨 또는 다이하드로 리포익산인 진단 키트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 전류 피크 측정부에 의해 측정된 전류피크를 디지털 신호로 변환하기 위한 아날로그 디지털 변환부를 추가 포함하는 진단 키트.
  7. 제1항에 있어서,
    아연, 카드늄, 납, 구리, 갈륨, 비소, 탈륨, 니켈, 망간 및 창연으로 이루어진 메탈그룹에서 선택된 4 이상의 각기 다른 나노 입자를 이용하여 제조된 각기 다른 나노입자-생체 물질 복합체를 사용하여 4 이상의 생체 물질을 동시에 검출하는 진단 키트.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 추출 용액이 질산 용액을 포함하는 진단 키트.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 나노 입자가 양이온 특성을 갖는 경우 상기 포집 전극에 소정의 음 전위를 인가하고,
    상기 나노 입자가 음이온 특성을 갖는 경우 상기 포집 전극에 소정의 양 전위를 인가하는 진단 키트.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 전류 피크 측정부는
    상기 포집 전극에 포집된 상기 나노 입자에 소정의 전위를 인가하여, 상기 나노 입자를 산화/환원 반응시키고,
    상기 나노 입자의 산화/환원 반응으로부터 발생하는 각 나노 입자에 고유한 전류 피크를 측정하는 진단 키트.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 포집 전극에 소정의 음 전위 또는 양 전위를 인가하여, 각각 양이온 특성의 나노 입자 또는 음이온 특성의 나노 입자를 포집하고,
    상기 전류 피크 측정부는 포집된 상기 나노 입자로부터 각각 발생하는 상기 나노 입자에 고유한 전류 피크를 각각 측정하는 진단 키트.
  12. 제6항에 있어서,
    상기 디지털 신호를 해석하여 상기 디지털 신호에 대응하는 생체 물질의 정체 또는 검출된 생체 물질의 함량을 추정하는 디지털 신호 리더부를 추가 포함하는 진단 키트.
  13. 제6항에 있어서,
    상기 디지털 신호를 소정의 바코드로 변환하는 바코드 변환부를 추가 포함하는 진단 키트.
  14. 제6항에 있어서,
    상기 디지털 신호를 유선 또는 무선 통신을 통해 소정의 원격 진단부로 전송하고 상기 원격 진단부로부터 상기 디지털 신호의 해석 결과를 수신하는 통신부를 추가 포함하는 진단 키트.
  15. 나노 입자 표지를 이용하는 진단 방법에 있어서,
    검출하고자 하는 하나 이상의 생체 물질과 특이적으로 결합 가능한 하나 이상의 생체 결합 물질을 결정하는 단계;
    아연, 카드늄, 납, 구리, 갈륨, 비소, 탈륨, 니켈, 망간 및 창연으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 나노 입자를 선택하여 상기 하나 이상의 생체 결합 물질과 각각 결합하여 하나 이상의 나노 입자-생체 물질 복합체를 형성하는 단계;
    상기 하나 이상의 나노 입자-생체 물질 복합체를 진단하고자 하는 시료 내에 넣고 혼합하여 상기 검출하고자 하는 하나 이상의 생체 물질과 하나 이상의 나노 입자-생체 물질의 결합을 유도하는 단계;
    상기 생체 물질과 특이적으로 결합한 나노 입자-생체 물질 복합체를 분리하는 단계;
    분리된 나노 입자-생체 물질 복합체로부터 상기 나노 입자를 분리하여 포집하는 단계; 및
    상기 포집된 나노 입자에 대응하는 고유한 전류 피크를 측정하는 단계;
    를 포함하는 진단 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 나노 입자가 메탈 설파이드 형인 진단 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 나노 입자가 아연, 카드뮴, 납 및 구리로 이루어진 메탈 군으로부터 하나 이상 선택되는 진단 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 생체 결합 물질이 핵산 또는 항체인 진단 방법.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 나노 입자-생체 물질 복합체의 형성 단계가
    일측에 나노 입자와 결합 가능한 전하 특성의 치환기를 가지며, 반대측에 복수의 수용성 치환기를 갖는 고분자 사슬형의 결합 안정화 물질을 상기 나노 입자와 결합시켜 상기 나노 입자를 안정화하는 단계;
    상기 안정화된 나노 입자에 결합된 결합 안정화 물질을 활성화 시키는 단계; 및
    상기 활성화된 결합 안정화 물질과 상기 생체 결합 물질을 결합하는 단계;
    를 포함하는 진단 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 활성화 단계는 상기 나노 입자-결합 안정화 물질 복합체에 카보닐 다이이미다졸을 반응시켜 상기 결합 안정화 물질을 활성화 시키는 진단 방법.
  21. 제15항에 있어서,
    상기 검출하고자 하는 생체 물질이 DNA 또는 RNA 인 경우, 상기 생체 결합 물질은 해당 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합 가능한 상보 사슬을 포함하는 DNA 또는 RNA인 진단 방법.
  22. 제15항에 있어서,
    상기 검출하고자 하는 생체 물질이 항원인 경우, 상기 생체 결합 물질은 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체인 진단 방법.
  23. 제15항에 있어서,
    상기 측정된 전류 피크를 디지털 신호로 변환하는 단계를 추가 포함하는 진단 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 변환된 디지털 신호를 유선 또는 무선 통신을 통해 소정의 원격 진단부로 전송하는 단계; 및
    상기 원격 진단부로부터 상기 디지털 신호에 대한 진단 결과를 수신하는 단계를 추가 포함하는 진단 방법.
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