CN104224750A - 一种注射用卡巴他赛白蛋白纳米粒制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种卡巴他赛白蛋白纳米粒制剂及其制备方法，该卡巴他赛白蛋白纳米制剂包括卡巴他赛、白蛋白和药剂学上必要的辅料，可通过高压乳匀法、薄膜剪切法、溶剂挥发法等方法制备而成。本发明解决了现有白蛋白纳米粒的载药量和稳定性问题；本发明采用低毒的有机溶剂，能避免卡巴他赛注射液使用吐温-80（Tween-80）所产生的高过敏反应；本发明可以利用纳米粒子对肿瘤的高通透性和滞留效应，能使更多药物被动靶向而浓集于肿瘤组织，提高抗肿瘤效果；且制备方法简单，适合工业化大生产。

Description

一种注射用卡巴他赛白蛋白纳米粒制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种将难溶性药物卡巴他赛制备成可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂及其制备方法。该卡巴他赛白蛋白纳米制剂包括卡巴他赛、白蛋白和药剂学上必要的辅料，可通过高压乳匀法、薄膜剪切法、溶剂挥发法等方法制备而成。本发明可以利用纳米粒子对肿瘤的高通透性和滞留效应，能使更多药物被动靶向而浓集于肿瘤组织，提高抗肿瘤效果；同时，还能避免卡巴他赛注射液使用吐温-80（Tween-80）所产生的高过敏反应。本制剂制备方法简单，适合工业化大生产。

背景技术

卡巴他赛（cabazitaxel）为广谱抗肿瘤药物，主要通过加强微管蛋白聚合和抑制微管解聚从而形成稳定的非功能性微管束，具有抑制有丝分裂和分裂间期的肿瘤细胞功能，起到抗肿瘤作用。该药不仅对多西他赛敏感型肿瘤有效，而且对其他化疗药物(如多西他赛) 不敏感的肿瘤模型也表现出了活性。

目前，上市的卡巴他赛注射液是由法国赛诺菲-安万特（Sanofi-Aventis）公司开发，商品名为Jevtana。该注射液先将药物溶解于吐温-80中，临床使用前，用13%乙醇稀释至10mg/ml，给药前，进一步用5%葡萄糖或者生理盐水稀释至临床使用浓度，稀释后注射液需在24小时内使用，否则将会产生沉淀。

白蛋白是一类在血浆中大量存在、功能较多且分子量较小的蛋白。人血清白蛋白是人体内最丰富的血浆蛋白，人血清白蛋白在体内具有多种作用，如：1）增加长链脂肪酸的溶解度；2）作为一些金属离子、胆红素等的解毒蛋白；3）作为载体与多种药物结合，如抗生素、抗感染药、苯二氮卓类等。

一种白蛋白纳米粒是以白蛋白为载体的一类纳米制剂。这种白蛋白纳米制剂，不含有有机溶剂，给药后纳米粒能快速分散，并在病变组织优先摄取，从而提高抗癌效果；并且肿瘤部位的EPR效应能够促进纳米粒在肿瘤组织的选择性分布,可以增加药效并减少系统副作用；并且白蛋白无毒性、可生物降解和无免疫原性的特点使得包裹在白蛋白中的药物生物相容性好，在血液运输过程中也可以减少血液相互作用和被清除的几率，一定程度上提高了给药浓度，减少了毒副作用。

上市的卡巴他赛注射液虽然有其突出的抗肿瘤作用，但也存在一些尚未解决的问题：(1)水溶性差导致需要使用表面活性剂助溶，而上市的注射液中使用的吐温-80，易引起过敏反应。（2）临床上需要两次稀释，耗时费力。（3）所形成的制剂稳定性差，一旦稀释必须在24小时内使用。（4）组织分布广泛，对肿瘤部位无靶向性，一定程度上减弱了其抗肿瘤效果，增加了全身性的毒副作用。

