CN104523597A - 一种鬼臼毒素类药物的靶向给药制剂 - Google Patents

Abstract

一种含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒，其中包含鬼臼毒素类药物与磷脂形成的复合物及白蛋白，基于重量份计，鬼臼毒素类药物1份、磷脂1~50份，白蛋白2~100份。所述磷脂复合物白蛋白纳米粒既能显著降低鬼臼毒素类药物毒性，尤其是骨髓抑制毒性，同时具有肝、肺靶向性。

Description

一种鬼臼毒素类药物的靶向给药制剂

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种鬼臼毒素类药物的靶向给药制剂，具体涉及鬼臼毒素及其衍生物的磷脂复合物白蛋白纳米粒。

背景技术

鬼臼毒素是从小檗科鬼臼属植物鬼臼的根茎中分离得到的一种木脂体,具有2,3-丁内酯-4-芳基四氢萘的化学结构，对微管和肿瘤细胞具有抑制作用，但毒性较大，不适宜直接临床应用。目前市售的鬼臼毒素类药物主要有依托泊苷、替尼泊苷等，主要用于恶性淋巴瘤、霍奇金氏病、急性淋巴细胞性白血病、空管膜瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、神经母细胞瘤和儿童的其它实体瘤，也用于治疗小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤等。

鬼臼毒素类化合物的抗肿瘤作用机理主要有两种：1）鬼臼毒素本身的抗肿瘤活性是通过破坏正在进行有丝分裂的细胞中的微管蛋白集结以及微管形成，使细胞有丝分裂停止在M期，抑制了肿瘤细胞正常分裂，从而达到抗肿瘤作用，它与秋水仙碱有类似的作用机制。2）鬼臼毒素的4’-脱甲基衍生物,包括4’-脱甲基鬼臼毒素、4’-脱甲基脱氧鬼臼毒素、4’-脱甲基表鬼臼毒，依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)等这些化合物的抗肿瘤作用与DNA拓扑异构酶Ⅱ(即TopoⅡ)有关，它们以共价键形成稳定的“药物-DNA-TopoⅡ”三元复合物，最终导致对DNA连接活性的抑制和产生DNA单链及双链的断裂,使肿瘤细胞周期终止于G期(DNA合成前期)，从而表现抗肿瘤作用。

然而，鬼臼毒素类药物大多水溶性较差，目前鬼臼毒素类抗癌药物临床上常用剂型为注射液和口服软胶囊，由于此类药物水溶性差，必须溶于有机溶媒，而且要加入大量表面活性剂增溶。以替尼泊苷为例，市售制剂的处方组成为：每支安瓿（5ml)含替尼泊苷50mg, CremophorEL 2.5g，苯甲醇150mg, N, N-二甲基乙酰胺300mg, 42.7% (v/v)的无水乙醇。临床使用时用5%的葡萄糖溶液或生理盐水稀释后静滴。然而，市售制剂在临床使用过程中存在一定的问题，主要是处方中含有大量聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL)，使用后可引起体内组胺释放，导致严重的过敏反应。此外，鬼臼毒素类药物还具有较严重的毒性如骨髓抑制与胃肠道反应等。

目前，国内外药学工作者致力于研究减少或替代Cremophor EL使用的新型给药系统，以降低毒副作用。例如，含吐温的药物组合物、脂质体、环糊精包合物、微球制剂、乳剂和凝胶制剂等，但这些给药系统仍存在不稳定，易泄露，制备工艺复杂等问题。

2004年，美国生物科学有限公司披露了一种基于二硫键形成的白蛋白纳米粒制备专利技术(ZL97199720.9)。该技术以药物纳米粒为核心，白蛋白以二硫键部分交联包裹在纳米粒表面，保留了白蛋白的全部生物学特性，该公司应用该技术将紫杉醇类药物制成的白蛋白纳米粒制剂已上市。但中国发明专利（CN200810187488.8、CN201210130413.2和CN201210301743.3）的研究均表明上述技术有一定的局限性，在处方中添加一定量的磷脂能够使该方法适用范围更广，得到粒径更小、更均一的白蛋白纳米粒制剂。然而，通过研究，我们发现即使添加了磷脂，仍有一些药物的白蛋白纳米粒稳定性不太好，如喜树碱白蛋白纳米粒混悬液，放置一段时间后就会有药物的晶体析出。

