CN106061470A - 含有多种物质的聚合物纳米粒子及其方法 - Google Patents

含有多种物质的聚合物纳米粒子及其方法 Download PDF

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Abstract

本文公开的是聚合物纳米粒子，其包含：i.一种纳米沉淀的生物活性化合物，其中该纳米沉淀物是经由脂质封装的，和ii.一种疏水性生物活性化合物。本文还提供用于制备纳米粒子和包含纳米粒子的组合物的方法以及用于治疗对象的疾病或不希望的状况的方法，包含施用该聚合物纳米粒子。

Description

含有多种物质的聚合物纳米粒子及其方法
政府支持声明
本发明是在由美国国立卫生研究院所颁发的基金号CA 149363的政府支持下进行的。政府对本发明享有一定权益。
发明领域
本发明涉及使用包含脂质的聚合物纳米粒子递送生物活性化合物组合。
发明背景
活性物质，如药物，是往往难以配制成具有所期望性质例如递送活性物质到靶点和活性物质释放谱的药物制剂。配制单一活性物质到可接受的制剂中是困难的，配制两种或更多种活性物质到同一制剂中是指数性地更加困难的。虽然期望将多个活性物质配制到单一制剂中，因为多药物疗法能有效对抗疾病例如癌症，但常常不能克服与制备这些制剂相关的困难。
聚合物纳米粒子是已知的活性物质递送载体。然而，把活性物质负载到纳米粒子中是非常困难的并且可能遇到低负载效率。特别是当使用具有低溶解度的药物时，现有纳米制剂遭遇到低负载效率和突发的药物释放动力学。两种活性物质的共负载是更加困难的。在现有方法中，该两种活性物质需要具有相似的理化性质。
因为有用的活性物质可能具有不同的理化性质，能够共负载任意活性物质到单个纳米粒子中将是有益的，特别是具有彼此不同理化性质的活性物质。本发明满足了这些需求。
发明简述
本文提供包括纳米粒子的组合物，包含，i.至少一个纳米沉淀的(nano-precipitated)生物活性化合物，其中该沉淀核是被脂质封装的或具有至少一部分脂质包被的表面；和ii.不同于纳米沉淀生物活性化合物的疏水性生物活性化合物。因为纳米粒子包含生物活性化合物的纳米沉淀物，该纳米粒子能够配制基本上不溶形式的生物活性化合物。该纳米粒子还可以包含疏水性生物活性化合物。本文还提供用于治疗对象疾病或不希望的状况的方法，其中该方法包括施用该纳米粒子。该纳米粒子可以包含任意类型的纳米沉淀的生物活性化合物，包括但不限于多核苷酸、多肽和药物。
纳米粒子可以被用于递送生物活性化合物至细胞。因此，本文提供用于递送两种或更多种生物活性化合物至细胞的方法，其中该方法包括用包含至少一种纳米沉淀的生物活性化合物和至少一种疏水性生物活性化合物的纳米粒子与细胞相接触。
纳米粒子可以包含靶向配体并且被称为被靶向纳米粒子。这些被靶向纳米粒子可以特异性将生物活性化合物靶向至患病的细胞，增强纳米粒子的效应和最小化任意可能的毒性。
本文进一步提供用于制备该纳米粒子的方法。
本发明的这些和其他方面将在以下给出的发明描述中更详细公开。
附图简述
图1描述了透射电子显微镜(TEM)图像：负载有1.9重量％的DOPA-CDDP核(A)，4.5重量％的DOPA-CDDP核(B)和具有2.2重量％RAPA的4.5重量％DOPA-CDDP核(C)的MBA-PEG-PLGA NP。所述NP用醋酸铀负染色。
图2描述了负载有DOPA-CDDP核的PLGA NP的LE(负载效率)和EE(封装效率)(A)，由DLS(B)测量的尺寸和多分散性；特征化负载有RAPA的PLGA NP的LE和EE(C)，由DLS(D)测量的尺寸和多分散性。每个MBA-PEG-PLGA NP(E和F)的DOPA-CDDP核的数目可以通过改变其进料率控制并且其不被RAPA的存在而影响。
图3描述了在37℃下在PBS中CDDP和RAPA从NP的体外释放动力学(A)。在(CDDP+RAPA)NP中CDDP和RAPA的负载分别是4.5重量％和2.2重量％。使用ICP-MS确定MBA-PEG-PLGA NP的细胞摄取(B)。细胞与NP孵育4小时。RAPA、CDDP和它们的组合在A375-luc细胞中的细胞毒性(C)；RAPA NP、CDDP NP和(CDDP+RAPA)NP在A375-luc细胞中的细胞毒性(D)。经与药物孵育24小时诱导的A375-luc细胞凋亡。凋亡细胞的数目通过流式细胞术计数(E)。
图4显示出由与药物孵育24小时诱导的A375-luc细胞凋亡。细胞用膜联蛋白V-FITC/PI染色和使用荧光显微镜成像。
图5描述了空白NP、RAPA NP、CDDP NP和(RAPA+CDDP)NP分别对A375-luc荷瘤小鼠的肿瘤生长(A)和体重(B)的作用。箭头指示注射时间。RAPA以0.15mg/kg的剂量静脉内给药；CDDP以0.30mg/kg的剂量静脉内给药。结果显示为每组4只动物的平均值±SEM(误差条)。
图6显示出用Masson三色染色的肿瘤切片，蓝色表示胶原含量。胶原含量使用ImageJ定量。
图7描述了RAPA和CDDP组合改造肿瘤微环境。(RAPA+CDDP)NP耗尽了基质并且表现出在肿瘤中抗血管生成和血管正常化。
图8描述了经由CD-31染色研究药物对A375-luc异种移植肿瘤的抗血管生成作用；癌症相关的成纤维细胞经α-SMA抗体染色；经TUNEL法(A)指出A375-luc肿瘤中的细胞凋亡。该数量表示每个显微镜视野中CD-31阳性血管的平均数目；百分比分别表示α-SMA+成纤维细胞的平均百分比和TUNEL阳性细胞的百分比。血管面积，使用ImageJ定量，相对PBS对照被标准化(B)。
图9描述药物对A375M异种移植肿瘤的抗血管生成作用，经由CD-31染色研究；经由TUNEL法指出A375M肿瘤中的细胞凋亡(C)。该数量分别表示每个显微镜视野中CD-31阳性面积的平均百分比和TUNEL阳性细胞的百分比。
图10描述了负载CDDP核和GMP核的MBA-PEG-PLGA NP的一个优选制剂。a.DOPA-GMP核的TEM图像；b.DOPA-CDDP核的TEM图像；负载有5重量％的DOPA-GMP核和1重量％的DOPA-CDDP核的MBA-PEG-PLGA NP的TEM图像。LE：负载效率；EE：封装效率。
图11显示负载DOPA-CDDP核和DOPA-GMP核的MBA-PEG-PLGA NP的LE和EE的特征描述。在MBA-PEG-PLGA NP中GMP和CDDP之间的摩尔比最初控制为5∶1，两种药物的进料比(预期总LE，绿色柱线)因此从1重量％变化至8重量％。计算了MBA-PEG-PLGA NP中GMP和CDDP之间的实际比例(紫色三角形)(A)；研究了在上述制剂中CDDP和GMP的LE和EE(B)；通过DLS测量粒径和多分散性(C)。然后总进料比(预期比)保持在6重量％，GMP和CDDP之间的摩尔比从0.5∶1、1∶1、3∶1变化至5∶1。计算MBA-PEG-PLGA NP中GMP和CDDP之间的实际比例(紫色三角形)(D)；研究了在上述制剂中CDDP和GMP的LE和EE(E)；通过DLS测量粒径和多分散性(F)。LE：负载效率；EE：封装效率。
图12描述了在37℃在PBS中CDDP和GMP从NP的体外释放动力学。在(CDDP+GMP)NP中CDDP和GMP的负载分别是0.88重量％和5重量％。
图13描述了游离GMP、CDDP和可变摩尔比的游离药物组合的毒性研究(A)和相应的CI比Fa曲线(C)；游离GMP、CDDP和摩尔比5∶1的游离药物组合的细胞毒性研究；单独负载DOPA-GMP核和DOPA-CDDP核的单个MBA-PEG-PLGA NP，摩尔比为5∶1的共负载DOPA-GMP核和DOPA-CDDP核的MBA-PEG-PLGA NP(B)和相应的PLGA组合的CI比Fa曲线(D)。注意每次治疗中存在的总药物浓度和IC50，n＝5。
图14描述了负载单一核或共负载DOPA-GMP和DOPA-CDDP核的MBA-PEG-PLGA NP对膀胱肿瘤荷瘤小鼠的肿瘤生长的作用。箭头指示注射时间。GMP以8mg/kg的剂量和CDDP以1.6mg/kg的剂量静脉内给药(均以游离药物和纳米粒子制剂)。结果显示为每组4-5只动物的平均值±SD。
图15描述了可以通过本文所公开的方法制备的包括不同生物活性化合物的聚合物纳米粒子。
图16描述了在PLGA组合和PLGA NP中CDDP和GMP的累积释放。
图17描述了A375-luc细胞中MBA-PEG-PLGA NP的细胞毒性。
图18显示出由游离RAPA、CDDP和(RAPA+CDDP)诱导的细胞凋亡。RAPA的浓度为0.36μM和CDDP的浓度为2.0μM。CDDP对RAPA的摩尔比为5.5。
图19显示出由RAPA NP、CDDP NP和(CDDP+RAPA)NP诱导的细胞凋亡。RAPA的浓度为0.36μM和CDDP的浓度为2.0μM。CDDP对RAPA的摩尔比为5.5。
图20描述了来自用PBS、空白NP、RAPA NP、CDDP NP和(CDDP+RAPA)NP治疗的小鼠肾脏组织的H&E染色。
图21(A)描述了通过单步溶剂置换法包含CP核和GMP核的PLGA-PEG-茴香酰胺NP(PLGA NP)的制造。(B)顺铂和GMP，其被按比例封装在PLGA NP中，被按比例递送到肿瘤中并且表现出强烈的协同抗肿瘤功效。
图22描述了(A)双药按比例负载在组合NP中。在组合NP中GMP和顺铂的EE和DL，而药物的总负载固定在6重量％；(B)在组合NP中GMP和顺铂的EE和DL，而GMP对顺铂的进料摩尔比固定为5∶1；(C)5.5重量％的总药物负载的具有GMP和顺铂摩尔比为5.3∶1的组合NP的TEM图像；(D)组合NP的EDS光谱；(E)观察在单个NP中来自CP核的铂和来自GMP的氟，表示在单个NP中双药的实际负载。组合NP的XPS光谱。还使用氟和铂的原子比定量GMP和顺铂的摩尔比。Pt 4F的光谱和F1S的光谱，来自峰面积被积分用于原子量化。
图23描述了(A)组合NP的双药按比例细胞摄取和释放。组合NP、Sepa NP和游离药物的顺铂和GMP在37℃在UMUC3细胞中摄取4小时；(B)负载顺铂和GMP的组合NP在UMUC3细胞中的累积摄取；(C)在PBS中在37℃顺铂和GMP从组合NP和单个NP的体外释放动力学；和(D)顺铂和GMP从组合NP的细胞内释放；(E)游离GMP、顺铂和摩尔比5.3∶1的游离组合，以及单个药物NP和摩尔比5.3∶1的组合NP的IC50；(F)X-轴表示双药或单一药物制剂的总浓度。显示组合NP和游离组合的相应CI比Fa曲线。在组合NP中顺铂和GMP的DL分别是0.8重量％和4.6重量％，而在单个NP中顺铂和GMP的DL分别是4.4重量％和4.2重量％。n.s.：无显著差异；*P＜0.05；**P＜0.01。
图24描述了(A)游离药物、游离组合、顺铂NP、GMP NP、Sepa NP和组合NP在基质丰富UMUC3膀胱癌异种移植模型中肿瘤抑制作用；(B)在图框A中的箭头表示注射时间。在所有治疗组中以1.9mg/kg的顺铂剂量和12mg/kg的GMP剂量3次静脉注射治疗所述肿瘤。在以1.9mg/kg的顺铂剂量和12mg/kg的GMP剂量注射组合NP、Sepa NP和游离组合到携带基质丰富膀胱癌异种移植肿瘤的裸鼠中10小时后，计算顺铂和GMP的肿瘤积累；(C)比较多个低剂量方案和单个高剂量方案的抗肿瘤作用，N＝5；*P＜0.05；**P＜0.01；*P＞0.2；##P＞0.5；n.s：无显著差异。ID/g：每克组织(肿瘤)的注射剂量；(D)组合NP的单个高剂量和多个低剂量的给药方案和肿瘤图像。
图25描述了在不同治疗施用后，体内肿瘤细胞的凋亡(A)和增殖(B)。经过3个剂量的全身治疗之后，XPA和ERCC-1的表达，在核苷酸切除修复(NER)系统中常见(C)。在全身治疗后，经由抗-Pt-DNA加合物抗体检测肿瘤细胞中Pt-DNA加合物(绿色)的形成。D中条形图是在组织切片中Pt-DNA加合物的％定量分析。在图像J上定量分析5个随机选择的显微视野。*P＜0.05；**P＜0.01。
图26描述了GMP核的TEM图像(a)；CP核的TEM图像(b)。GMP和CP核具有相似的大小和形态。
图27描述了在非小细胞肺癌H460和膀胱癌细胞系UMUC3中上皮细胞表面标记物σ(Sigma)受体的蛋白质印迹分析。结果表明UMUC3具有与H460相当的σ受体表达，表明茴香酰胺靶向作用的可行性。
图28描述了GMP NP中GMP和顺铂NP中顺铂的EE，改变了在PLGA NP中单一药物核的进料负载。
图29描述了总进料负载固定在6重量％(a)或GMP/顺铂的进料摩尔比固定在5∶1(b)的组合NP的大小和PDI。
图30描述了由DLS测量的4.4重量％顺铂NP、4.2重量％GMP NP和具有GMP和顺铂摩尔比5.3∶1的5.5重量％组合NP的大小和PDI。
图31描述了在37℃在UMUC3细胞中用或未用茴香酰胺修饰的组合NP的总药物摄取。氟哌啶醇作为σ受体的抑制剂。
图32在pH 5.6PBS中在37℃组合NP和单个NP的顺铂和GMP的体外释放动力学。(n.s.：无显著差异)。
图33描述了在3个剂量后不同治疗对UMUC3肿瘤重量的作用。箭头指示注射日期。
图34描述了在3个剂量治疗后的肿瘤裂解物中PARP，切割的PARP，caspase-3和GAPDH的蛋白质印迹。
图35描述了在静脉注射到携带UMUC3基质丰富肿瘤的裸鼠中10小时后在主要器官中组合NP、Sepa NP和游离组合的生物分布。(％ID/g组织：每克组织中注射剂量的百分比)。
图36描述了在3次注射治疗后主要药物累积器官的HE染色。
图37描述了用3种剂量的如所示的游离药物和NP治疗的健康裸鼠收集的全血的血液学测试(n＝4)。WBC，白细胞；HCT，红细胞比容；PLT，血小板；HGB，血红蛋白；RBC，红细胞。(如果没有显示，在PBS组和治疗组之间无显著差异。*P＜0.05；**P＜0.01)。
发明详述
目前公开的主题将在下文更充分地描述。然而，本文所述的目前公开的主题的许多修改和其它实施方案将可以由目前公开的主题涉及的领域的技术人员想到，其具有在前述描述中存在的教导的益处。因此，可以理解的是目前公开的主题不限于所公开的具体实施方案并且所述修改和其他实施方案旨在包括在所附权利要求的范围内。
包含多种生物活性化合物的聚合物纳米粒子(NP)已被制备。至少一种所述生物活性化合物是纳米沉淀物的形式，例如如在美国申请公开号2012/0201872和PCT/US2013/061985中所述，其各自以其全文并入本文。在一些实施方案中，纳米沉淀核包被有单一脂质层。在一些实施方案中，至少一种生物活性化合物是疏水性生物活性化合物。在一些实施方案中，纳米粒子可以包含含有不同生物活性化合物的其他纳米沉淀核。如在本文完全描述的，生物活性化合物被共负载和封装在聚合物纳米粒子中。
特别地，封装DOPA-顺铂(CDDP)核和雷帕霉素(RAPA)的MBA-PEG-PLGA NP已被制备。本文描述的方法以高效负载和封装而直接封装CDDP到MBA-PEG-PLGA NP中。意料之外地，当共封装RAPA时，DOPA-CDDP核提高了RAPA负载约3.48倍。此外，显示了CDDP和RAPA二者的受控释放谱。
有利地，由MBA-PEG-PLGA NP递送增强了组合药物的细胞毒性。组合的RAPA和CDDP减少了异种移植肿瘤中癌症相关的成纤维细胞数量和胶原的表达，具有抗血管发生作用和正常化肿瘤血管。因此，已经显示出具有不同理化性质的生物活性化合物可以有效地共负载到聚合物纳米粒子中以治疗多种疾病，具有成分之间协同活性的优点。
由于药物作用的协同增强，对抗肿瘤和支持微环境的联合治疗可能潜在地更有效。如本文所述，具有不同物理性质的药物共封装到相同的纳米粒子制剂的困难已被克服。通过一个非限制性实例，本文描述了使用纳米沉淀方法，共封装亲水性无机顺铂与雷帕霉素到PLGA中。具有疏水表面的DOPA包被的顺铂核被制备。封装DOPA包被的顺铂至PLGA NP通过雷帕霉素的存在和通过调节雷帕霉素和PLGA之间的相容性而出乎意料地提高。在A375黑色素瘤细胞中的这些NP诱导的凋亡，显示出抗血管生成作用，通过胶原蛋白的下调和癌症相关成纤维细胞的耗尽而调节肿瘤微环境。其他生物活性化合物也可使用。本文描述的是具有变化的理化性质的多个生物活性化合物的共封装，例如吉西他滨核和顺铂核以及疏水性雷帕霉素。
肿瘤微环境在血管生成、肿瘤进展、浸润和转移中起重要作用。重塑肿瘤微环境可能是使肿瘤细胞对化疗敏感的强有力策略。因此，如本文所述，潜在的治疗策略可以部分基于在肿瘤微环境中治疗诱导的变化。雷帕霉素(RAPA)，一种具有抗血管生成和抗肿瘤活性的mTOR抑制剂，可以使A375黑色素瘤细胞对顺铂(CDDP)敏感。以优选摩尔比使用CDDP和RAPA二者的联合治疗可以促进这两种药物之间的协同。但是，由于游离药物和聚合物基质之间的不相容性，封装这些药物至聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)纳米粒子(NPs)的以前尝试是无效的。单一药物可以如在美国申请公开号2012/0201872和PCT/US2013/061985中先前描述是稳定的，例如通过利用由二油酰磷脂酸(DOPA)稳定的CDDP疏水性纳米沉淀。本文所公开的是被靶向聚合物，例如PLGA，纳米粒子包含具有以促进CDDP和RAPA之间协同抗肿瘤活性的摩尔比的疏水性DOPA-CDDP核和RAPA二者的有效负载。
PLGA NP表明在治疗后促进支持A375-luc黑色素瘤异种移植肿瘤的微环境变化的能力。重要地，PLGA NP表明两种药物的控释，在培养的A375-luc黑色素瘤细胞中诱导凋亡，和在A375-luc异种移植模型中显著地调节肿瘤的脉管系统和微环境。如本文所公开，这种方法可以提供含有药物或成像剂与疏水性药物组合的其它脂质包被的纳米核的共负载以提供新的治疗选择。
本文提供的是如在下面方案1和3描述的纳米粒子，包括两个或更多个纳米沉淀生物活性化合物，或至少一种纳米沉淀生物活性化合物和另外的疏水性生物活性化合物，其中所述纳米沉淀化合物由脂质封装或包被至少一部分。通常，生物活性化合物的纳米沉淀物可以通过混合含有反应物的两个反相微乳剂制备。以这种方式，一个纳米沉淀物形成并且包被有单一脂质层。脂质包被的核在本文和美国申请公开号2012/0201872和PCT/US2013/061985中描述。利用用于纳米粒子形成的本文所述方法，难以配制的生物活性化合物不仅可以被配制而且可以有利地与具有不同理化性质的其它生物活性化合物一起配制。通过转换另外的非候选化合物为潜在的生物活性化合物和在配制用于递送的单个聚合物纳米粒子中成功地组合它们与其他试剂，本文所描述的主题对医药做出了显著的贡献，特别癌症化疗。
如本文所用的术语“纳米沉淀物”是指纳米沉淀的生物活性化合物或其前体。在一些实施方案中，生物活性化合物具有在水和油中的低溶解度或在水和油中是基本上不溶的，和脂质封装或包被至少一部分所述生物活性化合物表面。术语“低溶解度”意在所述纳米沉淀生物活性化合物或其前体是在水和油没有溶解至可观测量。
