CN104922067A - 一种载药纳米脂质体、制备方法及用途 - Google Patents
一种载药纳米脂质体、制备方法及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104922067A CN104922067A CN201410734132.7A CN201410734132A CN104922067A CN 104922067 A CN104922067 A CN 104922067A CN 201410734132 A CN201410734132 A CN 201410734132A CN 104922067 A CN104922067 A CN 104922067A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- liposome
- adr
- ceramide
- lipo
- cer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
一种载药纳米脂质体、制备方法及用途。本发明涉及纳米脂质体合成与治疗领域,具体涉及了一种共载PEG-C16-ceramide和阿霉素的纳米脂质体及其制备方法,还涉及其在肿瘤治疗领域的应用。本发明构建了一种共载PEG-C16-ceramide和阿霉素的纳米脂质体(Lipo-ADR-Cer),公开了Lipo-ADR-Cer的制备方法和稳定性,未改变脂质体的基本表征、体外释放过程及体外细胞转染内吞效率。在肿瘤耐药细胞株上,本发明的Lipo-ADR-Cer的体外细胞毒性、体外促凋亡能力增强以及体内治疗效果增强。本发明实现了ceramide和ADR的共载,可以降低耐药细胞对于阿霉素的IC50,可用于治疗耐药的肿瘤细胞。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,更具体地,本发明公开了一种共载PEG-C16-ceramide和阿霉素的纳米脂质体及其制备方法,及其在肿瘤治疗领域的应用。
背景技术
多药耐药(multidrug resistance,MDR),是指由一种化疗药物诱发,同时对其他作用机理不同的多种抗肿瘤药物均具有耐药性的耐药现象,成为临床上导致化疗失败和肿瘤复发的重要原因。多药耐药的形成机制复杂,影响因素众多,涉及了细胞膜、细胞质到细胞核的多个方面,而且这些影响因素可能联合在多药耐药的形成中起作用。据文献报道,肿瘤细胞内ceramide含量的下降是肿瘤细胞耐药的一个重要机制(J. Liu. Foroozesh.A review of ceramide
analogs as potential anticancer agents.Future Med Chem,2013,5(12):1405-1421; N.
Bartke. Hannun.Bioactive sphingolipids: metabolism and function.J Lipid
Res,2009,50 Suppl(S91-S96))。
Ceramide,作为鞘磷脂代谢的分子核心,是具有细胞毒性的脂质成分。Ceramide在细胞内的来源途径主要有三条:从头合成途径,鞘磷脂酶途径,外源性ceramide的重循环再利用途径(N. Bartke. Hannun.Bioactive sphingolipids:
metabolism and function.J Lipid Res,2009,50 Suppl(S91-S96))。多种化疗药物,包括阿霉素(ADR)可以通过从头合成途径或者鞘磷脂酶途径增加ceramide,从而引起胞内ceramide的聚集。由于ceramide的增加而产生ADR诱导的毒性反应。
细胞内ceramide含量的下降是由于ceramide降解酶如糖基化ceramide合酶(GCS)的过表达和内质网转运的抑制。糖基化ceramide合酶(GCS)的功能是催化ceramide转变为GluCer,降低了细胞内ceramide的含量。与对应的肿瘤敏感细胞株相比较,在多种耐药细胞株上过表达GCS蛋白,胞内ceramide下降,这可以限制ceramide相关毒性反应的发生。
Ceramide激活化疗药物引起的细胞死亡信号中占据重要地位,胞内ceramide含量的下降使得化疗药物的毒性反应下降,ceramide的降解被抑制后使得化疗药物的毒性反应增加。因此,外源性ceramide与化疗药物联合给药可能为克服MDR增加可能性,带来新的希望。
目前一些研究已经利用ceramide和化疗药物联合给药来克服卵巢癌MDR(van Vlerken LE1. Modulation of intracellular ceramide
using polymeric nanoparticles to overcome multidrug resistance in cancer.
Cancer Res,2007,67(10):4843-4850;Devalapally
H1. Paclitaxel and ceramide co-administration in biodegradable polymeric
nanoparticulate delivery system to overcome drug resistance in ovarian cancer.
Int J Cancer.,2007,121(8):1830-1838)。在这些联合给药的治疗中,ceramide和化疗药物均以单独的形式。单药的给药形式简单而且便利,而共载的方式即两种药物在同一纳米药物中比如纳米脂质体更容易吸收。与单独的给药形式相比较,本发明中的ceramide和化疗药物ADR共载的治疗方式具备两方面的优势。首先,通过一种纳米药物共载两种药物,MDR细胞可以同时得到两种药物的处理。这是由于通过两种单独的纳米药物处理可能会引起MDR细胞对两种药物暴露异质性,从而降低了联合给药对MDR细胞的治疗效果。其次,共载的治疗策略降低了两种单独纳米药物药物动力学的相互不良作用。因此,本发明中,利用纳米药物共载ceramide和化疗药物是克服MDR的一条有前景的肿瘤治疗途径。( Devalapally H1.
Paclitaxel and ceramide co-administration in biodegradable polymeric
nanoparticulate delivery system to overcome drug resistance in ovarian cancer.
Int J Cancer.,2007,121(8):1830-1838)
纳米载药系统的应用是肿瘤治疗的一项重要突破,其中纳米脂质体由于具备良好的生物相容性,良好的药物动力学特征和长循环时间而得到广泛的应用,而且已有脂质体类型的化疗药物得到了FDA的批准在临床使用,如阿霉素脂质体(Doxorubicin Liposomal,商品名为Doxil)以及枸橼酸柔红霉素脂质体(DaunoXome)。携载ceramide的纳米脂质体已经被证实了单独或者联合其他的化疗药物给药均是一个有前景的肿瘤治疗手段,包括MDR肿瘤的克服(E. V. Diatlovitskaia.[Sphingolipids and cancer].Bioorg
Khim,1998,24(10):723-730;L. Brizuela, O.
Cuvillier.Biochemical methods for quantifying sphingolipids: ceramide,
sphingosine, sphingosine kinase-1 activity, and sphingosine-1-phosphate.Methods
Mol Biol,2012,874(1-20))。当前的研究已经(Khazanov E1.
