CN102626393B - 一种可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，涉及一种可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂。本发明以白蛋白和难溶性替尼类药物结合、并以磷脂加以分散和稳定而形成的白蛋白纳米粒，制成可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂。本发明利用纳米粒子对肿瘤的增强渗透和滞留效应，使更多药物被动靶向而浓集于肿瘤组织，提高其抗肿瘤效果；同时，由于注射方式的生物利用度高以及所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂存在被动靶向作用，可大大降低给药剂量，从而使得非靶部位的药物浓度有效降低，有助于降低药物的毒副作用，具有良好的临床应用前景。

Description

一种可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂及其制备方法，尤其涉及一种将难溶性替尼类药物制备成可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂及其制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是人类最难对付的顽症之一。近年来，肿瘤的发病率急剧上升，其治疗难度大、死亡率高，已成为人类死亡的第二大病因。据报道，全世界每年约有600万人死于恶性肿瘤，其中，中国癌症患者约450万人，死亡率逾30％，已成为严重的社会问题。目前，临床上通常采用手术、化疗及放疗等手段治疗恶性肿瘤；对于早期肿瘤，手术切除辅以其它疗法往往可取得较好的治疗效果；而对于晚期肿瘤，多以放、化疗综合治疗以延缓病情的发展，但均伴随严重的免疫系统抑制或毒副作用，难以有效提高患者的生存率和生活质量。因此，探寻疗效好、不良反应较小的治疗手段或药物一直是肿瘤治疗的研究热点和努力方向。

有研究发现，替尼类药物是一类较新的分子靶向性药物，主要靶向一定受体的酪氨酸激酶，通过抑制酪氨酸激酶的活性抑制肿瘤生长，因此，该类药物对正常组织细胞的毒性较低，安全性较高；其中，拉帕替尼由葛兰素史克公司研发，于2007年由美国食品药品管理局核准上市，其临床上主要用于目前核准的适应症：与卡培他滨合并治疗晚期或是转移性乳癌。但是，有研究表明，所述的拉帕替尼对多种实体瘤均有抑制作用。艾力替尼为上海艾利斯医药自主研发的1.1类新药，现已取得国家食品药品监督管理局临床批件，获准开展临床试验；吉非替尼已被美国食品药品监督管理局、中国食品药品监督管理局批准用于治疗非小细胞肺癌，而苏尼替尼则在进行治疗肾细胞癌的二期临床实验。上述药物可统称为替尼类药物或难溶性替尼类药物。

目前，尽管替尼类药物在抗肿瘤方面有着诸多优势，但治疗实践显示其仍存在以下缺陷：①水溶性差导致药物无法注射，而口服生物利用度又不高，且容易产生胃肠道副作用；②给药剂量大，且需要频繁给药，使得患者顺应性差；③组织分布广泛，对肿瘤部位无靶向性，一定程度上减弱了其抗肿瘤效果，增加了全身性的毒副作用。

当前，有关替尼类药物的制剂已有较多专利和论文公开，但尚未见相关专利或文献报道能够同时克服上述缺陷。专利CN200810228902.5将拉帕替尼制备为注射剂，然而处方中却含有大量的有机溶剂，且没有纳米制剂的靶向作用；专利CN200710202970.X、CN200610200203.0、CN200610200543.3、CN200610200545.2、CN200610200201.1、CN200610200204.5、CN200610200196.4、CN200610200704.9、CN200610200522.1、CN200610200733.5、CN200610200992.8、CN200610201190.9、CN200610201184.3、CN200610201343.X、CN200710200319.9、CN200710202627.5、CN200810301833.6、CN200810301837.4、CN200810304214.2、CN200810300851.2、CN200810300852.7、CN200810304640.6、CN200910301860.8等将替尼类药物与其它制剂合用制备为缓释注射液，虽然不含有机溶剂，但其中却通过聚合物等物质形成凝胶辅以表面活性剂而形成，并未制备成纳米制剂，因此也不具备肿瘤靶向性。

白蛋白虽已经有报道和专利用于制备纳米粒，如中国发明申请CN200380109606.9、CN97199720.9、CN20031023461.X、CN02811017.X、CN03108361.7、CN200610077006.4、及发明专利ZL01119258.5、ZL03108361.7。但是其中涉及的产品和技术仅仅是采用人血清白蛋白，且制备中采用大量有机溶剂，但仍存在仅用白蛋白不足以制备得到粒径合适、稳定分散的纳米制剂的问题。