如本文所用，生物活性化合物通过将化合物或化合物前体与形成生物活性化合物纳米沉淀物的物质接触而被制备为纳米沉淀物。如本文所用，纳米沉淀的生物活性化合物具有如本文别处所述的脂质包被。因此，纳米沉淀物是与大块沉淀物相区分的。此外，大块沉淀物不具有纳米尺寸的脂质包被粒子。利用本文公开的方法，生物活性化合物可以制备为纳米沉淀物和配制在含有至少一种其它不同生物活性化合物的纳米粒子中。
在这个实施方案中，纳米沉淀生物活性化合物在反相微乳液中形成盐，导致纳米沉淀的生物活性化合物具有至少一部分由脂质包被的表面。在一些实施方案中，纳米沉淀物基本上由在其纳米沉淀盐形式的生物活性化合物和脂质包被组成。优选地，纳米沉淀物由纳米沉淀盐形式的生物活性化合物和脂质包被组成。在一些情况下，一个以上的生物活性化合物可以通过单一离子共沉淀以形成是纳米沉淀物的混合的不溶性盐。例如，依托泊甙磷酸盐和吉西他滨磷酸盐两者在本文描述的方法中使用InCl3可以是纳米沉淀的。因此可以制备含有混合的依托泊甙磷酸铟盐和吉西他滨磷酸铟盐的纳米沉淀物的聚合物纳米粒子。在聚合物纳米粒子中不同生物活性化合物能够抑制靶细胞中相同或不同的生化途径以实施加和或协同治疗活性。
在一些情况下，生物活性化合物可以是高度强效的，但是，它的实际应用性是被高毒性、低生物利用度、不稳定性等严重限制的。因此，一些实施方案涉及包含封装的纳米沉淀的生物活性化合物的聚合物纳米粒子，其中生物活性化合物是高度可溶的还具有上述不希望的性质。在一些实施方案中，这样高度可溶的生物活性化合物可以使用合适的金属抗衡离子而从溶液中沉淀。这样的金属离子包括但不限于In+3、Gd+3、Mg+2、Zn+2和Ba+2。
重要地，在纳米沉淀物中所需的起源材料的缺乏提供了大大增加的负载潜力。具有纳米沉淀物的纳米粒子负载可以导致所述纳米粒子至少10重量％的纳米沉淀物量。优选地，所述量是从约20至约70％重量或从约20％至约85％重量；从约30至约60％；和更优选从约40％重量至约50％重量。所述纳米粒子还可以包括本文别处特别列出的组分。
如本文所用，术语“按比例”指的是相对于在纳米粒子中存在的一种或多种其它生物化合物的量，一种生物活性化合物的有意的、受控的负载量。术语“受控”是指能够精准负载和与不能施加控制精准负载量的方法相区分的过程。第一种生物活性化合物相对于第二种生物活性化合物的按比例量是从约1∶1000至约1000∶1。优选地，生物活性化合物的按比例量提供如本文别处所公开的协同作用。有利地，可以以具有优良精度的所需水平按比例实施共负载。例如，比例可以是1∶1，其中每个药物是以摩尔或以重量相同的比例存在的。优选的摩尔比是从约2∶1；3∶1；4∶1；6∶1；7∶1；或最优选约5∶1，DOPA-GMP核：DOPA-CDDP核。
通过调节DOPA-CDDP核：MBA-PEG-PLGA输入比控制每个NP的DOPA-CDDP核的数量。雷帕霉素对封装或NP形态没有影响(图2F)。
通过调节CDDP和GMP的输入摩尔比制备具有按比例负载的双载(DOPA-GMP和DOPA-CDDP)MBA-PEG-PLGA NP。当输入GMP：CDDP设定为5∶1和总负载低于6重量％时，在PLGA NP中GMP对CDDP的计算比例几乎相同于输入比。此外，两种药物的封装效率是相似的。当两种药物对PLGA的总输入设定在6％重量，在MBA-PEG-PLGA NP中GMP对CDDP的比率被很好控制。这导致封装效率高达90％(图11D和E)。TEM图像显示出MBA-PEG-PLGA NP是球形的和直径约80-100nm。在每个粒子中清楚地观察到核。这些结果证实具有显著不同性质的两种药物的比率可以通过以这种方式配制而被控制。数据还显示游离GMP和CDDP表现出对培养的UMUC-3膀胱癌细胞增殖的协同作用，在5∶1比例有最大效果，这也是在临床治疗中使用的接受比率(图13C)。此外，对于有效的组合疗法，所述制剂必须实现对两种药物的有效释放速率。通过ICP-MS和HPLC的CDDP和RAPA释放的测量(图3)显示出两种药物相似的持续速率。没有药物影响另一个的释放速率。
纳米粒子，通过被动和主动靶向，可以增强在癌症细胞内的药物细胞内浓度同时避免在正常细胞中的毒性。表面PEG化纳米粒子可以有效地递送核酸、化学药物和蛋白质至实体瘤和转移位点。然而，仍然必须是生物活性的足够负载，这对基本上不溶性药物是特别困难的。当试图共负载生物活性化合物至单个聚合物纳米粒子时难度是指数性增加。在所述纳米粒子表面是PEG化的实施方案中，这可以提高循环中胶体稳定性和减少由单个核吞噬细胞系统(MPS)的非特异性摄取。在一些实施方案中，这些纳米粒子也可以用茴香酰胺(MBA)功能化，靶向在肿瘤细胞上过表达的σ受体以促进细胞摄取。根据生物活性化合物的肿瘤靶向递送，这些纳米粒子在体外和体内的性能可以被表征。另外，全身性毒性被检查以确定这些纳米粒子的安全性。
如本文所用，“高负载能力”意指活性化合物比该特定活性化合物任意已知的纳米粒子制剂的改进的或更好的负载能力。
如本文所用，“高生物利用度”意指生物活性化合物相比于游离生物活性化合物的生物利用度的更好的或改进的生物利用度。“游离生物活性化合物”是指不用脂质封装的不是沉淀的生物活性化合物。
如本文所用，“较少毒性”意指相比于游离生物活性化合物或其任何已知制剂的较少或没有毒性。
如本文所用，“较高的吸收率”意指活性化合物相比于游离生物活性化合物或其任何已知制剂的更好的或改进的吸收率。
如本文所用，“改进的效率”意指活性化合物的效率相比于该特定活性化合物的任何已知纳米粒子制剂在种类或程度或两者上更好。
上述性质可以使用本领域任意熟知的方法测量和定量。
在一个实施方案中，本文描述的主题涉及一种制备聚合物纳米粒子的方法，包括：
i.通过将第一脂质包被的包含第一生物活性化合物的纳米沉淀核与1)游离形式的不同疏水性生物活性化合物和2)聚合物接触，形成有机相；其中所述接触是在可以混溶于水的有机溶液中以形成所述有机相；和
ii.将所述有机相与液体溶液接触以形成包含含有第一生物活性化合物的第一脂质包被核和疏水性生物活性化合物的所述聚合物纳米粒子。
在一个实施方案中，本文描述的主题涉及一种制备聚合物纳米粒子的方法，包括：
i.通过将第一脂质包被的包含第一生物活性化合物的纳米沉淀核与1)包含不同于所述第一生物活性化合物的第二生物活性化合物的第二脂质包被的纳米沉淀核和2)聚合物接触，形成有机相；其中所述接触是在可以混溶于水的有机溶液中以形成所述有机相；和
ii.将所述有机相与液体溶液接触以形成包含含有第一生物活性化合物的脂质包被核和含有与所述第一生物活性化合物不同的第二生物活性化合物的脂质包被核的所述聚合物纳米粒子。
这些方法可进一步包括一旦形成纳米粒子则冲洗和纯化纳米粒子。在一些实施方案中，液体溶液是水，其可以是去离子水。在上述方法中，该聚合物可以首先与有机溶剂接触或者核或疏水性生物活性化合物可以首先接触，随后接触聚合物。该方法可以在加热到室温以上或冷却至低于室温而进行，或者可以在室温下进行。唯一的限制是组分必须能够承受该温度。
在一些实施方案中，本文描述的主题涉及包含能提供协同作用的按比例量的生物活性化合物的聚合物纳米粒子，其中存在至少一种脂质包被的含有生物活性化合物的纳米沉淀核和至少一种游离形式的或在脂质包被的纳米沉淀核中的不同生物活性化合物。
在一些实施方案中，本文描述的主题涉及一种纳米粒子，其中第一生物活性化合物的存在增加了第二、第三或更多种生物活性化合物的负载效率。
本文所述的纳米粒子可以是自组装的基本上球形的小泡。所述纳米粒子的外部包括聚合物。有用的聚合物包括生物相容的已知聚合物。在本文中使用的术语“生物相容”如在本领域中用于描述适合于医药用途的聚合物。生物相容的聚合物可以是经由机体随时间降解和吸收的生物吸收聚合物。
聚合物是指经由聚合形成的和基本上由重复结构单元组成的化合物或化合物的混合物。有用的聚合物可以是能够形成纳米粒子和旨在与生物系统相互作用的在体内或体外应用的合成材料。这些包括但是不限于在美国专利5,514,378(通过引用而并入本文)教导的那些。生物降解的共聚物也被描述，包括脂肪族聚酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚α-氨基酸、聚磷酸原和聚氰基丙烯酸烷酯。在脂肪族聚酯中，聚乳酸(PLA)、聚乙交酯(PGA)和聚乳酸乙交酯(PLGA)。生物降解的聚合物包括乳酸聚合物如聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(DL-乳酸)(PLA)和聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)的共聚单体(丙交酯∶乙交酯)比率优选在100∶0和50∶50之间。最优选，共聚单体比率在85∶15(PLGA 85∶15)和50∶50(PLGA50∶50)之间。可以使用PLGA与PLLA的共混物，优选PLGA 85∶15和PLGA50∶50的共混物。特别有用的聚合物是聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。所述纳米粒子的内部是由聚合物封装的和包含所述生物活性化合物。
包含生物活性化合物的纳米沉淀核可以被脂质包被。如本文所用，术语“脂质”是指具有亲脂性或两亲性性质的有机化合物组的成员，包括但不限于脂肪、脂肪油、精油、蜡类、类固醇、甾醇、磷脂、糖脂、磺脂类、氨基脂质、脂色素(脂色素)和脂肪酸。术语“脂质”包括天然存在的和合成产生的脂质。“亲脂性”是指那些溶解在脂肪、油、脂质和非极性溶剂如有机溶剂中的有机化合物。亲脂性化合物在水中是微溶的或不溶的。因此，亲脂性化合物是疏水性的。两亲性脂质，在本文中也称为“两亲脂质”是指同时具有亲水和疏水特性的脂质分子。两亲性脂质的疏水性基团，如在下文中立即被更详细描述的，可以是长链烃基。两亲性脂质的亲水性基团可以包括带电基团，例如阴离子或阳离子基团，或极性不带电基团。两亲性脂质可以具有多个疏水性基团、多个亲水性基团，和它们的组合。因为疏水性基团和亲水性基团的同时存在，两亲性脂质可以溶于水，并且在一定程度上可以溶于有机溶剂。
如本文所用，“亲水性”是能够与水(H2O)分子氢键连接的和可以溶于水和其它极性溶剂的分子的物理性质。术语“亲水性”和“极性”可以互换应用。亲水性特性源自极性或带电基团的存在，如碳水化合物、磷酸盐、羧酸、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其它类似基团。
相反，术语“疏水性”是被水团排斥的分子的一种物理性质，可被称作“非极性”或“无极性”，所有这些都是可以与“疏水性”互换使用的术语。疏水性可以通过包含无极性基团而被赋予，无极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂族烃基基团和被一个或多个芳族、脂环或杂环基团取代的这类基团。两亲性化合物的实例包括但不限于磷脂、氨基脂和鞘脂。磷脂的代表性实例包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酸和二亚油酰基磷脂酰胆碱。缺乏磷的其他化合物如鞘脂、鞘糖脂家族、二脂酰甘油和β-环氧酸也被指定为在两性脂质组内。
脂质可以包括阳离子脂质。如本文所用，术语“阳离子脂质”包括任何数目的在生理pH下携带净正电荷的脂质种类，其可以使用本领域技术人员已知的任何方法测定。这类脂质包括但不限于在2009年5月1日提交的国际申请PCT/US2009/042476、题为“Methodsand Compositions Comprising Novel Cationic Lipids”中公开的式(I)阳离子脂质，并且其在此通过引用而全文并入本文。这些包括但不限于N-甲基-N-(2-(精氨酰氨基)乙基)-N，N-双十八烷基氯化铵或二硬脂精氨酰基氯化铵(DSAA)、N，N-二-肉豆蔻酰基-N-甲基-N-2-[N′-(N6-胍基-L-赖氨酰)]氨基乙基氯化铵(DMGLA)、N，N-二肉豆蔻酰基-N-甲基-N-2[N2-胍基-L-赖氨酰]氨基乙基氯化铵、N，N-二肉豆蔻酰基-N-甲基-N-2[N′-(N2，N6-二-胍基-L-赖氨酰)]氨基乙基氯化铵和N，N-二-硬脂酰基-N-甲基-N-2[N′-(N6-胍基-L-赖氨酰)]氨基乙基氯化铵(DSGLA)。可以存在的阳离子脂质的其它非限制性实例包括N，N-二油基-N，N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(“DOTAP”)；N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(“DOTMA”)或其它的N-(N，N-1-二烷氧基)-烷基-N，N，N-三取代铵表面活性剂；N，N-二硬脂基-N，N二甲基溴化铵(“DDAB”)；3-(N-(N′，N′-二乙基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”)和N-(1，2-双十四烷氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)；1，3-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N-(2-(精胺羧基氨基)乙基)-N，N-二甲基-1三氟乙酸铵(DOSPA)；GAP-DLRIE；DMDHP；3-β[4N-(1N，8N-双胍基亚精胺)氨基甲酰基]胆固醇(BGSC)；3-β[N，N-双胍乙基-氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(BGTC)；N，N1，N2，N3四甲基四棕榈酰精胺(cellfectin)；N-叔丁基-N′-十四烷基-3-十四烷基-氨基丙脒(CLONfectin)；二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)；1，3-二油酰氧基-2-(6-羧基精烷基)-丙基酰胺(DOSPER)；4-(2，3-双-棕榈酰氧基-丙基)-1-甲基-1H-咪唑(DPIM)，N，N，N′，N′-四甲基-N，N′-双(2-羟乙基)-2，3-二油酰氧基-1，4-丁二胺碘化物)(Tfx-50)；1，2-二油酰基-3-(4′-三甲基铵)丁醇-sn-甘油(DOBT)或胆固醇基(4′三甲基铵)丁酸酯(ChOTB)，其中三甲基铵基团经由丁醇连接臂连接双链(用于DOTB)或胆固醇基(用于ChOTB)；DL-1，2-二油酰基-3-二甲基氨基丙基-β-羟乙基铵(DORI)或DL-1，2-O-二油酰基-3-二甲基氨基丙基-β-羟乙基铵(DORIE)或其类似物，如在国际申请公开号WO 93/03709中公开的，其通过引用而全文引入本文；1，2-二油酰基-3-琥珀酰基-sn-甘油胆碱酯(DOSC)；胆固醇基半琥珀酸酯(ChOSC)；脂多胺如双十八烷基酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)和二棕榈酰磷脂酰乙醇戊基精胺(DPPES)或在美国专利5,283,185中公开的阳离子脂质，其全文加入本文参考；胆固醇基-3β-羧基-氨基-乙烯基三甲基碘化胺；1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-DL-2-丙基-胆甾醇羧酸碘化物；胆固醇基-3-β-羧胺基哌嗪；胆固醇基-3-β-氧琥珀酰胺-乙烯基三甲基碘化铵；1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-DL-2-丙基-胆固醇基-3-β-氧琥珀酸碘化物；2-(2-三甲基铵基)-乙基甲基氨基乙基-胆固醇基-3-β-氧琥珀酸碘化物；和3-β-N-(聚乙烯亚胺)-氨基甲酰胆固醇。
脂质可以包含带负电荷的或中性的共脂质。如本文所用，“共脂质”指的是非阳离子脂质，其包括中性(不带电荷)或阴离子脂质。术语“中性脂质”指的是在生理pH下以不带电荷的或中性的两性离子形式存在的任何数量的脂质种类。术语“阴离子脂质”包括在生理pH下携带净负电荷的任何数量的脂质种类。共脂质可以包括但不限于二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油、磷脂相关物质，如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、心磷脂、磷脂酸、双十六烷基磷酸盐、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二油酰基磷脂酸(DOPA)、硬脂胺、十二烷基胺，十六烷基胺、乙酰棕榈酸酯、单蓖麻油酸甘油酯、十六烷基硬脂酸酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-硫酸月桂酯、烷基-芳基硫酸盐聚乙氧基化脂肪酸酰胺、溶血磷脂酰胆碱和双十八烷基二甲基溴化铵等。共脂质还包括基于聚乙二醇的聚合物如PEG 2000，PEG5000和聚乙二醇缀合到磷脂或神经酰胺，如在美国专利5,820,873中所描述的，其内容全文加入本文参考。
优选地，具有游离磷酸基的两亲性脂质是二油酰基磷脂酸(DOPA)。
尽管不受任何特定理论或作用机理的约束，确信该纳米粒子可以通过内吞作用进入细胞并且在显示出相对低pH(例如pH 5.0)的内体中发现。因此，在一些实施方案中，生物活性化合物在内体pH下被释放。在某些实施方案中，pH水平是小于约6.5，小于约6.0，小于约5.5，小于约5.0，小于约4.5，或小于约4.0，包括但不限于约6.5、约6.4、约6.3、约6.2、约6.1、约6.0、约5.9、约5.8、约5.7、约5.6、约5.5、约5.4、约5.3、约5.2、约5.1、约5.0、约4.9、约4.8、约4.7、约4.6、约4.5、约4.4、约4.3、约4.2、约4.1、约4.0或更低。
纳米粒子可以是任何尺寸的，只要它们能够递送掺入的生物活性化合物至细胞(例如在体外，体内)，生理部位或组织。如本文所用，术语“纳米粒子”是指具有至少一个维度小于约1000nm的任何形状的颗粒。在一些实施方案中，纳米粒子具有在约1nm至约1000nm范围内的至少一个维度，包括在1nm和1000nm之间的任何整数值(包括约1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500和1000)。在某些实施方案中，纳米粒子具有约150nm的至少一个维度。球形纳米粒子可以具有小于约100nm的直径，包括但不限于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100nm。在特定实施方案中，纳米粒子具有小于约50nm的直径。在特定实施方案中，纳米粒子具有在约40nm至约50nm之间的直径。在特定实施方案中，纳米粒子具有约-17mV的ζ(zeta)电位。使用本领域已知的任何方法可以测定颗粒尺寸，包括但不限于沉降场流动分级，光子相关光谱，圆盘离心，和动态光散射(使用例如亚微米粒度分级器如来自AutodilutePAT Model 370的NICOMP粒子尺寸系统；Santa Barbara，CA)。
