CN109464420B - 一种基于蛋清的食物仿生纳米递药体系及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于蛋清的食物仿生纳米递药体系及其制备方法和应用。该制备方法，包括以下步骤：S1.将稳定剂和药物溶解于溶剂中，得到混合溶液；S2.于冰浴条件下，将上述混合溶液低温均匀分散到蛋清溶液中，得到粒径均一、稳定的纳米溶液，超滤，即得。本发明以蛋清为主要材料，通过将稳定剂、治疗药物与蛋清溶液通过低温分散的方式混合，得到整个体系粒径大小合适，体外稳定性良好，肿瘤的酸性环境能够触发该体系释放，具有很好的生物安全性、生物可降解性、循环稳定性和肿瘤靶向性，具备高效抑制肿瘤细胞生长的特点，能够实现口服和静脉注射联合给药途径的协同抗肿瘤作用，在生物医药领域具有较好的应用前景。

Description

一种基于蛋清的食物仿生纳米递药体系及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于功能高分子材料和生物医药技术领域。更具体地，涉及一种基于蛋清的食物仿生纳米递药体系及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是危害人类健康、引起人类死亡的重大疾病之一。临床上，晚期的癌症患者主要以化学药物治疗为主。近年来，化疗药物的研究日趋成熟，在临床抗肿瘤治疗中也表现出良好的效果。但化疗药物的毒副作用及给药方式一直以来是制约其进一步发展的重要原因。口服给药方式作为患者容易接受的用药途径，无疑是更受患者青睐的，但由于化疗药物很大比例属于疏水性药物，其口服吸收差，而且容易产生胃肠道毒性，加重毒副作用。因此，急需开发一种优良的递药体系来提升口服化疗药物的疗效，同时能够有力降低毒副作用。目前化疗药的给药（特别是口服给药）往往需要采取各种增加溶解度的办法，如将药物制备成盐、加入潜溶媒、加入助溶剂、以及加表面活性剂增溶。由于成盐往往需要强酸或强碱条件，对许多药物往往不适用；生理安全的潜溶媒很少，且用量有限；通过与药物形成络合物而增加药物溶解度的助溶剂的安全性不易保证。对于水溶性较差的药物往往需要同时采用几种措施，这往往导致许多不足，从而影响药物的作用。
对口服途径而言，食物来源的材料无疑是最佳选择，天然食材来源的材料的安全性经过成百上千年的考证，是最让人放心的。但就目前来看，很少有人研究利用食物来源的材料来改善口服药物的疗效。而且，大部分抗癌药物由于药物的选择性不强，在体内容易被破坏，半衰期短，毒副作用大，杀灭癌细胞的同时也不可避免的对正常细胞产生损伤。因此，在改善药物口服效果的同时，如何将抗癌药物安全有效的运输至肿瘤组织内是亟待解决的问题。
蛋类作为日常生活中最为普通的食材，其含有丰富的蛋白，营养价值较高。食用蛋类，可以增加机体的营养，补充人体每日所需蛋白。鉴于蛋类对消化道的良好安全性，利用蛋类成分来开发药物载体提升治疗药物的口服效果，既是一个大胆创新的尝试，同时具备一定的可行性。目前利用蛋清来传递药物的研究较少，利用蛋清来传递药物在肿瘤治疗中的应用仍面临诸多挑战，如：目前多是将蛋清与治疗药物混合，加入乳化剂后再与油相乳化成微球，然后通过加热或变形等进行固化，而乳化剂在界面上的吸附属于动态吸附，容易发生解吸附，其在加工及存储过程中具体表现为相分层、液滴絮凝、奥氏熟化等不稳定现象，通过上述方法制备得到的载药体系的不稳定性限制了其在药品行业中的应用。而且通常其粒径较大，不能有效进入肿瘤组织，以及其在生物体内的靶向性等有待于进一步改善等。再者，近年来，小分子表面活性剂的安全问题也引发了消费者们的担忧。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种基于蛋清的食物仿生纳米递药体系的制备方法，实现药物在肿瘤细胞内的定位可控释放，提高口服化疗药物的安全性和治疗效果，其制备方法简单易于实现，制备获得的食物仿生纳米递药体系理化性能优异，生物安全性和循环稳定性高，可应用于口服和注射给药抑制肿瘤生长。
