CN105944109B - 一种肾小球靶向的蛋白纳米颗粒药物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肾小球靶向蛋白纳米颗粒药物组合物及其用途，所述蛋白纳米颗粒药物组合物主要由蛋白成分、药理活性物质、稳定剂制成，其粒径在10nm‑170nm之间。该药物组合物实现了肾小球系膜细胞被动靶向递药，显著提高了药物在肾小球中的聚集浓度或延长了药物在肾小球中的聚集时间，使其在显著提高疗效的同时，极大地降低了药物在非靶向部位的毒副作用。

Description

一种肾小球靶向的蛋白纳米颗粒药物组合物及其用途
技术领域
本发明涉及一种肾小球靶向的蛋白纳米颗粒药物组合物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。
背景技术
肾小球类疾病，常见的有原发性和继发性肾小球肾炎，是目前引起慢性肾衰竭和终末期肾病最主要的原因，正严重威胁着人类健康。据统计，在我国，导致终末期肾病的病因中，肾小球类疾病占54.4%，其中肾小球肾炎又占了48.1%。多数肾小球类疾病属于免疫介导性炎症疾病，因此，免疫调节疗法是治疗免疫介导性肾小球炎症疾病的重要手段，目前临床主要以糖皮质激素和免疫抑制剂等方法治疗为主，但这两种药物都具有明显的毒副作用，如激素造成的股骨头坏死、柯兴氏综合征，免疫抑制剂造成的终生不愈、肝脏损害、骨髓抑制，给患者造成了终生损害。
近期研究表明，肾小球系膜细胞在肾小球类疾病的发生和发展过程中起着至关重要的作用。肾小球系膜细胞是肾小球的三种固有细胞之一，具有分泌产生细胞外基质、收缩、吞噬、维持基质正常代谢等多种生理功能。当肾小球损伤时，肾小球系膜细胞是最易被激活的肾脏固有细胞，多种免疫反应炎症细胞产生的细胞因子以及非免疫产物均可导致肾小球系膜细胞活化。活化的肾小球系膜细胞可发生明显的增殖，并释放多种炎症介质，促进细胞外基质积聚，从而形成恶性循环，加剧肾小球损伤，最终发生肾小球硬化乃至肾功能衰竭。因此，将肾小球系膜细胞作为靶细胞，研究开发肾小球系膜细胞靶向递药系统，以提高系膜细胞处药物浓度、降低药物全身毒副作用，对于治疗肾小球类疾病具有重大意义。
肾小球系膜组织是位于肾小球毛细血管袢之间的一种特殊间充质，由系膜细胞和系膜基质组成，其与毛细血管之间仅隔着具孔隙的内皮细胞，内皮细胞的孔隙约为80nm-170nm。此外，据文献报道肾小球过滤膜对纳米颗粒的有效截留粒径大小约为10nm，因此，理论上讲，流经肾小球毛细血管粒径为10nm-170nm的纳米颗粒均可通过内皮细胞的孔隙进入到肾小球系膜从而实现肾小球系膜细胞的靶向作用。
现有技术文献CN103690957A公开了一种肾小球靶向微粒给药系统及其制备方法，虽然其通过对微粒（脂质体、纳米粒、胶束）进行PEG化脒修饰后成功构建了肾小球靶向微粒给药系统，但是现有技术仍存在很多不足：首先，其制得的微粒给药系统属于阳离子微粒给药系统，存在体内毒性的风险，已有大量文献报道证实，作为载体的阳离子脂质体本身会对多种细胞产生较强的细胞毒性，且带电量越高毒性越大，显然这种微粒给药系统在安全性方面存在一定缺陷，不利于临床用药；其次，这种微粒给药系统的成分复杂，制备过程繁琐，制备成本较高，尚无法进行工业化大生产。综上，申请者认为这种肾小球靶向微粒给药系统缺乏安全可靠性，应用于临床尚不可行。
由于蛋白成分具有生物相容性好、安全无毒、无免疫原性、可生物降解性等优点，使其作为药用载体在药物传递系统中得到了广泛应用。本发明试图以蛋白成分作为药用载体构建肾小球靶向给药系统。雷公藤红素是一种醌甲基三萜，主要存在于卫矛科雷公藤属及南蛇藤属植物中，是治疗肾炎、类风湿等疾病雷公藤片和雷公藤多苷片等制剂的主要有效成分之一。据大量文献报道，雷公藤红素具有显著的抗炎、免疫抑制等活性。因此，雷公藤红素被选作为本发明具体实施例之一蛋白纳米颗粒药物组合物的模型药物。现有技术文献CN103356492A公开了一种以白蛋白为药用载体的雷公藤红素药物组合物，但其制备方法为传统的去溶剂化法，该方法先通过脱水剂——无水乙醇的去溶剂化作用除去白蛋白的水化膜，使白蛋白变性析出，再用戊二醛交联固化。显而易见，此种传统方法制备所得的蛋白纳米粒的生物降解性差，毒性大，特别是残留的戊二醛等有机溶剂会造成生物活性大分子失活，增加机体毒副作用风险。而且该方法繁琐复杂，耗时长，尤其是交联固化需要24 h以上，时间成本高。综上，申请者认为这种以白蛋白为药用载体的雷公藤红素药物组合物应用于肾小球靶向给药系统尚不可行。
因此，制备一种安全、有效、可靠的肾小球靶向给药系统迫在眉睫。发明人经过大量实验研究，选用蛋白成分作为药用载体，通过一种安全绿色的基于二硫键形成的蛋白纳米颗粒制备技术，成功构建了高效低毒的肾小球靶向的蛋白纳米颗粒药物组合物，并在肾脏疾病中取得了显著疗效。
发明内容
本发明的目的之一，提供了一种肾小球靶向的蛋白纳米颗粒药物组合物，主要包含蛋白成分、稳定剂及药理活性物质。
本发明的目的之一，提供了一种蛋白纳米颗粒（药物组合物）在制备肾小球靶向的药物中的用途。
本发明的目的之一，提供一种基于二硫键形成的蛋白纳米颗粒制备技术，该技术以药物纳米颗粒为核心，蛋白以二硫键部分交联在纳米颗粒表面，一方面保留了蛋白的全部生物学特征，另一方面避免了使用交联剂造成的醛类物质残留引起毒副作用等问题。而且，此种制备技术简单易操作，生产成本低，制备得到的制剂稳定性好，适宜于工业化大生产，方便临床使用。
本发明所述的肾小球靶向的蛋白纳米颗粒药物组合物，含有药理活性物质和蛋白的蛋白纳米颗粒药物组合物粒径在10nm-170nm之间，其在流经肾小球时能够被肾小球过滤膜有效截留，使其可通过肾小球内皮细胞的孔隙（80-170nm）进入到肾小球系膜区。