纳米沉淀核通过乳剂方法形成。乳剂是一种液体在第二种不混溶液体中的分散体。术语“不混溶”当指两种液体时是指这些液体不能被混合或掺合成均匀的溶液。当添加在一起时，两个不混溶液体将总是形成两个分离相。在目前公开的方法中使用的有机溶剂基本上是与水不混溶的。乳剂基本上是溶胀胶束，虽然不是所有的胶束溶液可以溶胀以形成乳剂。胶束是以被称为临界胶束浓度的良好定义的浓度下形成的两亲性分子的胶态聚集体。胶束用胶束内部脂质分子的疏水部分和在外表面、暴露于水的亲水性部分定向。在胶束中聚集分子的通常数目(聚集数)具有从约50至约100的范围。术语“胶束”还指逆向或反相胶束，其在有机溶剂中形成，其中所述疏水部分在外表面，暴露于有机溶剂以及亲水部分定向于胶束内部。
水包油型(O/W)乳剂由分散于水中的有机化合物液滴(如油)所组成，油包水型(W/O)乳剂是相位反转的和由分散在有机化合物(如油)中的水滴所组成。本文的油包水型乳剂还指反相乳剂。热力学稳定的乳剂是包含表面活性剂(例如两亲性分子)和自发形成的那些。术语“乳剂”可以指微乳剂或粗乳剂，取决于粒子的尺寸。在微乳剂中液滴直径通常为从约10至约100nm。相对地，术语粗乳剂是指具有大于约100nm直径的液滴。
可以将足够量的水溶液、有机溶剂和表面活性剂加入到反应溶液中以形成所希望的乳剂，这将对本领域技术人员是明显的。
为了促进油包水型微乳剂的进展和稳定，表面活性剂加入到反应溶液中。表面活性剂是可以减小液体表面张力的分子。表面活性剂具有亲水性和疏水性特性，因此可以在一定程度上溶解于水或有机溶剂中。表面活性剂被分为四个主要组：阳离子、阴离子、非离子和两性离子。优选所述表面活性剂是非离子表面活性剂。非离子表面活性剂是那些当溶解或分散在液体溶液中时不带电荷的表面活性剂。因此，非离子表面活性剂的亲水部分是不带电荷的、极性基团。适用于目前公开的方法和组合物的非离子表面活性剂的非限制性代表实例包括聚乙二醇、聚山梨醇酯，包括但不限于聚乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如化合物)和山梨糖醇酐衍生物(例如化合物)；环氧乙烷/环氧丙烷共聚物(例如化合物，其也被称为泊洛沙姆)；聚氧乙烯醚化合物，如那些家族，包括但不限于聚氧乙烯硬脂基醚(也称为聚氧乙烯(100)十八烷基醚和商品名700)；脂肪醇的醚。在特定实施方案中，非离子表面活性剂包括辛基酚乙氧基化物(即Triton X-100)，其可以商购于多个供应商(例如Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。
聚乙氧基化山梨糖醇酐脂肪酸酯(聚山梨醇酯)可以商品名而商购于多个供应商(例如Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，包括但不限于聚氧乙烯(POE)山梨糖醇酐单油酸酯(80)、POE山梨糖醇酐单硬脂酸酯(60)、POE山梨糖醇酐单月桂酸酯(20)和POE山梨糖醇酐单棕榈酸酯(40)。
环氧乙烷/环氧丙烷共聚物包括已知为泊洛沙姆的嵌段共聚物，其也以商品名所公知和可以从BASF公司(Florham Park，New Jersy)购得。泊洛沙姆是由聚氧乙烯的两个亲水链(聚(环氧乙烷))相伴的聚氧丙烯的中央疏水链(聚(环氧丙烷))而构成的并且由以下的化学结构所表示：HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH；其中C2H4O亚基是环氧乙烷单体和C3H6O亚基是环氧丙烷单体，并且其中a和b可以是范围从20至150的任何整数。
可以在目前公开的方法中使用的有机溶剂包括那些与水不混溶或基本上不混溶的。可以在目前公开的方法中使用的有机溶剂的非限制性实例是四氢呋喃(THF)。在特定实施方案中，有机溶剂是非极性的或基本上非极性的。在一些实施方案中，多于一种有机溶剂的混合物可以在目前公开的方法中使用。表面活性剂可以加入到该溶液中。
反应溶液可以被混合以形成微乳剂和该溶液还可以温育一段时间。这个温育步骤可以在室温下进行。在一些实施方案中，反应溶液在室温下混合约5分钟至约60分钟之间的一段时间，包括但不限于约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟和约60分钟。在特定实施方案中，该反应溶液在室温下混合约15分钟。
为了络合纳米沉淀的生物活性化合物与脂质，所述纳米沉淀物的表面可以是带电的，正或负。在一些实施方案中，该沉淀物将在形成后具有带电表面。具有正电荷表面的那些纳米沉淀物可以与阴离子脂质混合，而具有负电荷表面的那些纳米沉淀物可以与阳离子脂质混合。
在某些实施方案中，可以使用本领域中已知的任何方法增强或反转所述纳米沉淀物的表面电荷。例如，具有正电荷表面的纳米沉淀物可以被修饰以创建带负电荷的表面。或者，具有负电荷表面的纳米沉淀物可以被修饰以创建带正电荷的表面。
在创建具有正电荷表面的纳米沉淀的那些实施方案中，表面电荷可以通过添加柠檬酸钠至油包水型微乳剂变成负电荷。在一些实施方案中，柠檬酸钠以约15mM的浓度添加至微乳剂中。在一些这些的实施方案中，添加到微乳剂中的15mM柠檬酸钠的总体积是约125μl。柠檬酸钠是特别有用于赋予负表面电荷至纳米沉淀物，因为它是无毒的。
在一些实施方案中，所述沉淀物具有或被修饰为具有小于-10mV的ζ电位和在某些实施方案中，ζ电位在约-14mV和约-20mV之间，包括但不限于约-14mV、约-15mV、约-16mV、约-17mV、约-18mV、约-19mV和约-20mV。在特定实施方案中，纳米沉淀物的ζ电位是约-16mV。
随着乳剂的生产，具有脂质包被的纳米沉淀的生物活性物可以从非离子表面活性剂和有机溶剂纯化。纳米沉淀物可以使用本领域中已知的任何方法纯化，所述方法包括但不限于凝胶过滤色谱法。已经从非离子表面活性剂和有机溶剂纯化的纳米沉淀物是基本上不含非离子表面活性剂或有机溶剂的纳米沉淀物(例如，纳米沉淀物包括小于10％、小于1％、小于0.1％重量的非离子表面活性剂或有机溶剂)。在一些使用凝胶过滤纯化纳米沉淀物的那些实施方案中，沉淀物吸附到硅胶或相似类型的固定相，用极性有机溶剂(例如乙醇、甲醇、丙酮、DMSO、DMF)洗涤硅胶或相似的固定相以除去非离子表面活性剂和有机溶剂，所述纳米沉淀物用含有极性有机溶剂的水溶液从硅胶或其它固体表面洗脱。
在一些这样的实施方案中，用乙醇洗涤硅胶以及用水和乙醇的混合物洗脱纳米沉淀物。在特定实施方案中，用水和乙醇的混合物洗脱纳米沉淀物，其中所述混合物包括在约1∶9和约1∶1之间的体积/体积比，包括但不限于约1∶9、约1∶8、约1∶7、约1∶6、约1∶5、约1∶4、约1∶3、约1∶2、和约1∶1。在特定实施方案中，水与乙醇的体积/体积比是约1∶3。在一些这样的实施方案中，包含25ml水和75ml乙醇的混合物用于洗脱步骤。在使用例如旋转蒸发除去乙醇之后，纳米沉淀物可以分散在液体溶液(例如水)中，然后与有机溶剂和聚合物混合以形成纳米粒子。在某些实施方案中，制备所述纳米粒子的方法可以进一步包括其它或另外的纯化步骤。纯化可以通过本领域已知的任何方法实现，包括但不限于通过蔗糖密度梯度或其它适于形成密度梯度的介质离心。然而，可以理解的是，也可以使用其它纯化方法，如色谱法、过滤、相分配、沉淀或吸附。
DOPA-包被磷酸钙(CaP)平台可以封装含磷酸盐的药物，包括吉西他滨单磷酸酯、siRNA和其他(美国申请公开号2012/0201872)。如本文所公开，多种药物可以封装到PLGA纳米粒子效率，允许药物负载比例的微调。
在一个实施方案中，在PLGA NP中封装的吉西他滨单磷酸酯CaP核和CDDP核可以用于癌症治疗。特别是膀胱癌。非重叠的作用机制增加这两种药物在膀胱癌治疗中协同抗癌作用的可能性。CDDP+GC联合治疗培养的UMUC-3(人膀胱移行细胞癌)细胞的研究表明对细胞增殖的比例依赖的协同效应。在常规给药中，肿瘤组织内累积的两种药物之间的比例可以与初始给药的比例不同。用于联合治疗的单一载体(脂质体或聚合纳米粒子)的应用提供了解决在体内控制药物比例的这个难题的机会。
复乳剂已经被用于封装亲水性药物至PLGA NP。这个方法已经被低负载效率(＜1.0％)和有限的封装效率所限制。低水溶性和低油溶性CDDP的掺入甚至更是难题。在DOPA-CDDP核或CaP核(例如DOPA-GMP核)中的药物可以通过用按比例控制的纳米沉淀被封装到PLGA15k-PEG3500纳米粒子(PEG-PLGA NP)(方案3)。拴系的靶向配体(tethered targetingligand)茴香酰胺(MBA)被进一步锚定到PLGA15k-PEG 3500纳米粒子(MBA-PEG-PLGA NP)，其通过增强的渗透性和滞留(EPR)效应和特定的σ受体靶向机制而增加了药物的肿瘤积累。
方案1描述了用于制备示例性纳米粒子的合成路线。
方案1.用于制备含有两种生物活性化合物的聚合物纳米粒子的纳米沉淀法；一种化合物是纳米沉淀核(DOPA-CDDP核)的形式和其它化合物雷帕霉素是游离形式。
方案2描述了用于制备MBA-PEG-PLGA的合成路线。
方案2.MBA-PEG-PLGA的合成路线。
方案3描述了用于制备含有DOPA-CDDP核和DOPA-GMP核的MBA-PEG-PLGA NP的合成路线。
方案3.通过纳米沉淀法，含有DOPA-CDDP核和DOPA-GMP核的MBA-PEG-PLGA NP的制备。
方案4描述了生物活性化合物GMP和CDDP的按比例负载和递送。
方案4.
在一些实施方案中，第一反相微乳剂具有与第二反相微乳剂相同的或不同的pH。
在一些实施方案中，用乙醇洗涤纳米沉淀物，并且洗涤步骤可以实施约1-5次，包括1、2、3、4和5次。
生物活性化合物包括那些可以与离子种类组合以形成盐形式的纳米沉淀物。这类有用的生物活性化合物公开在美国申请公开号2012/0201872和PCT/US2013/061985，其各自以其全文并入本文。前体可以组合阳离子，如In+3、Gd+3、Mg+2、Zn+2和Ba+2或阴离子如卤化物，以在原位形成纳米沉淀物，即在反相微乳剂的混合期间。在后一种情况下，优选前体是顺式-二氨基二氢铂(II)。优选纳米沉淀物形式的生物活性化合物是顺铂或吉西他滨单磷酸酯。后者可以是含有磷酸钙的沉淀核。可以共负载的生物活性化合物包括疏水性化合物的游离形式。优选的疏水性药物是雷帕霉素。
其它化合物现在将被说明。“低溶解度生物活性化合物”是指具有对活细胞、组织或生物体具有所需作用(例如治疗作用)的任意物质，或可以与活细胞、组织或生物体的组分(例如酶)所需相互作用并且是不明显溶于水和油的物质或可以溶于水和/或油的生物活性化合物，如前体，其能够与离子组合以形成不明显溶于水和油的纳米沉淀物。该低溶解度生物活性剂在生理条件下也不是明显溶解的。优选的生物活性剂可以形成纳米沉淀物并且在25℃的水中具有小于10mg/ml的溶解度。不像现有技术，本文描述的主题有利地利用了低溶解性或不溶性的活性剂和其纳米沉淀物。因此，优选生物活性化合物或其纳米沉淀物在25℃的水中具有小于8mg/ml的溶解度。更优选生物活性化合物或其纳米沉淀物在25℃的水中具有小于5mg/ml的溶解度。最优选生物活性化合物或其纳米沉淀物在25℃的水中具有小于3mg/ml的溶解度。
在一些实施方案中，低溶解度生物活性化合物包括在水和油中基本上不溶的化合物。在本文所述的聚合物纳米粒子中有用的生物活性化合物组合离子(离子种类)，例如阴离子如卤化物，或阳离子，以形成纳米沉淀物。在一些实施方案中，纳米沉淀物基本上由生物活性化合物和脂质组成。换言之，不存在是种子材料的其它离子核材料。
值得注意的是当根据本文描述的方法制备以形成本文所述的纳米沉淀物时，可以利用可溶性生物活性化合物，特别是可溶性前体化合物。一个实例是与卤化物盐组合以形成纳米沉淀物的顺铂前体。另一个实例是依托泊甙磷酸酯()，其是水溶性的。然而，使用本文描述的方法，包含在第一反相乳剂中的依托泊甙磷酸酯可以与包含在第二反相乳剂中的InCl3相接触。此处形成的依托泊甙磷酸In盐是不溶的并且形成纳米沉淀物。
生物活性化合物可以包括但不限于多核苷酸、多肽、多糖、有机和无机小分子。术语“生物活性化合物”包括天然存在的和合成的生物活性化合物。术语“生物活性化合物”可以是指与生物分子相互作用的检测或诊断物质，以提供可检测的反映特定的生理或病理事件的读数。
示例性化合物包括无机复合物如铂配位复合物，其包括顺铂、卡铂、羟基脲、安吖啶、甲基苄肼、米托坦、米托蒽醌、左旋咪唑和六甲蜜胺、紫杉醇。
可以形成纳米沉淀物的其他特定生物活性化合物和它们的离子对在美国申请公开号2012/0201872和PCT/US2013/061985中公开，其各自以其全文并入本文。所述基本上不溶的生物活性化合物可以是化疗药物。在其它实施方案中，生物活性化合物包含感兴趣的多核苷酸或感兴趣的多肽，如本文别处所描述的沉默元件(例如siRNA)。
生物活性化合物可以是药物，包括但不限于抗微生物剂、抗生素、抗分枝杆菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、肿瘤剂、影响免疫反应的物质、血钙调节剂、有用的葡萄糖调节剂、抗凝血剂、抗血栓形成剂、抗高血脂剂、强心药、拟甲状腺素和抗甲状腺药物、肾上腺素能剂、抗高血压剂、胆碱能药、抗胆碱能药、解痉药、抗溃疡剂、骨骼肌和平滑肌松弛剂、前列腺素、过敏反应的一般性抑制剂、抗组胺剂、局部麻醉剂、镇痛药、麻醉性拮抗药、止咳药、镇静催眠剂、抗惊厥药、抗精神病药、抗焦虑剂、抗抑郁剂、食欲抑制药、非甾体抗炎剂、甾体类抗炎剂、抗氧化剂、血管活性剂、骨活性剂、抗关节炎药和诊断剂。优选的抗病毒药物包括替诺福韦、阿德福韦、阿昔洛韦单磷酸和L-胸苷单磷酸。在一个优选的实施方案中，生物活性化合物是抗癌药。在这个实施方案中，优选生物活性化合物是顺铂及其类似物、依托泊苷单磷酸、阿仑膦酸、帕米膦酸和吉西他滨单磷酸和其盐、酯、构象异构体和前药。
如本文所用，术语“递送”是指将物质或分子(例如多核苷酸、生物活性化合物、药物)转移到生理部位、组织或细胞。这包括递送至细胞的胞内部分或胞外空间。如本文所用，术语“胞内的”或“胞内地”具有作为本领域中理解的通常含义。通常，细胞内的空间，其是由一个膜包围的，被定义为“胞内”空间。类似地，如本文所用，术语“胞外的”或“胞外地”具有如本领域中理解的通常含义。通常，细胞膜外侧的空间被定义为“胞外”空间。
本文公开的方法提供了共负载纳米沉淀核和疏水性生物活性化合物或疏水性生物活性化合物衍生物或类似物。术语“衍生物”或“类似物”意指化学修饰的生物活性剂。例如，生物活性化合物可以通过本领域中已知的方法制备疏水性。通过制备生物活性化合物的疏水性类似物或衍生物，生物活性化合物可以在目前的方法中应用。
如果生物活性药物是疏水性的，它可以被共负载为游离药物。或者，生物活性化合物的疏水性形式可以被共负载。
联合治疗在HIV/AIDs和癌症治疗中是特别有效的。它提供了一种通用的方式以提高治疗功效，克服治疗抗性，和减少不良作用。(F.Greco，M.J.Vicent，Adv.DrugDelic.Rev.2009，61，1203；b)H.J.Broxterman，N.H.Georgopapadakou，Drug.Resist.Updat.2005，8，183.)组合药物的剂量和摩尔比的调节是用于促进协同效应而非拮抗效应。(a)L.D.Mayer，A.S.Janoff，Mol.Interv.2007，7，216；b)L.D.Mayer，T.O.Harasym，P.G.Tardi，N.L.Harasym，C.R.Shew，S.A.Johnstone，E.C.Ramsay，M.B.Bally，A.S.Janoff，Mol.Cancer Ther.2006，5，1854；c)P.G.Tardi，N.Dos Santos，T.O.Harasym，S.A.Johnstone，N.Zisman，A.W.Tsang，D.G.Bermudes，L.D.Mayer，Mol.Cancer Ther.2009，8，2266.)。然而，在常规施用的“鸡尾酒”之中个体药物的差别药代动力学和分布会导致在全身递送期间优化比例的偏差。这个事实使得从体外协同作用预测改善的体内治疗效果成为临床上的挑战。(N.Kolishetti，S.Dhar，P.M.Valencia，L.Q.Lin，R.Karnik，S.J.Lippard，R.Langer，O.C.Farokhzad，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2010，107，17939.)。
基于纳米材料的递送是一种统一双药药代动力学的方法。(Tardi，等人)。然而，负载具有实质不同的物理化学药物至设计的纳米载体中在历史上已经是困难的，其解释了为什么只有少数纳米粒子制剂(Tardi，等人)已经被报道。虽然已经进行了尝试，具有不同的溶解度、立体构型和其他理化性质的药物的精确负载和按比例递送仍然是一个挑战。(a)S.Aryal，C.M.Hu，L.Zhang，Mol.Pharm.2011，8，1401；b)C.M.Hu，L.Zhang，Biochem.Pharmacol.2012，83，1104)。此外，将个体化治疗模块组合在一起而不干扰其自身功能性增加了用于组合药物递送的紧凑纳米结构的复杂性。(a)S.H.Hu，X.Gao，J.Am.Chem.Soc.2010，132，7234；b)X.W.Chen，K.B.Sneed，S.Y.Pan，C.Cao，J.R.Kanwar，H.Chew，S.F.Zhou，Current drug metabolism 2012，13，640。
顺铂被认为是在几个一线联合治疗中的金标准。(J.Valle，H.Wasan，D.H.Palmer，D.Cunningham，A.Anthoney，A.Maraveyas，S.Madhusudan，T.Iveson，S.Hughes，S.P.Pereira，M.Roughton，J.Bridgewater，N.Engl.J.Med.2010，362，1273)。用于增强比例依赖性协同的顺铂相关的联合疗法的纳米粒子方法必须克服在负载顺铂与其它类型的药物至单个纳米粒子内以及与药物如核酸的其它基团可能的化学干扰的难题。(a)S.M.Lee，T.V.O′Halloran，S.T.Nguyen，Journal of the American Chemical Society2010，132，17130；b)X.Xu，K.Xie，X.Q.Zhang，E.M.Pridgen，G.Y.Park，D.S.Cui，J.Shi，J.Wu，P.W.Kantoff，S.J.Lippard，R.Langer，G.C.Walker，O.C.Farokhzad，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 2013，110，18638)。在水和油中无机顺铂的有限溶解度显著阻碍了具有高载药量和封装效率的NP开发。(S.Guo，Y.Wang，L.Miao，Z.Xu，C.M.Lin，Y.Zhang，L.Huang，ACS Nano 2013，7，9896.)