本发明的第一个目的是提供一种基于蛋清的食物仿生纳米递药体系的制备方法。
本发明的第二个目的是提供使用上述制备方法得到的基于蛋清的食物仿生纳米递药体系。
本发明的第三个目的是提供上述基于蛋清的食物仿生纳米递药体系在在制备抗癌药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种基于蛋清的食物仿生纳米递药体系的制备方法，包括以下步骤：
S1. 将稳定剂和药物溶解于溶剂中，得到混合溶液；
S2. 于冰浴条件下，将上述混合溶液低温均匀分散到蛋清溶液中，得到粒径均一、稳定的纳米溶液，超滤，即可得到所述基于蛋清的食物仿生纳米递药体系。
蛋清来源丰富，含有丰富的氨基酸组成与人类必需氨基酸比例接近的蛋白质，生物安全性和生物可降解性优异，本发明以蛋清为主要材料，通过将稳定剂、治疗药物与蛋清溶液通过低温分散的方式混合，得到的食物仿生纳米递药体系粒径大小合适，体外稳定性良好，肿瘤的酸性环境能够触发该体系释放，具有很好的生物安全性、生物可降解性和循环稳定性，具备高效肿瘤靶向和高效抑制肿瘤细胞生长的特点，可有效解决纳米药物载体的生物利用度差、循环稳定性较差、靶向性差和生物安全性差等诸多问题。
本发明同时具有良好的生物相容性，能够实现抗肿瘤药物口服和静脉注射联合给药途径的协同抗肿瘤作用，可通过调节投料配比和条件参数来实现粒径大小和载药量的调控。
本发明使用的蛋清可来自所有蛋类，包括但不限于鸡蛋、鸭蛋、鸟蛋等蛋类。
优选地，所述冰浴的温度控制在0～4℃。
更优选地，所述冰浴的温度控制在0～2℃。
优选地，所述低温均匀分散的方法为：向蛋清溶液中滴加所述混合溶液，同时进行低温分散处理。低温处理可以降低分散过程产生高温，避免蛋白变性。
优选地，所述分散的方法为超声分散或高压均质分散。
更优选地，所述分散的方法为超声分散。可通过超声产生高能量的机械波来分散溶液中的大蛋清从而实现纳米粒的制备。
更进一步优选地，利用超声波细胞破碎仪进行超声分散，其所能提供的能量远大于其他方式，能确保粒径在比较小的范围。
优选地，所述分散的时间至少为15 min。如果分散时间不足，溶液中的蛋清分散不均匀，粒径较大，容易聚沉，稳定性差。
更优选地，所述分散的时间至少为15～40 min。
更进一步优选地，所述分散的时间至少为25 min。
优选地，超声分散的功率控制在15～25 kHz之间。
优选地，超声分散的振幅控制在20%～30%之间。
优选地，所述蛋清溶液的浓度为0.2%～1% W/V。
更优选地，所述蛋清溶液的浓度为0.5% W/V。
优选地，所述蛋清溶液为蛋清水溶液。
更优选地，所述蛋清溶液通过以下方法得到：直接从蛋类中分离出蛋清，冻干，得到蛋清粉末；将蛋清粉末溶于PBS缓冲溶液中，即可得到所述蛋清溶液。
冻干的温度可根据实际需要进行调节。
优选地，所述稳定剂的加入量为蛋清粉末质量的4.2%～100%。若稳定剂比例不够，获得的纳米溶液不稳定，容易聚沉。
更优选地，所述稳定剂的加入量为蛋清粉末质量的6%～30%。
更进一步优选地，所述稳定剂的加入量为蛋清粉末质量的25%。
优选地，所述稳定剂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPEG-PEG）类稳定剂、聚乙烯醇（PVA）或泊洛沙姆188。
更优选地，所述稳定剂为DSPEG-PEG，DSPEG-PEG的稳定效果最佳。
更进一步优选地，所述DSPEG-PEG中聚乙二醇链段的重均分子量为500～5000。
最优选地，所述DSPE-PEG中聚乙二醇链段的重均分子量为3000，即所述稳定剂为DSPEG-PEG 3000。
优选地，步骤S1中，所述溶剂为醇溶剂。
更优选地，步骤S1中，所述溶剂为乙醇。
所述药物为疏水性药物。
所述药物为抗肿瘤药物。
本发明对常见的疏水性抗肿瘤药物均适用，例如紫杉醇（PTX）、甲氨蝶呤、喜树碱、阿霉素等常见的疏水性抗肿瘤药物。