磷脂常用于脂质体的制备中，已有专利采用脂质体作为载药系统包载活性药物。但是在本申请中，拟证实磷脂作为分散稳定药物和白蛋白复合物的介质，与药物和白蛋白一起构成稳定的纳米制剂，磷脂并不单独形成脂质体。

在中国发明申请CN200610037609.1、CN02129204.3、CN02160028.7和发明专利ZL94191101.2、ZL96190332.5中构建了几种蛋白与磷脂的组合物，但其中的蛋白是活性药物，与本专利申请中要解决的问题有本质的区别。

迄今为止，有关替尼类药物的基础和应用基础研究中，主要集中于其作用机制和药物合用的研究，尚未见有效地以白蛋白纳米粒将其制备为纳米制剂的文献报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂及其制备方法，尤其涉及一种将难溶性替尼类药物制备成可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂及其制备方法。

本发明所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂以磷脂为稳定剂，难溶性替尼类药物与白蛋白结合后经磷脂分散并使其稳定。本发明利用替尼类药物与白蛋白结合率高的特性，使两者自然形成并制成白蛋白纳米粒，再采用磷脂分散、稳定所述的纳米粒子(使其具有极高的水溶性)，最终制得可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂。

本发明的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，将难溶性替尼类药物与生物可降解材料结合形成可溶性纳米粒，利用所述纳米粒子对肿瘤具有增强渗透和滞留效应(EPR效应)、可被动靶向至肿瘤部位，提高抗肿瘤效果；同时，由于注射方式的生物利用度高，因此可降低给药剂量，有助于降低抗肿瘤药物的全身性毒副作用；另一方面，也可避免药物口服造成的胃肠道毒副作用。

具体而言，本发明的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，由难溶性替尼类药物、白蛋白、磷脂及药剂学上必要的辅料制成，其中，难溶性替尼类药物、白蛋白、磷脂和辅料所占的质量比分别为1～30％，5～70％，5～95％，0.01～1％，优选的，所述的难溶性替尼类药物、白蛋白、磷脂和辅料所占的质量比分别为2～5％，10～25％，50～75％，0.02～0.5％。

本发明中，所述的难溶性替尼类药物选自阿西替尼(axitinib)、伯舒替尼(bosutinib)、达沙替尼(dasatinib)、厄洛替尼(erlotinib)、凡德他尼(vandetanib)、吉非替尼(gefitinib)、卡纽替尼(卡奈替尼，卡拉替尼，canertinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来妥替尼(lestaurtinib)、马赛替尼(masitinib)、伏他替尼、莫立替尼(mubritinib)、坦度替尼(tandutinib)、尼罗替尼(nilotinib)、尼拉替尼、培立替尼、替拉替尼(telatinib)、苏尼替尼(舒尼替尼，sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、伊马替尼(imatinib)、艾力替尼(ALS1306)、巴非替尼(bafetinib)或普喹替尼的一种或者几种的组合；

本发明中，所述的白蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、驴血清白蛋白、马血清白蛋白、兔血清白蛋白、猪血清白蛋白及其他种类白蛋白，优选人血清白蛋白或牛血清白蛋白；

本发明中，所述的磷脂选自蛋黄卵磷脂(EPC)、大豆磷脂(SPC)、氢化豆磷脂(HSPC)、二月桂酰卵磷脂(DLPC)、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂(MPPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂(PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂(PSPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂(SPPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰甘油(DPPG)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二棕榈酰神经鞘磷脂(DPSP)、二棕榈酰卵磷脂(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸(DPPS)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、脑磷脂酰丝氨酸(PS)、二肉豆蔻酰卵磷脂(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、脑神经鞘磷脂(BSP)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二硬脂酰神经鞘磷脂(DSSP)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)中的一种或多种；优选EPC、SPC或HSPC；

本发明中，所述的药剂学上必要辅料主要为抗氧化剂如维生素E、维生素C、反丁烯二酸、苹果酸、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸和L-异亮氨酸；优选维生素E、维生素C和亚硫酸氢钠；

所述的难溶性替尼类药物制备为白蛋白纳米粒后，其分散介质可为水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸盐缓冲液、5％葡萄糖溶液或生理盐水。

本发明采用乳化法制备注射用白蛋白纳米粒，初乳已经具有合适注射的粒径，但可选择性采用超声或高压均质工艺进一步控制粒径。本发明的一个实施例中，分别将表1处方1～30中的拉帕替尼溶于适量乙醇-水(6∶1～2∶1)混合溶剂或其他合适溶剂中，将磷脂溶于适量二氯甲烷中，将二者混合后作为油相；将白蛋白和抗氧化剂溶于适量去离子水中(水相)，于室温或冰水浴中将油相滴入磁力搅拌的水相中，并继续搅拌一定时间，然后40℃水浴旋转蒸发除去乙醇和二氯甲烷，制得载拉帕替尼的白蛋白纳米粒。