吉西他滨单磷酸酯(GMP)，一种有机亲水性药物，和如本文所述已经被用于与顺铂的联合治疗。吉西他滨是被用作与顺铂联合用于膀胱癌治疗的第一线治疗。然而，吉西他滨依靠核苷转运蛋白(J.R.Mackey，R.S.Mani，M.Selner，D.Mowles，J.D.Young，J.A.Belt，C.R.Crawford，C.E.Cass，Cancer research 1998，58，4349)进入到细胞内，其随后通过脱氧胞苷激酶磷酸化以形成用于DNA合成干扰的活性中间体。GMP是吉西他滨的活性中间体之一。(W.Plunkett，P.Huang，V.Gandhi，Anti-cancer drugs 1995，6 Suppl 6，7)。由于在GMP形成的第一磷酸基团的加入是限速步骤，GMP可以是一种有效治疗药物候选物以证明与顺铂联合的协同效应。(a)M.A.Moufarij，D.R.Phillips，C.Cullinane，Mol.Pharmacol.2003，63，862；b)O.G.Besancon，G.A.Tytgat，R.Meinsma，R.Leen，J.Hoebink，G.V.Kalayda，U.Jaehde，H.N.Caron，A.B.van Kuilenburg，Cancer Lett.2012，319，23)。然而，由于在物理化学性质的显著差异，顺铂和GMP的共封装预计将是难题。如本文所述，本文所述的NP可以按比例共封装和共递送天然顺铂和GMP而不损害药物活性。
二油酰磷脂酸(DOPA)包被磷酸钙核具有负载亲水性磷酸化药物(如GMP核)(Y.Zhang，W.Y.Kim，L.Huang，Biomaterials 2013，34，3447)、小干扰RNA(siRNA)(J.Li，Y.Yang，L.Huang，J.Control.Release 2012，158，108)、DNA(Y.Hu，M.T.Haynes，Y.Wang，F.Liu，L.Huang，ACS Nano 2013，7，5376)和肽(Z.Xu，S.Ramishetti，Y.C.Tseng，S.Guo，Y.Wang，L.Huang，J.Control.Release 2013，172，259)的能力；以及DOPA包被的顺铂核(CP核)，其中顺铂同时作为纳米载体和抗癌药物。(Guo等人，ACS Nano 2013；S.Guo，L.Miao，Y.Wang，L.Huang，J.Control.Release 2014，174，137)。在这两个类型的核之间的表面和尺寸相似性提供了一个方法学以统一广泛范围的具有显著不同的溶解性和极性的药物或生物分子成标准化的疏水性理化性质。如本文所述，统一双药的理化特性是用于比例受控负载和递送的一个提出的先决条件。
如本文所公开，NP已经被制备同时提供顺铂与GMP的按比例负载和递送。顺铂和GMP被配制成DOPA包被的CP核和DOPA包被的GMP核。如图21A所示，PLGA NP被用于掺入这两个单独的疏水性核。在这个实施方案中，CP核和GMP核具有类似的表面性质和这两种药物可以按比例封装到相同PLGA NP中。
如本文所述，使用溶剂置换法(图21A)和方案3共负载CP核和GMP核到单一PLGA NP中。测定GMP和顺铂的按比例负载和证实PLGA NP的按比例负载性质。
如本文所述，这种包含双药的NP可以是以所需的比率而按比例递送至恶性病部位(图21B)。如本文所述，通过释放动力学研究和细胞摄取研究在体外测试NP和通过肿瘤积累分析在体内测试NP。
如本文所述，两种药物以所需比例的共递送可以导致协同抗癌功效。基质丰富的人膀胱癌异种移植模型用于评估含有优化比例双药的NP的抗肿瘤功效。(J.Zhang，L.Miao，S.Guo，Y.Zhang，L.Zhang，A.Satterlee，W.Y.Kim，L.Huang，J.Control.Release，DOI10.1016/j.jconrel.2014.03.016)。协同抗癌作用是通过基于蛋白质机理分析而进一步确定。如本文所述，顺铂已经以精确的按比例控制与另一种亲水性药物共封装在相同NP中。
本文所述的聚合物纳米粒子用于哺乳动物组织培养系统，动物研究中，和用于治疗目的。包含具有治疗活性的生物活性化合物的聚合物纳米粒子当表达或引入细胞时可以在治疗性应用中使用。所述聚合物纳米粒子可以为治疗目的施用或包含聚合物纳米粒子和附加药物载体的药物组合物可以被配制用于递送，即施用给对象，通过任何可用的途径，包括但不限于肠胃外(例如静脉内)、皮内、皮下、口服、经鼻、支气管、眼用、经皮(局部)、经粘膜、直肠和阴道途径。在一些实施方案中，递送的途径是静脉内、肠胃外、经粘膜、经鼻、支气管、阴道和口服。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包被剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。补充的活性化合物也可以掺入到组合物中。
如本领域普通技术人员将理解，目前公开的药物组合物被配制成与其意欲的施用途径是相容的。用于胃肠外(例如静脉内)、肌内、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，如苄醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的物质，如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于注射使用的药物组合物通常包括无菌液体溶液或分散体如本文别处描述的那些和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，适宜的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。该组合物应当是无菌的并且应当是易注射性程度的流体。在一些实施方案中，药物组合物在制造和储存的条件下是稳定的并且应当保存防止微生物如细菌和真菌的污染作用。通常，相关载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)和其适宜的混合物。微生物作用的预防可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂实现，例如对羟苯甲酸类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在一些实施方案中，等渗剂例如糖类、多元醇如甘露醇或山梨糖醇或氯化钠包括在制剂中。注射制剂的延长吸收可以通过在制剂中包含延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶而实现。
无菌注射溶液可以通过如本文别处所述的过滤灭菌制备。在某些实施方案中，用于注射的溶液是不含内毒素的。通常，分散体是通过将所述聚合物纳米粒子掺入到含有基础分散介质和来自上述列举的所需其它成分的无菌载体内而制备的。在无菌粉末被用于制备无菌注射溶液的那些实施方案中，溶液可以通过真空干燥和冷冻干燥制备，从其先前无菌过滤的溶液产生了活性成分粉末加上任何另外所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。口服组合物可以使用用作漱口剂的流体载体制备。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以包含作为组合物的一部分。口服组合物可以包括甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯，或橙子调味剂。
对于吸入施用，目前公开的组合物可以气溶胶喷雾的形式从加压容器或分配器或喷雾器递送，加压容器或分配器含有适宜的推进剂，例如气体如二氧化碳。也可以使用液体气溶胶、干粉等。
目前公开的组合物的全身施用也可以通过经粘膜或经皮方式。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适于屏障渗透的渗透剂。这类渗透剂是在本领域中公知的，例如用于经粘膜施用包括洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过应用鼻喷雾剂或栓剂实现。对于经皮施用，活性化合物配制成如本领域中公知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。
有利的是配制成易于施用和剂量均匀的单位剂量形式的口服或肠胃外组合物。本文使用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗对象的物理上离散的单位；每个单位含有计算的预定量活性化合物以产生与所需药物或化妆品载体相关的所需治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格根据和直接依赖于(a)活性化合物的独特性质和要实现的特定治疗效果，和(b)在化合物领域中用于个体治疗的这种活性化合物的固有限制。在本文别处提供了关于剂量的指导。
本发明还包括提供本文所述聚合物纳米粒子的制品。该制品可以包括含有适合于本发明方法的组合物的小瓶或其它容器以及任何干燥的或液体形式的载体。该制品还包括在容器上标签形式的和/或在包装容器的盒子中包括的插页形式的用于实施本发明方法的说明。该说明还可以印刷在包装小瓶的盒子上。该说明包含信息如足够剂量和施用信息以允许对象或在该领域工作人员施用所述药物组合物。据预计，该领域工作人员包括可能施用该组合物的任何医生、护士、技师、配偶或其他看护者。该药物组合物还可以由对象自我施用。
生物活性化合物递送至细胞可以包括体外方法，离体方法，其中生物活性化合物递送到细胞发生在对象体外(然后转染细胞可以移植到对象)，和体内方法，其中所述递送发生在对象自身体内。
本文描述的包含生物活性化合物的聚合物纳米粒子可以用于治疗对象中的疾病或不希望的状况，其中生物活性化合物当表达或引入细胞内时具有针对所述疾病或不希望的状况的治疗活性。生物活性化合物以治疗有效量施用给对象。在生物活性化合物包含多核苷酸的那些实施方案中，当感兴趣的多核苷酸以治疗有效量施用给对象时，感兴趣的多核苷酸或其编码的多肽能够治疗所述疾病或不希望的状况。
当提及生物活性化合物时，“治疗活性”意指当施用给有需要的对象时，分子能够引发所需的药理学或生理学作用。
如本文所用，术语“治疗”或“预防”是指获得所需的药理学和/或生理学作用。作用就完全或部分预防特定感染或疾病或迹象或其症状而言可能是预防性的，和/或就部分或完全治愈感染或疾病和/或归因于感染或疾病的不利作用而言可能是治疗性的。因此，该方法“预防”(即延迟或抑制)和/或“减少”(即降低，减缓或改善)在接受本发明组合物的对象中疾病或病症的不利作用。对象可以是任何动物，包括哺乳动物如人类，包括但绝不限于家养动物如猫或犬对象，农场动物如但不限于牛、马、山羊、绵羊和猪对象，野生动物(无论在野外或在动物园中)，研究动物如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、狗、猫等，鸟类如鸡、火鸡、鸣禽等，即用于兽医医药用途。
待治疗的疾病或不希望的状况可以包括任何类型的能够被治疗的状况或疾病。在一些实施方案中，待治疗的疾病或不希望的状况是癌症。如本文别处所述，术语“癌症”包括任何类型的未经调节的细胞生长和包括所有形式的癌症。在一些实施方案中，待治疗的癌症是转移癌。特别地，癌症可能对已知的治疗具有抗性。检测癌症生长或进展抑制作用的方法在本领域中是已知的，包括但不限于测量原发肿瘤的大小以检测其尺寸的减小，延迟的继发性肿瘤外观，减慢的继发性肿瘤进展，减少的继发性肿瘤发生，和减缓的或降低的疾病继发效应的严重性。
本领域技术人员应当理解的是所述聚合物纳米粒子可以单独或与包括但不限于外科手术治疗、放疗或用任何类型治疗剂如药物的治疗的其它治疗方式联合使用。在对象患有癌症的那些实施方案中，所述聚合物纳米粒子可以组合本领域中公知的任何化疗剂一起递送。
纳米粒子的聚合物表面可以是PEG化的。术语“聚合物-PEG缀合物”还指这些聚合物-PEG-靶向配体缀合物和包含聚合物-PEG靶向配体缀合物的纳米粒子。PEG化通过减少经由网状内皮(RES)系统的纳米粒子清除而增强了循环半衰期。
在一些那些实施方案中，所述表面包括的聚合物-PEG缀合物浓度为表面的约4摩尔％至约15摩尔％，包括但不限于约4摩尔％、约5摩尔％、约6摩尔％、约7摩尔％、8摩尔％、约9摩尔％、约10摩尔％、约11摩尔％、约12摩尔％、约13摩尔％、约14摩尔％，和约15摩尔％的PEG。PEG的更高百分比值(以摩尔％表示)也已发现是有用的。有用的摩尔％值包括从约12％摩尔至约50摩尔％的那些。优选所述值是从约15摩尔％至约40摩尔％。还优选从约15％摩尔至约35摩尔％的值。最优选的值是从约20摩尔％至约25％摩尔，例如23摩尔％。
脂质-PEG缀合物的聚乙二醇部分可以具有范围从约100至约20,000克/摩尔的分子量，包括但不限于约100克/摩尔、约200克/摩尔、约300克/摩尔、约400克/摩尔、约500克/摩尔、约600克/摩尔、约700克/摩尔、约800克/摩尔、约900克/摩尔、约1000克/摩尔、约5000克/摩尔、约10,000克/摩尔、约15,000克/摩尔和约20,000克/摩尔。在一些实施方案中，脂质-PEG缀合物包含具有约2000克/摩尔分子量的PEG分子。在某些实施方案中，脂质-PEG缀合物包含DSPE-PEG2000。
在一些实施方案中，该表面包括靶向配体，从而形成被靶向纳米粒子。“靶向配体”是指将物理结合分子或复合物靶向到被靶向的细胞或组织的分子。如本文所用，术语“物理结合”是指两个分子之间的共价或非共价相互作用。
靶向配体可以包括但不限于小分子、肽、脂质、糖、寡核苷酸、激素、维生素、抗原、抗体或其片段、特异的膜-受体配体、能够与抗配体反应的配体、促融合肽、核定位肽或这类化合物的组合。靶向配体的非限制性实例包括去唾液酸糖蛋白、胰岛素、低密度脂蛋白(LDL)、叶酸、苯甲酰胺衍生物、包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的肽和针对细胞表面分子的单克隆和多克隆抗体。在一些实施方案中，小分子包含苯甲酰胺衍生物。在一些这样的实施方案中，所述苯甲酰胺衍生物包含茴香酰胺。
一些靶向配体包括在表面和靶向配体之间的中间分子，其是共价结合到表面和靶向配体两者的。在一些这样的实施方案中，中间分子是聚乙二醇(PEG)。
“被靶向的细胞”是指靶向配体向其募集物理结合分子或复合物的细胞。靶向配体可以与靶细胞的一或多种组分相互作用。被靶向的细胞可以是任何细胞类型或在任何发育阶段，表现不同表型，和可以是在各种病理状态(即异常和正常状态)。例如，所述靶向配体可以与微生物(即原核细胞(细菌)、病毒、真菌、原生动物或寄生物)或真核细胞(例如上皮细胞、肌细胞、神经细胞、感觉细胞、癌细胞、分泌细胞、恶性细胞、类红细胞和淋巴细胞、干细胞)上正常的、异常的和/或独特的成分相关联。因此，靶向配体可以与靶细胞上的成分相关联，其是疾病相关抗原，包括例如肿瘤相关抗原和自身免疫疾病相关抗原。此类疾病相关抗原包括例如生长因子受体、细胞周期调节物、血管生成因子和信号传导因子。
在一些实施方案中，靶向配体与被靶向的细胞的细胞表面蛋白相互作用。在一些这些实施方案中，能够结合靶向配体的细胞表面蛋白的表达水平在被靶向细胞中相对于其它细胞是更高的。例如，癌细胞过表达某些细胞表面分子，如HER2受体(乳腺癌)或σ受体。在某些所述靶向配体包括苯甲酰胺衍生物如茴香酰胺的实施方案中，靶向配体将所关联的聚合物纳米粒子靶向至σ受体过表达细胞，其可以包括但不限于癌症细胞如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、肾癌、结肠癌、肉瘤、乳腺癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤和前列腺癌(Aydar，Palmer，和Djamgoz(2004)Cancer Res.64：5029-5035)。
因此，在一些实施方案中，被靶向细胞包括癌细胞。术语“癌症”或“癌症的”是指或描述在哺乳动物中通常由未调节的细胞生长所表征的生理状况。如本文所用，“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指通过这种未调节的细胞生长所表征的细胞。术语“癌症”包括所有类型的癌症，包括但不限于各种形式的癌症、黑色素瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病，包括但不限于膀胱癌、脑瘤、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、喉癌、肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，被靶向癌细胞包括肺癌细胞。术语“肺癌”是指所有类型的肺癌，包括但不限于小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC，其中包括大细胞肺癌、鳞状细胞肺癌和肺腺癌)和混合的小细胞/大细胞肺癌。特别地，纳米粒子用于抗黑色素瘤。
在一些实施方案中，特别是其中聚合物纳米粒子的直径小于100nm的那些，所述聚合物纳米粒子可以用于递送生物活性化合物透过血脑屏障(BBB)到中枢神经系统或透过胎盘屏障。可用于靶向BBB的靶向配体的非限制性实例包括运铁蛋白和乳铁蛋白(Huang等人(2008)Biomaterials29(2)：238-246，其以全文并入本文参考)。此外，聚合物纳米粒子可以被胞吞转运透过内皮至骨骼肌和心肌细胞内。例如，外显子跳跃寡核苷酸可被递送以治疗Duchene肌肉营养不良症(Moulton等人.(2009)Ann N Y Acad Sci 1175：55-60，其以全文并入本文参考)。
治疗有效量的聚合物纳米粒子的递送可以通过施用包括治疗有效剂量的生物活性化合物或纳米粒子的药物组合物而获得。“治疗有效量”或“剂量”意指足以引起所需治疗效果的递送系统或其中包含的生物活性化合物的浓度。
如本文所用，“有效量”是足以引起有益的或所需的临床或生化结果的量。有效量可以一次或多次施用。