由于肾小球系膜细胞自身的类巨噬细胞样性质，赋予其具有对胞外纳米颗粒的主动吞噬作用，于是在肾小球自身生理结构特点和肾小球系膜细胞主动摄取的双重作用下，使得更多含有药理活性物质和蛋白的蛋白纳米颗粒药物组合物能够被动靶向而浓集于肾小球系膜细胞处，从而实现了肾小球系膜细胞的靶向递药。
本发明所述的肾小球靶向蛋白纳米颗粒药物组合物，蛋白纳米颗粒药物组合物由于对肾小球系膜细胞的被动靶向作用，大大提高了肾小球系膜细胞处的药物浓度，于是在显著提高治疗效果的同时，使得非靶部位药物浓度有效降低，有助于降低药物的毒副作用。
由此制得的蛋白纳米颗粒药物组合物具有高载药量和高包封率，使得药物治疗剂量大大减少，且其能在靶部位缓释药物，长时间发挥疗效，使得给药次数大大减少，从而进一步降低了药物的毒副作用。
本发明所述的肾小球靶向蛋白纳米颗粒药物组合物的蛋白成分，具有生物相容性好、安全无毒、无免疫原性、可生物降解性等优点。
本发明所述的蛋白纳米颗粒药物组合物的粒径要求在10nm-170nm，优选在60nm-150nm，最优选在80nm-100nm。
本发明所述的蛋白成分包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、驴血清白蛋白、马血清白蛋白、兔血清白蛋白、猪血清白蛋白、疏水蛋白、糖蛋白、脂蛋白或其他种类蛋白以及类似物和衍生物；优选自人血清白蛋白。
本发明所述的稳定剂包括大豆油、中链油、椰子油、橄榄油、红花油、棉籽油、芝麻油、橙油、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化豆磷脂、二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、十二烷基硫酸钠、Solutol HS-15、月桂酸、棕榈酸、油酸、鲸蜡醇硫酸钠、硬脂醇硫酸钠、脂肪酸磺酸化物、烷基芳基磺酸化物、司盘、吐温、卖泽、苄泽、泊洛沙姆188、壬基酚、辛基酚、辛基甲酚、平平加0和类似化合物的一种或其混合物。优选自大豆油、中链油、油酸、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、Solutol HS-15、泊洛沙姆188中一种或其混合物。
本发明所述的药理活性物质包含但不仅限于预防和/或治疗肾脏疾病的药物。
本发明所述的预防和/或治疗肾脏疾病的药物包括但不仅限于：抗炎药、免疫抑制剂、直接或间接抗肾小球系膜细胞增生和/或系膜基质沉积药物、NF-κB抑制剂、肾小球过滤膜保护剂、抗肿瘤药物、抗微生物药、抗病毒药等。
本发明所述的抗炎药包含但不仅限于：吲哚美辛、布洛芬、可的松、地塞米松、氢化可的松、氢化泼尼松、泼尼松、泼尼松龙、倍他米松以及类似物和衍生物。
本发明所述的免疫抑制剂包含但不仅限于：雷公藤碱、雷公藤次碱、雷公藤红素、雷公藤内酯甲、雷公藤甲素、雷公藤乙素、环孢素A、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸，以及类似物和衍生物。
本发明所述的直接或间接抗肾小球系膜细胞增生和/或系膜基质沉积药物包含但不仅限于：肝素、厚朴酚、和厚朴酚、丹参酮、曲尼斯特、双嘧达莫、己酮可可碱、荷包牡丹碱、哌唑嗪、多沙唑嗪、伊马替尼、伐地那非、抗血小板源生长因子抗体、抗转化生长因子抗体以及类似物和衍生物。
本发明所述的NF-κB抑制剂包含但不仅限于：DHMEQ、N-乙酰半胱氨酸、维生素E、抗坏血酸、吡咯烷二硫基甲酸盐、小白菊内酯、白叶藤素生物碱以及类似物和衍生物。
本发明所述的肾小球过滤膜保护剂包含但不仅限于：黄芪皂苷、黄柏碱、大黄酸、茯苓酸、茯苓酸甲酯、丹参酮等中草药中主要活性成分以及类似物和衍生物。
本发明所述的抗肿瘤药物包含但不仅限于：氟尿嘧啶、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑、异溶肉瘤素，以及类似物和衍生物。
本发明所述的抗微生物药包含但不仅限于：头孢菌素类如头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢拉定类似物和衍生物；青霉素类如氨比西林、阿莫西林、环己西林类似物和衍生物；四环素类如：盐酸四环素、多西环素以及类似物和衍生物，以及类似物和衍生物。
本发明所述抗病毒药包含但不仅限于：齐多夫定、盐酸金刚烷胺以及类似物和衍生物。
本发明所述的蛋白纳米颗粒药物组合物，其中所述药物包含以上药物的一种或多种组合物。
作为本发明的具体实施方案之一，所述的蛋白纳米颗粒药物组合物，主要包含基于重量份计，蛋白成分5~1000份、稳定剂0.02~500份及药理活性物质0.02~40份；进一步优选地，蛋白成分50~500份、稳定剂10~200份及药理活性物质2~20份。
本发明的目的之一，提供一种能够不加冻干保护剂而直接冻干的肾小球靶向蛋白纳米颗粒药物组合物。
作为具体的实施方案，本发明组合物中也可额外加入冻干保护剂和其他药学上可接受辅料，冷冻干燥制成粉末。
本发明中，所述的冻干保护剂包括但不仅限于：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖、海藻糖、甘氨酸、右旋糖酐、纤维二糖、肌糖、棉籽糖、麦芽糖糊精、麦芽多糖、肝素、甘油、甘露醇、肌醇、山梨醇、硫醇、聚乙二醇、氨基酸等一种或多种。优选蔗糖、甘露糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖。
本发明中，所述的其他辅料可为等渗调节剂、抗氧化剂、防腐剂、pH调节剂等药剂学上必要辅料。
本发明中，制备所得的冻干蛋白纳米颗粒药物组合物可在任何合适的时间在适宜的水性介质中再分散以得到能用于注射给药的纳米胶体体系，且粒度分布与冷冻干燥前几乎无改变。所述的水性介质有生理盐水、5%葡萄糖溶液、缓冲生理盐水、缓冲的水性介质、氨基酸溶液、维生素溶液或类似的介质之一或多种混合物。