本发明中，所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，可采用静脉、皮下、肌内、膜内、腹膜内或其它途径进行注射给药。

本发明中，所述难溶性替尼类药物被包载后，每次的难溶性替尼类药物给药剂量为0.1～200mg/kg，优选的每次给药剂量为10～100mg/kg；给药方案为每天给药或间隔给药，每一疗程给药剂量为3～6000mg/kg，优选的每一疗程给药剂量为40～400mg/kg。

本发明的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂可用于制备治疗癌症的药物，或者作为药物用于癌症治疗；其中，所述的癌症包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤、肝癌、胰腺导管癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、睾丸癌、皮肤癌、淋巴瘤、头颈部肿瘤和起源于胆囊、口腔、外周神经系统、粘膜、腺体、血管、骨组织、淋巴结、眼睛的原发或继发的癌、肉瘤或癌肉瘤等。

本发明的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂经药效学试验，结果表明，其治疗效果优于口服片剂。

本发明利用纳米粒子对肿瘤的增强渗透和滞留效应(EPR效应)，使更多药物被动靶向而浓集于肿瘤组织，提高其抗肿瘤效果；同时，由于注射方式的生物利用度高以及所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂存在被动靶向作用，可大大降低给药剂量，从而使得非靶部位的药物浓度有效降低，有助于降低药物的毒副作用；所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂避免了上市口服制剂生物利用度较低、患者顺应性差的缺点，将白蛋白纳米粒的水溶性提高作用和被动靶向作用相融合，具有良好的临床应用前景。

本发明的可溶性注射用白蛋白纳米粒与现有技术相比，具有以下显著优点：

①对难溶性替尼类药物具有显著的增溶作用，其溶解度足够临床注射应用；

②包封率几乎为100％，制备过程无损失，载药量亦较高；

③可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂可利用肿瘤部位的EPR效应，增加药物在肿瘤组织的蓄积，利于发挥药物的抗肿瘤效果，降低对其它组织的毒副作用。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1显示了本发明中各制剂组给药后人乳腺癌BT-474瘤体体积与时间的关系。

图2显示了本发明中各制剂组给药后人卵巢癌SKOV-3瘤体体积与时间的关系。

图3显示了本发明中各制剂组给药后荷人脑胶质瘤裸鼠的生存期。

图4显示了本发明中各制剂组给药后人非小细胞肺癌A549瘤体体积与时间的关系。

图5显示了本发明中苏尼替尼白蛋白纳米粒在荷皮下肾上腺神经母细胞肿瘤裸鼠的组织分布。

图6显示了本发明中拉帕替尼白蛋白纳米粒在荷人脑胶质瘤裸鼠的组织分布。

图7显示了本发明中正常小鼠给与吉非替尼白蛋白纳米粒或者口服混悬液后体重随时间的变化。

图8显示了本发明中KP-N-NS细胞与不同浓度载香豆素-6的苏尼替尼处方27白蛋白纳米粒孵育1h(A)，或者与200μg/mL载香豆素-6的苏尼替尼处方27白蛋白纳米粒孵育不同的时间(B)。

图9显示了本发明中荧光显微镜观察BT-474细胞与100μg/mL(A)、200μg/mL(B)、400μg/mL(C)和600μg/mL(D)的载香豆素-6的拉帕替尼处方28白蛋白纳米粒孵育1h，或者与200μg/mL载香豆素-6的帕替尼处方28白蛋白纳米粒孵育0.5h(E)、1h(F)、2h(G)和4h(H)；标尺为100μm。

具体的实施方式

实施例1、拉帕替尼白蛋白纳米粒的处方工艺

表1包载拉帕替尼的白蛋白纳米粒处方中各组分的比例(mg)

分别将表1处方1～30中的拉帕替尼溶于适量乙醇-水(6∶1～2∶1)混合溶剂或其他合适溶剂中，将磷脂溶于适量二氯甲烷中，将二者混合后作为油相；将白蛋白和抗氧化剂溶于适量去离子水中(水相)，于室温或冰水浴中将油相滴入磁力搅拌的水相中，并继续搅拌一定时间，然后40℃水浴旋转蒸发除去乙醇和二氯甲烷，即得载拉帕替尼的白蛋白纳米粒。