白蛋白包裹在纳米粒的表面上一方面可以抑制血浆蛋白的吸附，降低纳米粒的毒性（Preformed albumin corona, a protective coating for nanoparticles-based drug delivery system Biomaterials 34 (2013) 8521-8530），另一方面，可一定程度上延长纳米粒血液循环时间，通过纳米粒子对肿瘤的增强渗透和滞留效应（EPR效应），以及白蛋白具有对肿瘤细胞上gp60受体、SPARC受体的靶向作用，从而对肿瘤组织具有一定的靶向性，但这些靶向作用并不强，抗癌药物白蛋白纳米粒更多的作用还是降低抗癌药物对正常组织器官的毒性。虽然，未经PEG化等表面修饰的微粒制剂进入体循环之后，由于粒径、表面性质的影响，易被网状内皮系统识别摄取，从而分布在肝、脾、肺、骨髓等网状内皮系统较为丰富的器官，但常常毒性也相应增加。

普通的纳米粒由于粒径的关系被肝脏的网状内皮系统的吞噬细胞吞噬，从而达到被动肝靶向的目的，但是这种靶向实际上主要集中在肝脏的免疫细胞中，所以更容易杀死免疫细胞，引起更严重的骨髓抑制的副作用。

目前，白蛋白纳米粒的制备方法主要有两种，一种是比较早的研究，白蛋白加甲醛或戊二醛等交联固化，或加热固化，白蛋白变性了，失去立体结构和生理功能，这种纳米粒如果不加表面修饰，静脉注射后主要被肝、脾、骨髓等的网状内皮系统摄取，虽然有这些器官组织的靶向性，但通常都会增加骨髓抑制这一毒副作用，因为骨髓的网状内皮系统很丰富，摄取过多的抗癌药物纳米粒，肯定会引起骨髓抑制。如果在纳米粒的表面上修饰靶向配体，就会靶向到相应的细胞或组织，但这种靶向是由于配体的原因，与白蛋白无关。

毛声俊、侯世祥等发表了“甘草酸表面修饰万乃洛韦白蛋白纳米粒的制备及其肝靶向性研究，生物医学工程杂志，2004，21：570-574”，然而这种白蛋白纳米粒是白蛋白被交联剂固化了，已失去白蛋白的立体结构、生理作用，只是普通的纳米粒表面修饰上具有肝靶向性的配体甘草酸，达到肝靶向性的目的。

专利文献CN102784109A中披露“紫杉醇白蛋白纳米粒的被动靶向作用主要是由于肿瘤生长产生的EPR效应”，其中所谓EPR效应是肿瘤的血管生长过快，与正常组织的血管相比，肿瘤的血管上漏洞很多，所以大分子和纳米粒很容易透过肿瘤血管，渗透到肿瘤组织中去，但肿瘤组织的淋巴系统不发达，渗透进去的纳米粒无法排除，所以在肿瘤组织会慢慢地聚集起来。而且，这种是白蛋白包裹在药物纳米粒的表面，其生理作用未改变，可靶向肿瘤细胞的gp60等受体，但不具有肝、肺的组织靶向性。

另一种白蛋白纳米粒就是季秀峰、石莉、邓意辉等人写的综述“白蛋白纳米粒药物传递系统的研究进展 沈阳药科大学学报 2010， 27 （12）968-978”后半部分主要介绍的基于二硫键形成法的nabTM-技术制备的白蛋白纳米粒，它是药物和其他辅料一起先形成纳米粒，然后白蛋白分子通过高压剪切做功，打断分子内的二硫键，形成分子间二硫键而相互交联，包裹在纳米粒的表面上，所以白蛋白的生理活性全部被保留了。这种纳米粒一方面由于表面是白蛋白，具有一定程度的长循环功能，可利用EPR效应靶向肿瘤组织；另一方面由于肿瘤细胞表面的gp60等白蛋白受体表达比较丰富，所以这种白蛋白纳米粒可主动靶向至肿瘤细胞。这种白蛋白纳米粒不会被网状内皮系统摄取，故不具有肝、脾、肺、骨髓的靶向性，能降低细胞毒性抗癌药物的骨髓抑制等副作用。

因此，获得一种可使抗癌药物具有肝肺靶向性，但不具有骨髓抑制副作用的制剂系统，成为当前抗癌药物开发中的迫切需求。

发明内容

本发明的目的之一，提供一种鬼臼毒素类抗癌药物的新制剂，其一方面使药物具有肝肺靶向性，另一方面降低了药物的骨髓抑制副作用。

本发明的鬼臼毒素类药物磷脂复合物白蛋白纳米粒中，白蛋白包裹在药物纳米粒的表面上，不仅白蛋白保留了生物活性，而且出人预料地发现其聚集于肝、肺，这是现有技术未曾公开的。