本发明的药物活性物质优选为雷公藤红素和泼尼松龙；蛋白成分优选人血清白蛋白；稳定剂优选自大豆油、中链油、油酸、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、Solutol HS-15、泊洛沙姆188中一种或其混合物。
所述稳定剂根据其溶解性，水不溶性稳定剂优先加入至雷公藤红素或泼尼松龙+有机溶剂形成的油相中，水溶性稳定剂优先加入至蛋白+水形成的水相中。所述稳定剂根据需要可只加入水不溶性稳定剂或水溶性稳定剂或两种类型稳定剂均加入。
所述有机溶剂可选二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氧六环、乙酸乙酯、乙腈、甲基吡咯烷酮、甲醇、乙醇、中链醇或类似溶剂，以及2种或2种以上这些溶剂的混合物，优先选择二氯甲烷、乙酸乙酯或二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶剂。
本发明的目的之一，提供的肾小球靶向蛋白纳米颗粒药物组合物，其特征在于，可通过注射给药、口服给药、体内局部给药、黏膜吸收给药等方式给药，优先选择注射给药。
本发明所述的注射给药是指采用静脉、皮下、肌内、腹内、腹膜内或其他途径进行注射给药，优先选择静脉给药。
本发明的目的之一，提供的肾小球靶向蛋白纳米颗粒药物组合物，其特征在于，可用于预防和/或治疗肾脏疾病，但不仅限于：肾小球类疾病、肾小球类疾病诱发的肾小管间质疾病以及肾小球类疾病诱发的肾血管疾病、肾肿瘤及肾移植后的抗排斥反应以及其他肾脏疾病。
本发明所述的肾小球类疾病包含但不仅限于：按临床表现分类有急慢性肾小球肾炎、隐匿性肾小球疾病、IgA肾病、膜性肾病、肾病综合征、肾功能衰竭、肾功能不全、终末期肾病、高血压肾病、糖尿病肾病、紫斑性肾炎、狼疮性肾炎、淀粉样变肾病、小儿肾病；按病理分类有微小病变型肾病、局灶性肾小球肾炎、局灶性肾小球硬化、毛细血管内增殖性肾小球肾炎、内皮系膜性肾小球肾炎、系膜增殖性肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、膜一增殖性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、毛细血管外性肾小球肾炎、终末期固缩肾等。
本发明的目的之一，提供一种蛋白纳米颗粒药物组合物的制备方法，选择基于二硫键形成的蛋白纳米颗粒制备技术，例如：超声法、高压均质法、微射流法等，但不仅限于这几种方法。
该技术以药物纳米颗粒为核心，蛋白以二硫键部分交联在纳米颗粒表面，一方面保留了蛋白的全部生物学特征，另一方面避免了使用交联剂造成的醛类物质残留引起毒副作用等问题。而且，此种制备技术简单易操作，耗时短，生产成本低，制备得到的制剂稳定性好，适宜于工业化大生产。通过本发明制备得到的蛋白纳米颗粒用药物组合物，保留了蛋白的优良生物活性，安全性高，在体内可被代谢为氨基酸而充分利用。
作为具体实施方案，本发明提供的制备一种制备蛋白纳米颗粒组合物采用的超声法、高压均质法、微射流法，其特征包括以下步骤：
（1）将活性物质与水不溶性稳定剂溶于有机溶剂中作为油相，必要时可用超声辅助溶解。
（2）将蛋白成分、水溶性稳定剂溶于水中作为水相，必要时可在30-40℃，优选37℃下加热溶解。
（3）根据需要，（1）和（2）中稳定剂可只加入水不溶性稳定剂或水溶性稳定剂或两种类型稳定剂均加入。
（4）油相与水相混合，对于超声法，混合后直接在超声功率400-800w（3s/5s），0-10℃冰浴条件下超声5-15min，即得纳米乳剂；对于高压均质法和微射流法，混合后先在0-10℃冰浴条件下探头超声10-15次，得到的混悬液转移到高压均质机和微射流内，在3000-30000Psi压力范围内循环均化10-15次即得纳米乳剂。
（5）得到的纳米乳剂，减压蒸发除去有机溶剂，即得蛋白纳米颗粒组合物。
本发明中，制得的纳米乳剂中的有机溶剂于减压下蒸发，形成由蛋白包衣活性药物颗粒和蛋白组成的胶体系统。蒸发方法包括使用旋转蒸发器、降膜蒸发器、喷雾干燥器、冷冻干燥器和类似设备。本发明优选旋转蒸发器。
本发明的目的之一，提供了一种肾小球靶向的蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物的制备方法。
本发明的目的之一，提供了一种肾小球靶向的蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物的制备方法。
本发明所述的肾小球靶向蛋白纳米颗粒组合物在制备雷公藤红素或泼尼松龙药物中的用途，所述药物显著提高了雷公藤红素或泼尼松龙在全肾、肾皮质以及肾小球中的聚集浓度或延长了其在全肾、肾皮质以及肾小球中的聚集时间，实现了肾小球系膜细胞靶向递药，显著提高了雷公藤红素或泼尼松龙对肾小球肾炎等肾脏疾病的治疗效果。
作为具体实施例之一，本发明提供的蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物粒径，最优选超声法，制备得到的蛋白纳米颗粒药物组合物粒径在80nm-100nm。
发明益处
（1）本发明选择安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性的蛋白成分作为载体材料，将药理活性物质与蛋白成分通过一种简单易行、安全可靠的制备方法（超声法、高压均质法、微射流法）制得了粒径在10nm-170nm的高包封率、高载药量、高稳定性的蛋白纳米颗粒药物组合物。
（2）本发明制得的蛋白纳米颗粒药物组合物在自身粒径特点、肾小球生理结构特点以及肾小球系膜细胞类巨噬细胞样特点三重作用下，实现了肾小球系膜细胞的被动靶向作用。