实施例2、艾力替尼白蛋白纳米粒的处方工艺

表2包载艾力替尼的白蛋白纳米粒处方中各组分的比例(mg)

将表2处方1～30中的艾力替尼溶于适量乙醇-水(6∶1～2∶1)混合溶剂或其他合适溶剂中，将磷脂溶于适量二氯甲烷中，将二者混合后作为油相；将白蛋白和抗氧化剂溶于适量去离子水中(水相)，于室温或冰水浴中将油相滴入磁力搅拌的水相中，并继续搅拌一定时间，然后40℃水浴旋转蒸发除去乙醇和二氯甲烷，即得载艾力替尼的白蛋白纳米粒。

实施例3、吉非替尼白蛋白纳米粒的处方工艺

表3包载吉非替尼的白蛋白纳米粒处方中各组分的比例(mg)

将表3处方1～30中的吉非替尼溶于适量乙醇-水(6∶1～2∶1)混合溶剂或其他合适溶剂中，将磷脂溶于适量二氯甲烷中，将二者混合后作为油相；将白蛋白和抗氧化剂溶于适量去离子水中(水相)，于室温或冰水浴中将油相滴入磁力搅拌的水相中，并继续搅拌一定时间。然后40℃水浴旋转蒸发除去乙醇和二氯甲烷，即得载吉非替尼的白蛋白纳米粒。

实施例4、苏尼替尼白蛋白纳米粒的处方工艺

表4包载苏尼替尼的白蛋白纳米粒处方中各组分的比例(mg)

将表4处方1～30中的苏尼替尼溶于适量乙醇-水(6∶1～2∶1)混合溶剂或其他合适溶剂中，将磷脂溶于适量二氯甲烷中，将二者混合后作为油相；将白蛋白和抗氧化剂溶于适量去离子水中(水相)，于室温或冰水浴中将油相滴入磁力搅拌的水相中，并继续搅拌一定时间。然后40℃水浴旋转蒸发除去乙醇和二氯甲烷，即得载苏尼替尼的白蛋白纳米粒。

实施例5、包载拉帕替尼的白蛋白纳米粒对乳腺癌的药效学试验

肿瘤细胞：人乳腺癌细胞株BT-474，用含12.5％胎牛血清的RPMI1640培养液培养。

动物：SCID小鼠，4周龄，雌性。

肿瘤细胞的接种：采用右腋皮下接种模型，无菌条件下取生长旺盛的BT-474细胞，将细胞消化后离心重悬成约2.0E7/ml细胞悬液，于每只小鼠右腋皮下接种0.1ml癌细胞悬液。

抑瘤率的计算及数据处理：给药后每2日以游标卡尺测量各组裸小鼠肿瘤的长径及短径，根据公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(短径²×长径)/2和抑瘤率：肿瘤抑制率％＝[(阴性对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100]。

给药方案：试验分4组：2种不同给药剂量和给药途径的试验组及生理盐水阴性对照组，每组6只裸小鼠。各组按照表5的方案给药，两周为一个周期。在第30天除生理盐水组外其他组给予第二个周期。肿瘤体积及抑瘤率等实验结果如表6所示，肿瘤的体积变化如图1所示。

表5各实验组的给药方案

组别	给药方案
		生理盐水组	尾静脉注射一周两次
拉帕替尼处方2(30mg/kg)组	尾静脉注射一周两次
		拉帕替尼处方2(10mg/kg)组	尾静脉注射一周两次
口服拉帕替尼混悬液(100mg/kg)组	口服一周连续四次

表6不同治疗组的肿瘤抑制效果

天	组别	肿瘤体积(mm3)	抑瘤率
				30	生理盐水组	544.6±160.0	/
30	拉帕替尼处方2(30mg/kg)组	174.3±108.9*	68.0％
				30	拉帕替尼处方2(10mg/kg)组	346.9±64.3*	36.3％
30	口服拉帕替尼混悬液(100mg/kg)组	150.1±59.1*	72.4％
				45	拉帕替尼处方2(30mg/kg)组	279.9±178.9*	48.6％
45	拉帕替尼处方2(10mg/kg)组	510.7±43.5	6.2％
				45	口服拉帕替尼混悬液(100mg/kg)组	197.4±27.7*	63.7％

^*P＜0.05，与生理盐水组相比。

结果显示，各药物治疗组的肿瘤体积在第30天时均显著小于生理盐水组(p＜0.05)，表明各制剂对BT-474细胞接种的皮下肿瘤均有一定的治疗效果。但拉帕替尼处方2白蛋白纳米粒在30mg/kg剂量时其抑瘤效果与口服拉帕替尼混悬剂100mg/kg时的抑瘤效果相似，且无显著性差异，此时白蛋白纳米粒的累积剂量仅为口服的15％；本发明所制得的白蛋白纳米粒比现有临床使用的口服制剂具有更好的治疗效果。