本发明的目的之一，提供一种具有肝肺靶向性的含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒（制剂）或药物组合物。

本发明在现有的白蛋白-磷脂载体技术的基础上，根据鬼臼毒素类药物的结构特征，先将鬼臼毒素类药物与磷脂形成复合物，增加药物与磷脂的亲和力和改善其亲脂性，采用适当的有机溶剂将复合物溶解作为油相，再将白蛋白溶于水作为水相，两相混合高压均质制成混悬液，旋蒸除去有机溶剂后，制备成药学上可以接受的注射给药纳米粒制剂。

除了将原本水不溶性的鬼臼毒素类药物制备成可以通过适宜水性介质输送的制剂之外，本发明更加注重的一个方面是降低鬼臼毒素药物的骨髓抑制毒性。

普通的纳米粒由于粒径的关系，容易被网状内皮系统（RES）吞噬，进而被动靶向至肝、脾、肺、骨髓等器官。但这种靶向实际上是将含药纳米颗粒大量集中在这些器官的免疫细胞中，不可避免地会杀伤免疫细胞，甚至引起更严重的骨髓抑制毒性（白细胞减少）。在实验中发现，本发明中通过引入白蛋白，在药理活性物质表面形成一定的外壳包裹，显著降低了鬼臼毒素类药物的骨髓抑制毒性，而且出人意料地发现该白蛋白纳米粒具有明显的肝、肺靶向性，这和我们前期研制的蒽环类抗肿瘤药物白蛋白纳米粒（ZL201010150346.1）的体内分布结果大不一样。

考虑到已上市的鬼臼毒素类药物如依托泊苷和替尼泊苷本身就对小细胞肺癌、非小细胞肺癌等有良好的疗效，鬼臼毒素类药物白蛋白纳米粒具有很好的应用前景。我们还可以进一步在本发明纳米制剂的白蛋白表面修饰一定的配体/抗体，以实现更精确的靶向。

专利文献CN1772290A中披露“本发明华蟾酥毒基白蛋白纳米粒制剂，具有缓释性和肝靶向性，有利于华蟾酥毒基治疗”。实际上，加了交联剂，白蛋白被交联剂固化了，已失去白蛋白的立体结构、生理作用，作为普通的纳米粒，进入血液后，由于粒径在50-250nm范围内，会被肝脏的网状内皮系统摄取，达到肝靶向。由于骨髓中的网状内皮系统也很丰富，这种方式通常会增加骨髓抑制。然而，本发明中白蛋白包裹在药物纳米粒的表面上，白蛋白保留了生物活性，其聚集于肝、肺的机理却不一定是被网状内皮系统摄取，但具体机理还需进一步研究。

本发明的目的之一，提供一种含鬼臼毒素类药物的药物组合物，其中包含鬼臼毒素类药物与磷脂形成的复合物及白蛋白，基于重量份计，鬼臼毒素类药物1份、磷脂1~50份，白蛋白2~100份；优选地，鬼臼毒素类药物1份、磷脂2~10份、白蛋白5~50份。

本发明的目的之一，提供一种含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒（制剂），其中包含鬼臼毒素类药物与磷脂形成的复合物及白蛋白，基于重量份计，鬼臼毒素类药物1份、磷1~50份，白蛋白2~100份；优选地，鬼臼毒素类药物1份、磷脂2~10份、白蛋白5~50份。

本发明所述的含鬼臼毒素类药物的药物组合物，等同于含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒（制剂）的概念。

本发明提供的药物组合物或纳米（制剂）的粒径在约10-500nm，优选在100-300nm，更优选为100-200nm左右。

本发明所述的鬼臼毒素类药物，也包括经过亲脂化处理的鬼臼毒素类药物及其衍生物。

本发明所述的鬼臼毒素类抗肿瘤药物或鬼臼毒素类药物具有相同涵义，具体包括鬼臼毒素、替尼泊苷、依托泊苷、依托泊苷盐酸盐、氨基糖依托泊苷、4-脱氧-4-取代芳基胺基表鬼臼毒素，4-氨基表鬼臼毒素的席夫碱，4-烷胺基表鬼臼毒素及其药学上可接受的衍生物（如，盐、酯、前体、水合物等）中的一种或多种混合物。