目前，有关卡巴他赛和白蛋白已有较多专利和论文公开。专利CN102068407A公开了一种cabazitaxel注射液及其制备方法，该注射液为单一制剂，无需用专用溶剂预先溶解配制，可直接稀释后给药。但该注射剂仍使用吐温-80，过敏性问题没有得到解决。专利CN103768018A将卡巴他赛制成脂质体，虽具有较好的肿瘤靶向作用，但现有技术仍然存在不足，且该类制剂稳定性差，载药量低，制备方法繁琐，尚无法进行工业化大生产。专利CN102784109A将紫杉烷类制成白蛋白纳米粒，但其使用磷脂作为稳定剂，虽然磷脂也是生物膜的组成部分，但其稳定性差，易发生水解反应、羟基化、酰基化、饱和化等多种反应，它作为稳定剂会破坏制剂稳定性。专利CN103520734 A公开了一种基于白蛋白的纳米粒子其制备方法及用途，但其利用白蛋白的电性与带正电的大分子结合而制得纳米粒。中国专利CN102415999 A、CN103495179 A、CN103768024 A等公开了白蛋白用于制备纳米粒，但其制备过程中要么使用化学方法制得白蛋白纳米粒，要么使用大量的有机溶剂，毒性较大。

本发明针对上述缺陷，提供了一种卡巴他赛白蛋白纳米粒制剂，相比于CN102068407A公开的cabazitaxe注射液，本制剂不使用吐温-80, 解决了使用吐温-80所可能产生的过敏反应；相比于专利CN103768018A公开的卡巴他赛脂质体，本制剂稳定性好，载药量高并且制备工艺简单，可工业化生产；相比于专利CN102784109A公开的紫杉烷类白蛋白纳米粒，本法制备的卡巴他赛白蛋白纳米粒稳定性大大提高等。所以，本法制得的卡巴他赛白蛋白纳米粒具有毒性低、临床上使用简便、增加患者顺应性而且靶向性高并且稳定性好的特点。本发明克服了以上缺陷，并且寻找到一种稳定剂，大大提高了制剂的稳定性。

发明内容

本发明的目的是克服已上市的卡巴他赛注射液的缺陷和不足，提供一种可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂及其制备方法。

本发明所述的可溶性注射用白蛋白纳米制剂以油类为稳定剂，难溶性药物卡巴他赛与白蛋白结合后经油类分散并使其稳定。本发明利用卡巴他赛与白蛋白结合率高的特性，在高速剪切条件下将有机相加入到水相中形成初乳，再用高压均质机均质以获得更小的粒径，最后旋转蒸发除去有机溶剂而制得卡巴他赛白蛋白纳米粒制剂。

本发明提供了一种卡巴他赛白蛋白纳米粒制剂及其制备方法，该卡巴他赛白蛋白纳米粒制剂包括卡巴他赛、白蛋白及药剂学上必要的辅料制成。其中，所述的卡巴他赛、白蛋白和药剂学上必要的辅料所占的质量比分别为1～30 %，1～80 %，1% ~ 20%。其中优选的为卡巴他赛、白蛋白、和药剂学上必要的辅料所占的质量比分别为5～20%，30～75%，1%~5%。

本发明中，所述的白蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、驴血清白蛋白、马血清白蛋白、兔血清白蛋白、猪血清白蛋白及其他种类白蛋白，优选人血清白蛋白或牛血清白蛋白。

本发明中，所述的药剂学上必要的辅料主要为油类如大豆油、精制麻油、精制茶油、精制棉籽油、精制红花油、橄榄油、椰子油、深海鱼油及植物挥发油中的一种或几种的混合物。

本发明采用乳化法制备注射用白蛋白纳米粒，初乳已经具有合适的粒径，但可选择性采用超声或高压均质或微射流工艺进一步控制粒径。本发明的一个实施例1中，将处方量的卡巴他赛溶于适量二氯甲烷和无水乙醇的混合溶剂或其他合适溶剂中，将油类溶于上述混合溶剂中作为油相；将白蛋白和一些其他辅料溶于适量去离子水中作为水相，于室温或冰水浴中将油相逐滴滴入高速剪切的水相中，然后40 oC水浴旋转蒸发除去有机溶剂，制得载卡巴他赛的白蛋白纳米粒。