（3）本发明人以雷公藤红素或泼尼松龙为模型药物，优先选择的蛋白成分为人血清白蛋白，优先选择的稳定剂为大豆油、中链油、油酸、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、SolutolHS-15、泊洛沙姆188中一种或其混合物，优先选择本领域常规的超声法、高压均质法、微射流法制备了含有雷公藤红素或泼尼松龙和人血清白蛋白的纳米颗粒药物组合物，其粒径在10-170nm。通过大鼠体内分布实验研究发现，相比于雷公藤红素或泼尼松龙原药而言，尾静脉注射的人血清白蛋白纳米颗粒药物组合物显著提高了雷公藤红素或泼尼松龙在全肾、肾皮质以及肾小球中的浓度，其肾小球相对摄取率Re值分别为2.39、3.67，峰浓度比Ce值分别为3.80、2.58。
（4）本发明制得的蛋白纳米颗粒药物组合物，可利用其肾小球靶向递药，增加药物在肾小球处的蓄积，利于药物发挥在预防和/或治疗肾脏疾病的作用，同时显著降低药物对其他非靶向组织的毒副作用。
（5）本发明制得的蛋白纳米颗粒药物组合物，由于其肾小球靶向递药显著提高了药物在预防和/或治疗肾脏疾病的作用，同时由于蛋白纳米颗粒药物组合物具有缓释作用，能够持续在靶部位发挥疗效，因而可以在保证药效的同时大大减少给药剂量，减少给药次数，从而进一步降低药物的毒副作用。
（6）本发明制得的蛋白纳米颗粒药物组合物由于载体材料安全无毒、制备工艺简单可靠以及肾小球系膜细胞靶向递药三方面的显著优点，使得蛋白纳米颗粒药物组合物成为一种高效、低毒、具有良好临床应用价值的肾小球靶向给药系统。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1 表示超声法制得的人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物透射电镜图。
图2 表示超声法制得的人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物透射电镜图。
图3表示人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物及雷公藤红素原药尾静脉给药5min后，在各组织脏器浓度分布图（n=5）。
图4表示人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物及雷公藤红素原药尾静脉给药后在肾脏的经时分布图（n=5）。
图5表示人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物及雷公藤红素原药尾静脉给药后在肾皮质的经时分布图（n=5）。
图6表示人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物及泼尼松龙原药尾静脉给药5min后，在各组织脏器浓度分布图（n=5）。
图7表示人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物及泼尼松龙原药尾静脉给药后在肾脏的经时分布图（n=5）。
图8表示人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物及泼尼松龙原药尾静脉给药后在肾皮质的经时分布图（n=5）。
图9表示人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物及雷公藤红素原药尾静脉给药后在肾小球的经时分布图（n=5）。
图10表示人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物及泼尼松龙原药尾静脉给药后在肾小球的经时分布图（n=5）。
图11表示人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物相较于雷公藤红素原药显著降低了肾小球肾炎大鼠尿蛋白含量（n=5）。
图12表示人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物相较于泼尼松龙原药显著降低了肾小球肾炎大鼠尿蛋白含量（n=5）。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
实施例1
超声法制备人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物及其表征
将雷公藤红素7mg或泼尼松龙20mg以及水不溶性稳定剂大豆油50mg溶于2mL二氯甲烷:乙酸乙酯（7:3，V/V）中，后与10mL人血清白蛋白双蒸水溶液（2%W/V）混合，在冰浴中，超声功率500W（3s/5s）条件下超声8min，后在37℃下减压旋转蒸发除去有机混合溶剂，即得人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物。通过马尔文粒径仪测量粒径和电位，透射电镜进行形态表征，并通过葡聚糖凝胶柱法测定包封率。
结果：
如表1，制得的人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物分别在85nm、95nm左右，均带负电，包封率均大于90%。如图1和图2，所得的人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物呈类圆形，且粒径均一。
表1：人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物的性质（n=3）
实施例2
高压均质法制备人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物