本发明所述的磷脂包括天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂或它们的混合物。

其中，天然磷脂包括蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂，或它们以任何比例组成的混合物；其中，半合成和合成磷脂包括但不限于氢化磷脂、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂、上述磷脂的聚乙二醇化衍生物（如聚乙二醇一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺）或它们的混合物。

本发明所述的白蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、猪血清白蛋白、半乳糖化白蛋白及其他种类白蛋白。其加入水相的浓度范围约为0.1-25%(w/v)，优选范围0.5-10%(w/v)。白蛋白因其良好的生物相容性和低免疫原性在本发明中作为优选，实际上只要在其结构内含有巯基或二硫键，可以在纳米粒周围形成二硫键交联外壳的天然或人工合成的聚合物，也可以应用于本发明，例如球蛋白、血红蛋白、脂蛋白、多核苷酸、多聚糖（淀粉，纤维素，透明质酸等）等的巯基衍生物。

本发明的目的之一，提供一种性质稳定且可采用现有技术工业化生产的鬼臼毒素类药物磷脂复合物白蛋白纳米粒的制备方法。

本发明将鬼臼毒素及其衍生物先制备成磷脂复合物，再包裹于白蛋白纳米粒中，既能消除现有制剂的过敏反应，降低此类抗肿瘤药物自身的毒性，又能显著改变药物分布，提高肝、脾、肺的靶向性，利于这些部位肿瘤的治疗。

本发明提供一种上述组合物的制备方法，其特征包括下述步骤：

(1)取鬼臼毒素类药物和磷脂，溶于脂溶性溶剂中（如选用鬼臼毒素类药物的盐酸盐，先用如碳酸氢钠等的碱性溶液中和盐酸，再和磷脂溶于脂溶性溶剂中），在温度约30℃～50℃下，搅拌反应，形成鬼臼毒素类药物磷脂复合物；

(2)减压浓缩除去脂溶性溶剂；

(3)用水不溶性有机溶剂溶解上述药理活性物质，作为油相；

(4)取适量白蛋白，溶解于适量水性溶剂中，作为水相；

(5)油相与水相混合，搅拌或超声形成乳浊液；

(6)将(5)所述的乳浊液用高压乳匀机、微射流均质机、超声处理器、高剪切混合器、高剪切搅拌器或类似设备制备成纳米乳剂；

(7)减压蒸发除去有机溶剂，即得鬼臼毒素类药物磷脂复合物白蛋白纳米粒混悬液。

本发明所述的药理活性物质即鬼臼毒素类抗肿瘤药物和磷脂形成的复合物优选溶解在一种合适的有机溶剂内，所述溶剂选自乙醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氧六环、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮或类似溶剂，以及2种或2种以上这些溶剂的混合物；所述溶剂也可选自大豆油、棉籽油、芝麻油、椰子油、橙油、橄榄油、红花油、苎烯油、聚乙二醇、C₁-C₂₀醇、C₂-C₂₀酯、C₃-C₂₀酮、脂肪烃、芳香烃、卤代烃及其混合物。

其中，步骤(1)所述的脂溶性溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、四氢呋喃等。

其中，步骤(3)所述的水不溶性有机溶剂选自乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正己烷、正庚烷等。

其中，步骤(4)所述的水性溶剂选自纯水、缓冲盐溶液或水与乙醇混合溶剂。

其中，步骤(7)所述的蒸发方法包括使用旋转蒸发器、降膜蒸发器、喷雾干燥器、冷冻干燥器和类似设备。

作为本发明的具体实施方案之一，本发明提供上述组合物的制备方法，其特征包括下述步骤：

(a)取鬼臼毒素类药物和磷脂，溶于脂溶性溶剂中（如选用鬼臼毒素类药物的盐酸盐，先用如碳酸氢钠等的碱性溶液中和盐酸再和磷脂溶于脂溶性溶剂中），在温度约30℃～50℃下，搅拌反应，形成鬼臼毒素类药物磷脂复合物，作为油相；

(b)取适量白蛋白，溶解于适量水性溶剂中，作为水相；

(c)油相与水相混合，搅拌或超声形成乳浊液；

(d)将(c)所述的乳浊液用高压乳匀机、微射流均质机、超声处理器、高剪切混合器、高剪切搅拌器或类似设备制备成纳米乳剂；

(e)减压蒸发除去有机溶剂，即得鬼臼毒素类药物磷脂复合物白蛋白纳米粒混悬液。

其中，步骤(a)所述的脂溶性溶剂选自水不溶性的乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正己烷、正庚烷等。