Physicochemical and biological characterization of ceramide-containing liposomes:
paving the way to ceramide therapeutic application. Langmuir. 2008 Jun
1;24(13):6965-80.)证实了携载ceramide的纳米脂质体的物理化学特征,一些重要的发现如下:ceramide的头部羟基簇修饰少,PP值大于13,使得ceramide不容易与磷脂类分子相混合,引起了混合结构的不稳定。为克服携载ceramide的纳米脂质体的不稳定性,具有锥形结构且PP值约0.5的1,2 - 二硬脂酰-sn-甘油基-3 - 磷酸乙醇胺[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-DSPE),被用来构建携载ceramide的纳米脂质体。加入PEG-DSPE后,携载ceramide的纳米脂质体展示了更好的稳定性。
综上所述,多种耐药细胞内ceramide含量下降,限制ceramide相关毒性反应的发生,使得化疗药物的毒性反应下降。因此, ceramide和化疗药物联合给药是克服MDR的一条有前景的肿瘤治疗途径。而当前现有技术的研究中,已经利用ceramide和化疗药物联合给药来克服卵巢癌MDR(文献)。但是,在这些联合给药的治疗中,ceramide和化疗药物均以单独的形式给药。这种单独的纳米药物处理可能会引起MDR细胞对两种药物暴露异质性,从而降低了联合给药对MDR细胞的治疗效果。
发明内容
为解决上述现有技术存在的不足,本发明构建了一种共载PEG-C16-ceramide和阿霉素的纳米脂质体(Lipo-ADR-Cer),充分解决了ceramide和化疗药物分别给药治疗效果不佳的问题,以及ceramide的纳米脂质体中ceramide不容易与磷脂类分子相混合的问题。
本发明公开了:
1、一种载药纳米脂质体,其特征在于,所述纳米脂质体中共载ceramide及化疗药物。
2、如上所述的一种载药纳米脂质体,其特征在于,所述纳米脂质体中共载的ceramide为经修饰的ceramide。
3、如上所述的一种载药纳米脂质体,其特征在于,所述纳米脂质体中共载的经修饰的ceramide为PEG-C16-ceramide。
4、如上所述的一种载药纳米脂质体,其特征在于,所述纳米脂质体中共载的化疗药为阿霉素。
5、如上述的一种载药纳米脂质体的制备方法,包括以下步骤:
a)油相:氢化大豆卵磷脂、胆固醇、PEG2000-DSPE、PEG2000-C16-Ceramide按比例12:4:1:3进行混合,65℃加热溶于乙醇中,备用;水相:250nM/L的硫酸铵溶液,65℃加热备用;
b)油相与水相按1:3比例进行混合,取油相于水相液面以下缓慢加入水相,不断进行磁力搅拌,获得脂质体后进行200nm、100nm、50nm薄膜筛选,获得90nm粒径的空白脂质体,备用;
c)取10mg/ml的阿霉素以75:1000的比例与空白脂质体于65℃制备共载药脂质体Lipo-ADR-Cer;
d)以硫酸铵及HEPES溶液为透析液,进行两次透析,获得共载药脂质体Lipo-ADR-Cer,于4℃避光保存代用。
6、一种载药纳米脂质体的用途,其特征在于,用于多药物耐药的癌症治疗。
7、如上所述的一种载药纳米脂质体的用途,其特征在于,用于化疗药物阿霉素耐药的癌症治疗。
8、如上所述的一种载药纳米脂质体的用途,其特征在于,用于化疗药物阿霉素耐药的乳腺癌的治疗。
9、如上所述的一种载药纳米脂质体的用途,其特征在于,用于化疗药物阿霉素耐药的白血病的治疗。
研究表明加入了PEG-DSPE后的携载ceramide的纳米脂质体再载入ADR后仍不稳定。基于PEG-DSPE可以稳定纳米脂质体的考虑,我们推测ceramide PEG化后,PEG-ceramide带来的多且明显的头部亲水性修饰可以增加纳米脂质体的空间位阻,从而稳定纳米脂质体。因此,PEG-ceramide的PP值小于ceramdie,共载PEG- C16-ceramide和阿霉素的纳米脂质体的稳定性有望增加。由于短酰基链的PEG-
ceramide(如PEG-ceramide C8)具有快速去移除的功能而且使得纳米脂质体不稳定(Zhang YP. Stabilized plasmid-lipid
particles for regional gene therapy: formulation and transfection properties.