本发明的卡巴他赛白蛋白纳米粒制剂可作为药物用于癌症治疗或用于制备治疗癌症的药物；其中，所述的癌症包括小细胞肺癌、激素难治性前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤、肝癌、胰腺导管癌、食管癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、睾丸癌、皮肤癌、淋巴瘤、头颈部肿瘤和起源于胆囊、口腔、外周神经系统、粘膜、腺体、血管、骨组织、淋巴结、眼睛的原发或继发的癌、肉瘤或癌肉瘤等。

本发明的卡巴他赛白蛋白纳米粒制剂经药效学试验，结果表明，其治疗效果优于市售制剂。

本发明的卡巴他赛白蛋白纳米粒与现有技术相比，具有以下显著优点：

1 避免了使用表面活性剂吐温-80，提高了用药安全性和患者顺应性。

2 给药前不用预处理，不用给予抗过敏药且不用稀释可直接使用，方便易行。

3稳定性大大提高，室温下可放置一周。

4其中发挥活性的是白蛋白本身，卡巴他赛物理结合于白蛋白的亲脂性空穴中，具有生物降解性、毒性和免疫原性小的特点。

5包封率几乎为100%，制备过程无损失，载药量亦较高；

6可溶性注射用白蛋白纳米粒制剂可利用肿瘤部位的EPR效应，增加药物在肿瘤组织的蓄积，利于发挥药物的抗肿瘤效果，降低对其它组织的毒副作用。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实例对本发明的卡巴他赛白蛋白纳米粒制剂进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为实施例4所得的载卡巴他赛的白蛋白纳米粒和空白纳米粒的粒径分布图；A为空白纳米粒的粒径，B为载卡巴他赛的白蛋白纳米粒的粒径。

图2为实施例5所得的常温和4℃放置一周前后的载卡巴他赛白蛋白纳米粒的粒径。A为刚制出的载卡巴他赛白蛋白纳米粒的粒径，B为4℃放置一周后的卡巴他赛白蛋白纳米粒的粒径，C为室温放置一周后卡巴他赛白蛋白纳米粒的粒径。

图3为实施例6中各制剂组给药后人前列腺癌PC3瘤体体积与时间的关系。

图4为实施例7中各制剂组给药后小鼠神经胶质瘤昆明鼠的生存期。

图5为实施例9中正常小鼠给予卡巴他赛白蛋白纳米粒和卡巴他赛注射液后体重随时间的变化。

具体实施方式

实施例1：

取处方量的卡巴他赛溶于二氯甲烷和无水乙醇（9:1）的混合溶剂中，并加一定体积的棉籽油，超声使混合均匀作为有机相。取10mg的人血清白蛋白溶于10ml的去离子水中作为水相，于室温或冰水浴中，在高速剪切下将有机相逐滴加入水相中，并继续剪切一定时间制成初乳，进一步用高压均质机进行均质，然后40℃水浴旋转蒸发除去有机溶剂即得卡巴他赛白蛋白纳米粒。

实施例2：

取处方量的卡巴他赛溶于二氯甲烷和无水乙醇（1:3）的混合溶剂中，并加一定体积的大豆油，超声使混合均匀作为有机相。取100mg的牛血白蛋白溶于10ml的去离子水中作为水相，于室温或冰水浴中，在高速剪切下将有机相逐滴加入水相中，并继续剪切一定时间制成初乳，进一步用高压均质机进行均质，然后40℃水浴旋转蒸发除去有机溶剂即得卡巴他赛白蛋白纳米粒。

实施例3：

取处方量的卡巴他赛溶于二氯甲烷和无水乙醇（1:9）的混合溶剂中，并加一定体积的麻油，超声使混合均匀作为有机相。取100mg的卵清白蛋白溶于10ml的去离子水中作为水相，于室温或冰水浴中，在高速剪切下将有机相逐滴加入水相中，并继续剪切一定时间制成初乳，进一步用高压均质机进行均质，然后40℃水浴旋转蒸发除去有机溶剂即得卡巴他赛白蛋白纳米粒。

实施例4：

将所得卡巴他赛白蛋白纳米粒和不含卡巴他赛的空白白蛋白纳米粒进行比较，两者的粒径没有明显差别，说明载药过程不影响纳米粒的性质，在一定程度上验证了卡巴他赛药物是通过物理作用结合在白蛋白的疏水空穴中。含卡巴他赛和空白白蛋白纳米粒的粒径及电位分布图如附图1，其中A为空白纳米粒的粒径，B为载卡巴他赛白蛋白纳米粒的粒径。