所述聚合物纳米粒子或生物活性化合物的有效量将根据体重、性别、年龄、和对象的病史而变化。影响有效量的其它因素可以包括但不限于对象状况的严重程度，正被治疗的病症，该化合物或复合物的稳定性，和，如果需要的话，正在与多核苷酸递送系统一起施用的佐剂治疗剂。确定功效和剂量的方法是本领域技术人员已知的。参见例如Isselbacher等人.(1996)Harrison’s Principles of Internal Medicine 13ed.，1814-1882，并入本文参考。
这类化合物的毒性和治疗功效可以通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中确定，例如确定LD50(致死50％群体的剂量)和ED50(50％群体中治疗有效的剂量)。在毒性(例如免疫毒性)和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，它可以被表示为比例LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。虽然可以使用表现出毒副作用的化合物，应当小心设计递送系统，其将此类化合物靶向至受影响组织部位以最小化对未感染细胞的潜在损害和因此减少副作用。
从细胞培养物测定和动物研究中获得的数据可以用于配制一系列人类使用的剂量。这类化合物的剂量优选处于包括具有很少或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可以根据所使用的剂量形式和利用的施用途径在此范围内变化。对于在目前公开的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以从细胞培养测定最初评估。剂量可以在动物模型中配制以达到包括如在细胞培养中确定的IC50(即实现症状的半数最大抑制作用的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可以用于更准确地确定人中的有用剂量。测量血浆中的水平，例如通过高效液相色谱法。
该药物制剂可以以不同的时间间隔和在所要求的不同时期内施用，例如每天多次，每日，隔日，在约1至10周、在2至8周、在约3至7周、约4、5或6周等之间每周一次。本领域技术人员将理解某些因素可以影响有效治疗对象所需的剂量和时间，包括但不限于疾病、病症或不希望状况的严重程度，以前的治疗，对象的一般健康状况和/或年龄，和存在的其它疾病或不希望的状况。通常，对象的治疗可以包括单一治疗或，在许多情况下，可以包括一系列治疗。此外，对象的治疗可以包括单一化妆品应用或，在一些实施方案中，可以包括一系列化妆品应用。
可以理解的是化合物的适当剂量取决于其效力和可以任选地适合于特定的接收者，例如通过施用增加剂量直至获得预先选择的所期望的响应。可以理解的是对于任何特定动物对象的具体剂量水平可以取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、对象的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、任何药物组合和被调节的表达或活性的程度。
根据目前公开的主题，本领域普通技术人员将理解目前公开的化合物及其药物组合物可以直接施用给细胞、细胞培养物、细胞培养基、组织、组织培养物、组织培养基等。当提及本发明的递送系统，术语“施用”和其衍生词，包括任何允许化合物接触细胞的方法。目前公开的化合物或其药物组合物可以在体外或离体施用给(或接触)细胞或组织。目前公开的化合物或其药物组合物也可以通过施用给个体对象，例如患者，而体内施用给(或接触)细胞或组织，例如通过全身施用(例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内施用)或局部应用，如本文别处所述。
以下实施例是以说明的方式而不是通过限制的方式提供。
实施例
实施例1-4
材料和方法：
tBOC-PEG3500-NH2.HCl和mPEG3000-NH2.HCl购自JenKem Technology USA Inc。酸终止的PLGA购自DURECT公司。顺铂(CDDP)购自Acros Organics。对-茴香酸，EDC，NHS DIPEA和二氯甲烷购自Sigma-Aldrich。Luc-siRNA购自Sigma-Aldrich，雷帕霉素购自ChemieTek。
细胞系：
A375M细胞在RPMI 1640培养基(Gibco)中培养。
PLGA-PEG-MBA的合成：
800mg的Boc-PEG-NH2.TFA，278mg的茴香酸(8当量)和160μl的DIPEA(4当量)溶解于10ml DCM中。283μl的DIC(8当量)加入到混合物中。26小时后，MBA-PEG-NH2-Boc通过沉淀到乙醚中纯化并用乙醚洗涤。产量：530mg，66wt％。使用1H NMR确认MBA-PEG-Boc的纯度。胺基被定量消耗。
在室温下520mg的Boc-PEG-MBA溶解于4.5ml的TFA/DCM(1∶2，v/v)混合物中。2小时后，在真空下除去溶剂。沉淀重新溶解在DCM中并沉淀到乙醚中。固体化合物然后用乙醚洗涤和在真空下干燥。产量：470mg，90wt％。NMR图谱表明Boc基被完全去保护。
445mg的MBA-PEG-NH2.TFA(3500，0.131mmol)，1500mg的PLGA(15kDa，0.1mmol)和132μl的DIPEA(0.504mmol)溶解在6ml DCM中。250μl的DIC(1.0mmol)加入到混合物中。26小时后，聚合物然后通过在甲醇中沉淀纯化并用甲醇洗涤。产量：1200mg，62wt％。MBA-PEG-PLGA的结构通过1H NMR证实。
mPEG-PLGA的合成：
378mg的mPEG-NH2.TFA(3000，0.126mmol)，1500mg的PLGA(15kDa，0.1mmol)和88μl的DIPEA(0.5mmol)溶解在6ml DCM中。156μl的DIC(1.0mmol)加入到混合物中。24小时后，它通过沉淀到甲醇中纯化，用甲醇洗涤。产量：1200mg，64wt％。
DOPA-CDDP核的制备：
首先，100μL的200mM顺式-[Pt(NH3)2(H2O)2](NO3)2分散于环己烷/Igepal CO-520(71∶29，V∶V)和环己烷/triton-X100/己醇(75∶15∶10，V∶V∶V)的混合物组成的溶液中以形成良好分散的、油包水反相微乳剂。通过加入100μL在水中的800mM KCl到一个分离的8.0mL油相中制备含KCl的另一个乳剂。100μL DOPA(20mM)加入到CDDP前体相中并搅拌该混合物。20分钟后，混合两种乳剂，反应再进行30分钟。之后，16.0mL乙醇加入到微乳剂中，该混合物以12,000g离心至少15分钟以除去环己烷和表面活性剂。用乙醇充分洗涤2-3次后，沉淀重新分散在3.0ml氯仿中并储存在玻璃小瓶中以用于进一步修饰。
DOPA-GMP核的制备：
为制备DOPA-GMP核，100μL的60mM GMP与500μL的25mM Na2HPO4混合，然后分散在含有环己烷/Igepal CO-520(71∶29，V∶V)的20mL油相中，而其它的乳剂含有600μL的2.5MCaCl2。600mL于氯仿中的20mM DOPA加入到磷酸盐相中。然后混合两个分离的微乳剂并搅拌5分钟。另外的400mL的20mM DOPA加入到乳剂中。乳剂继续再搅拌20分钟，之后加入40mL无水乙醇。之后，混合物以12,000g离心至少15分钟以除去环己烷和表面活性剂。在用乙醇充分洗涤2-3次后，沉淀重新分散在2.0ml氯仿中和储存在玻璃小瓶中用于进一步修饰。
负载不同药物的PLGA/PLGA-PEG-MBA(1∶1重量/重量)NP的制备：
使用本文描述的纳米沉淀法将核和/或药物负载到MBA-PEG-PLGA NP内。药物和10mg聚合物溶于200μl THF中并在室温搅拌下滴加到2ml水中。将所得的NP悬浮液在室温下开放式搅拌6小时以除去THF。NP通过超滤进一步纯化(15分钟，3000×g，Amicon Ultra，具有50,000NMWL的Ultracel膜，Millipore，Billerica，MA)。然后，PLGA-PEG NP重悬，用水洗涤，并同样收集。为确认茴香酰胺的靶向能力，0.1wt％的DiI掺入PEG-PLGA NP中作为荧光探针。
纳米粒子(NP)的表征：
使用高效液相色谱法(HPLC，Waters，λ＝277nm)测定雷帕霉素的负载和封装效率；使用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS，NexIONTM 300，Perkin Elmer Inc)测定CDDP的负载和封装效率；通过紫外可见分光光度计(UV，800，Beckman Coulter)和使用液体闪烁分析仪(TRI-CARB2900TR，Packard Bioscience Co)的3H标记的CMP掺入测定GMP的负载效率。使用Malvern ZetaSizer Nano系列(Westborough，MA)测定粒子的尺寸分布。使用JEOL100CX II TEM(JEOL，日本)获得NP的TEM图像。NP用2％醋酸铀负染色。对约100个NP进行分析以计算每个PLGA NP中CDDP核的平均数目。
细胞摄取：
还使用ICP-MS测量细胞中NP摄取。A375M-Luc细胞接种于含有1ml培养基的12孔板中(1.5×105细胞/孔)。24小时后，以20μM CDDP的浓度将1ml游离药物，含有单独或组合CDDP的被靶向PLGA NP和含有单独或组合CDDP的非被靶向PLGA NP与细胞孵育。4小时后，用裂解缓冲液处理细胞。使用ICP-MS测量CDDP的浓度。
CDDP和雷帕霉素从PLGA NP的体外释放：
雷帕霉素浓度通过高效液相色谱法(HPLC)测定，使用保持在25℃的CLC-ODS-18柱(5cm，4.6×150mm；Waters公司，Milford，MA)在277nm紫外线检测器进行。60％乙腈和40％水的混合物(v/v)作为流动相，以0.5mL min-1的流速递送。注射体积是20μL，保留时间是约5分钟。另外，使用ICP-MS测定Pt浓度。
使用透析技术研究来自不同PLGA NP的雷帕霉素和CDDP在具有0.25％吐温-80的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)中的释放。具有0.85mg/mL最终雷帕霉素浓度的雷帕霉素负载胶束放置在具有截留分子量3000Da的透析管中并在37℃于具有200rpm搅拌速度的热控制震荡器中对含有0.25％吐温-80的15mL PBS(pH 7.4)透析。在指定的时间取出200μL样本。通过RP-HPLC测定雷帕霉素浓度；使用ICP-MS测量Pt浓度。
用新鲜培养基替换用于测量的样品并且将在每个时间点释放到培养基中的药物累积量计算为释放的总药物对药物初始量的百分比。所有的实验一式两份进行并且数据报告为三个独立实验的平均值。
CDDP和GMP从PLGA NP的体外释放：
除了没有吐温-80加入到系统中，使用如上面所述的在相同pH和温度条件下的相同透析技术进行GMP和CDDP从PLGA NP的体外释放。分别负载100μg/mL的GMP和CDDP或共负载100μg/mL的5∶1比例的GMP和CDDP的500μL PLGA NP加入到透析袋中并且透析96小时。在DOPA-GMP核的制备中，痕量放射性胞苷5′单磷酸(CMP)[5-3H]二钠盐(Moravek Bio Inc，1mCi/mL)与GMP混合并作为截留GMP的标记物。在每个预定的时间点(1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h和96h)，取出400μL样品并且用新鲜培养基替换。然后用ICP-MS和闪烁分析器分别在指定的时间测定Pt浓度和GMP浓度。所有实验一式三份进行并且数据报告为三个独立实验的平均值±SD。
细胞活性：
细胞以2×103个细胞/孔的密度在96孔板上接种24小时。在药物暴露2天后存活的细胞团用MTS法测定。根据制造商的方案，含有四唑鎓化合物MTS的CellTiter 96 AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay(Promega，Madison，WI)试剂盒用于测定细胞活性。
药物组合分析：
通过使用由Chou和Talalay描述的方法进行药物组合分析。
凋亡检测：
根据制造商的说明，使用BD ApoAlert膜联蛋白V-FITC凋亡试剂盒(BDBiosciences，美国)进行膜联蛋白V/碘化丙啶(PI)染色的凋亡定量。在药物处理24小时后收集悬浮的和贴壁的细胞。RAPA的浓度是0.36μM和CDDP的浓度是2.0μM。CDDP对RAPA的摩尔比是5.5。使用CellQuest Pro软件(版本5.1.1；BD Biosciences，美国)在FACS Calibur流式细胞仪分析细胞。
体内抗癌功效：
500万A375M细胞皮下注射到5-6周龄和体重18-22克的雌性无胸腺裸鼠中。8天后，将小鼠随机分成4组(每组4只小鼠)。每周静脉注射PLGA NP和生理盐水作为对照治疗小鼠。施用0.30mg/kg的Pt和0.15mg/kg雷帕霉素的剂量。此后，监测肿瘤生长和体重。肿瘤体积使用下列公式计算：TV＝(L x W2)/2，W小于L。最后，使用CO2吸入法处死小鼠。在治疗实验完成后，在治疗后收集主要器官并且用福尔马林固定以及使用标准方法进行常规H&E染色。使用尼康光学显微镜(尼康)收集图像。对于共负载DOPA-GMP和DOPA-CDDP核的PLGA NP体内初步抗癌研究，在携带UMUC-3人膀胱移行细胞癌和NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞异种移植组合的裸鼠上进行实验：
8天后，将小鼠随机分成4组(每组2只小鼠)。静脉注射PLGA NP和盐水作为对照来治疗小鼠，总共3次。施用1.6mg/kg剂量的Pt和8.0mg/kg剂量的GMP。肿瘤生长和体重如上所述类似监测。
Masson三色染色：
石蜡包埋的肿瘤切片脱蜡和再水化。根据制造说明书使用Masson三色试剂盒(Sigma-Aldrich)，载玻片然后被染色。
TUNEL测定：
肿瘤固定在4.0％多聚甲醛(PFA)中，石蜡包埋，并在UNC LinebergerComprehensive Cancer Center Animal Histopathology Facility被切片。为检测肿瘤组织中的凋亡细胞，使用DeadEndTM荧光TUNEL系统(Promega，Madison，WI)按照制造商的方案进行TUNEL测定。绿色荧光染色的细胞核定义为TUNEL阳性细胞核。通过使用荧光显微镜(尼康，东京，日本)监测TUNEL阳性细胞核。细胞核用含4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)Vectashield(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)染色。在30倍放大倍数下拍摄的3个切片图像中TUNEL阳性细胞被计数以定量凋亡。
CD-31抗体染色。为观察脉管系统，用CD31初级抗体(Abeam，Cambridge，MA)的1∶250稀释液在4℃孵育切片过夜，随后用FITC标记的次级抗体(1∶200，Santa Cruz，CA)在室温孵育1小时。切片也用DAPI染色并覆盖盖玻片。使用尼康光学显微镜(尼康公司，东京，日本)观察切片。
石蜡包埋的肿瘤切片依次用Alexa 647染色用于α-SMA(α平滑肌肌动蛋白)免疫荧光染色和用FITC染色用于TUNEL测定。对于α-SMA的免疫荧光，通过二甲苯和分级醇系列将载玻片脱石蜡。在抗原修复缓冲液(Tris-EDTA缓冲液，pH 9.0)中回收抗原之后，所有切片用1％牛白蛋白(Sigma，美国)在室温阻断1小时，之后它们与初级多克隆兔抗-α-SMA抗体(Abeam，Cambridge，MA，USA)以1∶100稀释度在4℃过夜孵育。免疫复合物用相应的Alexa 647标记的山羊抗大鼠次级抗体以1∶100稀释度在黑暗中在室温显现1小时。载玻片然后用PBS漂洗，用4％甲醛预固定。然后根据制造商的说明使用凋亡检测试剂盒(Promega，Madison，WI)通过TdT-依赖性dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)测定检测原位凋亡。载玻片然后用PBS漂洗并且用DAPI的Vectashield(Vector Laboratories，Burlingame，CA)盖玻片盖上。评估所有染色和数字图像通过Eclipse Ti-U倒置显微镜(尼康公司，东京，日本)×20放大倍数获得和在Image J(National Institutes of Health)上定量分析。
实施例1
负载
DOPA-CDDP核，直径为12nm，被高效负载到MBA-PEG-PLGA NP内(图1B-D)。用82％的封装效率实现12重量％的药物负载(图2A)。RAPA也与DOPA-CDDP核一起封装(图2C)。虽然RAPA通过疏水相互作用被封装到PLGA NP的聚合物基质中，封装被药物和共聚物的疏水性嵌段之间的相容性所极大限制。当RAPA与PLGA的进料比是5重量％时，RAPA的封装效率仅为23％，相应的药物负载是仅1.15重量％(图2C)。然而，4.5重量％的DOPA-CDDP核的存在带来了分别高达80％和4重量％的EE和LE。DOPA-CDDP核的存在将RAPA负载增强了3.48倍。
透射电子显微镜(TEM)显示具有直径约40-50nm的球形NP形态，小于通过DLS测定的(图1B-D和图2B和D)。每个NP的DOPA-CDDP核的数量可以通过调节DOPA-CDDP核和MBA-PEG-PLGA之间的进料比控制。DOPA-CDDP核的形态和封装不受RAPA影响(图2E和F)。
实施例2
释放
两种药物以预定的、优化的速率和摩尔比的释放对有效联合治疗是至关重要的。这些参数必须是微调的以充分利用这些药物协同作用的益处。我们通过ICP-MS和HPLC测量CDDP和RAPA从NP释放的量(图3A)。类似地，观察CDDP和RAPA两者的持续释放率。每种药物的释放速率是互相独立的。测定MBA-PEG-PLGA NP的细胞摄取以确认MBA介导的靶向。如由ICP-MS所示茴香酰胺增强了约2倍的NP摄取(图3B)。