Gene Ther. 1999 Aug;6(8):1438-47),因此,我们选择PEG-ceramide
C16来进行这项研究。
本发明选择PEG-ceramide C16作为纳米脂质体载体的一部分,携载化疗药物阿霉素,实现共载PEG-
C16-ceramide和阿霉素的单药给药形式。
本着高效、简单、低毒的设计宗旨,本项发明构建了一种共载PEG-C16-ceramide和阿霉素的纳米脂质体(Lipo-ADR-Cer),与对照阿霉素脂质体(Lipo-ADR)相比,Lipo-ADR-Cer并未改变基本表征、体外释放过程、体外稳定性和体外细胞内吞转染效率,使该发明具有了较大的规模化生产可能。在体外抗肿瘤实验研究实验中,本发明的共载PEG-C16-ceramide和阿霉素的纳米脂质体在耐药细胞上增强了细胞毒性和促凋亡能力。在耐药细胞体内抗肿瘤实验中,本发明的共载PEG-C16-ceramide和阿霉素的纳米脂质体增强了治疗效果。本发明的高的抗肿瘤效果、促凋亡能力、简单的特点,使其在肿瘤治疗以及耐药的克服领域具有良好的应用价值。
本发明根据ceramide在细胞内的生理功能,结合耐药肿瘤细胞胞内ceramide下降的特征,把PEG-mCeramide与纳米药物结合起来,成功构建了一种共载PEG-C16-ceramide和阿霉素的纳米脂质体(Lipo-ADR-Cer),实现共载PEG-
C16-ceramide和阿霉素的单药给药形式。在体内外各项实验中对纳米脂质体的功能进行研究,为肿瘤细胞耐药的研究以及治疗提供一些证据,给临床上耐药的病人带来新的希望。
本发明中所涉及的名词解释:
MDR:multidrug resistance 多药耐药
GCS:glucosyl-ceramide synthase 葡萄糖神经酰胺合成酶
ADR:阿霉素
PEG-Ceramide:甲氧基-聚乙二醇2000-神经酰胺
PEG-DSPE:甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
Lipo-ADR-Cer:PEG-mCeramide 修饰的阿霉素脂质体
Lipo-ADR:阿霉素脂质体
CFPE :1,2 - 二油酰-sn-甘油基-3 - 磷酸乙醇胺-N-(羧基荧光素)
CFPE-labeled Lipo-Cer:CFPE标记的PEG-mCeramide 修饰的空白脂质体
CFPE-labeled Lipo:CFPE标记的空白脂质体
HEPES溶液:4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。
附图说明:
图1. Lipo-ADR-Cer脂质体的体外释放过程
图2.Lipo-ADR-Cer脂质体的体外稳定性
图3. Lipo-ADR-Cer脂质体的体外毒性实验结果
图4. Lipo-ADR-Cer脂质体的体外凋亡实验结果
图5. CFPE-labeled-Lipo-Cer脂质体的体外转染效率实验结果
图6. Lipo-ADR-Cer脂质体体外转染效率实验结果
图7. 共聚焦显微镜评价Lipo-ADR-Cer脂质体体外内吞效率实验结果
图8. Lipo-ADR脂质体的MCF-7-ADR小鼠体内肿瘤治疗结果
图9. Lipo-ADR脂质体的HL-60-ADR小鼠体内肿瘤治疗结果。
具体实施方式
下面结合实验例、实施例进一步说明本发明,但本发明的保护范围并不局限于此,在本发明公开的技术范围内,任何根据本发明的技术方案及其发明构思加以同等替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
实例中所用材料与试剂的具体来源如下:进胎牛血清(FBS), RPMI-1640与 DMEM购自美国GIBCO公司。氢化大豆卵磷脂(HSPC)购自Lipoid 公司。CFPE(880132P),PEG2000—DSPE(880120P)与PEG2000—C16-Ceramide(880180P)购自美国Avanti
Polar Lipids公司。胆固醇(cholestrol):美国Sigma公司。盐酸阿霉素(HCL-ADR)购自大连美伦生物公司有限公司。TritonX-100购自美国Amresco公司。氯仿,硫酸铵,六水三氯化铁,硫氰酸铵等购自上海化学试剂公司。透析袋MD18(截留分子量1000)购自美国spectrum公司。聚碳酸酯膜(200nm,100nm,50nm)购自英国whatman公司。CCK-8细胞增值试剂盒购于日本DOJINDO公司。凋亡试剂盒Alexa Fluor®488 Annexin V 购自Invitrogen
公司。
人乳腺癌细胞株MCF-7和人白血病细胞株HL-60购自ATCC,人乳腺癌耐药细胞株MCF-7-ADR购自上海蓝基生物科技有限公司,人白血病耐药细胞株HL-60-ADR购自南京凯基生物科技有限公司。雌性BALB/c裸鼠购于中科院上海动物所。
实施实例
1
:本发明
Lipo-ADR-Cer
脂质体以及
Lipo-ADR
脂质体空白脂质体的制备
PEG-Ceramide修饰的阿霉素脂质体的空白脂质体的组成及比例:A氢化大豆卵磷脂 24 mg(30.57nmol,56.35%mol);B 胆固醇 8mg (20.69nmol,38.14%mol);C PEG2000-DSPE 2mg(0.71nmol,1.31%mol);D PEG2000—C16-Ceramide 6mg(2.28nmol,4.20%)。 PEG2000—DSPE和PEG2000—C16-Ceramide购买自美国Avanti
Polar Lipids公司,胆固醇购买自Sigma公司,氢化大豆卵磷脂购买自Lipoid
公司。对照阿霉素脂质体空白脂质体的组成及比例:A 氢化大豆卵磷脂 24 mg(30.57nmol,56.50%mol)B胆固醇 8mg (20.69nmol,38.24%mol)C PEG2000-DSPE 8mg
(2.85nmol,5.27%mol)。根据上述组成,精确称量以上成分至1.5
ml EP管。
具体制备方法如下:油相制备:取ABC/ABCD于1.5
ml EP管中,加热溶解于0.3 ml的乙醇溶液中(65℃) ,吸取于1 ml注射器中。水相制备:取3 ml的250 mM的硫酸铵溶液(AS,pH值不调)于玻璃瓶中65℃加热条件下,磁力搅拌。空白脂质体制备:取出注射器,缓慢将油相注入水相中(液面下均匀注射30秒),磁力搅拌10-15min使形成脂质体。控制脂质体粒径:将形成的脂质体溶液通过薄膜挤出器(分别200nm,100nm,50nm聚碳酸酯膜),反复挤出20次,获得粒径在90nm左右的脂质体。薄膜挤出器先放置在MilliQ水中。透析去除脂质体外的硫酸铵:透析分两步,第一步,用250
mM的硫酸铵溶液将乙醇透析掉;第二步,用HEPES溶液 (pH 7.4)将外水相的硫酸铵溶液透析掉。透析方法:取脂质体溶液加入到截留分子量为1000的透析袋中,透析液(硫酸铵和HEPES溶液)的体积为1 L,透析时间为6~8小时,换两次液体。
实施实例
2
:本发明
Lipo-ADR-Cer
脂质体以及
Lipo-ADR
脂质体载药脂质体的制备
取实施实例1中透析后脂质体溶液,加入预先配好的10
mg/ml阿霉素溶液(MilliQ水溶解,阿霉素购买自大连美伦生物公司有限公司),1ml空白脂质体加入75ul阿霉素原液,载药过程混合溶液65℃水浴15~20 min。
为除小分子的游离阿霉素,采用透析的方法如下:将制备好的阿霉素脂质体溶液放入到截留分子量为1000KDa的透析袋中,透析液为1 L 的HEPES溶液 (pH 7.4),透析时间为6~8小时,换两次液体,透析时应注意避光。透析后得到Lipo-ADR-Cer脂质体以及Lipo-ADR脂质体,4℃冰箱避光保存待用。