实施例6、包载艾力替尼的白蛋白纳米粒对皮下卵巢癌的药效学试验

肿瘤细胞：人卵巢癌SKOV-3细胞(购自中国科学院上海细胞库)，用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养。

动物：Balb/c裸鼠，4周龄，雄性。试验组及阴性对照组每组6只裸小鼠。

肿瘤细胞的接种：采用右腋皮下接种模型，无菌条件下取生长旺盛的SKOV-3细胞，将细胞消化后离心重悬成约2.0E7/ml细胞悬液，于每只小鼠右腋皮下接种0.1ml癌细胞悬液。

同前方法计算肿瘤体积及抑瘤率。

表7各实验组的给药方案

组别	给药方案
		生理盐水组	尾静脉注射一周两次
艾力替尼处方6(30mg/kg)组	尾静脉注射一周两次
		艾力替尼处方6(10mg/kg)组	尾静脉注射一周两次
口服艾力替尼混悬液(100mg/kg)组	口服一周连续四次

表8不同治疗组的肿瘤抑制效果

组别	肿瘤体积(mm3)	抑瘤率
			生理盐水组	3061±769	/
艾力替尼处方6(30mg/kg)组	1434±470*	53.1％
			艾力替尼处方6(10mg/kg)组	2142±579*	30.0％
口服艾力替尼混悬液(100mg/kg)组	2226±457*	27.3％

^*P＜0.05，与生理盐水组相比

各组按照表7的给药方案给药两周。

肿瘤体积及抑瘤率等实验结果如表8所示，肿瘤体积变化如图2所示；

结果显示，各药物治疗组的肿瘤体积在第20天时均显著小于生理盐水组(p＜0.05)，表明各制剂对SKOV-3细胞接种的皮下肿瘤均有一定的治疗效果。但艾力替尼处方6白蛋白纳米粒在10mg/kg剂量时其抑瘤效果与口服拉帕替尼混悬剂100mg/kg时的抑瘤效果相似，且无显著性差异，此时白蛋白纳米粒的累积剂量仅为口服的5％；本发明所制得的白蛋白纳米粒比现有临床使用的口服制剂具有更好的治疗效果。

实施例7、包载拉帕替尼的白蛋白纳米粒对脑胶质瘤的药效学试验

肿瘤细胞：人脑胶质瘤U87细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养。

动物：Balb-c裸小鼠，4周龄，初始体重为18～20克，雌性。试验组及阴性对照组每组6只裸小鼠。

肿瘤细胞的接种：脑部原位接种模型，无菌条件下取生长旺盛的U87细胞，以匀浆法制备成约2.0E5/5μl细胞悬液，于裸小鼠右脑纹状体接种细胞的数量为20万/鼠。

评价指标：以裸鼠的生存期为指标，评价各组制剂的抗肿瘤效果。

按照表9的方案给药两周。

表9各实验组的给药方案

组别	给药方案
		生理盐水组	尾静脉注射一周两次
拉帕替尼处方7(30mg/kg)组	尾静脉注射一周两次
		拉帕替尼处方7(10mg/kg)组	尾静脉注射一周两次
口服拉帕替尼混悬液(100mg/kg)组	口服一周连续四次

表10荷原位脑胶质瘤裸鼠经不同方案给药后的中位生存期比较

组别	中位生存期(天)	标准误差	95％置信区间
				生理盐水组	22.0	1.2	19.7-24.3
拉帕替尼处方7(30mg/kg)组	26.0*	0.8	24.5-27.5
				拉帕替尼处方7(10mg/kg)组	27.0*	5.5	16.2-37.8
口服拉帕替尼混悬液(100mg/kg)组	23.0	2.4	18.4-27.6

^*P＜0.05，与生理盐水组相比。

结果如表10及图3所示，结果表明，拉帕替尼白蛋白纳米粒高低剂量组的生存期分别为26和27天，与生理盐水组的生存期相比，具有显著性差异(P＜0.05)。而口服拉帕替尼混悬液组与生理盐水组无显著性差异；表明拉帕替尼制备为白蛋白纳米粒后其抗肿瘤效果大大提高。

实施例8、包载吉非替尼的白蛋白纳米粒对皮下非小细胞肺癌的药效学试验

肿瘤细胞：人非小细胞肺癌A549细胞(购自中国科学院上海细胞库)，用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养。