将雷公藤红素7mg或泼尼松龙20mg溶于2mL二氯甲烷:乙酸乙酯（7:3，V/V），后与10mL人血清白蛋白（2%W/V）以及水溶性稳定剂Solutol HS-15 40mg的双蒸水溶液混合，在冰浴中探头超声15次，得到的混悬液转移到高压均质机内，在15000Psi压力范围内循环均化15次即得纳米乳剂，后在37℃下减压旋转蒸发除去有机混合溶剂，即得人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物，平均粒径均在100nm左右，PDI均在0.2以下。
实施例3
微射流法制备人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物
将雷公藤红素7mg或泼尼松龙20mg以及水不溶性稳定剂中链油50mg溶于2mL二氯甲烷:乙酸乙酯（7:3，V/V），后与10mL人血清白蛋白（2%W/V）以及水溶性稳定剂Solutol HS-15 40mg的双蒸水溶液混合，在冰浴中探头超声15次，得到的混悬液转移到高压均质机内，在20000Psi压力范围内循环均化15次即得纳米乳剂，后在37℃下减压旋转蒸发除去有机混合溶剂，即得人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物，平均粒径均在90nm左右，PDI均在0.2以下。
试验例1
人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物大鼠体内分布实验
取120只健康SD大鼠（体重200±20g，雌雄各半），随机分为四大组，每组各30只。第一组为雷公藤红素原药组，分为6个小组（每组5只），按1mg/kg尾静脉注射给药；第二组为人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物组，分为6个小组（每组5只），按1mg/kg尾静脉注射给药；第三组为泼尼松龙原药组，分为6个小组（每组5只），按8mg/kg尾静脉注射给药；第四组为人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物组，分为6个小组（每组5只），按8mg/kg尾静脉注射给药。
给药后0.083h，0.25h， 0.5h， 1h，2h， 4h分别取血后处死，立即分离心、肝、脾、肺、全肾、肾皮质、脑，生理盐水洗，滤纸吸干，称重，然后加入两倍量的生理盐水匀浆，然后置于-40℃冰箱冷冻待用。全血于7000r/min离心5min，吸取血浆后置于-40℃冰箱待用。解冻保存的组织匀浆及血浆后，分别按照对应的生物样品处理方法和体内含量测定方法对组织样品中雷公藤红素或泼尼松龙进行测定，进而对原药与人血清白蛋白纳米颗粒药物组合物的体内分布情况进行比较。
雷公藤红素生物样品处理方法及其对应LC-MS/MS体内含量测定方法如下：精密吸取100μL血浆或组织匀浆液于1.5mL EP管中，加入9.42μg/mL甘草次酸甲醇溶液10μL，涡旋振荡30s，再精密加入1mL乙酸乙酯，漩涡振荡6min，离心（12500r/min,5min），取上清液0.8mL于1.5mL EP管中，残渣再加入1mL乙酸乙酯同法萃取一次。合并上清液，用氮吹仪吹干，残渣用200μL甲醇溶解，离心（13500r/min,10min），取上清液过0.22μm微孔滤膜后1μL进样。LC-MS/MS方法：（1）色谱部分：Diamonsil ODS柱： (250 × 4.6 mm, 3 μm)；流动相：乙腈：0.5% 甲酸水溶液=80:20；流速：0.4 ml/min；进样量：1μL。（2）质谱部分：用于定量分析的离子反应分别为m/z 451.3→m/z 201.1（雷公藤红素），m/z 471.4→m/z 317.4（内标：甘草次酸）。
泼尼松龙生物样品处理方法及其对应LC-MS/MS体内含量测定方法如下：精密吸取100μL血浆或组织匀浆液于1.5mL EP管中，加入50μL甲醇和250μL乙腈混匀，涡旋10min，离心（13500rpm,10min），取上清液过0.22μm微孔滤膜后1μL进样。LC-MS/MS方法：（1）色谱部分：Diamonsil ODS柱： (250 × 4.6 mm, 3 μm)；流动相：甲醇：0.1% 甲酸水溶液=65:35；流速：0.4 ml/min；进样量：1μL。（2）质谱部分：用于定量分析的离子反应为m/z 361.2→m/z147.1（泼尼松龙）。
结果：
人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物提高了对应原药在全肾、肾皮质中药物含量，如图3至图8所示。
图3结果表明人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物尾静脉给药后，在全肾、肾皮质的雷公藤红素浓度均高于雷公藤红素原药组，5min的雷公藤红素浓度分别是其1.85倍、2.31倍。
图4结果表明人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物尾静脉给药后不同时间点（0.083h，0.25h，0.5h，1h，2h，4h），在全肾的药物浓度均高于雷公藤红素原药组，分别是雷公藤红素原药的1.85倍、1.94倍、2.56倍、1.65倍、1.61倍、1.45倍。
图5结果表明人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物尾静脉给药后不同时间点（0.083h，0.25h，0.5h，1h，2h，4h），在肾皮质的药物浓度均高于雷公藤红素原药组，分别是雷公藤红素原药的2.31倍、2.23倍、1.91倍、2.31倍、2.27倍、2.81倍。
图6结果表明人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物尾静脉给药后，在全肾、肾皮质的泼尼松龙远高于泼尼松龙原药组，5min的泼尼松龙分别是其1.66倍、2.08倍。