实施实例
3
:共载脂质体
Ceramide
和
ADR
脂质体的处方优化
(1)
C16-Ceramide共载阿霉素脂质体的空白脂质体的组成及比例:A氢化大豆卵磷脂 24 mg(30.57nmol,56.35%mol)B 胆固醇 8mg (20.69nmol,38.14%mol)C PEG2000-DSPE 2mg
(0.71nmol,1.31%mol) D C16-Ceramide 1.23mg(2.28nmol,4.20 %)。 PEG2000—DSPE和C16-Ceramide购买自美国Avanti
Polar Lipids公司,胆固醇购买自Sigma公司,氢化大豆卵磷脂购买自Lipoid
公司。共载C16-Ceramide和阿霉素的脂质体的制备过程如实施案例2。
(2)C6-Ceramide共载阿霉素脂质体的空白脂质体的组成及比例:氢化大豆卵磷脂 24 mg(30.57nmol,56.35%mol)B 胆固醇 8mg (20.69nmol,38.14%mol)C PEG2000-DSPE 2mg
(0.71nmol,1.31%mol) D C6-Ceramide 0.91mg (2.28nmol,4.20 %)。 PEG2000—DSPE和C6-Ceramide购买自美国Avanti
Polar Lipids公司,胆固醇购买自Sigma公司,氢化大豆卵磷脂购买自Lipoid
公司。共载C6-Ceramide和阿霉素的脂质体的制备过程如实施案例2。
(3)我们的实验结果表明共载C16-Ceramide和阿霉素的脂质体和共载C6-Ceramide和阿霉素的脂质体不稳定,易沉降,而共载PEG-
Ceramide和阿霉素的脂质体相对稳定。我们推测这是由于PEG- Ceramide的PP(包装因子)值小于ceramide,增加了共载PEG- Ceramide和阿霉素的脂质体的稳定性。由于短碳基的PEG-ceramide(比如PEG-ceramide C6)具备快速解离的特性从而降低了纳米脂质体的稳定性(Zhang
YP, Stabilized plasmid-lipid particles for regional gene therapy: formulation
and transfection properties. Gene Ther. 1999 Aug;6(8):1438-47),因此本发明制备了共载PEG-C16-ceramide和阿霉素的纳米脂质体并探讨其功能。
实验例
1
:
Lipo-ADR-Cer
脂质体的纳米表征检测
(1)Stewart法测定实施例1中制备的的脂质体磷脂浓度:按照配方比例称取定量的脂质体(根据脂质体组成不同,脂质组成不同)溶于4 ml氯仿,2倍比稀释6个管。每管1ml。加入1 ml的0.1 mol/L的硫氰酸亚铁铵溶液,涡旋混匀15 s,3500rpm, 6 min离心。吸取400 微升的下层溶液(有分层,且在吸取下层溶液前,枪不要按到底打尽,留一部分空气,这样插到下层溶液内后,打尽空气再按到底,这样可防止吸到上层染色液),在500
nm,紫外分光光度计(UV-2401PC)检测。用氯仿调零,建立标准曲线。取10~20
μl脂质体溶液,用MilliQ水定容到0.5 ml,加入1.1 ml甲醇,0.5 ml氯仿,涡旋15s形成单相。向单相中继续加入0.5 ml氯仿,0.5
ml MilliQ水,涡旋60 s,3500rpm,离心6 min形成双相。取双相下层的氯仿溶液500ul,用氯仿定容到1 ml,加入显色剂1ml混合,涡旋震荡1 min。静置分层。取下层氯仿 400ul,用氯仿调零,在紫外分光光度计读值(500 nm)。代入标曲。
(2)实施实例2制备的阿霉素脂质体的包封率(EE)和载药量测量:第一步,建立阿霉素测定的标准曲线。光谱分析:配制10ug/ml的阿霉素溶液(以Milli-Q水溶解),以Milli-Q水调零后,在200-800nm波长范围内通过紫外分光光度计全扫描,根据扫描图谱可得,阿霉素得最大吸收波长为499nm。标准曲线的绘制:配制10mg/ml的阿霉素溶液(为阿霉素母液,4℃冰箱保存),按照一定浓度梯度,配置不同浓度的阿霉素溶液,加入150μl10%Triton-X
100。通过紫外分光光度计(CARY 100)调零后,在499nm波长处读各样品值。以吸光度(A)对应阿霉素的浓度(C)作图,得到线性回归方程。第二步,包封率(EE)和载药量测量。处理样品:将150μl10%Triton-X 100水溶液加入0.01
ml阿霉素脂质体溶液中,振荡1 min破乳,用Milli-Q水补充体积至400ul。通过紫外分光光度计在499nm处读取吸光度值,代入阿霉素测定的标准曲线,计算阿霉素脂质体溶液中的阿霉素浓度和质量。包封率(EE):EE = W包/W投 * 100%(W包指包裹进入的阿霉素的质量;W投指投入的阿霉素的总质量)。载药量(Ew,亦称载药量drug loading): Ew =
W包/W类脂 *
100%(W包指包裹进入的阿霉素的质量;W类脂指处方类脂的总质量;W类脂可通过Stewart法来测定浓度)。实验结果见表1,实验结果展示了Lipo-ADR-Cer脂质体的载药量为5.3%±0.003,包封率为96.6%±2.1%,与Lipo-ADR脂质体的载药量和包封率相似。
表1. Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR的纳米表征( n = 3, X ± SD)
(3)实施例2制备的阿霉素脂质体的粒径分布和Zeta电位:以1:100的体积比稀释阿霉素脂质体样品,加入样品池。通过英国Malvern公司的激光粒径电位分析仪测定阿霉素脂质体的粒径分布和Zeta电位。每个样品重复测定3次。实验结果见表1,实验结果展示了Lipo-ADR-Cer脂质体的粒径为96.5±5.6,Zeta电位为﹣2.3±0.2,PDI值为0.1±0.03,与Lipo-ADR脂质体的粒径、Zeta电位和PDI值相似。
实验例
2
:
Lipo-ADR-Cer
脂质体的体外释放过程
取1ml的实施例2的阿霉素脂质体溶液(Lipo-ADR,Lipo-ADR-Cer)放入透析袋(MWCO) 1000)中,透析液为20ml的PBS溶液(pH 7.4,pH 6.5),在37℃振荡水浴中透析。在不同时间的点,取样品:设置实验时间点为2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 1 D, 2 D, 3
D, 4 D,每个时间点取出1ml的透析液,并同时补充1ml的透析液,以保证体系的稳定。根据上述的阿霉素浓度的测定过程,将不同时间点得到的透析液在499nm下通过紫外分光光度计读值,带入标曲,计算得浓度和质量。以时间点为横轴,以各个时间点下的释放百分比为纵轴。释放率 = (W总- W剩)/ W总* 100% (W总指投入阿霉素的总质量;W剩指剩余阿霉素的总质量)。实验结果见图1,实验结果展示了在PH
7.4和PH 6.5的透析环境下,本发明Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR的体外释放过程无差异,本发明Lipo-ADR-Cer在两种PH透析环境下的释放过程亦无差异。
实验例
3
:
Lipo-ADR-Cer
脂质体的体外稳定性