动物：Balb/c裸鼠，4周龄，雄性。试验组及阴性对照组每组6只裸小鼠。

肿瘤细胞的接种：采用右腋皮下接种模型，无菌条件下取生长旺盛的A549细胞，将细胞消化后离心重悬成约2.0E7/ml细胞悬液，于每只小鼠右腋皮下接种0.1ml癌细胞悬液。

同前方法计算肿瘤体积及抑瘤率。

各组按照表11的给药方案给药两周。

表11各实验组的给药方案

组别	给药方案
		生理盐水组	尾静脉注射一周两次
吉非替尼处方11(25mg/kg)组	尾静脉注射一周两次
		吉非替尼处方11(50mg/kg)组	尾静脉注射一周两次
口服吉非替尼混悬液(100mg/kg)组	口服一周连续四次

表12不同治疗组的肿瘤抑制效果

组别	肿瘤体积(mm3)	抑瘤率
			生理盐水组	1894±490	/
吉非替尼处方11(25mg/kg)组	894±164*	52.8％
			吉非替尼处方11(50mg/kg)组	266±110*※	85.9％
口服吉非替尼混悬液(100mg/kg)组	833±235*	56.0％

^*P＜0.05，与生理盐水组相比；^※P＜0.05，与口服吉非替尼组相比。

肿瘤体积及抑瘤率等实验结果如表12所示、肿瘤体积变化如图4所示；结果显示，各药物治疗组的肿瘤体积在第21天时均显著小于生理盐水组(p＜0.05)，表明各制剂对A549细胞接种的皮下肿瘤均有一定的治疗效果。但吉非替尼处方14白蛋白纳米粒在25mg/kg剂量时其抑瘤效果与口服吉非替尼混悬剂100mg/kg时的抑瘤效果相似，且无显著性差异，此时白蛋白纳米粒的累积剂量仅为口服的12.5％；而吉非替尼处方14白蛋白纳米粒在50mg/kg剂量时其抑瘤效果显著好于口服吉非替尼组；本发明所制得的白蛋白纳米粒比现有临床使用的口服制剂具有更好的治疗效果。

实施例9、包载苏尼替尼的白蛋白纳米粒对皮下肾上腺神经母细胞癌的组织分布试验

肿瘤细胞：人肾上腺神经母细胞癌KP-N-NS细胞(购自中国科学院上海细胞库)，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养。

动物：Balb/c裸鼠，4周龄，雄性。

肿瘤细胞的接种：采用右腋皮下接种模型，无菌条件下取生长旺盛的KP-N-NS细胞，将细胞消化后离心重悬成约2.0E7/ml细胞悬液，于每只小鼠右腋皮下接种0.1ml癌细胞悬液。

同前方法计算肿瘤体积。

按照苏尼替尼处方13，并在磷脂的二氯甲烷溶液中添加适量近红外荧光探针DiR，制备载DiR的苏尼替尼白蛋白纳米粒。待肿瘤长至100mm³以上，尾静脉给予20mg/kg载DiR的苏尼替尼白蛋白纳米粒，并于0、2、4、8、12和24h在活体成像仪中观察小鼠的整体荧光分布，结果如图5所示。

结果显示，纳米粒能有效的靶向并蓄积在肿瘤部位，随着时间的延长在12h达到最强，之后开始缓慢清除。

实施例10、包载拉帕替尼的白蛋白纳米粒对脑胶质瘤的组织分布试验

肿瘤细胞：人脑胶质瘤U87细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养。

动物：Balb-c裸鼠，4周龄，初始体重为18～20克，雌性。试验组及阴性对照组每组6只裸小鼠。

肿瘤细胞的接种：脑部原位接种模型，无菌条件下取生长旺盛的U87细胞，以匀浆法制备成约2.0E5/5μl细胞悬液，于裸小鼠右脑纹状体接种细胞的数量为20万/鼠。同时有裸鼠在脑部接种等体积不含细胞的PBS作为对照。

按照拉帕替尼处方18，并在磷脂的二氯甲烷溶液中添加适量近红外荧光探针DiR，制备载DiR的拉帕替尼白蛋白纳米粒。小鼠接种肿瘤或PBS10天后，尾静脉给予30mg/kg载DiR的拉帕替尼白蛋白纳米粒，于2、4和8h在活体成像仪中观察小鼠的整体荧光分布。8h时将小鼠处死取出各脏器观察荧光分布。结果如图6所示。