其中，步骤(b)所述的水性溶剂选自纯水、缓冲盐溶液或水与乙醇混合溶剂。

其中，步骤(e)所述的蒸发方法包括使用旋转蒸发器、降膜蒸发器、喷雾干燥器、冷冻干燥器和类似设备。

本发明所述的鬼臼毒素类药物磷脂复合物白蛋白纳米粒是在高压和高剪切力条件下经均化作用形成的。这种均化作用通常在高压乳匀机内进行，典型的操作压力在3,000至30,000Psi范围内，本发明优选的压力在5,000至15,000Psi范围。可接受的均化方法包括可赋予高剪切和空化作用：如高压乳匀机、微射流均质机、高剪切混合器、超声处理器和类似设备。

本发明的目的之一，提供一种鬼臼毒素类药物磷脂复合物白蛋白纳米粒固体制剂，该固体制剂是上述纳米粒加入冻干保护剂并采用冷冻干燥工艺制成的。

为延长上述纳米粒的存放时间，便于运输，可将本发明的纳米粒通过冷冻干燥工艺制成固体制剂；为防止干燥工艺中纳米粒聚集，保护其形态结构，需加入冻干保护剂及其他药学上可接受的辅料。

本发明所述的冻干保护剂包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、木糖醇，山梨醇、海藻糖、氨基酸、右旋糖酐中的一种或它们的混合物；其用量按纳米粒水溶液总重量计为100份总重量加入0~20份冻干保护剂，某些产品并不需要加入冻干保护剂也能获得其冻干粉针制剂；优选地其用量按纳米粒水溶液总重量计为100份总重量加入2~20份冻干保护剂。

本发明所述的其他辅料可为等渗调节剂、抗氧化剂、防腐剂、pH调节剂，电位调节剂等药剂学制备白蛋白纳米粒的常规赋形剂。

本发明所述的鬼臼毒素类药物磷脂复合物白蛋白纳米粒制剂给药途径包括静脉注射给药、肌肉或皮下注射给药，口服给药、体内局部给药、肺部吸入给药、黏膜吸收给药等。

而且，可以作为药物组合物或药物制剂的活性成分，加入药学上合适的辅料，制成片剂，缓释片剂，胶囊剂，栓剂，冻干粉针，注射剂，凝胶剂，乳剂，混悬剂等。

本发明的所述的鬼臼毒素类药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。

所述癌症选自恶性淋巴瘤、霍奇金氏病、急性淋巴细胞性白血病、空管膜瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、神经母细胞瘤和儿童的其它实体瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤等。

本发明所述的鬼臼毒素类药物组合物在降低药物毒性方面的应用。

所述药物毒性包括骨髓抑制毒性，胃肠道毒性，过敏反应等。

本发明的优点

1、鬼臼毒素类药物白蛋白纳米粒既具有明显的肝、肺靶向性，又降低了鬼臼毒素类药物的毒性，尤其是降低骨髓抑制。

、与鬼臼毒素类药物现有的市售制剂相比较，本发明中的组合物以无毒副作用的辅料磷脂、白蛋白等替代了原有制剂中的聚氧乙烯蓖麻油、乙醇等乳化剂和增溶剂，大大改善了现有制剂毒性、过敏性等方面的缺陷。

、所述制备方法灵活多样，均采用常规工艺设备，可工业规模、高效率生产，也可直接或二次加工制备注射或口服制剂。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明中替尼泊苷白蛋白纳米粒粒径分布图。

图2为本发明中替尼泊苷磷脂复合物的DSC分析结果比较。从上至下依次为替尼泊苷（图2-1）、磷脂（图2-2）、替尼泊苷磷脂复合物（图2-3）、替尼泊苷与磷脂物理混合物（图2-4）。

图3为本发明中替尼泊苷白蛋白纳米粒与替尼泊苷原药给药后大鼠骨髓抑制情况比较。

图4为小鼠黑色素瘤细胞B16对本发明中替尼泊苷白蛋白纳米粒与替尼泊苷原药的摄取情况比较。

图5为本发明中替尼泊苷白蛋白纳米粒与替尼泊苷原药给药后小鼠体内分布情况比较（图5-1至图5-3）。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1