经由在pH7.4的PBS中37℃透析96小时以模拟生理条件研究CDDP和GMP从MBA-PEG-PLGA NP的体外释放动力学。评估仅负载DOPA-GMP核，仅负载DOPA-CDDP核或共负载DOPA-GMP核和DOPA-CDDP核的MBA-PEG-PLGA NP的释放曲线。从粒子释放的铂经ICP-MS测定。3H-标记的CMP(胞苷一磷酸)被用作为如前面所述的GMP释放测量的标记物。公知的突释现象经常在亲水性药物中观察到。例如，CDDP掺入PLGA15K-PEG5000NP在起始4小时后显示约50％的释放分数。吉西他滨封装的PLGA NP在不到6小时中显示60％的药物释放。在我们的研究中，当药物被封装在DOPA-包被核中时，我们的制剂仅有微不足道的突释(图12)。
分组T检验显示在组合的两种药物的释放动力学之间没有显著性差异(p＝0.784)，与预期的按比例释放谱一致。在观察到的释放速率中细微差别可能是由于DOPA-CDDP和DOPA-GMP核的不同组成所致。由于从MBA-PEG-PLGA NP的释放速率，这个差异将可能变得不显著，其是在该过程中的关键限速步骤。另一个有趣的观测是药物似乎从它们的单一制剂中更迅速释放，在RAPA/CDDP MBA-PEG-PLGA NP组合中也发现。这可能是由于在每个粒子中核数量的差异或不同药物的核之间相互作用所致。可以得出结论，CDDP和GMP从MBA-PEG-PLGA NP的释放动力学也表现出按比例关系。
实施例3
协同作用
就对培养中A375-Luc细胞的细胞毒性，我们评估了在RAPA和CDDP之间协同作用的程度。具有CDDP∶RAPA摩尔比5.5∶1的CDDP+RAPA游离药物组合物导致相比于游离CDDP和RAPA的IC50(分别为10μM和16μM)低得多的IC50值0.82μM(CDDP浓度)(图3C)。相比之下，具有CDDP∶RAPA摩尔比5.5∶1的(CDDP+RAPA)NP导致了相比于CDDP NP和RAPA NP的IC50(分别为2.1μM和1.2μM)甚至更低的IC50值0.30μM(CDDP浓度)(图3D)。使用Chou-Talalay等效线方程确定组合指数(CI)。2，4在IC50处组合的游离药物的CI是0.36，表明协同效应。经NP递送的组合CDDP和RAPA的细胞毒性相对游离药物组合是增强的。
A375-luc细胞凋亡在组合的CDDP和RAPA治疗后(以CDDP的IC50剂量)通过使用FITC-膜联蛋白V/PI染色测定(图3E，图4和图19-20)。图3E显示经流式细胞仪检测的凋亡细胞的数量。流式细胞仪结果与显微镜图像(图4)一致。RAPA使A375-luc黑色素瘤细胞对CDDP敏感。mTOR抑制剂可以通过阻断p21上调和诱导凋亡结果使肿瘤细胞对CDDP敏感。
我们测试了(RAPA+CDDP)NP的抗癌活性。RAPA NP和CDDP NP单独使用均具有最小效应(图5A)。(RAPA+CDDP)NP表现出显著的抗癌活性而不降低治疗动物的体重(图5)。H&E染色证实没有观察到肾毒性(图20)，支持了(RAPA+CDDP)NP既有效又安全的可能性。然后我们研究了治疗如何影响肿瘤微环境。首先，胶原蛋白，一种细胞外基质成分，用Masson三色染色。CDDP NP和(RAPA+CDDP)NP治疗显著减少了胶原蛋白量(图6)，可能便于NP灌注到肿瘤中和增强治疗作用(图7)。
总之，使用具有CDDP∶RAPA摩尔比约5.5∶1的(CDDP+RAPA)NP(4.5重量％/2.2重量％)，RAPA和CDDP对培养的A375M细胞存活率具有协同效应。单独的游离CDDP和RAPA(图4B)每个分别具有10μM和16μM的IC50。在组合中，CDDP和RAPA具有非常低的IC50值0.82μM(CDDP的浓度)。在组合中游离药物的Chou-Talalay组合指数(CI)是0.36，表明协同作用。被靶向NP的使用显著增强了组合的CDDP和雷帕霉素对细胞存活的作用(图4)。空NP没有作用，即使在浓度高达10mg/ml时。单独的CDDP NP和单独的RAPA NP的IC50分别为2.1μM和1.2μM，相比于游离药物是5倍和13倍降低。CDDP+RAPA NP的IC50是约0.3Mm(CDDP的浓度)和在IC50处的CI是0.50。这些结果证实了当在单个PLGA NP中组合时保持了CDDP和RAPA之间的任何协同作用。
通过α-平滑肌肌动蛋白(SMA)染色和通过TUNEL法的凋亡我们进一步研究了治疗对肿瘤成纤维细胞的作用(图8A)。CDDP NP和(RAPA+CDDP)NP诱导肿瘤细胞凋亡并也减少了成纤维细胞群，其可能导致较低水平的胶原蛋白。5个随机选择的显微镜视野包括在对照组中平均0.4％的TUNEL阳性细胞，在RAPA治疗组中7.8％，在CDDP治疗组中14.2％，和在联合治疗组中66.2％。25.1％的对照组细胞是SMA+。(RAPA+CDDP)NP在(RAPA+CDDP)NP治疗后几乎完全耗尽了这些仅有2.2％SMA+的细胞。(RAPA+CDDP)NP通过与癌症相关的成纤维细胞的耗尽和胶原蛋白表达的减少基本改变了肿瘤微环境。因此，(RAPA+CDDP)NP不仅靶向肿瘤细胞，而且靶向微环境中的成纤维细胞。
进行MTT测定以测试在培养的UMUC-3细胞中的抗癌作用。治疗48小时后，游离CDDP，游离CDDP和GMP组合，单独负载DOPA-GMP核和DOPA-CDDP核的单个MBA-PEG-PLGA NP，共负载DOPA-GMP核和DOPA-CDDP核的MBA-PEG-PLGA NP引起存活的UMUC-3细胞数目的剂量依赖性减少，虽然游离GMP在较高浓度下达到平稳状态。包含茴香酰胺的MBA-PEG-PLGA NP可能是通过σ受体介导的内吞作用进入细胞，而游离GMP通过核苷转运体进入细胞之前代谢成吉西他滨。核苷转运体的饱和可以解释游离GMP在更高浓度下的剂量-非依赖性反应。虽然，在游离CDDP和负载DOPA-CDDP核的MBA-PEG-PLGA NP的IC50之间存在细微差别，NP递送导致相比于游离药物(34.8μM的IC50)低得多的IC50值17.8μM。在IC50处的Chou-Talalay组合指数(CI)确定为0.41，证实了协同组合疗法和支持了进一步的在体内的肿瘤抑制研究。
实施例4
在体内
RAPA具有已知的抗血管生成性质。血管用抗CD31抗体染色(图8A)，显示出血管数量显著减少而单独用CDDP治疗的小鼠不受影响。血管生成的抑制在联合治疗组中是更显著的。也观察到血管正常化，与之前的乳腺癌报告相一致。NVP-BEZ235，一种磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)和mTOR的双重抑制剂，也肿瘤脉管系统具有正常化作用。正常化可能增强血流量和改善NP递送至肿瘤。为了表征血流量，血管面积经ImageJ定量和相对对照组数据归一化。(RAPA+CDDP)NP相对PBS对照组增加了约3倍的血管面积(图8)。
使用CDDP的IC50剂量用FITC-膜联蛋白V/PI染色测定用CDDP和RAPA治疗的A375M细胞凋亡(图4和19)。凋亡细胞的百分比通过流式细胞术测定并与显微镜结果(图4)一致。显然，RAPA使A375M黑色素瘤细胞对CDDP敏感。(RAPA+CDDP)NP的抗癌功效在荷瘤小鼠中进行测试。单独的RAPA NP和CDDP NP都具有最小的效力，而RAPA+CDDP NP最有效地减少了肿瘤体积。NP对治疗动物的体重没有影响(图9)和没有证据在治疗小鼠肾脏组织的H&E染色中可见肾毒性(图20)。
RAPA显示已知的抗血管生成特性。为研究RAPA的作用，肿瘤血管内皮细胞的免疫组织染色用抗CD31抗体进行。RAPA治疗降低了肿瘤血管的密度而CDDP没有作用。联合治疗具有比单独的RAPA更明显的作用。
我们通过TUNEL比较了单独的RAPA与RAPA+CDDP联合治疗对肿瘤细胞凋亡的作用(图5C)。在5个随机选择的显微镜视野中，对照组中TUNEL阳性细胞的平均百分比是0.1％，RAPA治疗组中18％，CDDP治疗组中28％，和联合治疗组中58％，提示RAPA通过抑制血管生成和通过与CDDP的协同作用抑制肿瘤生长。
进行研究以测试共负载DOPA-GMP和DOPA-CDDP核的MBA-PEG-PLGA NP在荷瘤小鼠中的抗癌功效。UMUC-3细胞与基质胶中的NIH 3T3成纤维细胞在皮下共接种。肿瘤进展5天直至体积达到150-200mm3。然后用在PLGA中组合的8mg/kg GMP和1.6mg/kg CDDP总共3次注射治疗小鼠(图14A)。负载单一药物的NP效果较差，而联合治疗导致了强效的肿瘤抑制。
递送药物的效力经由基于MBA-PEG-PLGA NP的递送大大增强。DOPA-CDDP核和RAPA协同作用以在体外和体内诱导肿瘤细胞凋亡。我们还以受控比例和高效率共封装DOPA-GMP和DOPA-CDDP核至MBA-PEG-PLGA NP中。这些NP表现出GMP和CDDP的受控释放谱。初步数据显示这些NP显示出在体外和体内对膀胱癌的协同效应。此外，疏水性和脂质包被的药物可以有效地装载在一起，创造机会以组合具有多样理化性质的生物活性化合物。
实施例5-15
化学物和材料：
获得吉西他滨单磷酸二钠盐(GMP，纯度≥97％)。
顺铂购自Sigma-Aldrich(Dorset，UK)。二油酰磷脂酸(DOPA)购自Avanti PolarLipids，Inc.(Alabaster，AL)。mPEG3000-NH2.HCl和tBOC-PEG3500-NH2.TFA购自JenKemTechnology USA Inc.(Allen，TX)。酸终止PLGA购自DURECT公司(Cupertino，CA)。N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)-丙基)碳二亚胺(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，二氯甲烷，tritonTM X-100， CO-520，对茴香酸，硝酸银和环己烷购自Sigma-Aldrich(St Louis，MO)，未进一步纯化。
细胞培养：
小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH 3T3)得自UNC Tissue Culture Facility。人膀胱移行细胞系(UMUC3)由William Kim博士(University of North Carolina at Chapel Hill，NC)惠赠。这两种细胞系培养于Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(DMEM)(Invitrogen，Carlsbad，CA)，补充有链霉素(100μg/mL)(Invitrogen)，青霉素(100U/mL)和分别的10％小牛血清(Hyclone，Logan，Utah)或10％胎牛血清(Sigma，St.Louis，MO)。细胞在具有5％CO2的加湿培养箱中在37℃培养。
实验动物：
在所有研究中使用的雌性无胸腺裸鼠是28-22g重和6-8周龄。
PLGA-PEG-MBA和PLGA-mPEG的合成：
对于PLGA-PEG-MBA的合成，tBoc-PEG3000-NH2.HCl(1当量)，茴香酸(8当量)和DIPEA(4当量)溶解在DCM中并且加入DIC(8当量)反应26小时获得MBA-PEG-Boc。在纯化和经NMR结构确认后，使用TFA/DCM(1∶2，v/v)混合物除去Boc保护基团以获得MBA-PEG-NH2.TFA。然后，MBA-PEG-NH2.TFA在DIPEA和DIC存在下缀合至PLGA(15kDa，0.1mmol)26小时并纯化。通过NMR证实PLGA-PEG-MBA结构。在PLGA-mPEG的合成中，mPEG-NH2.TFA(3000，0.126mmol)，PLGA(15kDa，0.1mmol)和DIPEA(0.5mmol)溶解在6ml DCM中并与DIC(1.0mmol)反应24小时。
CP核的制备：
如前面提及进行少许调整来制备CP核。(S.Guo，Y.Wang，L.Miao，Z.Xu，C.M.Lin，Y.Zhang，L.Huang，ACS Nano 2013，7，9896；S.Guo，L.Miao，Y.Wang，L.Huang，J.Control.Release 2014，174，137)。首先，300μL的200mM顺式-[Pt(NH3)2(H2O)2](NO3)2分散于环己烷/Ttriton-X100/己醇(75∶15∶10，V∶V∶V)和环己烷/Igepal CO-520(71∶29，V∶V)的混合溶液中以形成良好分散的反相微乳剂。通过加入300μL的800mM KCl液体溶液至分离的油相中制备包含KCl的另一反相微乳剂。然后，500μL的DOPA(20mM)加入到顺铂前体相中并且搅拌该混合物。20分钟后，混合两种乳剂并且再反应20分钟。然后加入40mL乙醇以打破微乳剂并且混合物以10,000g离心至少15分钟。用乙醇再洗涤沉淀2次以确保表面活性剂和环己烷的完全除去，然后再分散于2.0mL氯仿中存储。
GMP核的制备：
根据我们以前工作的少许调整合成GMP核。(Y.Zhang，L.Peng，R.J.Mumper，L.Huang，Biomaterials 2013，34，8459)。简而言之，100μL的60mM GMP与500μL的25mMNa2HPO4混合和然后分散于20mL含有Igepal CO-520/环己烷(29∶71，V∶V)的油相中。其它乳剂通过添加600μL的2.5M CaCl2至一个分离的油相中制备。600mL的20mM DOPA加入磷酸盐相中，然后与两个单独的乳剂混合。混合5分钟后，另外400μL的20mM DOPA加入到组合乳剂中。该乳剂再搅拌20分钟，然后加入40mL乙醇。接着，将混合物在10,000g离心15分钟以除去表面活性剂和环己烷。用乙醇洗涤2-3次后，将沉淀再次分散于2.0mL氯仿中存储。
制备负载核的PLGA/PLGA-PEG/PLGA-PEG-MBA(4∶4∶2)NP(PLGA NP)：
使用如之前所述的少许调整的单步溶剂分散法将封装药物的核负载至PLGA NP中。(S.Guo，C.M.Lin，Z.Xu，L.Miao，Y.Wang，L.Huang，ACS Nano，DOI：10.1021/nn5010815)。简而言之，2mg的聚合物和核溶解于200μl的THF中并且在室温连续搅拌下滴加到2ml水中。然后，NP悬浮液在室温未覆盖搅拌6小时以除去残留的THF。所得的NP通过超滤(3000×g，15分钟，Amicon Ultra，具有50,000NMWL的Ultracel膜，Millipore，Billerica，MA)进一步纯化。然后将所得的PLGA NP重悬，用水洗涤两次，在14,000rpm离心20分钟以进一步除去游离脂质和胶束。然后再次重悬和以800rpm离心以除去纳米核聚集体。
PLGA NP的表征：
使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS，NexIONTM 300，Perkin Elmer Inc)测定顺铂的DL和EE；GMP的LE和EE均由紫外-可见吸收光谱(UV，800，Beckman Coulter)和使用液体闪烁分析仪(TRI-CARB 2900TR，Parkard Bioscience Co)的3H标记的胞苷5′一磷酸(CMP)[5-3H]二钠盐(Moravek Bio Inc，lmCi/mL)掺入测量。粒子的尺寸分布使用MalvernZetaSizer Nano系列(Westborough，MA)测定。使用JEOL 100CX II TEM(JEOL，日本)获得NP的TEM图像。对于NP成像，NP用2％醋酸铀负染色。使用电子色散光谱(EDS)(Oxford instruments，INCA PentaFET-x3)和X-射线光电子能谱(XPS)(Kratos AxisUltra DLD X-ray Photoelectron Spectrometer)研究PLGA组合NP的组合物。
在UMUC3细胞系中细胞摄取研究：
UMUC3细胞接种到包含1ml培养基的12孔板(1.5×105细胞/孔)。24小时后，以20μMGMP和3.8μM顺铂的浓度将1ml的游离药物组合，被靶向的PLGA组合NP，被靶向的PLGA SepaNP，20％-被靶向的PLGA组合NP或非靶向的PLGA组合在无血清培养基内与细胞温育。4小时后，用RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich)处理细胞。如前所述使用ICP-MS测定顺铂的浓度和使用闪烁计数器的3H-CMP测定GMP浓度。
顺铂和GMP从PLGA NP的体外释放和细胞内释放：
透析技术被用以研究在37℃下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4或pH5.6)中GMP和顺铂从PLGA的体外释放。500μL单独负载100μg/mL GMP和顺铂或以5.33∶1的比例共负载100μg/mL GMP与顺铂的PLGA NP加入到具有截断分子量3000Da的透析管中并在37℃下对15mL的PBS(pH 7.4或pH 5.6)在200rpm搅拌速度的热控振荡器内透析96小时。在GMP核的制备中，痕量放射性3H-CMP与GMP混合以用作捕获的GMP的标记物。在每个预定的时间点，采集400μL样品并用新鲜培养基替换。然后在指定的时间通过ICP-MS和闪烁分析仪分别确定铂和GMP浓度。所有实验一式三份进行并且数据报告为三个单独实验的平均值±SD。游离药物从纳米粒子的胞内释放的测量根据先前方案进行。(S.Guo，Y.Wang，L.Miao，Z.Xu，C.M.Lin，Y.Zhang，L.Huang，ACS Nano 2013，7，9896)。简而言之，12孔板UMUC3细胞如在摄取研究中所述制备，并且用封装入PLGA组合NP的20μM GMP和3.8μM顺铂孵育。在1、4和16小时后，细胞用50μL RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich)在4℃下处理10分钟，并且细胞裂解物在4℃下在14,000rpm下离心20分钟以将纳米粒子和细胞裂解物与游离药物分离。游离药物和纳米粒子用ICP-MS和3H-标记的闪烁测量。所有实验重复进行4次并且数据报告为平均值±SD。