结果表明，荷原位脑胶质瘤裸鼠尾静脉注射载DiR的拉帕替尼白蛋白纳米粒后可以快速分布到脑部，并随着时间的延长而逐步消除，8h时离体的脑组织仍有较为明显的荧光分布，并且在肿瘤部位有明显的蓄积，且明显强于正常的左半脑。而假手术裸鼠脑部则仅有微弱的荧光分布，且从离体脑部可以看出在手术部位无蓄积现象。说明拉帕替尼白蛋白纳米粒的被动靶向作用主要是由于肿瘤生长产生的EPR效应，而非手术对脑部造成的创伤。

实施例11、包载艾力替尼的白蛋白纳米粒的急性毒性试验

动物：ICR小鼠，4周龄，初始体重为18～20克，雌雄各半，每组6只。

按照艾力替尼处方20制备艾力替尼白蛋白纳米粒，并浓缩至6、12、24、50mg/mL，其中艾力替尼为50mg/mL时制剂(含辅料)的浓度为1g/mL，已达溶解度极限。将不同浓度纳米粒静脉给予小鼠0.2mL/20g。观察其2天内死亡情况。

结果表明，各浓度组的雌雄小鼠均未出现死亡，即此制剂的半数致死剂量(LD50)大于500mg/kg，远远高于药效实验中的最高使用剂量(30mg/kg即有很好的抗肿瘤效果)，表明此制剂安全性良好。

实施例12、包载吉非替尼的白蛋白纳米粒的长期毒性试验

动物：ICR小鼠，4周龄，初始体重为18～20克，雌雄各半，每组6只。

考察指标：给药过程中监测动物体重，给药结束后24h摘眼球取血，测血常规。

按照表13的方案给药两周。

表13各实验组的给药方案

组别	给药方案
		生理盐水组	尾静脉注射一周两次
吉非替尼处方22(30mg/kg)组	尾静脉注射一周两次
		吉非替尼处方22(10mg/kg)组	尾静脉注射一周两次
口服吉非替尼混悬液(100mg/kg)组	口服一周连续四次

表14不同组的血常规参数

^ap＜0.05vs生理盐水组。

结果如表14及图7所示，结果表明，除口服组在第一次给药后小树体重有所下降外各组在给药过程小鼠平均体重均正常上升，并未表现出明显的差异，说明吉非替尼处方22对小鼠体重影响不大。但是在血常规检验中，不同实验组具有一定差异。口服组各项指标除血小板分布宽度(PDW)与生理盐水组有微小差异，其余主要指标均无显著性区别，说明吉非替尼口服毒性很小，与报道相一致。吉非替尼处方22导致红细胞(RBC)略为升高，说明吉非替尼处方22高浓度对血液系统具有轻微的毒性，造成小鼠贫血。而中性粒细胞升高以及单核巨噬细胞降低，说明吉非替尼处方22高浓度时对免疫系统也具有一定毒性。这些指标随着吉非替尼浓度的降低而趋于正常，低浓度(10mg/kg)时基本与生理盐水组无区别。吉非替尼处方22的毒性可能主要由其辅料牛血清白蛋白起的，由于牛血清白蛋白对小鼠来说为异体蛋白，很容易引起免疫系统的排斥。另外处方中牛血清白蛋白的浓度为吉非替尼的5倍，在高浓度组时牛血清白蛋白的浓度为150mg/kg，引起血液系统的毒性也就不足为怪了；另一方面用于人体时处方可以选用人血清白蛋白从而可以避免此毒性，吉非替尼白蛋白纳米粒仍然有望具有较好的安全性。

实施例13、包载苏尼替尼的白蛋白纳米粒的细胞摄取试验

肿瘤细胞：人肾上腺神经母细胞癌KP-N-NS细胞(购自中国科学院上海细胞库)，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养。

将KP-N-NS细胞以2.0E4/孔的浓度接种在6孔板中。待长至合适浓度后给予一系列浓度的载荧光物质的苏尼替尼处方27白蛋白纳米粒，在培养箱中孵育0.5～4h，之后测细胞中纳米粒的浓度。

实验结果表明，细胞能够有效的摄取白蛋白纳米粒，并呈现时间和浓度依赖性，如图8所示。

实施例14、包载拉帕替尼的白蛋白纳米粒的细胞摄取试验

肿瘤细胞：人乳腺癌细胞株BT-474，用含12.5％胎牛血清的RPMI1640培养液培养。

将BT-474细胞以2E4/孔的浓度接种在6孔板中。待长至合适浓度后给予一系列浓度的载荧光物质的拉帕替尼处方28白蛋白纳米粒，在培养箱中孵育0.15～4h，之后在荧光显微镜下观察细胞摄取的荧光强度。