取人血清白蛋白50mg，加入10ml注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取替尼泊苷10mg，加入50mg蛋黄卵磷脂E80溶于约10ml甲醇，40℃搅拌1～2小时，得浅黄色澄清溶液。旋蒸除去甲醇即得替尼泊苷磷脂复合物，用二氯甲烷1ml将其溶解，并与上述人血清白蛋白溶液混合，探头超声1min制成混悬液，然后将混悬液在高压乳匀机内乳匀5次，将其旋蒸以除去有机溶剂，得到纳米粒溶液，用激光粒度仪测得白蛋白纳米粒的粒径为138.3nm，PDI为0.127。其粒径分布图见图1。

实施例2

取人血清白蛋白200mg，加入10ml注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取依托泊苷10mg，加入50mg蛋黄卵磷脂E80溶于约10ml甲醇，40℃搅拌1～2小时，得浅黄色澄清溶液。旋蒸除去甲醇即得依托泊苷磷脂复合物，采用差示扫描量热法分别测得替尼泊苷、磷脂、依托泊苷磷脂复合物、依托泊苷与磷脂物理混合物的DSC图谱，见图2-1至图2-4所示。用氯仿1ml将依托泊苷磷脂复合物溶解，并与上述人血清白蛋白溶液混合，探头超声1min制成混悬液，然后将混悬液在高压乳匀器内乳匀10次，将其旋蒸以除去有机溶剂，得到纳米粒溶液，粒径为168.9nm，PDI为0.182。

实施例3

取人血清白蛋白400mg，加入10ml注射用水：乙醇=9:1的混合溶剂中溶解得人血清白蛋白溶液。取依托泊苷盐酸盐10mg，加入5mg/ml的NaHCO₃溶液100μl，加入200mg蛋黄卵磷脂E80溶于约10ml甲醇，40℃搅拌1～2小时，得浅黄色澄清溶液。旋蒸除去甲醇即得依托泊苷磷脂复合物，用二氯甲烷1ml将其溶解，并与上述人血清白蛋白溶液混合，探头超声1min制成混悬液，然后将混悬液在高压乳匀器内乳匀5次，将其旋蒸以除去有机溶剂，得到纳米粒溶液，粒径为201.8nm，PDI为0.225。

实施例4

取人血清白蛋白500mg，加入10ml注射用水，溶解得人血清白蛋白溶液。取鬼臼毒素10mg，加入300mg蛋黄卵磷脂E80，用1ml二氯甲烷，通过加热、超声将其溶解，并与上述人血清白蛋白溶液混合，探头超声5min（功率200-600W），将其旋蒸以除去有机溶剂，得到纳米粒溶液，粒径为172.2nm，PDI为0.191。

实施例5

取人血清白蛋白50mg，加入10ml注射用水，溶解得人血清白蛋白溶液。取替尼泊苷10mg，加入30mg大豆磷脂S100，用2ml二氯甲烷，通过加热、超声将其溶解，并与上述人血清白蛋白溶液混合，探头超声5min（功率200-600W），将其旋蒸以除去有机溶剂，得到纳米粒溶液，粒径为204.8nm，PDI为0.202。

实施例6

取牛血清白蛋白800mg，加入10ml注射用水，溶解得牛血清白蛋白溶液。取鬼臼毒素10mg，加入450mg大豆磷脂S100溶于约10ml甲醇，40℃搅拌1～2小时，得浅黄色澄清溶液。旋蒸除去甲醇即得鬼臼毒素磷脂复合物，用二氯甲烷2ml将其溶解，并与上述牛血清白蛋白溶液混合，探头超声1min制成混悬液，然后将混悬液在高压乳匀器内乳匀10次，将其旋蒸以除去有机溶剂，得到纳米粒溶液，粒径为185.1nm，PDI为0.154。

实施例7

取牛血清白蛋白150mg，加入10ml注射用水，溶解得牛血清白蛋白溶液。取依托泊苷20mg，加入100mg大豆磷脂S100，用1ml二氯甲烷，通过加热、超声将其溶解，并与上述牛血清白蛋白溶液混合，探头超声5min（功率200-600W），将其旋蒸以除去有机溶剂，得到纳米粒溶液，粒径为234.8nm，PDI为0.189。

实施例8

取人血清白蛋白100mg，加入10ml注射用水，溶解得人血清白蛋白溶液。取替尼泊苷10mg，加入50mg氢化大豆磷脂，用1ml二氯甲烷，通过加热、超声将其溶解，并与上述人血清白蛋白溶液混合，探头超声5min（功率200-600W），将其旋蒸以除去有机溶剂，加入冻干保护剂配制成含5%葡萄糖的纳米粒水溶液，在无菌条件下冷冻并冻干24小时，得疏松块状冻干品。取适量加水复溶，得到纳米粒溶液，粒径为178.0nm，PDI为0.169。