药物组合在体外对UMUC3细胞的细胞活性和协同效应分析：
MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四氮唑溴盐)法被用于检测游离GMP、顺铂和它们的组合以及PLGA GMP NP，PLGA顺铂NP和PLGA组合NP在体外的活性。简而言之，在药物处理前24小时，细胞以每孔3,000细胞的密度接种在96孔板中。第2天，用一系列具有各种摩尔比的稀释的游离药物或药物组合处理细胞。处理后48小时，加入20μL的MTT(5mg/mL)试剂，在37℃下再处理4小时。然后弃去培养基并且形成的甲鐕(formazan)盐溶解在150μL的DMSO中。使用多重检测酶标仪(Plate CHAMELEONTM V-Hidex)在570nm的波长下读出在每个孔的吸光度。每个浓度在5个孔中检测并且数据表示为平均值±SD。使用CompuSyn软件(1.0版，Combo-Syn Inc.，U.S.)的半数有效方程：Fa＝[1+(IC50/D)m]-1计算50％生长抑制(IC50)所需的平均药物浓度，其中m是Hill斜率，D是药物浓度和Fa是受影响的细胞分数。
基于Chou和Talalay方法(T.C.Chou，P.Talalay，Adv.Enzyme Regul.1984，22，27)的游离药物组合的组合指数(CI)分析使用CompuSyn软件进行。简而言之，对于Fa的每个水平，顺铂和GMP组合的CI值根据下列公式计算：CI＝(D)1/(Dx)1+(Dx)2/(Dx)2，其中(Dx)1和(Dx)2是导致Fa×100％生长抑制的单独药物的浓度，而(D)1和(D)2是组合中导致Fa×100％生长抑制的每种药物的浓度。药物组合的CI值被绘制为Fa的函数。CI值大于1或小于1分别表示药物组合的拮抗作用或协同作用。值得注意的是，在Fa 0.2至0.8之间的CI值被认为有效。(Y.Han，Z.He，A.Schulz，T.K.Bronich，R.Jordan，R.Luxenhofer，A.V.Kabanov，Mol.Pharm.2012，9，2302)。
在基质丰富异种移植膀胱肿瘤模型中GMP和顺铂的肿瘤积累：
基质丰富的皮下异种移植膀胱肿瘤模型是我们实验室以前建立的。(J.Zhang，L.Miao，S.Guo，Y.Zhang，L.Zhang，A.Satterlee，W.Y.Kim，L.Huang，J.Control.Release，DOI 10.1016/j.jconrel.2014.03.016)。简而言之，在100μL的PBS中UMUC3(5×106)和NIH3T3细胞(2×106)与Matrigel(BD Biosciences，CA)以3∶1(v/v)的比例皮下共注射到小鼠右侧腹内。当肿瘤达到100-150mm2大小时，动物被随机分为3组(n＝8)并且分别以12mg/kgGMP和1.9mg/kg顺铂的剂量静脉注射游离GMP和顺铂(游离组合)，PLGA组合NP和PLGA SepaNP。3H-CMP的痕量部分加入到用于GMP肿瘤积累测量的GMP相关组中。每组4只小鼠在每一个预定的时间点被处死并且收集肿瘤组织。GMP和顺铂的肿瘤摄取表示为每克肿瘤的注射剂量的百分比。GMP的测定中，10-20mg肿瘤组织立即与II组织增溶剂(AmershamBiosciences，Inc)混合并且在60℃下消化过夜。然后300μL过氧化氢(在水中30％，Fisher)加入到样品中并且涡旋以漂白颜色。然后将样品与4mL闪烁鸡尾酒(Fisher Inc)混合。肿瘤样品中的3H放射性使用液体闪烁分析仪(TRI-CARB 2900TR，Parkard Bioscience Co.)计数。在顺铂的测量中，25-35mg的肿瘤组织用400μL的60％硝酸(Acros Organic)在70℃下消化过夜并且通过ICP-MS测量铂的量。
双药在主要脏器中的生物分布：
小鼠以1.9mg/kg顺铂和12mg/kg GMP的剂量被分别给予单次剂量的游离组合，PLGA Sepa NP和PLGA组合NP。每组包括4只小鼠，其在注射后10小时被处死。如先前在肿瘤累积研究所述消化组织样品。顺铂通过ICP-MS定量和GMP通过闪烁计数器定量。
在基质丰富异种移植瘤中的抗肿瘤功效：
当接种的肿瘤达到100-150mm2大小时，小鼠被随机分为如下的8组(n＝5)：未处理的对照(PBS)，游离GMP(游离GMP)，游离顺铂(游离顺铂)，游离GMP和顺铂的组合(游离组合)，PLGA GMP NP，PLGA顺铂NP，GMP和顺铂PLGA NP混合物(PLGA Sepa NP)以及PLGA组合NP。每3天进行静脉注射，总共3次注射12mg/kg的GMP剂量和1.9mg/kg的顺铂剂量。每天测量肿瘤体积。也记录体重。小鼠在最后一次注射后2天被处死和收集肿瘤组织用于进一步研究。
TUNEL分析：
在这个手稿中提到的关于UMUC荷瘤小鼠的所有免疫荧光检测是使用石蜡包埋的切片(由UNC Tissue Procurement Core制备)制备的。载玻片通过二甲苯和分级醇系列脱蜡并且用4％甲醛预固定。然后根据制造商的说明使用凋亡检测试剂盒(Promega，Madison，WI)由TdT-依赖性dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)法检测凋亡。然后载玻片使用含有DAPI的VECTASHIELD(Vector Laboratories，Burlingame，CA)盖上盖玻片。所有染色被评价和数字图像由Eclipse Ti-U倒置显微镜(尼康公司，东京，日本)在20x放大倍率获得。5个随机选择的显微镜视野使用ImageJ(National Institutes of Health)进行定量分析。
PCNA分析：
在上述治疗后，肿瘤细胞增殖是由抗增殖细胞核抗原的抗体(PCNA)(1∶200稀释，Santa Cruz)检测(Y.Zhang，W.Y.Kim，L.Huang，Biomaterials2013，34，3447)。石蜡包埋的组织切片被脱蜡，抗原被回收，封闭和用PCNA抗体在4℃下探测过夜，然后使用小鼠-特异性HRP/DAB检测IHC试剂盒按照制造商(Abeam，Cambridge，MA)的推荐进行检测。用苏木精复染细胞核。增殖细胞的百分比通过用PCNA阳性细胞的数量(表示为棕色圆点)除以总细胞数(由苏木精染色的蓝色细胞核)计算。每个治疗组中随机选择5个代表性显微镜视野用于定量。
铂加合物染色：
使用抗顺铂修饰的DNA抗体[CP9/19](Abeam，Cambridge，MA)检测铂-DNA加合物(S.Guo，Y.Wang，L.Miao，Z.Xu，C.M.Lin，Y.Zhang，L.Huang，ACS Nano 2013，7，9896)。肿瘤切片被脱蜡，抗原被回收，用1％BSA/PBS在室温封闭1小时，用1∶250稀释的抗顺铂修饰的DNA抗体[CP9/19]在4℃温育过夜，然后用FITC标记的山羊抗大鼠IgG抗体(1∶200，SantaCruz，CA)温育。切片也用具有DAPI的VECTASHIELD封装介质(Vector Laboratories，Burlingame，CA)复染。使用Nikon光学显微镜(尼康公司，东京，日本)观察和定量肿瘤切片。
蛋白质印迹分析：
3次每天静脉注射后2天，处死UMUC荷瘤小鼠以及收集和使用放射免疫测定法(RIPA)缓冲液(Sigma-Aldrich)裂解肿瘤组织。根据制造商的说明(Invitrogen)，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白质测定试剂定量肿瘤裂解物中总蛋白浓度。用含有还原剂的4×样品缓冲液稀释和在95℃加热5分钟后，每泳道40μg蛋白通过4-12％的SDS-PAGE电泳(Invitrogen)分离。然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad)上。用5％脱脂乳封闭膜1小时并且在4℃用小鼠单克隆聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)抗体，小鼠单克隆ERCC1，小鼠单克隆XPA(12F5)温育过夜。GAPDH抗体(1∶4000稀释；Santa Cruz biotechnology，Inc.)用作内部上样对照。将膜洗涤3次并且然后用次级抗体(1∶4000稀释；Santa Cruzbiotechnology，Inc.)在室温温育1小时。山羊抗-小鼠次级抗体用于PARP，XPA和ERCC-1初级抗体。山羊抗-兔次级抗体用于GAPDH初级抗体。最后，将膜洗涤4次并且根据制造商的说明(Thermo Fisher Scientific)使用Pierce ECL蛋白质印迹底物进行检测。
血清生化值分析和血液学分析：
3次注射后，收集血液和在4000rpm离心5分钟以得到血清。血尿素氮(BUN)、肌酐、血清天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平检测作为肾脏和肝脏功能的指标。在3次重复治疗后，从健康裸鼠收集全血。红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)、血红蛋白(HGB)和红细胞比容(HCT)被计数用于骨髓抑制的检测。器官(心脏、肝、脾、肺和肾)被固定和切片用于H&E染色以评估器官特异性毒性。
统计分析：
定量结果表示为平均值±SD。方差分析使用学生t-检验和方差的单向分析(ANOVA)完成。p＜0.05的p值被认为是统计学显著的。
实施例5
负载单一药物的PLGA NP的制备和表征：
GMP核和CP核如前所述(S.Guo等人，ACS Nano 2013，7，9896；Y.Zhang等人，Biomaterials 2013，34，3447)制备和经由透射电子显微镜(TEM)测定表征为8-12nm直径(图26)。在GMP核中GMP的封装效率(EE)是由在273nm处GMP的吸光度测定为60.6±4.3％(n＝5)。还制备经由电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定为具有40.4±1.4％的EE的CP核。GMP核和CP核两者可以良好地分散到有机溶剂如四氢呋喃(THF)中。上述结果表明亲水性GMP和顺铂已经成功地分别负载到疏水核中并且这些核准备被进一步掺入到PLGA NP中。
每个成分的高和相当的封装效率是用于在相同纳米粒子中某些方式的受控负载的一种建议的先决条件。因此，单一药物负载的PLGA NP被表征。PLGA NP与聚乙二醇(PEG)缀合以延长全身循环时间，并且然后通过单步溶剂置换用PLGA和DOPA包被核自组装到PLGANP中(图21)。
聚合物和含有药物的核溶解在THF中，一种水混溶溶剂，并且逐滴倾入水中。NP在这个快速溶剂扩散过程瞬间形成。茴香酰胺，一种σ受体激动剂，也被引入到PLGA NP中作为配体以提高在过量表达σ受体的上皮衍生的癌症细胞中内化(图27)。(a)J.L.Vivero-Escoto，K.M.Taylor-Pashow，R.C.Huxford，J.Delia Rocca，C.Okoruwa，H.An，W.Lin，W.Lin，Small 2011，7，3519；b)O.Nakagawa，X.Ming，L.Huang，R.L.Juliano，J.Am.Chem.Soc2010，132，8848)。图28的结果表明在DOPA包被核结构中的GMP和顺铂两者可以单独以高达约5重量％的药物负载(DL)封装到具有高EE(分别为70.6±2.5％和74.0±10.1％，n＝5)的PLGA NP中。如本文所述，GMP和顺铂已经使用溶剂置换法构建入PLGA NP中。
这种方法比通过最大负载仅有约1重量％的双重乳化法负载游离吉西他滨和顺铂至PLGA NP中显著更有效。(a)K.Avgoustakis，A.Beletsi，Z.Panagi，P.Klepetsanis，A.G.Karydas，D.S.Ithakissios，J.Control.Release 2002，79，123；b)S.Aggarwal，S.Yadav，S.Gupta，J.Biomed.Nanotechnol.2011，7，137)。值得注意的是，游离顺铂和GMP是相当极性的并且不能使用溶剂置换法负载到PLGA NP；因此，DOPA包被核不仅提供了一种使用溶剂置换法负载不同类型的药物，特别是亲水性药物，至PLGA NP中的方法，而且便于亲水性药物以更高的DL和EE负载到PLGA NP中。更重要地，使用本文所述的这种新的制备方法，单一游离药物在PLGA NP中的EE可以促进以相似的EE但是不同的双药比率同时负载不同药物部分至相同的NP中，这是按比例负载的一个必要参数。
实施例6
在组合NP中双药负载的精确按比例控制：
负载GMP核和CP核至PLGA NP提供了一种以按比例方式封装两种不同含药核至单个NP中的手段。下面的研究进一步证实CP核和GMP核可以按比例共负载至PLGA NP(组合NP)。
首先，组合NP中GMP和顺铂的总进料负载固定在6重量％，而GMP和顺铂之间的进料摩尔比从0.5∶1至5∶1变化(图22A)。结果表明在组合NP中两种药物之间所测量的摩尔比与进料摩尔比(0.52∶0.5；0.97∶1；3.3∶3，5.3∶5)几乎相同并且两种药物的EE，其中所有保持在70％以上具有微妙波动，也是几乎相同的。接着，GMP对顺铂的进料摩尔比被设定为5(图22B)。发现当该两种药物的总负载低于6重量％时，在组合NP中GMP对顺铂的测量摩尔比是约5。此外，获得了大于80％的EE。在两个实验中，经由动态光散射(DLS)测得的粒子尺寸在120nm以下并且双药粒子的多分散指数为约0.2(图29)。因此，这些结果进一步证明在DOPA包被核中按比例负载不同类型药物可以在宽泛双药比例范围和负载效率实现。
实施例7
使用TEM和XPS负载双药的组合NP的表征：
为证明GMP核和CP核是均匀地分布在每个组合NP中，测试进一步特征具有6重量％的总药物进料比和5的GMP/顺铂进料比的组合NP，其确定的负载为5.5±0.8重量％(n＝5)和GMP与顺铂之间的摩尔比为5.3。TEM揭示了组合NP如球形和单分散的具有约90-120nm的直径(图22C)，这与经由DLS测量的值(平均为120nm)(图30)一致。此外，大量的良好分散的核清晰聚集在每个NP中，进一步证实具有高和有效药物负载的纳米胶囊状结构的假设(图22C)。值得注意的是，每个NP含有类似量的核。然而，单独的TEM结果不能显示核在NP中的均匀分布。因此，我们进一步使用具有能量色散谱(EDS)的高分辨率TEM分析和X-射线光电子能谱(XPS)表征所述组合NP。使用EDS的化学元素分析表明氟(GMP的特征元素)和铂(顺铂的特征元素)存在于单个NP中(图22D)。超过20个粒子被分析以确定每个NP内GMP和顺铂的平均摩尔比。氟对铂的比例，代表GMP对顺铂的比例，是约4.9±1.9，这与5的进料比和5.3的大量溶液中所确定的比率相当。这个结果表明这两种不同的核在单个NP中存在并且它们的比率被精确地控制。为了避免邻近氧对氟定量的干扰，进行XPS以进一步确认这两种药物的按比例分布。组合NP溶解在THF中，粒子裂解物的5nm层通过XPS分析。在图22E中的光谱表明氟可以与从氧良好分离，GMP对顺铂的计算摩尔比是约5.6，类似于使用其它技术确定的结果。因此，从粒子裂解物的单个粒子纳米层和大量溶液的定量强烈表明事实是双药组合已经以相对精确的按比例控制成功均匀负载至单个组合NP中。
实施例8
在体外按比例控制双药细胞摄取：
使用Chou-Talalay方法游离顺铂和GMP(游离组合)在体外协同研究(T.C.Chou，P.Talalay，Adv.Enzyme Regul.1984，22，27)表示游离组合以5的GMP/顺铂比例在人膀胱癌UMUC3细胞系中显示最强的协同作用。(J.Zhang，L.Miao，S.Guo，Y.Zhang，L.Zhang，A.Satterlee，W.Y.Kim，L.Huang，J.Control.Release，DOI 10.1016/j.jconrel.2014.03.016)。此处，3H-标记的CMP(胞苷一磷酸)掺入PLGA NP的单个GMP核(GMP NP)中用作检测GMP浓度的标记物。游离GMP和游离顺铂的体外细胞摄取(图31)表明UMUC3细胞显示GMP和顺铂的等价摄取，表明药物组合的进料比和实际细胞内比例在体外测定中几乎相同(图23A)。然而，在体内肿瘤细胞中药物的摄取可能是非常不同的，由于不同的PK谱和复杂的肿瘤微环境所致。为了保持在体内的药物比例和揭示以5的GMP/顺铂比例的游离组合所期望的协同作用，具有5.5±0.8重量％总药物负载(n＝5)和GMP与顺铂之间摩尔比为5.3的PLGA NP在以下研究中被进一步研究。进料比6重量％的单一药物的PLGA NP用于比较(表1)。值得注意的是，在单个PLGA NP(顺铂NP)中CP核的尺寸比GMP NP和组合NP的尺寸更小(约60nm)。主要由磷酸钙组成的CP核比GMP核更致密。
GMP与顺铂两者按比例由UMUC3细胞的细胞摄取是评估协同效应的一个提出的先决条件。在单独的NP中GMP和顺铂的细胞摄取与在组合NP中双药组合的细胞摄取进行比较(图23A)。结果表明组合NP按比例输送药物进入细胞，这与游离组合的结果一致，而单独的NP(Sepa NP)的混合物不能维持药物的预定比率，因为较小的顺铂NP递送它们的货物进入细胞比较大的GMP NP更有效。在NP与细胞的较长孵育中也观察到组合NP的按比例摄取(图23B)。
表1.优化的单一药物PLGA NP和双药PLGA组合NP的特征
(n＝3)
实施例9
体外按比例控制双药从PLGA NP的释放：