图7结果表明人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物尾静脉给药后不同时间点（0.083h，0.25h，0.5h，1h，2h，4h），在全肾的药物浓度均高于泼尼松龙原药组，分别是泼尼松龙原药的1.66倍、2.04倍、2.84倍、2.52倍。在给药2h后，泼尼松龙原药在肾脏的浓度已经低于检测限，但人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物还有较高浓度。
图8结果表明人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物尾静脉给药后不同时间点（0.083h，0.25h，0.5h，1h，2h，4h），在肾皮质的药物浓度均高于泼尼松龙原药组，分别是泼尼松龙原药的2.08倍、2.68倍、2.67倍、5.60倍。在给药2h后，泼尼松龙原药在肾皮质的浓度已经低于检测限，但人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物还有较高浓度。
综上所述，本发明通过将雷公藤红素和泼尼松龙制备成其相应的人血清白蛋白纳米颗粒药物组合物，可以实现其对肾脏、肾皮质靶向递药，能够显著提高药物在全肾、肾皮质的聚集浓度或延长药物在全肾、肾皮质的聚集时间。
试验例2
人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物肾小球靶向性评价
为了进一步探究本发明制备的人血清白蛋白纳米颗粒药物组合物在肾小球内的分布情况，发明人对其在肾小球中药物浓度进行了测定和分析。
按照试验例1中进行分组给药，给药后0.083，0.25， 0.5， 1， 2，4h分别取血后处死，立即分离肾脏，生理盐水洗，滤纸吸干，剥离肾被膜，然后用手术小刀小心剪去肾皮质，置于-40℃冰箱冷冻待用。解冻保存的肾皮质，按照肾小球分离及鉴定的方法进行处理。
肾小球分离及鉴定的方法：1、取肾皮质：给药后处死大鼠。用生理盐水冲净肾脏组织表面血迹，剥离肾被膜，剪取肾皮质，将获取的肾皮质混在一起剪成1mm×1mm×1mm小块。2、筛网研磨：依次放入3层不锈钢筛网。孔径分别为 250μm（60目），110μm（120目），75μm（200目）。在最上层筛网上用消毒针筒轻碾肾皮质，同时用生理盐水冲洗使其滤入下层筛网（110μm）。用生理盐水冲洗第二层筛网（同时轻碾组织）。到75μm这层筛网时，尽量只冲洗不碾磨。3、验证纯度：在第三层筛网上，用一次性吸管吸取少量于载玻片上，在倒置显微镜下观察，若见纯净肾小球达95%以上，即可停止冲洗。4、收集肾小球：用一次性吸管吸取少量生理盐水分多次转移第三层筛网面上的肾小球至2mLEP管中。2000rpm 4℃离心5min，缓慢弃上清，沉淀即为肾小球。收集得到的肾小球置于-40℃冰箱冷冻待用。解冻保存的肾小球，按照肾小球样品处理方法对其进行处理。
肾小球样品处理方法：解冻保存的肾小球，精密加入150uL生理盐水，在超声波细胞粉碎机下破碎肾小球（参数为：超声时间5s；间隔时间：5s；超声总时间：3min；超声功率150W），破碎液于倒置显微镜下观察，发现全为细胞碎片，无完整的肾小球球形结构，说明肾小球在此超声条件下已被彻底破碎。得到的肾小球破碎液，一部分按照实施例4中雷公藤红素或泼尼松龙生物样品处理方法及其对应LC-MS/MS体内含量测定方法进行药物含量测定，另外精密吸取2μL肾小球破碎液用BCA试剂盒测定蛋白质的含量。药物在肾小球中含量表示为：药物含量（ng/mg) = 肾小球中药物浓度(ng) / 肾小球中蛋白浓度(mg)
为了对药物肾小球靶向性进行定量评价，使用下列参数：相对摄取率(Re)、峰浓度比(Ce)进行评价，其中Re用于评价药物是否具有靶向性，大于1表示药物具有肾小球靶向性，Re愈大靶向效果愈好，等于或小于1表示无靶向性；Ce值表示药物对肾小球靶向分布的效果，Ce值愈大，在肾小球靶向分布的效果愈明显，计算公式分别为：Re=(AUC)制剂/(AUC)原药；Ce=(Cmax)制剂/(Cmax)原药。运用DAS2.1.1统计软件分别计算静脉给药后肾小球中的AUC0-t (ng/mg•h)、Cmax(ng/mg)。
结果：
人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物提高了对应原药在肾小球中药物含量，结果如图9、图10及表2所示。
图9结果表明人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物尾静脉给药后不同时间点（0.083h，0.25h，0.5h，1h，2h，4h），在肾小球的药物浓度均高于雷公藤红素原药组，分别是雷公藤红素原药的3.80倍、3.25倍、1.81倍、1.53倍、1.51倍、1.82倍。
图10结果表明人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物尾静脉给药后不同时间点（0.083h，0.25h，0.5h，1h，2h，4h），在肾小球的药物浓度均高于泼尼松龙原药组，分别是泼尼松龙原药的2.58倍、4.60倍、3.33倍、5.60倍。在给药2h后，泼尼松龙原药在肾小球的浓度已经低于检测限，但人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物还有较高浓度。
如表2，人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物在肾小球中的Re值、Ce值均大于1，说明本发明制备的人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物具有肾小球靶向作用。
表2：尾静脉给药后药物在肾小球中的药动学参数以及肾小球靶向评价指标（n=5）