实施例9

取人血清白蛋白150mg，加入10ml pH7.4的醋酸盐缓冲液溶解得人血清白蛋白溶液。取依托泊苷盐酸盐10mg，加入5mg/ml的NaHCO₃溶液100ul，加入50mg蛋黄卵磷脂E80溶于约10ml甲醇，40℃搅拌1～2小时，得浅黄色澄清溶液。旋蒸除去甲醇即得依托泊苷磷脂复合物，用二氯甲烷1ml将其溶解，并与上述人血清白蛋白溶液混合，探头超声1min制成混悬液，然后将混悬液在高压乳匀器内乳匀10次，将其旋蒸以除去有机溶剂，加入冻干保护剂配制成含15%蔗糖的纳米粒水溶液，在无菌条件下冷冻并冻干24小时，得疏松块状物。取适量，加水复溶，得到纳米粒溶液，粒径为166.0nm，PDI为0.148。

实施例10

取牛血清白蛋白150mg，加入10mlpH7.4的醋酸盐缓冲液溶解得牛血清白蛋白溶液。取鬼臼毒素10mg，加入50mg大豆磷脂S100，用1ml二氯甲烷，通过加热、超声将其溶解，并与上述牛血清白蛋白溶液混合，探头超声5min（功率200-600W），将其旋蒸以除去有机溶剂，加入冻干保护剂配制成含10%葡萄糖的纳米粒水溶液，加入0.2ml油酸钠溶液（5-10mg/ml）作为电位调节剂，在无菌条件下冷冻并冻干24小时，得疏松块状冻干品。取适量加水复溶，得到纳米粒溶液，粒径为200.5nm，PDI为0.177。

实施例11

取人血清白蛋白100mg，加入10ml注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取替尼泊苷10mg，加入100mg蛋黄卵磷脂E80溶于约10ml甲醇，40℃搅拌1小时，得浅黄色澄清溶液。旋蒸除去甲醇即得替尼泊苷磷脂复合物，用二氯甲烷1ml将其溶解，并与上述人血清白蛋白溶液混合，探头超声1min制成混悬液，然后将混悬液在高压乳匀机内乳匀5次，将其旋蒸以除去有机溶剂，得到纳米粒溶液，加入1.0g海藻糖作为冻干保护剂，-30℃冷冻干燥48小时，得疏松块状冻干品。取适量加水复溶，测得粒径为178.5nm，PDI为0.189。

实施例12替尼泊苷白蛋白纳米粒骨髓抑制毒性实验

药品：按“实施例1”制备的制剂与按市售替尼泊苷注射液处方（含大量Cremophor EL）配置的原药溶液。

动物：雄性Wista大鼠，体重170-180g，随机分为2组（制剂组和原药组），每组12只。

在给药前先将所有大鼠眼眶取血约0.5ml，全血置于 EDTA-2K真空采血管内，轻微晃动，用血细胞分析仪测定血常规。取血后，原药组和制剂组大鼠分别按 10 mg/kg 的剂量尾静脉注射替尼泊苷原药溶液和替尼泊苷白蛋白纳米粒制剂；并于注射后第三天取血，与给药前相同方法测定血常规。

以白细胞计数为标准考察骨髓抑制情况，从图3可以看出：给药后制剂组的白细胞数约下降17%，原药组白细胞数下降54%。本发明制备的白蛋白纳米粒与原药相比明显降低了鬼臼毒素类药物（替尼泊苷）的毒性。

实施例13  细胞摄取实验

药品：按“实施例1”制备的制剂与按市售替尼泊苷注射液处方（含大量Cremophor EL）配置的原药溶液。

实验分为2组：原药组、制剂组。用无血无抗的DMEM高糖培养基将上述2组溶液稀释至0.1mg/ml，给药前均用0.22 μm的无菌滤头过滤除菌。每个实验组设0.5、1、2、4、6 h ，5个时间点，每点3个复孔。

取正常生长的B16细胞，胰酶消化，培养基稀释至适宜浓度，按每孔约1x10⁶个细胞（2ml）接种于6孔板内，37℃恒温，5 % CO₂饱和湿度条件下培养24 h后给药。药物与细胞共培养一定时间后吸出含药培养基，每孔加少量生理盐水，-80℃/37℃反复冻融使细胞破裂，孔内液体一部分用于HPLC检测药物浓度，另一部分用BCA试剂盒测定蛋白含量。以每mg蛋白中所含药物量表征细胞对药物的摄取情况。