在验证组合NP可以按比例运输药物进入细胞后，进行研究以确定组合NP的细胞外和细胞内释放。首先通过在37℃在PBS(pH＝7.4)中透析96小时，研究从组合NP，顺铂NP和GMP NP的顺铂和GMP的体外释放动力学。通过ICP-MS测定从NP释放的铂的量，而3H-标记的CMP作为GMP测量的标记物。值得注意的是当DOPA包被核内的药物封装在PLGA NP中时，仅观察到可忽略的突释(图23C)，虽然突释现象是众所周知的和通常在PLGA纳米微粒制剂的亲水性药物中观察到。(a)K.Avgoustakis，A.Beletsi，Z.Panagi，P.Klepetsanis，A.G.Karydas，D.S.Ithakissios，J.Control.Release 2002，79，123；b)S.Aggarwal，S.Yadav，S.Gupta，J.Biomed.Nanotechnol.2011，7，137；P.Pantazis，K.Dimas，J.H.Wyche，S.Anant，C.W.Houchen，J.Panyam，R.P.Ramanujam，Methods Mol.Biol 2012，906，311)。例如，掺入顺铂的PLGA15K-PEG5000NP已经显示在初始4小时内具有约50％释放分数的突释和封装吉西他滨的PLGA NP已经显示在初始6小时内60％的释放的药物(Avgoustakis等人，2002；L.Martin-Banderas，E.Saez-Fernandez，M.A.Holgado，M.M.Duran-Lobato，J.C.Prados，C.Melguizo，J.L.Arias，Int.J.Pharm 2013，443，103)。这表明DOPA层防止GMP和顺铂从PLGA NP突释。在组合中这两种药物的释放动力学通过分组t-检验进一步分析，其显示在这两种药物之间没有显著性差异(p＝0.78)。这个观察表明组合NP中双药遵循按比例释放谱。释放速率的细微差别可能是由于CP核和GMP核的不同组成，但是当与为该过程的关键限速步骤的药物从PLGA NP的释放速率相比时，这个差异可以忽略。这表明共封装至单个PLGA NP中时，顺铂和GMP的释放可以以相同速度和按比例方式进行控制。为了进一步模拟酸性内体微环境(Z.Tong，W.Luo，Y.Wang，F.Yang，Y.Han，H.Li，H.Luo，B.Duan，T.Xu，Q.Maoying，H.Tan，J.Wang，H.Zhao，F.Liu，Y.Wan，Plos one 2010，5，el0234)，一个释放动力学研究还在pH5.6的PBS中进行96小时。在药物释放动力学中有微妙的变化并且组合NP中双药的比例控制释放仍然良好保持(图32)。
然后研究药物从组合NP的细胞内释放。UMUC3细胞首先与组合NP孵育1、4或16小时，随后洗涤。在每个时间点，将细胞用RIPA缓冲液裂解，接着通过在16,000g离心20分钟分离NP和游离药物。这种方法可以从细胞提取98％以上的NP和游离药物，几乎没有破坏NP。图23D的结果表明在细胞水平在UMUC3中也观察到顺铂和GMP的受控和按比例释放。
实施例10
在体外组合NP的协同效应：
通过使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法评价游离药物和负载药物的PLGA NP的体外细胞毒性。结果显示虽然游离顺铂和顺铂NP的半数最大抑制浓度(IC50)之间存在细微差别，GMP NP导致与GMP游离药物(34.8μM的IC50)相比低得多的IC50值17.8μM，表明被靶向NP递送可以维持或提高体外细胞毒性(图23E)。此外，数据显示含有CaP核的空白PLGA NP具有可忽略的毒性(数据未显示)。为了验证具有5.3∶1双药摩尔比(GMP：顺铂)的组合NP的体外协同作用，使用Chou-Talalay等效线方程进一步确定组合指数(CI)。(T.C.Chou，P.Talalay，Adv.Enzyme Regul.1984，22，27)。如图23F所示，当Fa值在0.2至0.8的验证范围内时，组合NP显示整体的CI值＜1，表明PLGA组合疗法在体外明显和清楚的协同作用。
实施例11
在体内组合NP对基质丰富的膀胱异种移植肿瘤模型的抗癌功效：
如前面提到的，该制剂背后的最基本原则之一是以优化的比例可控递送双药进入肿瘤从而实现在体内增强的抗肿瘤功效。因此，在一个侵袭性基质基质丰富的膀胱癌模型中评价不同的治疗，所述模型通过皮下共接种在基质胶中的UMUC3细胞和成纤维细胞NIH3T3细胞建立的。肿瘤进展直到它们的体积达到100-150mm3。然后以剂量为12mg/kg GMP和1.9mg/kg顺铂的组合NP共3次注射处理荷瘤小鼠。在单独的PLGA NP中制备的顺铂和GMP(Sepa NP)在混合物中同时施用以进行比较。空白PLGA NP没有肿瘤抑制作用。(S.Guo，C.M.Lin，Z.Xu，L.Miao，Y.Wang，L.Huang，ACS Nano，DOI：10.1021/nn5010815)。如图24A所示，游离药物显示出在相同剂量和剂量方案时几乎没有的抑制作用，可能是由于低肿瘤积累所致；而在PLGA NP中单一药物表现出比游离药物增强的治疗功效。这是由于较早提到的EPR效应和受体介导的内吞作用。组合NP中的双药最显著地抑制UMUC3肿瘤生长而不会降低体重(图24A和图33)，表明顺铂和GMP组合相比于单一药物增强的抗癌效果和安全性。然而，当双药在混合物中一起给药时(即Sepa NP)，肿瘤抑制似乎受到损害和在测量最后一天的肿瘤重量显著高于组合NP的(图24A)。为了进一步证实组合NP在侵袭性UMUC3肿瘤模型中有力的抗癌功效，施用高剂量组合NP的单次注射并且与定期给药间隔的低剂量进行比较。结果表明在单次高剂量组合NP中GMP和顺铂表现出强力功效，其与定期给药间隔的低剂量的效果是相当的。因此，仅单次注射可以抑制侵袭性基质丰富肿瘤模型中的肿瘤生长(图24C)。
实施例12
在体内在异种移植瘤模型中双药物肿瘤积累的按比例控制：
组合NP比Sepa NP在抑制肿瘤生长中更有效，可能由于事实是组合NP可以以预定的优化协同比例和剂量递送顺铂和GMP至肿瘤。肿瘤积累数据表示注射后10小时间GMP和顺铂从组合NP的按比例积累(图24B)。然而，Sepa NP给药后观察到顺铂NP的更高摄取和GMPNP的较低摄取。一方面，较小的粒子尺寸(约60nm)可以引起单个PLGA NP中顺铂更高的肿瘤积累，而在另一方面，与在单个PLGA NP中5.5重量％双药物负载相比，在分离的PLGA NP中相同剂量的4.4重量％顺铂和4.2重量％GMP加倍注入射的茴香酰胺修饰的PLGA NP的量，这可能导致σ受体的饱和并且随后降低肿瘤中GMP的积累。这个观察表明在单个PLGA NP中DOPA包被核中控制药物比例比不同NP的混合物具有优势，其具有变化的理化性质和独特的药代动力学。在负载率和肿瘤组织摄取药物的实际量的变化会直接影响通过协同作用引起的抗肿瘤功效。此外，由于通过受体介导途径的EPR效应和增强的内化至肿瘤细胞，纳米粒子也增加游离药物的肿瘤积累从2％ID/g至10％ID/g以上。
实施例13
在体内基质丰富UMUC3异种移植物中组合NP有效触发显著的肿瘤细胞凋亡和抑制 肿瘤细胞增殖：
组合NP增强的抗肿瘤效果通过凋亡和增殖分析证实。治疗后的肿瘤组织被进一步切片用于TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记)分析和PCNA(增殖细胞核抗原)免疫组化(图25A和25B图)。结果表明组合NP在UMUC3异种移植肿瘤28.8％细胞中诱导凋亡。在Sepa NP中双药相比于顺铂NP和GMP NP治疗引起更多细胞凋亡，但是仍然比组合NP在诱导凋亡上显著效率较低。游离药物在体内诱导很少凋亡细胞，可能是因为大多数的游离药物在它们在肿瘤中积累之前被代谢和清除。此外，肿瘤细胞增殖的抑制作用使用PCNA测定法研究。PCNA在DNA合成过程中在细胞核中表达并且可以用作细胞增殖的标记物。PCNA结果与TUNEL法的结果一致。组合NP示出最少量的PCNA阳性细胞。这些数据进一步说明在单个NP中组合的药物通过增强的凋亡诱导和减少的细胞增殖而抑制肿瘤生长。
实施例14
双药组合NP协同效应的机制：
为了验证观察的组合NP增强的抗肿瘤效果是通过NP中GMP和顺铂施加的协同作用，随后的研究从机理基础相应设计。据报道吉西他滨通过抑制参与核苷酸切除修复(NER)和错配修复(MMR)的关键蛋白质的表达增强顺铂损伤的积累，导致Pt-DNA加合物降低的修复，从而抑制顺铂-诱导的DNA损伤的修复。(O.G.Besancon，G.A.Tytgat，R.Meinsma，R.Leen，J.Hoebink，G.V.Kalayda，U.Jaehde，H.N.Caron，A.B.van Kuilenburg，CancerLett 2012，319，23；a)H.P.CJA van Moorsel，G Veerman，A M Bergman，CM Kuiper，JBVermorken，WJF van der Vijgh，Br.J.Cancer 1999，80，10；b)B.Liedert，D.Pluim，J.Schellens，J.Thomale，Nucleic Acids Res.2006，34，e47)。因此，加强的DNA修复抑制和Pt-DNA加合物去除是协同相互作用的两个标志。组合疗法对NER中具有关键作用的两个主要蛋白ERCC1和XPA的作用(Beasancon等人，2012)首先通过蛋白质印迹检查，并且表明ERCC1和XPA的下调由GMP游离药物诱导和由GMP NP治疗增强(图25C)。组合NP几乎完全耗尽ERCC1和XPA的表达并且比Sepa NP更有效。为了研究ERCC1和XPA的下调对Pt-DNA修复的作用，Pt-DNA加合物用FITC-标记的抗Pt-DNA加合物抗体染色。如图25D所示，当肿瘤用组合NP治疗时相比于Sepa NP治疗，观察到Pt-DNA加合物的量显著增加。
为了进一步研究抑制的DNA修复蛋白和凋亡的关系，观察裂解PARP和Caspase-3的水平。在凋亡执行阶段，完整PARP主要由Caspase-3或Caspase-7裂解成较大片段和较小片段。因此，PARP裂解用作凋亡的可靠标记物。(Y.Zhang，W.Y.Kim，L.Huang，Biomaterials2013，34，3447；Y.Zhang，L.Peng，R.J.Mumper，L.Huang，Biomaterials 2013，34，8459)。图34显示在组合NP治疗后裂解的PARP显著升高，这与DNA修复蛋白质和Pt-DNA加合物形成的结果一致。在组合NP治疗后Caspase-3也是升高的。总之，组合NP在抑制DNA修复和抑制Pt-DNA加合物去除中表现出更大的功效，导致在体内与在不同的NP中的双药相比加剧的凋亡。这些结果进一步验证组合NP以协同方式而不是仅加合方式作用，在基质丰富的膀胱癌异种移植物模型中诱导增强的抗癌作用。
实施例15
组合NP全身毒性的评估：
涉及联合疗法的另一个重要问题是双药在主要器官中的分布和比例，以及在这些器官中毒性与协同效应的关联。组合NP中GMP和顺铂的定量生物分布分析表明双药的比例在几乎所有器官中保持恒定(图35)。类似于其他纳米平台，在注射后10小时，主要颗粒吸收器官是肝(约20％ID/g组织)和脾(约40％ID/g组织)。然而，游离药物从作为主要积聚器官的肾脏离开身体而迅速清除，这也解释了游离顺铂的常见肾毒性。由于不同的粒子尺寸，不同的纳米粒子中顺铂和GMP在体内呈现非常不同的分布行为。值得注意的是，顺铂NP显示在脾中显著更高的积累，这可能是诱导脾毒性的潜在因素。
因为GMP的主要副作用是骨髓抑制和顺铂也可以诱导造血细胞计数的累积下降，在健康裸鼠中以8个治疗组的3种剂量进行血常规测试。游离GMP和顺铂相比未处理的对照均显著降低红细胞(RBC)、血小板(PLT)和白细胞(WBC)的水平(图37)。这些游离药物组合稍微加强毒性。虽然在肝脏和肾脏中存在不可避免的NP积累量，血液生化试验表明NP包被可以稍微减轻化学药物引起的骨髓抑制。在组合NP中没有明显恶化的血液毒性。组合NP的WBC、RBC、血细胞比容(HCT)、血红蛋白(HGB)均接近未处理对照的值(图37)。
其他血液学参数显示没有检测到造成损害；天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和血液尿素氮(BUN)分析均在正常范围(表2)中。在肝、肾和脾的H&E染色组织切片中没有可见明显的病理变化(图36)。这些研究表明组合NP，具有最显著的协同治疗功效，具有升高的肿瘤摄取和低脾脏积累，以及没有表现出对主要器官和组织的显著毒性。因此，具有非重叠毒性的按比例协同组合疗法是克服抗药性同时增强抗癌效果的有前景的策略。
表2.不同治疗对血清ALT，AST，BUN和肌酐水平的影响
(n＝5)
开发NP以同时封装具有以精确按比例负载和递送的不同理化性质的药物是挑战性的，但是在恶性疾病的联合化疗中是非常需要的。如本文所公开，具有GMP核和顺铂核有效负载的纳米胶囊状PLGA粒子已经开发出来。这些双药负载的NP表现出精确按比例控制药物负载、细胞摄取、体外释放和体内肿瘤积累。此外，具有良好控制的最佳双药比率的这个单一NP与在不同NP的混合物中的双药相比显示出更显著的抗肿瘤功效。这提供了对于配制顺铂和其它组的亲水性药物用于按比例联合疗法难题的一个解决方案。因此，这种单一纳米粒子递送平台是有效和相对安全的候选者，特别是用于人膀胱癌的治疗。
这种空间分离方式的纳米材料系统防止个体分子之间的功能干扰。此外，这个系统提供了用于共递送化疗和用于光热和治疗诊断目的的其它疏水性配体包被的无机NP(例如氧化离子NP、金NP、量子点和变频NP)的可能良好控制的平台。
应该指出的是术语“一”或“一个”实体指一个或多个该实体；例如，“一个纳米粒子”应被理解为代表一个或多个纳米粒子。这样，术语“一”(或“一个”)，“一个或多个”和“至少一种”可以在本文中互换使用。
贯穿这个说明书和权利要求书中，词语“包含”，“包括”和“含有”以非排他性含义使用，除非上下文另有要求。
如本文所用，术语“约”当指一个值时意在包括自特定量的变化，在一些实施方案中±20％，在一些实施方案中±10％，在一些实施方案中±5％，在一些实施方案中±1％，在一些实施方案中±0.5％，和在一些实施方案中±0.1％，当这样的变化对于实施所公开的方法或使用所公开的组合物是适宜的。
此外，当量、浓度或其他值或参数给定为范围、优选范围或较高优选值和较低优选值的列表，这应被理解为具体公开了从任何一对的任何范围上限或优选值和任何范围下限或优选值形成的所有范围，无论是否范围被单独公开。其中数值范围在本文列举，除非另有说明，该范围是意欲包括其端点，和该范围内的所有整数和分数。当限定范围时，不意欲目前公开主题的范围限于所列举的具体数值。
在说明书中提及的所有出版物和专利申请是本发明所属领域中本领域技术人员水平的指示。所有出版物和专利申请在此通过引用并入就如同每个单独的出版物或专利申请具体和单独地表明通过引用并入本文。
具有在前述说明书和相关附图中给出的教导的益处的本文所述发明的许多修改和其他实施方案将可以被本发明所属领域技术人员想到。因此，应理解的是本发明不限于所公开的具体实施方案，修改和其它实施方案旨在包括在前述实施方案列表和所附的权利要求书范围之内。尽管本文使用了特定术语，它们是仅在一般描述意义上使用而不是为了限制的目的。

Claims (31)

1.一种制备聚合物纳米粒子的方法，包括：
i.通过将第一脂质包被的含有第一生物活性化合物的纳米沉淀核与1)游离形式的不同疏水性生物活性化合物和2)聚合物接触，形成有机相；其中所述接触是在可以混溶于水的有机溶剂中以形成所述有机相；和
ii.将所述有机相与水接触以形成所述包含含有第一生物活性化合物的第一脂质包被核和疏水性生物活性化合物的聚合物纳米粒子。
2.权利要求1的方法，其中所述第一生物活性化合物是纳米沉淀盐。
3.权利要求1的方法，其中所述第一生物活性化合物是铂配位复合物。
4.权利要求1的方法，其中所述第一生物活性化合物为顺铂化合物或其衍生物。
5.权利要求1的方法，其中所述第一生物活性化合物是吉西他滨单磷酸酯-磷酸钙。
6.权利要求1的方法，其中所述疏水性生物活性化合物是抗癌化合物。
7.权利要求1的方法，其中所述疏水性生物活性化合物是雷帕霉素。
8.权利要求1的方法，其中所述第一生物活性化合物和所述疏水性生物活性化合物以按比例的量存在。
9.权利要求1的方法，其中所述第一生物活性化合物是顺铂和所述疏水性生物活性化合物是雷帕霉素。
10.权利要求1的方法，其中所述聚合物是生物相容性聚合物。
11.权利要求10的方法，其中所述聚合物是PLGA。
12.权利要求1的方法，其中所述有机溶剂与水混溶。
13.权利要求12的方法，其中所述溶剂是THF。
14.权利要求1的方法，其中所述脂质是DOPA。
15.一种制备聚合物纳米粒子的方法，包括：
i.通过将第一脂质包被的含有第一生物活性化合物的纳米沉淀核与1)含有不同于所述第一生物活性化合物的第二生物活性化合物的第二脂质包被的纳米沉淀核和2)聚合物接触，形成有机相；其中所述接触是在可以混溶于水的有机溶剂中以形成所述有机相；和
ii.将所述有机相与水接触以形成所述包含含有第一生物活性化合物的脂质包被核和含有不同于所述第一生物活性化合物的第二生物活性化合物的脂质包被核的聚合物纳米粒子。
16.权利要求15的方法，其中所述第一生物活性化合物是纳米沉淀盐。
17.权利要求15的方法，其中所述第一生物活性化合物是铂配位复合物。
18.权利要求15的方法，其中所述第一生物活性化合物是顺铂化合物或其衍生物。
19.权利要求15的方法，其中所述第二生物活性化合物是吉西他滨单磷酸酯-磷酸钙。
20.权利要求15的方法，其中所述第一生物活性化合物和所述疏水性生物活性化合物以按比例的量存在。
21.权利要求15的方法，其中所述第一生物活性化合物是顺铂和所述第二生物活性化合物是吉西他滨单磷酸酯。
22.权利要求15的方法，其中所述聚合物是生物相容性聚合物。
23.权利要求22的方法，其中所述聚合物是PLGA。
24.权利要求15的方法，其中所述有机溶剂与水混溶。
25.权利要求24的方法，其中所述溶剂是THF。
26.权利要求15的方法，其中所述脂质是DOPA。
27.一种PLGA纳米粒子，包括，
i.第一生物活性化合物的脂质包被纳米沉淀物；和
ii.不同于所述第一生物活性化合物的第二生物活性化合物，其中所述第一和第二生物活性化合物以受控的按比例的比率存在。
28.权利要求27的纳米粒子，其中所述第一生物活性化合物是CDDP。
29.权利要求28的纳米粒子，其中所述第二生物活性化合物是雷帕霉素。
30.权利要求28的纳米粒子，其中所述第二生物活性化合物以脂质包被的纳米沉淀物存在。
31.权利要求30的纳米粒子，其中所述第二生物活性化合物是吉西他滨磷酸酯。
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