相应地，使用上述方法制得的基于蛋清的食物仿生纳米递药体系，也在本发明的保护范围之内。
用于递送治疗药物的纳米粒，其粒径、稳定性及载药量对肿瘤细胞的生长、增殖、迁移和侵袭等有重要影响。
上述方法所制备的食物仿生纳米递药体系，粒径合适，稳定性好，能够用于体外抑制肿瘤细胞活性，可发挥口服和注射的协同治疗效果，满足抑制肿瘤生长的治疗要求。
优选地，所述食物仿生纳米递药体系的粒径为90～120 nm。由于实体瘤的高通透性和滞留效应（EPR effect），尺寸为10～200 nm的纳米药物能够更好的在肿瘤部位聚集。本发明所述食物仿生纳米递药体系，粒径为90～120 nm，能够更好的在肿瘤部位聚集，从而提高药物利用度及药效，并且减少了对机体的毒副作用。
本发明所述食物仿生纳米递药体系，经动态光散射检测，其粒径（DLS）为90～120nm，载药量在4%～10%之间。另外，经稳定性考察，表明该食物仿生纳米递药体系在PBS和含10%FBS的PBS中，72小时内粒径稳定性良好。同时，经释放实验，表明该食物仿生纳米递药体系在pH呈酸性时有利于治疗药物的释放。
本发明所述食物仿生纳米递药体系，首先，其基于蛋清的特殊结构和材料，使纳米递药体系的血液循环能力得到提高，可改善抗癌药物的口服生物利用度，然后通过EPR效应被动地靶向积累在肿瘤细胞中，并且有效地在细胞内转运并被内涵体捕获，之后逃逸到细胞质在内体/溶酶体的酸性环境下，在肿瘤细胞酸性微环境下具有较佳的pH响应性，在肿瘤细胞酸性微环境下能够快速分解，使得抗肿瘤药物能够在肿瘤部位内更加快速的释放，从而达到更加有效的抗肿瘤效果。
因此，上述食物仿生纳米递药体系在制备抗癌药物方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
上述食物仿生纳米递药体系可高效抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，并有效诱导肿瘤细胞凋亡。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明以蛋清为主要原料，开发了一种适用于肿瘤特殊微环境的食物仿生纳米递药体系，具有生物可降解性、体循环稳定性、靶向性和生物安全性优异的特点，可以包裹不同种类的抗肿瘤药物，在肿瘤细胞酸性环境下可迅速释放包载药物，从而可显着提高化疗药物的生物利用度，减少不良反应和毒副作用，并在体内具有优异的抗肿瘤作用，对肿瘤的治疗具有一定的参考意义。
（2）本发明的食物仿生纳米递药体系，可成功负载不同种类的疏水性药物，并进一步形成可控粒径的纳米粒；可通过肿瘤组织的高通透性及高保留性（EPR effect）蓄积在肿瘤组织中，从而实现被动靶向的作用；而且纳米粒被肿瘤细胞摄取后，在肿瘤细胞内低pH作用下，体系迅速瓦解，实现pH响应性药物释放，从而高效抑制肿瘤细胞增殖。
（3）本发明具有反应过程简单，反应步骤少，绿色安全，反应周期短、重复性好、易于实现等优势，在医药领域具有良好的应用前景和广阔的发展空间。
附图说明
图1中A图为不载药时蛋清纳米粒（EW-NPs）的TEM图，B图为负载了PTX的蛋清纳米粒（PTX/EW-NPs）的TEM图。
图2中A图为不载药时蛋清纳米粒（EW-NPs）的DLS粒径图，B图为负载了PTX的蛋清纳米粒（PTX/EW-NPs）的DLS粒径图。
图3为EW-NPs和PTX/EW-NPs在PBS和含有10%FBS的PBS的粒径稳定性。
图4为EW-NPs和PTX/EW-NPs在不同条件下的PTX释放曲线图。
图5为对比了PBS、PTX、PTX/EW-NPs处理细胞72小时的迁移情况。
图6为对比了PBS、PTX、EW-NPs、PTX/EW-NPs处理细胞48小时的侵袭情况。
图7为对比了PBS、PTX、PTX/EW-NPs处理细胞24小时的凋亡情况。