从图4可以看出，肿瘤细胞对纳米粒制剂的摄取量远高于原药，制剂的透膜能力显著增强。正是磷脂复合物与白蛋白纳米粒双重优势的体现。

实施例14替尼泊苷白蛋白纳米粒体内分布实验

药品：按“实施例1”制备的制剂与按市售替尼泊苷注射液处方（含大量Cremophor EL）配置的原药溶液。

雄性昆明小鼠30只（体重30g左右），随机分成2组，每组15只。实验前禁食一夜（>12h），自由饮水，分别尾静脉注射给予替尼泊苷原药溶液和纳米粒制剂，给药剂量15mg/kg。分别在给药后15min，1h，4h处死（每个时间点5只），取心，肝，脾，肺，肾，血。脏器用生理盐水洗净，滤纸吸干水分后，置于-4℃冻存。按2ml/g比例加生理盐水匀浆，取匀浆液150μl，加入15μl内标溶液（20.4μg/ml依托泊苷），加入乙醚1ml，涡旋10min（萃取），5500rpm离心5min，分离上清液（乙醚层），吹干，残留物用150μL流动相复溶，HPLC测定，记录主药峰面积A，内标峰面积Ai。

从图5可以看出，与原药相比，本发明制备的纳米粒具有明显的肝、脾、肺部靶向性。

与此相对应，Jing Zhou等采用类似方法制备的吡柔比星白蛋白纳米粒（Novel Lipid Hybrid Albumin Nanoparticle Greatly Lowered Toxicity of Pirarubicin，Mol. Pharmaceutics 2013, 10：3832?3841）静脉注射后的体内分布，与吡柔比星普通注射液相比，在肝、脾的药物浓度相差不多，在肺中明显减少。然而，本发明的鬼臼毒素白蛋白纳米粒的肝、脾、肺部靶向性完全不同。

Claims (10)

1.一种含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒，其中包含鬼臼毒素类药物与磷脂形成的复合物及白蛋白，基于重量份计，鬼臼毒素类药物1份、磷脂1~50份，白蛋白2~100份；优选地，鬼臼毒素类药物1份、磷脂2~10份、白蛋白5~50份。

2.根据权利要求1所述的含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒，其特征在于所述磷脂选自天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂或它们的混合物。

3.根据权利要求1所述的含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒，其特征在于所述白蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、猪血清白蛋白、半乳糖化白蛋白及其他种类白蛋白。

4.一种根据权利要求1含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒的冻干制剂，其特征在于包含冻干保护剂；冻干保护剂用量按纳米粒水溶液总重量计为100份总重量加入0-20份冻干保护剂；优选地2-20份冻干保护剂。

5.一种根据权利要求1含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒的药物制剂，其特征在于包含鬼臼毒素类药物及其衍生物、白蛋白、冻干保护剂，其他药学上可接受的辅料适量。

6.一种制备权利要求1的含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒的方法，其特征包括下述步骤：

(1)取鬼臼毒素类药物和磷脂，溶于脂溶性溶剂中，（如是鬼臼毒素类药物的盐酸盐，先用如碳酸氢钠等的碱性溶液中和盐酸再和磷脂溶于脂溶性溶剂中），在温度约30℃～50℃，搅拌反应约0.1～2小时；

(2)减压浓缩除去脂溶性溶剂；或者不除去脂溶性溶剂，直接作为步骤(3)中的水不溶性有机溶剂使用，直接跳到第(4)步；

(3)用适当的水不溶性有机溶剂溶解上述药理活性物质，作为油相；

(4)取适量白蛋白，溶解于适量的水性溶剂中，作为水相；

(5)油相与水相混合，搅拌或超声形成乳浊液；

(6)将(5)所述的乳浊液用高压乳匀机、微射流均质机、高剪切混合器、高剪切搅拌器、超声处理器或类似设备制备成纳米乳剂；

(7)减压蒸发除去有机溶剂，即得。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于步骤（7）的产品中可加入冷冻干燥赋形剂和/或其他赋形剂/辅料，制成冻干粉末。

8.权利要求1的所述的含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒在制备治疗癌症药物中的应用。

9.权利要求1的所述的含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒在制备降低药物毒性的药物中的应用。

10.权利要求1的所述的含鬼臼毒素类药物的磷脂复合物白蛋白纳米粒在制备具有肝肺靶向性的药物中的应用。