实施例5：

将实施例2所得的卡巴他赛白蛋白纳米粒分别于室温和4℃放置，隔天测其粒径和电位。所得的粒径和电位数据如下：

表1  稳定性试验粒径和电位数据

由上表数据和附图2可以共同说明，此种方法制得的卡巴他赛白蛋白纳米制剂稳定性良好，室温和4℃放置一周后粒径、PDI和电位均没有明显变化。

实施例6：包载卡巴他赛的白蛋白纳米粒对前列腺癌的药效学试验

肿瘤细胞：人前列腺癌细胞株PC3，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养。

动物：Balb/c裸鼠，4周龄，初始体重15~20g，雄性。

肿瘤细胞的接种：采用小鼠皮下注射接种模型，无菌条件下取生长旺盛的PC3细胞，将细胞消化后离心重悬成约2.0×107/ml细胞悬液，于每只小鼠皮下接种0.1ml癌细胞悬液。

抑瘤率的计算及数据处理：给药后每2日以游标卡尺测量各组裸小鼠肿瘤的长径及短径，根据公式计算肿瘤体积和抑瘤率：肿瘤体积=（短径2×长径）/2：肿瘤抑制率％ =［（阴性对照组平均瘤重－给药组平均瘤重）/ 阴性对照组平均瘤重×100］。

给药方案：试验分5组：2种不同的给药剂量和不同的组别及生理盐水阴性对照组，每组6只Balb/c裸鼠。各组按表2的方案给药6次。

表2各试验组的给药方案

表3不同治疗组的肿瘤抑制效果

*P＜0.05，与生理盐水组相比。

结果显示，各药物治疗组的肿瘤体积在第20天时均显著小于生理盐水组（p < 0.05），表明各制剂对PC3细胞接种的皮下瘤均有一定的治疗效果。并且15mg/kg组的抑瘤效果均优于5mg/kg组的，但是小鼠死亡率也较5mg/kg组的高，分析可能是剂量加大卡巴他赛所显示的毒副作用增大致使小鼠不能耐受，但15mg/kg组的卡巴他赛白蛋白纳米制剂组的毒副作用要小于卡巴他赛游离药物组的。同样5mg/kg卡巴他赛白蛋白纳米粒组的抑瘤效果也优于卡巴他赛注射液组，由此说明本发明所制得的白蛋白纳米粒比现有临床使用的卡巴他赛注射液具有更好的治疗效果。

实施例7：包载卡巴他赛的白蛋白纳米粒对脑胶质瘤的药效学试验

肿瘤细胞：人神经胶质瘤U87细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。

动物：Balb/c裸鼠，4周龄，初始体重为18～20克，雄性。试验组及阴性对照组每组6只建脑肿瘤的Balb/c裸鼠。

肿瘤细胞的接种：脑部原位接种模型，无菌条件下取生长旺盛的U87细胞，以离心重悬法制备成约2.0×105/5μl 细胞悬液，于裸鼠右脑纹状体接种细胞的数量为20万/鼠。