实验结果表明，细胞能够有效的摄取白蛋白纳米粒，并呈现时间和浓度依赖性如图9所示。

实施例15、仅采用白蛋白的比较试验

处方：取拉帕替尼6mg采用乙醇水溶解，在搅拌中加入到含有120mg人血清白蛋白的水溶液中。半小时后高压均质机均质4～5个循环，旋转蒸发除去乙醇。

结果显示：所得粒径大于1000nm，且在10分钟内沉淀。说明仅用白蛋白不足以制备得到粒径合适、稳定分散的替尼类纳米制剂。而本实施例1中所得粒径仅为70nm，可以稳定保存1年以上。

实施例16、拉帕替尼制剂的生物利用度

取Wistar大鼠18只，雄性，200g左右，随机分为三组：拉帕替尼白蛋白纳米粒静脉注射组(实施例1制剂)、拉帕替尼片剂口服组(市售制剂)、拉帕替尼混悬液静脉注射组。于给药后0.5、1、2、4、6、8、12、24、36和48h眼眶取血，分离血浆后测定药物浓度。

经计算，拉帕替尼白蛋白纳米粒静脉注射30mg/kg的AUC为55.35±23.35mg/L*h，拉帕替尼片剂口服100mg/kg的AUC为2.23±1.60mg/L*h，拉帕替尼混悬液静脉注射30mg/kg的AUC为19.49±8.49mg/L*h。相对于拉帕替尼混悬液静脉注射，拉帕替尼白蛋白纳米粒和拉帕替尼片剂的生物利用度分别为284％和11.4％。拉帕替尼白蛋白纳米粒是拉帕替尼片剂的25倍，说明制成白蛋白纳米粒后生物利用度明显提高。

Claims (10)

1.一种可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，由难溶性替尼类药物、白蛋白、磷脂及药剂学上必要的辅料制成，其中，所述的难溶性替尼类药物、白蛋白、磷脂和辅料所占的质量比分别为1～30％，5～70％，5～95％，0.01～1％；

所述的药剂学上必要的辅料选自维生素E、维生素C、反丁烯二酸、苹果酸、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸或L-异亮氨酸；

所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂通过下述方法制备：

将处方量的拉帕替尼溶于适量6：1～2：1乙醇-水混合溶剂中，将磷脂溶于适量二氯甲烷中，将二者混合后作为油相；将白蛋白和抗氧化剂溶于适量去离子水中，于室温或冰水浴中将油相滴入磁力搅拌的水相中，并继续搅拌一定时间，然后40℃水浴旋转蒸发除去乙醇和二氯甲烷，制得载拉帕替尼的白蛋白纳米粒。

2.按权利要求1所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，所述的难溶性替尼类药物、白蛋白、磷脂和辅料所占的质量比分别为2～5％，10～25％，50～75％，0.02～0.5％。

3.按权利要求1所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，所述的难溶性替尼类药物还选自阿西替尼、伯舒替尼、达沙替尼、厄洛替尼、凡德他尼、吉非替尼、卡纽替尼、来妥替尼、马赛替尼、伏他替尼、莫立替尼、坦度替尼、尼罗替尼、尼拉替尼、培立替尼、替拉替尼、苏尼替尼、索拉非尼、伊马替尼、艾力替尼、巴非替尼或普喹替尼的一种或者几种的组合。

4.按权利要求1所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，所述的白蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、驴血清白蛋白、马血清白蛋白、兔血清白蛋白或猪血清白蛋白。

5.按权利要求1所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，所述的白蛋白选自人血清白蛋白和牛血清白蛋白。

6.按权利要求1所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，所述的磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化豆磷脂、二月桂酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂、二油酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰神经鞘磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、二月桂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰神经鞘磷脂或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。

7.按权利要求1所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，所述的药剂学上必要的辅料选自维生素E、维生素C或亚硫酸氢钠。

8.按权利要求1所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，所述的白蛋白纳米粒的分散介质选自水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸盐缓冲液、5％葡萄糖溶液或生理盐水。

9.按权利要求1所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，其给药方式为，静脉、皮下、肌内、膜内、腹膜内或其它途径的注射给药。

10.按权利要求1所述的可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，所述的难溶性替尼类药物被包载后，每次替尼类药物的给药剂量为0.1～200mg/kg，给药方案为每天给药或间隔给药，每一疗程给药剂量为3～6000mg/kg。