图8为EW-NPs在小肠中的被摄入的荧光显微图，表明EW-NPs有利于小肠细胞的摄取；其中，A图为游离的Dil染料在肠道的分布；B图为将Dil包载在EW-NPs后在肠道中的分布。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 一种基于蛋清的食物仿生纳米递药体系（PTX/EW-NPs）的制备
1、制备方法，包括以下步骤：
（1）制备蛋清水溶液：用蛋清分离器将蛋清从鸡蛋中分离出来，离心后去弃除沉淀，将蛋清溶液冻干，得到蛋清粉末，将其溶于PBS缓冲溶液中，即可得到蛋清水溶液；
（2）取稳定剂DSPEG-PEG3000和适量紫杉醇（PTX）粉末溶于乙醇中，获得相应的乙醇溶液；
（3）制备PTX/EW-NPs：0℃冰浴条件下，将上述步骤（2）的乙醇溶液滴加到蛋清水溶液0.5%（W/V）中，同时进行超声分散处理，超声功率控制在20 kHz，振幅控制在25%，稳定剂的加入量为蛋清粉末质量的25%，超声25 min后，超滤浓缩处理，即可得到粒径均一、稳定的基于蛋清的食物仿生纳米递药体系（PTX/EW-NPs）。
实施例2 一种基于蛋清的食物仿生纳米递药体系的制备
1、制备方法，包括以下步骤：
（1）制备蛋清水溶液：用蛋清分离器将蛋清从鸡蛋中分离出来，离心后去弃除沉淀，将蛋清溶液冻干，得到蛋清粉末，将其溶于PBS缓冲溶液中，即可得到蛋清水溶液；
（2）取稳定剂DSPEG-PEG 500和适量甲氨蝶呤粉末溶于乙醇中，获得相应的乙醇溶液；
（3）制备PTX/EW-NPs：2℃冰浴条件下，将上述步骤（2）的乙醇溶液滴加到蛋清水溶液1%（W/V）中，同时进行超声分散处理，超声功率控制在25 kHz，振幅控制在30%，稳定剂的加入量为蛋清粉末质量的6%，超声40 min后，超滤浓缩处理，即可得到粒径均一、稳定的基于蛋清的食物仿生纳米递药体系。
实施例3 一种基于蛋清的食物仿生纳米递药体系的制备
1、制备方法，包括以下步骤：
（1）制备蛋清水溶液：用蛋清分离器将蛋清从鸡蛋中分离出来，离心后去弃除沉淀，将蛋清溶液冻干，得到蛋清粉末，将其溶于PBS缓冲溶液中，即可得到蛋清水溶液；
（2）取稳定剂DSPEG-PEG 5000和适量喜树碱粉末溶于乙醇中，获得相应的乙醇溶液；
（3）制备PTX/EW-NPs：4℃冰浴条件下，将上述步骤（2）的乙醇溶液滴加到蛋清水溶液0.2%（W/V）中，同时进行超声分散处理，超声功率控制在15 kHz，振幅控制在20%，稳定剂的加入量为蛋清粉末质量的30%，超声15 min后，超滤浓缩处理，即可得到粒径均一、稳定的基于蛋清的食物仿生纳米递药体系。
实施例4 一种基于蛋清的食物仿生纳米递药体系的制备
1、制备方法，包括以下步骤：
（1）制备蛋清水溶液：用蛋清分离器将蛋清从鸡蛋中分离出来，离心后去弃除沉淀，将蛋清溶液冻干，得到蛋清粉末，将其溶于PBS缓冲溶液中，即可得到蛋清水溶液；
（2）取稳定剂DSPEG-PEG3000和适量紫杉醇（PTX）粉末溶于乙醇中，获得相应的乙醇溶液；
（3）制备PTX/EW-NPs：0℃冰浴条件下，将上述步骤（2）的乙醇溶液滴加到蛋清水溶液0.5%（W/V）中，同时进行超声分散处理，超声功率控制在20 kHz，振幅控制在25%，稳定剂的加入量为蛋清粉末质量的4.2%，超声25 min后，超滤浓缩处理，即可得到粒径均一、稳定的基于蛋清的食物仿生纳米递药体系（PTX/EW-NPs）。
实施例5 一种基于蛋清的食物仿生纳米递药体系的制备
1、制备方法，包括以下步骤：
（1）制备蛋清水溶液：用蛋清分离器将蛋清从鸡蛋中分离出来，离心后去弃除沉淀，将蛋清溶液冻干，得到蛋清粉末，将其溶于PBS缓冲溶液中，即可得到蛋清水溶液；
（2）取稳定剂DSPEG-PEG 3000和适量紫杉醇（PTX）粉末溶于乙醇中，获得相应的乙醇溶液；
（3）制备PTX/EW-NPs：0℃冰浴条件下，将上述步骤（2）的乙醇溶液滴加到蛋清水溶液0.5%（W/V）中，同时进行超声分散处理，超声功率控制在20 kHz，振幅控制在25%，稳定剂的加入量为蛋清粉末质量的100%，超声25 min后，超滤浓缩处理，即可得到粒径均一、稳定的基于蛋清的食物仿生纳米递药体系（PTX/EW-NPs）。