评价指标：以裸鼠的生存期为指标，评价各组制剂的抗肿瘤效果。

各组按照表4的给药方案给药。

表4各试验组的给药方案

表5荷原位脑胶质瘤小鼠经不同方案给药后的中位生存期比较

＊P＜0.05，※P＜0.05与生理盐水组相比。

结果如表5及图5所示，结果表明，卡巴他赛白蛋白纳米粒高低剂量组的生存期分别为22和30.5天，其中卡巴他赛白蛋白纳米粒低剂量组与生理盐水组的生存期相比，具有显著性差异（P < 0.05），而其高剂量组与生理盐水没有显著性差异。卡巴他赛注射液组低剂量生存期与生理盐水组有显著性差异，但与卡巴他赛白蛋白纳米粒组没有显著性差异，而高剂量组与生理盐水组和卡巴他赛白蛋白纳米粒高剂量组都没有显著性差异。由上述数据可知低剂量组的较生理盐水组都有显著性差异，而低剂量的卡巴他赛白蛋白纳米粒组与低剂量的卡巴他赛注射液组没有显著性差异，但卡巴他赛白蛋白纳米粒组的中位生存期较卡巴他赛注射液组的要长，分析是卡巴他赛发挥了作用，明显的抑制了脑肿瘤的生长，卡巴他赛注射液中吐温-80的存在相比于白蛋白还是不利于荷瘤Balb/c裸鼠的生长的。但高剂量组的较生理盐水组都没有显著性差异，说明在本实验中高剂量时药物的副作用（中性粒细胞减少、胃肠道反应等）与治疗作用持平，不利于荷瘤Balb/c裸鼠的生长。所以综上所述，卡巴他赛制备为白蛋白纳米粒制剂（低剂量时）后其抗肿瘤效果有所提高。

实施例8：包载卡巴他赛的白蛋白纳米粒的急性毒性试验

动物：昆明小鼠，4周龄，初始体重为18～20克，雌雄各半，每组6只。

制备卡巴他赛白蛋白纳米粒，并浓缩至10mg/mL，将不同组小鼠按给药量分别为100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml静脉给予相应的体积。观察其2天内死亡情况。

结果表明，各浓度组的雌雄小鼠均未出现死亡，即此制剂的半数致死剂量（LD50）大于200mg/kg，远远高于药效实验中的最高使用剂量（15mg/kg即有很好的抗肿瘤效果），表明此制剂安全性良好。

实施例9：包载卡巴他赛的白蛋白纳米粒的长期毒性试验

动物：昆明小鼠，4周龄，初始体重为18～20克，雌雄各半，每组6只。

考察指标：给药过程中监测动物体重，给药结束后摘眼球取血，测血常规。

按照表6的方案给药6次。

表6各试验组的给药方案

表7不同组的血常规参数

^a p < 0.05 vs生理盐水组。

综合图4来看，空白纳米粒组、卡巴他赛注射液溶剂组和生理盐水组的相对体重比没有差异，但体重较初始体重都有增加，在第15天看到相对体重空白纳米粒高于生理盐水高于注射用溶剂，说明空白纳米粒组和卡巴他赛注射液溶剂组对小鼠毒性差异不大。但是卡巴他赛白蛋白纳米粒组的相对体重要明显高于卡巴他赛注射用溶剂组，说明做成卡巴他赛白蛋白纳米粒后毒性明显减小。另外，分析血常规数据可知，空白纳米粒组和卡巴他赛注射用溶剂组较生理盐水组的各项参数都没有明显差异，但明显可以看出较生理盐水组和卡巴他赛白蛋白纳米粒组，卡巴他赛注射液组的WBC数明显减少、PLT明显增加，说明卡巴他赛白蛋白纳米粒相对于卡巴他赛注射液有具有明显的安全性。

Claims (6)

1.一种卡巴他赛白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，由卡巴他赛、白蛋白和药剂学上必要的辅料制成，其中所述的难溶性卡巴他赛、白蛋白和药剂学上必要的辅料所占的质量比分别为1～30 %，1～80 %，1% ~ 20%。

2.其中优选的为难溶性卡巴他赛、白蛋白和药剂学上必要的辅料所占的质量比分别为5～20%，30～75%，1%~5%。

3.按权利要求1所述的卡巴他赛白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，所述的白蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、驴血清白蛋白、马血清白蛋白、兔血清白蛋白或猪血清白蛋白。

4.其中优选蛋白为人血清白蛋白和牛血清白蛋白。

5.按权利要求1所述的药剂学上必要的辅料主要为油类如大豆油、精制麻油、精制茶油、精制棉籽油、精制红花油、橄榄油、椰子油、深海鱼油及植物挥发油中的至少一种。

6.本发明的卡巴他赛白蛋白纳米粒制剂可作为药物用于癌症治疗或用于制备治疗癌症的药物；其中，所述的癌症包括前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤、肝癌、胰腺导管癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、睾丸癌、皮肤癌、淋巴瘤、头颈部肿瘤和起源于胆囊、口腔、外周神经系统、粘膜、腺体、血管、骨组织、淋巴结、眼睛的原发或继发的癌、肉瘤或癌肉瘤等。