综上所述，本发明制备的粒径在80nm-100nm的人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物能够被肾小球有效截留，进而实现其对肾小球的靶向递药，能够显著提高药物在肾小球的聚集浓度或延长药物在肾小球的聚集时间。
试验例3
人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物的药效学评价
抗Thy1.1抗体可特异性识别大鼠肾小球系膜细胞表面Thy1.1分子，导致补体依赖性系膜溶解、肾小球内炎症细胞浸润、显著的蛋白尿，以及急性或进展性系膜损伤，包括系膜细胞增殖和细胞外基质沉积等。据报道，单次注射该抗体所引发的大鼠可逆性抗Thy1.1抗体肾炎模型肾脏病理学特征基本类似于人类系膜增生性肾炎的早期病变。本发明采用的是抗Thy1.1单克隆抗体，通过单次静脉注射抗Thy1.1抗体（5mg/kg）给SD大鼠建立急性系膜增生性肾小球肾炎，药物治疗从给完抗体2h之后开始。
动物分组及给药方案：
1）正常组一（n=5）：按5mg/kg给予生理盐水，2h后，按1mg/kg给予生理盐水，之后每隔一天按1mg/kg给予生理盐水，共给3次。
2）模型组一（n=5）：按5mg/kg给予抗Thy1.1抗体，2h后，按1mg/kg给予生理盐水，之后每隔一天按1mg/kg给予生理盐水，共给3次。
3）雷公藤红素组（n=5）：按5mg/kg给予抗Thy1.1抗体，2h后，按1mg/kg给予雷公藤红素原液，之后每隔一天按1mg/kg给予雷公藤红素原液，共给3次。
4）雷公藤红素白蛋白纳米粒组（n=5）：按5mg/kg给予抗Thy1.1抗体，2h后，按1mg/kg给予雷公藤红素白蛋白纳米粒，之后每隔一天按1mg/kg给予雷公藤红素白蛋白纳米粒，共给3次。
5）正常组二（n=5）：按5mg/kg给予生理盐水，2h后，按8mg/kg给予生理盐水，之后每隔一天按8mg/kg给予生理盐水，共给3次。
6）模型组二（n=5）：按5mg/kg给予抗Thy1.1抗体，2h后，按8mg/kg给予生理盐水，之后每隔一天按8mg/kg给予生理盐水，共给3次。
7）泼尼松龙组（n=5）：按5mg/kg给予抗Thy1.1抗体，2h后，按8mg/kg给予泼尼松龙原液，之后每隔一天按8mg/kg给予泼尼松龙原液，共给3次。
8）泼尼松龙白蛋白纳米粒组（n=5）：按5mg/kg给予抗Thy1.1抗体，2h后，按8 mg/kg给予泼尼松龙白蛋白纳米粒，之后每隔一天按8 mg/kg给予泼尼松龙白蛋白纳米粒，共给3次。
药效评价：
1）尿蛋白检测，在实验第6天采集24h尿样本检测尿蛋白含量，以mg/day表示。
2）肾脏生化指标测定，在实验第7天对各实验组大鼠眼眶取血，全血4500r/min离心5min后取上清液，使用日立7020型生化仪生化测定血肌酐（CREA）和尿素氮（BUN）。
3）肾脏病理检查，在实验第7天处死各实验组大鼠，取肾组织用10%福尔马林缓冲液固定48h，石蜡包埋，按标准方法制备4μm厚的切片，进行PAS染色，利用显微镜及电子图像分析系统计数每张切片30个肾小球总有核细胞数，然后以150个肾小球取平均值表示肾小球的增殖程度。
以肾小球内PAS染色程度表示系膜基质沉积程度，具体评价方法（半定量评分法）如下：每张免疫组化切片读取30个肾小球，每个实验组读取150个肾小球，根据每个肾小球病变累及程度分为0～4+。0级：0分，肾小球内免疫组化染色阴性；1+级：1分，肾小球内部分系膜区少量染色阳性，病变累及不超过25％；2+级：2分，肾小球内系膜区染色阳性面积不超过50％；3+级：3分，肾小球的大部分出现明显团块样染色阳性区域，病变约占肾小球面积的75％；4+级：4分，主要在接近硬化的肾小球内呈现弥漫性染色强阳性，染色区域占肾小球面积的75~100％。每张切片总评分=(0×N0+1×Nl+2×N2+3×N3+4×N4)/(N0+N1+N2+N3+N4)，其中N0：0级的肾小球数；N1：1+级的肾小球数：N2：2+级的肾小球数；N3：3+级的肾小球数；N4：4+级的肾小球数。
结果：
相比原药组，雷公藤红素白蛋白纳米粒组和泼尼松龙白蛋白纳米粒组显著降低了抗Thy1.1肾小球肾炎大鼠的蛋白尿病理情况。结果如图11、图12所示。
相比原药组，雷公藤红素白蛋白纳米粒组和泼尼松龙白蛋白纳米粒组组显著改善了抗Thy1.1肾小球肾炎大鼠肾脏生化指标BUN和Crea，结果如表3、表4所示。
表3，雷公藤红素及雷公藤红素白蛋白纳米粒改善了抗Thy1.1肾小球肾炎大鼠的BUN和Crea血液指标。（n=5）
表4，泼尼松龙及泼尼松龙白蛋白纳米粒改善了抗Thy1.1肾小球肾炎大鼠的BUN和Crea血液指标。（n=5）
相比原药组，雷公藤红素白蛋白纳米粒组和泼尼松龙白蛋白纳米粒组组显著改善了抗Thy1.1肾小球肾炎大鼠的肾小球系膜损伤情况。结果如表5、表6所示。
表5，雷公藤红素及雷公藤红素白蛋白纳米粒改善了抗Thy1.1肾小球肾炎大鼠肾小球系膜区病理变化（n=5）
表6，泼尼松龙及泼尼松龙白蛋白纳米粒改善了抗Thy1.1肾小球肾炎大鼠肾小球系膜区病理变化（n=5）
综上可知，本发明制备的人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物和人血清白蛋白纳米颗粒泼尼松龙组合物通过肾小球系膜细胞靶向递药，显著提高了药物治疗抗Thy1.1系膜增生性肾小球肾炎的疗效。
试验例4
人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物的心脏毒性评价
由以上试验例可知，本发明制备的人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物通过肾小球靶向作用，显著提高了雷公藤红素在肾小球处的聚集，同时降低了心脏中的雷公藤红素的浓度。据报道，雷公藤红素具有很强的心脏毒性，在微摩尔级别浓度便会导致斑马鱼胚胎心脏中毒。因此，发明人通过测定血清中的肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)来对雷公藤红素和人血清白蛋白纳米颗粒雷公藤红素组合物的心脏毒性进行评价和比较。
动物分组及给药方案：1）生理盐水组（n=5）：每隔一天按1mg/kg给予生理盐水共给3次；2）雷公藤红素组（n=5）：每隔一天按1mg/kg给予雷公藤红素原液，共给3次；3）雷公藤红素白蛋白纳米粒组（n=5）：每隔一天按1mg/kg给予雷公藤红素白蛋白纳米粒，共给3次。于末次给药24小时后取血清，并使用日立7020全自动生化分析仪检测血清中的CK和LDH水平。
结果：
实验结果如表7所示，从实验结果可以看出，雷公藤红素白蛋白纳米粒组各项指标的水平与生理盐水组没有显著性差异，而雷公藤红素组的CK和LDH都显著高于生理盐水组，具有显著性差异(P＜0.001)。说明雷公藤红素具有一定的心脏毒性，但是制成白蛋白纳米粒之后毒性显著降低。
表7，雷公藤红素及雷公藤红素白蛋白纳米粒给药处理后大鼠血清CK和LDH水平(n= 5)
注：与生理盐水组比较，***P＜0.001。

Claims (11)

1.一种肾小球靶向蛋白纳米颗粒药物组合物，其特征在于主要由蛋白成分、药理活性物质、稳定剂制成，其中所述药理活性物质为预防和/或治疗肾脏疾病的药物，选自泼尼松龙、雷公藤红素、雷公藤内酯甲、雷公藤甲素、雷公藤乙素、环孢素A、他克莫司、雷帕霉素、厚朴酚、和厚朴酚；所述蛋白成分选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羊血清白蛋白、驴血清白蛋白、马血清白蛋白、兔血清白蛋白、猪血清白蛋白的一种或多种组合；所述稳定剂选自大豆油、中链油、椰子油、橄榄油、红花油、棉籽油、芝麻油、橙油、Solutol HS-15、吐温、卖泽、苄泽、泊洛沙姆188的一种或多种组合。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于其粒径为10nm-170nm。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于其粒径为60nm-150nm。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于其粒径为80nm-100nm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的药物组合物，其特征在于制备成适用于注射给药、口服给药、体内局部给药的药物制剂。
6.权利要求1-4任一项所述的蛋白纳米颗粒药物组合物在制备肾小球靶向的药物中的应用。
7.一种权利要求1-4任一项所述的肾小球靶向蛋白纳米颗粒药物组合物的制备方法，其特征在于选自超声法、高压均质法、微射流法，所述超声法具体包括以下步骤：
（1）将药物活性成分与水不溶性稳定剂溶于有机溶剂中作为油相，必要时可用超声辅助溶解；
（2）将蛋白成分、水溶性稳定剂溶于水中作为水相，必要时可在一定温度下加热溶解；
（3）根据需要，（1）和（2）中稳定剂分别可只加入水不溶性稳定剂或水溶性稳定剂或两种类型稳定剂均加入；
（4）将油相与水相混合，混合后以3s/5s的频率直接在超声功率400-800w，0-10℃冰浴条件下超声5-15min，即得纳米乳剂；
（5）得到的纳米乳剂，减压蒸发除去有机溶剂，即得蛋白纳米颗粒组合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述高压均质法包括以下步骤：
（1）将药物活性成分与水不溶性稳定剂溶于有机溶剂中作为油相，必要时可用超声辅助溶解；
（2）将蛋白成分、水溶性稳定剂溶于水中作为水相，必要时可在一定温度下加热溶解；
（3）根据需要，（1）和（2）中稳定剂分别可只加入水不溶性稳定剂或水溶性稳定剂或两种类型稳定剂均加入；
（4）将油相与水相混合，混合后先在0-10℃冰浴条件下探头超声10-15次，得到的混悬液转移到高压均质机内，在3000-30000Psi压力范围内循环均化10-15次即得纳米乳剂；
（5）得到的纳米乳剂，减压蒸发除去有机溶剂，即得蛋白纳米颗粒组合物。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述微射流法包括以下步骤：
（1）将药物活性成分与水不溶性稳定剂溶于有机溶剂中作为油相，必要时可用超声辅助溶解；
（2）将蛋白成分、水溶性稳定剂溶于水中作为水相，必要时可在一定温度下加热溶解；
（3）根据需要，（1）和（2）中稳定剂分别可只加入水不溶性稳定剂或水溶性稳定剂或两种类型稳定剂均加入；
（4）将油相与水相混合，混合后先在0-10℃冰浴条件下探头超声10-15次，得到的混悬液转移到微射流内，在3000-30000Psi压力范围内循环均化10-15次即得纳米乳剂；
（5）得到的纳米乳剂，减压蒸发除去有机溶剂，即得蛋白纳米颗粒组合物。
10.根据权利要求7-9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂可选二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氧六环、乙酸乙酯、乙腈、甲基吡咯烷酮、甲醇、乙醇、中链醇以及2种或2种以上这些溶剂的混合物。
11.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述药物用于预防和/或治疗肾脏疾病，所述肾脏疾病包括肾小球类疾病、肾小球类疾病诱发的肾小管间质疾病以及肾小球类疾病诱发的肾血管疾病、肾肿瘤及肾移植后的抗排斥反应。
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