取1ml的实施例2制备的阿霉素脂质体溶液(Lipo-ADR,Lipo-ADR-Cer)放入透析袋(MWCO) 1000)中,透析液分别为500ml的PBS溶液,含10%胎牛血清的PBS溶液,100%胎牛血清。在37℃细胞孵箱内搅拌透析。在1d,2d,3d,4d时间点取样品,每个时间点取出50ul的样品(Lipo-ADR,Lipo-ADR-Cer),以1:100的体积比稀释阿霉素脂质体样品,加入样品池。通过英国Malvern公司的激光粒径电位分析仪测定阿霉素脂质体的粒径分布和Zeta电位。实验结果见图2,实验结果展示了在整个实验过程中,本发明Lipo-ADR-Cer的粒径基本未变,且与Lipo-ADR的粒径基本一致。
实验例
4
:
Lipo-ADR-Cer
脂质体的体外毒性实验
通过实施例2制备阿霉素脂质体Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR,测定不同给药时间本发明Lipo-ADR-Cer脂质体的体外毒性。细胞株MCF-7、MCF-7-ADR、HL-60、HL-60-ADR培养在16DM培养基(10%牛血清)中,消化对数生长期的肿瘤细胞并收集计数,以每孔5000个细胞,100ul培养基铺入96孔板中,在7.5%CO2,37℃的细胞培养箱中孵育过夜。用细胞培养液按浓度梯度稀释药液,对应孔加入不同浓度的游离的阿霉素,游离的PEG-C16-ceramide+阿霉素,Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR,每种药物浓度做三副孔。在7.5%CO_2,37℃的细胞培养箱中继续培养48h和72h后,通过CCK8试剂检测细胞存活率。以10μl的CCK8试剂加入96孔板的每孔内,37℃孵育2小时。设置空白孔三副孔,只加同体积的cck8试剂。通过(MULTISKAN MK3)全自动酶标仪读值,波长为450nm,并计算细胞存活率,通过compuysn软件计算药物的IC50。
细胞生存率=(OD各浓度-OD空白孔)/( OD不加药组-OD空白孔)×100%,三副孔的OD求均值。计算细胞存活率和药物的IC50。实验结果如图3和表2,实验结果展示了给药时间为48h时,针对耐药细胞MCF-7-ADR,Lipo-ADR的IC50是Lipo-ADR-Cer的约2.25倍(p<0.01);同时针对耐药细胞HL-60-ADR, 给药时间为48h时, Lipo-ADR的IC50是Lipo-ADR-Cer的约1.4倍(p<0.01)。给药时间为72h时,在耐药细胞MCF-7-ADR上,Lipo-ADR的IC50是Lipo-ADR-Cer的约1.68倍(p<0.05);在耐药细胞HL-60-ADR上, Lipo-ADR的IC50是Lipo-ADR-Cer的约1.88倍(p<0.01)。这表明在耐药细胞株上,本发明Lipo-ADR-Cer的体外细胞毒性明显强于Lipo-ADR。然而,对于MCF-7细胞,在给药时间为48h和72h时,Lipo-ADR的IC50与Lipo-ADR-Cer的IC50无统计学差异,两者的杀伤曲线相似;对于HL-60细胞,在给药时间为48h和72h时,Lipo-ADR的IC50与Lipo-ADR-Cer的IC50无统计学差异,两者的杀伤曲线相似。
根据上述实验结果,在两株化疗药物耐药细胞株(MCF-7-ADR,HL-60-ADR)上,对比Lipo-ADR,本发明Lipo-ADR-Cer降低了阿霉素的IC50值。
表2. Lipo-ADR-Cer脂质体的体外毒性实验药物的IC50值( n = 3, X ± SD)
实验例
5
:
Lipo-ADR-Cer
脂质体的体外促凋亡实验
通过实施例2制备阿霉素脂质体Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR,测定本发明Lipo-ADR-Cer脂质体的体外促凋亡能力。细胞株MCF-7、MCF-7-ADR、HL-60、HL-60-ADR培养在16DM培养基(10%牛血清)中,消化对数生长期的肿瘤细胞并收集计数,以每孔10000个细胞铺48孔板,每个样品设置副孔。放入7.5%CO2,37℃的细胞培养箱中培养过夜。对应孔加入游离的阿霉素,游离的PEG-C16-ceramide+阿霉素,Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR,用细胞培养液稀释,设定阿霉素终浓度为25ug/ml,每种样品做副孔,设定空白不加药孔。放入7.5%CO_2,37℃的细胞培养箱中培养48h后,消化收集细胞于流式管中(HL-60和HL-60-ADR为半贴壁细胞不需要消化)。涌过Alexa Fluor 488 Annexin V 单染测凋亡。消化后取适当细胞数(总细胞数:5×104)加到流式管中,细胞离心1200rpm×5 min,弃上清,冷1×PBS溶液,2 mL/管,洗(混悬),离心1200rpm×5 min,弃上清,1×Annexin-Binding Buffer 重悬细胞,100
µL/管,每管 + 5 µL Annexin V 设定NEG染Annexin V孔, 室温下孵育 15 min。冰上操作,轻柔加入 200
µL/管 1×Annexin-Binding
Buffer,尽快上机。实验结果见图4,实验结果展示了在耐药细胞MCF-7-ADR上,Lipo-ADR-Cer的平均荧光强度是Lipo-ADR的约1.72倍(p<0.001);在耐药细胞HL-60-ADR上, Lipo-ADR-Cer的平均荧光强度是Lipo-ADR的约1.72倍(p<0.01)。在MCF-7上,Lipo-ADR-Cer的平均荧光强度与Lipo-ADR相接近;在HL-60上, Lipo-ADR-Cer的平均荧光强度与Lipo-ADR相接近。
这表明在耐药细胞株上,本发明Lipo-ADR-Cer的体外促凋亡能力明显强于Lipo-ADR;在敏感细胞株上,Lipo-ADR-Cer的体外促凋亡能力与Lipo-ADR的相近。
实验例
6
:
CFPE-labeled
Lipo-Cer
脂质体的体外转染效率实验
通过实施例1的处方比例中加入0.15mg的CFPE,制备CFPE标记的空白的脂质体,CFPE-labeled Lipo-Cer和CFPE-labeled
Lipo,通过流式细胞术检测不同时间点空白脂质体的体外转染效率。细胞株MCF-7、MCF-7-ADR、HL-60、HL-60-ADR培养在16DM培养基(10%牛血清)中,消化对数生长期的肿瘤细胞并收集计数,以每孔5*10000个细胞铺48孔板,每个样品设置副孔。放入7.5%CO2,37℃的细胞培养箱中培养过夜。CFPE标记的空白脂质体(CFPE-labeled
Lipo-Cer和CFPE-labeled Lipo)用细胞培养液稀释脂质体终浓度为4mg/ml,加入对应孔中,每种样品做副孔。放入7.5%CO_2,37℃的细胞培养箱中培养1h,2h,4h,8h后,消化收集细胞于流式管中(HL-60和HL-60-ADR为半贴壁细胞不需要消化)。细胞4℃离心1200 rpm × 5 min,弃上清。每管用2ml PBS洗涤后,涡旋细胞,4℃离心1200 rpm × 5 min,弃上清。重复PBS洗涤和离心的过程。最后,每管200ul PBS重悬细胞,通过流式细胞仪检测细胞内CFPE的平均荧光值。实验结果见图5。
实验结果展示了在四个细胞株(MCF-7、MCF-7-ADR、HL-60、HL-60-ADR)上,不同时间点细胞内的平均荧光值无统计学差异,表明本发明CFPE-labeled Lipo-Cer和CFPE-labeled Lipo在体外的细胞转染效率无差异。
实验例
7
:
Lipo-ADR-Cer
脂质体体外转染效率实验
通过实施例2制备阿霉素脂质体Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR,测定本发明Lipo-ADR-Cer脂质体的体外转染效率。细胞株MCF-7、MCF-7-ADR、HL-60、HL-60-ADR培养在16DM培养基(10%牛血清)中,样品分组为游离的ADR,
Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR。用细胞培养液稀释阿霉素的终浓度为0.2mg/ml,加入对应孔中,每种样品做副孔。在7.5%CO_2,37℃的胞培养箱中培养1h,2h,4h,8h后,消化收集细胞于流式管中。细胞4℃离心1200
rpm × 5 min,弃上清。每管用2ml
PBS洗涤后,涡旋细胞,4℃离心1200
rpm × 5 min,弃上清。为洗去吸附在细胞表面的ADR,需要重复PBS洗涤和离心的过程两次。每管200ul PBS重悬细胞,通过流式细胞仪检测细胞内阿霉素红光的平均荧光值。实验结果见图6。
实验结果展示了在四个细胞株(MCF-7、MCF-7-ADR、HL-60、HL-60-ADR)上,不同时间点Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR的细胞内平均荧光强度值无统计学差异,而游离的ADR的荧光强度最高。表明本发明Lipo-
ADR-Cer和Lipo- ADR在体外的细胞转染效率无差异。
实验例
8
:共聚焦显微镜评价
Lipo-ADR-Cer
脂质体体外内吞效率实验
通过实施例2制备阿霉素脂质体Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR,细胞株MCF-7、MCF-7-ADR、HL-60、HL-60-ADR培养在16DM培养基(10%牛血清)中,取对数生长期的细胞,消化计数,以每孔2*10000个细胞铺共聚焦专用皿,半贴壁细胞以每孔5*10000个细胞,为防止实验过程中带来的细胞损失,设置副孔。在7.5%CO2,37℃的细胞培养箱中培养过夜。样品分组为游离的ADR, Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR,NEG。设定阿霉素的终浓度为0.2mg/ml调齐各组样品的浓度,每种样品做副孔。在7.5%CO_2,37℃的胞培养箱中培养1h后,弃培养基。200μl PBS洗涤两次。4%甲醛溶液固定细胞,常温20 min。200μl* PBS洗涤两次。1ug/ml DAPI染色5 min,200μl PBS洗涤两次。每孔加入200ul PBS,通过共聚焦显微镜拍摄,分析细胞内阿霉素的红光强度。实验结果见图7。
实验结果展示了在四个细胞株(MCF-7、MCF-7-ADR、HL-60、HL-60-ADR)上,Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR荧光信号相似,表明本发明Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR的细胞内吞无统计学差异。而游离的ADR的荧光信号最强,这与上述的流式结果相一致。
实验例
9
:
Lipo-ADR-Cer
脂质体的
MCF-7-ADR
小鼠体内肿瘤治疗结果
(1)裸鼠人乳腺癌肿瘤耐药模型的构建:针对对数生长期的MCF-7-ADR细胞,消化收集,离心PBS清洗,计数后用PBS配制乳腺癌耐药细胞悬液。选取BALB/c裸鼠(雌性,5周龄,20 g),将上述MCF-7-ADR的细胞悬液接种到裸鼠腋下皮下,每只1×107,种植后,每天观察肿瘤大小,每三天称量体重并记录。肿瘤的体积计算公式:长×宽×宽/2。
(2)给药:精心饲养载瘤的裸鼠,待肿瘤体积长至100mm3左右,随机分组,设定组别为NEG, 游离的阿霉素,游离的PEG-C16-ceramide+阿霉素,Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR。NEG按每只给200μl* PBS, 其余各组按每只5mg/kg的ADR量,尾静脉注射给药。给药时间为2周,每周两次。记录肿瘤的大小和裸鼠的体重。
(3)解剖取瘤:给药后继续精心饲养,第48天时,处死裸鼠,解剖取肿瘤。拍照并称量肿瘤组织。实验结果见图8,实验结果展示了在第48天的时,NEG组,单纯ADR组,游离的PEG-C16-ceramide+阿霉素,Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR组肿瘤称重分别为:0.82+0.18g(n = 7),0.77+0.19g(n = 7),0.59+0.11g(n = 7),0.16+0.04g(n = 7),0.38+0.09g(n =7)。除了游离的PEG-C16-ceramide+阿霉素组的实验鼠的体重下降了8%左右,其它各组实验鼠的体重未发生下降。
结果表明了与其他组比较,Lipo-ADR-Cer能明显抑制肿瘤生长,显示出良好的抗肿瘤作用,未增加毒副作用,表明本发明Lipo-ADR-Cer脂质体可以有效改善阿霉素耐药肿瘤对化药的敏感性,并可以降低游离的PEG-C16-ceramide+阿霉素联合应用的毒副作用。
实验例
10
:
Lipo-ADR-Cer
脂质体的
HL-60-ADR
小鼠体内肿瘤治疗结果
(1)裸鼠体内人白血病耐药模型的构建:针对对数生长期的HL-60-ADR细胞,收集离心PBS清洗,计数后用PBS配制白血病耐药细胞悬液。选取 BALB/c裸鼠(雌性,5周龄,20 g),将上述HL-60-ADR的细胞悬液尾静脉注射,每只1×107,注射后后,每天观察裸鼠的生存状况,每三天称量体重并记录。
(2)给药:接种后精心饲养裸鼠,随机分组,设定组别NEG, 游离的阿霉素,游离的PEG-C16-ceramide+阿霉素,Lipo-ADR-Cer和Lipo-ADR。从第十五天(接种肿瘤细胞后一周,裸鼠的体重开始下降)起,NEG按每只给200μl PBS, 其余各组按每只5mg/kg的ADR量,尾静脉注射给药,给药时间为2周,每周两次。记录裸鼠的体重和各组的生存率。
(3)实验结果:如图9所示, Lipo-ADR-Cer组的裸鼠,最长生存时间为90天,最短为78天,平均生存时间为83±5d;Lipo-ADR组的裸鼠最长生存时间为63天,最短为57天,平均生存时间为,60±2d;游离的PEG-C16-ceramide+阿霉素联合给药组的裸鼠,最长生存时间为57天,最短为42天,平均生存时间为,47±6d;游离阿霉素组的裸鼠,最长生存时间为36天,最短为27天,平均生存时间为,32±3d;NEG组的裸鼠,最长生存时间为36天,最短为27天,平均生存时间为33±4d。
通过GraphPad Prism 5做生存分析(Long-rank
Test),结果显示Lipo-ADR-Cer组的治疗效果比Lipo-ADR组,游离药物联合给药组,NEG组,游离阿霉素组的治疗效果均强(p值均<0.001)。因此,对于体内的HL-60-ADR裸鼠模型,本发明Lipo-ADR-Cer的治疗效果最好。
Claims (9)
1.一种载药纳米脂质体,其特征在于,所述纳米脂质体中共载ceramide及化疗药物。
2.如权利要求1所述的一种载药纳米脂质体,其特征在于,所述纳米脂质体中共载的ceramide为经修饰的ceramide。
3.如权利要求1、2所述的一种载药纳米脂质体,其特征在于,所述纳米脂质体中共载的经修饰的ceramide为PEG-C16-ceramide。
4.如权利要求1所述的一种载药纳米脂质体,其特征在于,所述纳米脂质体中共载的化疗药为阿霉素。
5.根据权利要求1~4任一项所述的一种载药纳米脂质体的制备方法,包括以下步骤:
a)油相:氢化大豆卵磷脂、胆固醇、PEG2000-DSPE、PEG2000-C16-Ceramide按比例12:4:1:3进行混合,65℃加热溶于乙醇中,备用;水相:250nM/L的硫酸铵溶液,65℃加热备用;
b)油相与水相按1:3比例进行混合,取油相于水相液面以下缓慢加入水相,不断进行磁力搅拌,获得脂质体后进行200nm、100nm、50nm薄膜筛选,获得90nm粒径的空白脂质体,备用;
c)取10mg/ml的阿霉素以75:1000的比例与空白脂质体于65℃制备共载药脂质体Lipo-ADR-Cer;
d)以硫酸铵及HEPES溶液为透析液,进行两次透析,获得共载药脂质体Lipo-ADR-Cer,于4℃避光保存代用。
6.一种载药纳米脂质体的用途,其特征在于,用于多药物耐药的癌症治疗。
7.如权利要求1、6所述的一种载药纳米脂质体的用途,其特征在于,用于化疗药物阿霉素耐药的癌症治疗。
8.如权利要求1、6、7所述的一种载药纳米脂质体的用途,其特征在于,用于化疗药物阿霉素耐药的乳腺癌的治疗。
9.如权利要求1、6、7所述的一种载药纳米脂质体的用途,其特征在于,用于化疗药物阿霉素耐药的白血病的治疗。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410734132.7A CN104922067A (zh) | 2014-12-08 | 2014-12-08 | 一种载药纳米脂质体、制备方法及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410734132.7A CN104922067A (zh) | 2014-12-08 | 2014-12-08 | 一种载药纳米脂质体、制备方法及用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104922067A true CN104922067A (zh) | 2015-09-23 |
Family
ID=54109731
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410734132.7A Pending CN104922067A (zh) | 2014-12-08 | 2014-12-08 | 一种载药纳米脂质体、制备方法及用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104922067A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3630126A4 (en) * | 2017-06-02 | 2021-03-17 | The Penn State Research Foundation | CERAMIDE NANOLIPOSOMES, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR IMMUNOTHERAPY |
EP3703653A4 (en) * | 2017-11-03 | 2021-09-08 | University Of Virginia Patent Foundation | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF CANCERS |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101102752A (zh) * | 2004-11-15 | 2008-01-09 | 耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研发公司 | 联合优选为神经酰胺与细胞毒性药物的联合疗法 |
CN103340883A (zh) * | 2013-07-25 | 2013-10-09 | 山东大学 | 基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物 |
WO2014028487A1 (en) * | 2012-08-13 | 2014-02-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Amine-containing lipidoids and uses thereof |
WO2014144421A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Ceramide reversal of multi-drug resistance |
-
2014
- 2014-12-08 CN CN201410734132.7A patent/CN104922067A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101102752A (zh) * | 2004-11-15 | 2008-01-09 | 耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研发公司 | 联合优选为神经酰胺与细胞毒性药物的联合疗法 |
WO2014028487A1 (en) * | 2012-08-13 | 2014-02-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Amine-containing lipidoids and uses thereof |
WO2014144421A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Ceramide reversal of multi-drug resistance |
CN103340883A (zh) * | 2013-07-25 | 2013-10-09 | 山东大学 | 基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MURRAY S. WEBB ET AL.: "Comparison of different hydrophobic anchors conjugated to", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA》 * |
NUNO A. FONSECA ET AL.: "Simultaneous active intracellular delivery of doxorubicin and C6-ceramide shifts the additive/antagonistic drug interaction of non-encapsulated combination", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3630126A4 (en) * | 2017-06-02 | 2021-03-17 | The Penn State Research Foundation | CERAMIDE NANOLIPOSOMES, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR IMMUNOTHERAPY |
US11559504B2 (en) | 2017-06-02 | 2023-01-24 | The Penn State Research Foundation | Ceramide nanoliposomes, compositions and methods of using for immunotherapy |