实施例6 性能表征及抗肿瘤评价
1、肿瘤细胞CT26.WT迁移和侵袭活性的抑制
（1）迁移实验
1）将肿瘤细胞CT26.WT（结直肠癌细胞）接种于6孔板，待细胞铺板整个六孔板，用移液器的枪头划痕，使形成一道无细胞区域；
2）加入上述制备得到的PTX/EW-NPs共培养，不用时间进行观察，拍照取样；分别以PBS和PTX作为对照组。
（2）侵袭实验
1）将肿瘤细胞CT26.WT接种于transwell小室内，加入无血清培养基共培养；
2）加入上述制备得到的PTX/EW-NPs共培养，不用时间进行观察，拍照取样；分别以PBS和PTX作为对照组
2、产品性能及特征
（1）如图1所示，以本发明制备的负载了PTX的蛋清纳米粒（PTX/EW-NPs）为例，本发明的食物仿生纳米递药体系具有球形结构；如图2所示，其DLS粒径在100 nm左右；同时，如图3所示，其在PBS和10%FBS的PBS中72小时稳定。
（2）如图4所示，本发明制备的食物仿生纳米递药体系在酸性条件下和高浓度GSH的条件下有利于抗癌药物的释放。食物仿生纳米递药体系被肿瘤细胞摄取后，在肿瘤细胞内低pH和高浓度GSH作用下，尤其是在肿瘤细胞内低pH环境下，该递药体系迅速瓦解，实现pH响应性药物释放，从而高效抑制肿瘤细胞增殖。
（3）如图5至图6所示，以本发明制备的负载了PTX的蛋清纳米粒（PTX/EW-NPs）为例，本发明制备的食物仿生纳米递药体系对肿瘤细胞CT26.WT的迁移和侵袭具有显著的抑制作用，并能有效诱导肿瘤细胞凋亡（图7）。
（4）图8为EW-NPs在小肠中的被摄入的荧光显微图，实验表明本发明的食物仿生纳米递药体系（EW-NPs）有利于小肠细胞的摄取；另外，动物实验表明，本发明制备的食物仿生纳米递药体系具有良好的生物相容性，能够实现紫杉醇口服和静脉注射联合给药途径的协同抗肿瘤作用，同时具有生物可降解性、体循环稳定性、靶向性和生物安全性优异的特点，可以包裹不同种类的疏水性抗肿瘤药物，在肿瘤细胞酸性环境下可迅速释放包载药物，从而可显着提高化疗药物的生物利用度，减少不良反应和毒副作用，并在体内具有优异的抗肿瘤作用，对肿瘤的治疗具有一定的参考意义。
以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (7)

1.一种基于蛋清的食物仿生纳米递药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将稳定剂和药物溶解于溶剂中，得到混合溶液；
S2.于冰浴条件下，将上述混合溶液低温均匀分散到蛋清溶液中，得到粒径均一、稳定的纳米溶液，超滤，即可得到所述基于蛋清的食物仿生纳米递药体系；
其中，所述蛋清溶液的浓度为0.2%～1%W/V；
所述蛋清溶液通过以下方法得到：直接从蛋类中分离出蛋清，离心后去除沉淀，冻干，得到蛋清粉末；将蛋清粉末溶于PBS缓冲溶液中，即可得到所述蛋清溶液；
所述稳定剂的加入量为蛋清粉末质量的4.2%～100%。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冰浴的温度控制在0～4℃。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述低温均匀分散的方法为：向蛋清溶液中滴加所述混合溶液，同时进行低温分散处理。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分散的方法为超声分散或高压均质分散。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分散的时间至少为15min。
6.权利要求1～5任一所述方法制得的基于蛋清的食物仿生纳米递药体系。
7.权利要求6所述的食物仿生纳米递药体系在制备抗癌药物方面的应用。
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