EP3703653A4 (en) * | 2017-11-03 | 2021-09-08 | University Of Virginia Patent Foundation | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF CANCERS |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2017216525B2 (en) | pH-SENSITIVE CARRIER AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF, pH-SENSITIVE MEDICINE AND pH-SENSITIVE PHARMACEUTICAL COMPOSITION EACH CONTAINING SAID CARRIER, AND CULTURE METHOD USING SAID pH-SENSITIVE MEDICINE OR SAID pH-SENSITIVE PHARMACEUTICAL COMPOSITION | |
Lu et al. | A biocompatible reconstituted high-density lipoprotein nano-system as a probe for lung cancer detection | |
CN102784109B (zh) | 注射用紫杉烷类药物白蛋白纳米粒制剂及其制备方法 | |
CN102626393B (zh) | 一种可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂及其制备方法 | |
CN106474064B (zh) | 一种蒿甲醚纳米脂质体及其制备方法与应用 | |
Stras et al. | Growth of metastatic triple-negative breast cancer is inhibited by deep tumor-penetrating and slow tumor-clearing chemotherapy: the case of tumor-adhering liposomes with interstitial drug release | |
CN104490786B (zh) | 一种靶向多功能双载药脂质体的制备方法和应用 | |
Cui et al. | Dual-modified natural high density lipoprotein particles for systemic glioma-targeting drug delivery | |
CN110123761A (zh) | 一种仿生型高密度脂蛋白纳米粒及其制备和应用 | |
Li et al. | Stepwise targeting and responsive lipid-coated nanoparticles for enhanced tumor cell sensitivity and hepatocellular carcinoma therapy | |
Wang et al. | Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo | |
Chen et al. | Improved anti-triple negative breast cancer effects of docetaxel by RGD-modified lipid-core micelles | |
Tang et al. | TPGS2000-DOX prodrug micelles for improving breast cancer therapy | |
Liu et al. | Targeted delivery of irinotecan to colon cancer cells using epidermal growth factor receptor-conjugated liposomes | |
CN104922067A (zh) | 一种载药纳米脂质体、制备方法及用途 | |
CN105919935B (zh) | 索拉非尼药物脂质纳米混悬剂及其制备方法 | |
CN105287612B (zh) | 共载盐霉素钠与阿霉素纳米脂质体及其制备方法与应用 | |
CN108853056B (zh) | 一种叶酸靶向修饰共载盐酸阿霉素和藤黄酸纳米结构脂质载体制剂及其制备方法 | |
CN110898231A (zh) | 一种功能化拉洛他赛脂质体及其制备方法与应用 | |
CN106061470A (zh) | 含有多种物质的聚合物纳米粒子及其方法 | |
Li et al. | Vincristine-doxorubicin co-loaded artificial low-density lipoproteins towards solid tumours | |
US20220257514A1 (en) | Monosaccharide-tagged nano-liposome drug delivery system, the manufacture and use for drug targeting delivery thereof | |
US10639372B2 (en) | Nucleic acid, medical nanoparticle, and pharmaceutical composition thereof | |
Roberts et al. | Versatile Encapsulation and Synthesis of Potent Therapeutic Liposomes by Thermal Equilibration | |
Xie et al. | Evaluation of nanoscaled dual targeting drug-loaded liposomes on inhibiting vasculogenic mimicry channels of brain glioma |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20171121 Address after: 225316 Jiangsu city of Taizhou province China Road West of Lu Jia Lu, Chengkou pharmaceutical East Building G79 Applicant after: Taizhou Mai BARTEC Pharmaceutical Co. Ltd. Address before: 201203 Shanghai Guo Shou Jing Road, Zhangjiang High Tech Park of Pudong New Area No. 351 Building No. 1 room 440 Applicant before: Shanghai Zhangjiang Bio-Tech Co., Ltd. |
|
TA01 | Transfer of patent application right | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150923 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |