CN112386586A - 一种白蛋白纳米粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种白蛋白纳米粒的制备方法。本发明通过制备药物有机溶液和白蛋白水溶液，将药物有机溶液和白蛋白水溶液按一定流速通过微流控装置生成白蛋白纳米粒。将生成的白蛋白纳米粒孵育，孵育后加入到保护剂溶液中，并立即置于冰水浴中静置，静置后通过超滤离心法，去除未包封的药物和有机溶剂，得到白蛋白纳米粒溶液。最后通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到白蛋白纳米粒。本发明的制备方法简单快速，可以有效解决白蛋白纳米粒制备繁琐、粒径不均一且包封率低的问题。本发明微流孔道在50‑500微米，长度在0.5‑10厘米，极大的提高的流体的流速，且不易堵塞流道，制备的白蛋白纳米粒的粒粒径均一，包封率良好，重现性好，生产效率高。

Description

一种白蛋白纳米粒的制备方法
技术领域
本发明涉及药物制剂技术领域，尤其涉及一种白蛋白纳米粒的制备方法。
背景技术
紫杉烷类抗肿瘤药物是从红豆杉树皮中提取得到的天然化合物紫杉醇，具有独特的多烯抗癌机理，且具有广谱的抗癌活性，对于卵巢癌、乳腺癌、食管癌及其他癌症均有良好的药效。多西他赛是从欧洲红豆杉中提取的前体化合物经半合成得到的，分子式为C43H53NO14，分子量为861.9，白色晶体粉末。与紫杉醇相比，多西他赛虽紫杉醇同属于第一代紫杉烷类药物，但临床药理研究表明，多西他赛的抗肿瘤活性强于紫杉醇，并和紫杉醇没有交叉耐药性。因此，多西他赛白蛋白纳米粒的研究近年来也研究的比较深入。
尽管多西他赛具有良好的抗肿瘤活性，但其在水溶液中的溶解度极小，几乎不溶，但在有机溶剂中可溶，如甲醇、乙醇、氯仿等。由于其在水溶液中无法溶解，使得其在研发过程中举步维艰，为了使其能在静脉注射中溶解，只能选择在注射剂中加入表面活性剂氧乙烯蓖麻油。该方法虽然可以使多西他赛的溶解度提高，但聚氧乙烯蓖麻油的引入，会引起多种不良反应，其中包括严重的呼吸困难、皮肤过敏、心动过速、低血压和严重的肝肾毒性等，因此在病人给药前必须预先进行抗过敏处理，但并不能完全杜绝过敏反应的发生，给患者造成巨大的痛苦。
铂类抗癌药物的抗癌作用原理与传统的抗癌药不同，通过大量的研究和试验，初步确定铂类抗癌药物的抗癌机制可分为四个步骤：跨膜转运、水合解离、靶向迁移、作用于DNA，引起DNA复制障碍，从而抑制癌细胞的分裂。但铂类药物一般只能在氯仿或二氯甲烷中溶解，在水或者乙腈等溶液中几乎不溶，极低的水溶性使其难以制备成常规注射剂。
吉西他滨，为一种新的胞嘧啶核苷衍生物，进入人体后经脱氧胞嘧啶激酶活化由胞嘧啶核苷脱氨酶代谢为相应的单磷酸酯、双磷酸酯和三磷酸酯而发挥药效。目前，临床上使用的吉西他滨制剂均为盐酸吉西他滨冻干粉，临床实践显示，该剂型存在严重的缺点，如代谢快，血浆半衰期短，肿瘤靶向性差等缺点，因此在用药时剂量需增大，导致毒副作用变大。
替尼类抗肿瘤药物是一类新型生物靶向治疗肿瘤药物，目前在我国市场上常见的替尼类抗肿瘤药物包括：吉非替尼，伊马替尼，甲磺酸伊马替尼，尼罗替尼，舒尼替尼，拉帕替尼。虽然替尼类药物在抗肿瘤方面有着诸多优势，但替尼类药物大多难溶于水，口服生物度利用低，且副反应严重，如安罗替尼，服用过程中很容易引起高血压或出血等副作用，降低了患者服用的顺应性。
纳米粒是粒径在1-1000nm范围内的固态胶体颗粒，作为药物载体具有以下优点：保护药物不被降解，促进药物吸收，可以优化药物代谢动力学改善药物在组织中的分布，促进细胞内渗透与分布，在生理条件下具有较好的稳定性，对生理压力具有较好的承受能力等。由于实体瘤的高通性和滞留效应的存在，纳米粒具有较好的肿瘤和炎症组织富集的特性。而在制备纳米粒的材料中，白蛋白是一种血浆中含量最多的蛋白，其生物相容性较好，无毒，体内代谢不会产生有害物质，无抗原性，易于纯化且水溶性较好，可以通过静脉注射给药。由于白蛋白具有多种药物结合位点，白蛋白纳米粒可以包载各种药物，并且其结构域上含有疏水域，可以较好地包载疏水性药物。常见的白蛋白制备方法有去溶剂化法、乳化溶剂蒸发法、相分离法、喷雾干燥法和自组装法等。如CN201910752297.X专利使用膜挤出器，将高压均质后的白蛋白与紫杉醇的纳米乳通过50～220nm孔径的滤膜，挤出纳米乳整粒，然后再蒸发除去溶剂。但传统工艺依然存在一些缺点，如批次之间重现性差、粒径分布不均一、不同性质药物的包埋能力存在差异、制备过程繁琐等。CN201810338298.5专利采用去溶剂化法，将卡巴他赛和白蛋白混合后，加入交联剂戊二醛过夜搅拌得到卡巴他赛白蛋白纳米粒，其缺点实残余的戊二醛等交联剂对生物体有一定的毒副作用。
微流控装置是利用纳米级流体的剧烈混合，可以生产从毫升甚至到几升的纳米粒产品。由于其巨大的潜力，微流控装置已成为开发具有明确物理化学特性和可重复性的药物释放系统的先进方法。但是课题组在前期采用微流控装置制备白蛋白微球过程中，发现极易出现堵塞的问题，且无法满足清洁验证的要求，对大规模制备药物带来极大的不便。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种通过微流控装置制备白蛋白纳米粒的方法，其制备方法简单快速，可以有效解决白蛋白纳米粒制备繁琐、粒径不均一且包封率低的问题。本发明微流孔道在50-500微米，长度在0.5-10厘米，极大的提高的流体的流速，且不易堵塞流道，制备的白蛋白纳米粒的粒粒径均一，包封率良好，重现性好，生产效率高。
本发明的第一个目的是提供了一种白蛋白纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备药物有机溶液，将药物有机溶液置于60～70℃预热；
S2、制备白蛋白水溶液，将白蛋白水溶液置于60～70℃预热；
S3、将S1步骤的药物有机溶液和S2步骤的白蛋白水溶液分别经平流泵的油相和水相泵入微流控装置，得到含有白蛋白纳米粒的溶液，将含有白蛋白纳米粒的溶液在60～70℃孵育3～10min；
S4、将S3孵育后的溶液在搅拌下加入到保护剂溶液中，并置于0～4℃静置5～10min；
S5、将S4步骤静置后的溶液超滤离心，去除未包封的药物和溶剂，超滤离心后干燥得到所述的白蛋白纳米粒。
进一步地，所述的药物为紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、阿霉素、表阿霉素、铂及铂的类似物、吉西他滨、依马替尼或其它替尼类药物。
进一步地，所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇、甘油、二甲基亚砜和聚乙二醇中的一种或几种。
进一步地，所述的药物有机溶液中药物的质量浓度为1～10mg/mL。
进一步地，所述的白蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵白蛋白、重组人血清白蛋白中的一种或多种。
进一步地，所述的白蛋白水溶液通过将白蛋白溶解在缓冲溶液中制备。
进一步地，所述的缓冲溶液为Tris、PBS或12％磷酸二氢钠。
进一步地，所述的白蛋白水溶液中白蛋白的质量浓度为5～45mg/mL。
进一步地，在S3步骤中，油相和水相的流速为1～50mL/min。
进一步地，所述的油相和水相的体积比为1:1～1:10。
进一步地，所述的保护剂为葡萄糖酸钠、甘露醇、蔗糖、酒石酸钠、辛酸钠、乙酰色氨酸钠中的一种或几种。
进一步地，所述的保护剂溶液的浓度为1～100mM。
进一步地，所述的含有白蛋白纳米粒的溶液与保护剂溶液的体积比为1:8～1:10。
进一步地，所述的微流控装置的微孔通道的孔径为50～500μm，长度为0.5～10cm。
进一步地，所述的干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明的制备方法简单快速，可以有效解决白蛋白纳米粒制备繁琐、粒径不均一且包封率低的问题。本发明微流孔道在50-500微米，长度在0.5-10厘米，极大的提高的流体的流速，且不易堵塞流道，制备的白蛋白纳米粒的粒粒径均一，包封率良好，重现性好，生产效率高。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1是实施例13的粒径分布图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
称取多西他赛50mg溶解在10mL的乙醇溶液中，制备成5mg/mL的多西他赛药物有机溶液。称取450mg的牛血清白蛋白溶解在50mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为9mg/mL的白蛋白水溶液。将多西他赛药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。预热结束后，将10mL多西他赛有机溶液加入50mL的白蛋白水溶液中，将生成的白蛋白纳米粒溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入500mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到多西他赛白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到多西他赛白蛋白纳米粒。
实施例2
称取多西他赛50mg溶解在10mL的乙醇溶液中，制备成5mg/mL的多西他赛药物有机溶液。称取450mg的牛血清白蛋白溶解在20mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将多西他赛药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。预热结束后，将10mL多西他赛有机溶液加入20mL的白蛋白水溶液中，将生成的白蛋白纳米粒溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到多西他赛白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到多西他赛白蛋白纳米粒。
实施例3
称取多西他赛50mg溶解在10mL的乙醇溶液中，制备成5mg/mL的多西他赛药物有机溶液。称取450mg的牛血清白蛋白溶解在10mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为45mg/mL的白蛋白水溶液。将多西他赛药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。预热结束后，将10mL多西他赛有机溶液加入10mL的白蛋白水溶液中，将生成的白蛋白纳米粒溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入200mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到多西他赛白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到多西他赛白蛋白纳米粒。
实施例4
称取多西他赛50mg溶解在10mL的乙醇溶液中，制备成5mg/mL的多西他赛药物有机溶液。称取450mg的牛血清白蛋白溶解在20mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将多西他赛药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于60℃恒温水浴锅中预热5min。预热结束后，将10mL多西他赛有机溶液加入20mL的白蛋白水溶液中，将生成的白蛋白纳米粒溶液置于60℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到多西他赛白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到多西他赛白蛋白纳米粒。
实施例5
称取多西他赛50mg溶解在10mL的乙醇溶液中，制备成5mg/mL的多西他赛药物有机溶液。称取450mg的牛血清白蛋白溶解在20mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将多西他赛药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于70℃恒温水浴锅中预热5min。预热结束后，将10mL多西他赛有机溶液加入20mL的白蛋白水溶液中，将生成的白蛋白纳米粒溶液置于70℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到多西他赛白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到多西他赛白蛋白纳米粒。
实施例6
称取多西他赛50mg溶解在10mL的乙醇溶液中，制备成5mg/mL的多西他赛药物有机溶液。称取450mg的牛血清白蛋白溶解在20mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将多西他赛药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。预热结束后，将10mL多西他赛有机溶液加入20mL的白蛋白水溶液中，将生成的白蛋白纳米粒溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育10min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到多西他赛白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到多西他赛白蛋白纳米粒。
实施例7
称取多西他赛50mg溶解在10mL的乙醇溶液中，制备成5mg/mL的多西他赛药物有机溶液。称取450mg的牛血清白蛋白溶解在20mL的PBS溶液中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将多西他赛药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。预热结束后，将10mL多西他赛有机溶液加入20mL的白蛋白水溶液中，将生成的白蛋白纳米粒溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到多西他赛白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到多西他赛白蛋白纳米粒。
实施例8
称取多西他赛50mg溶解在10mL的乙醇溶液中，制备成5mg/mL的多西他赛药物有机溶液。称取450mg的牛血清白蛋白溶解在20mL的12％磷酸氢二钠溶液中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将多西他赛药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。预热结束后，将10mL多西他赛有机溶液加入20mL的白蛋白水溶液中，将生成的白蛋白纳米粒溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到多西他赛白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到多西他赛白蛋白纳米粒。
实施例9
称取多西他赛50mg溶解在10mL的乙醇溶液中，制备成5mg/mL的多西他赛药物有机溶液。称取450mg的人血清白蛋白溶解在20mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将多西他赛药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。预热结束后，将10mL多西他赛有机溶液加入20mL的白蛋白水溶液中，将生成的白蛋白纳米粒溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到多西他赛白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到多西他赛白蛋白纳米粒。
本发明中实施例1～9通过直接将有机相以滴加方式加入到水相中，用于考察白蛋白纳米粒形成的条件参数，但这种传统方式分散速度和程度不可控，制备重现性较差，不利于大规模生产使用。
1～9实施例处方对比表
Figure BDA0002810162960000071
实施例10
称取多西他赛50mg溶解在10mL的乙醇溶液中，制备成5mg/mL的多西他赛药物有机溶液。称取450mg的牛血清白蛋白溶解在20mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将多西他赛药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。设置平流泵油相流速为1mL/min，水相流速为2mL/min，将多西他赛有机溶液和白蛋白水溶液经平流泵的油相和水相按设定流速通过微流控装置生成白蛋白纳米粒。将该溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到多西他赛白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到多西他赛白蛋白纳米粒。
实施例11
称取多西他赛50mg溶解在10mL的乙醇溶液中，制备成5mg/mL的多西他赛药物有机溶液。称取450mg的牛血清白蛋白溶解在20mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将多西他赛药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。设置平流泵油相流速为2mL/min，水相流速为4mL/min，将多西他赛有机溶液和白蛋白水溶液经平流泵的油相和水相按设定流速通过微流控装置生成白蛋白纳米粒。将该溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到多西他赛白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到多西他赛白蛋白纳米粒。
实施例12
称取多西他赛50mg溶解在10mL的乙醇溶液中，制备成5mg/mL的多西他赛药物有机溶液。称取450mg的人血清白蛋白溶解在20mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将多西他赛药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。设置平流泵油相流速为4mL/min，水相流速为8mL/min，将多西他赛有机溶液和白蛋白水溶液经微流控装置生成白蛋白纳米粒。将该溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到多西他赛白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到多西他赛白蛋白纳米粒。
实施例13
称取吉西他滨50mg溶解在10mL的二甲基亚砜溶液中，制备成5mg/mL的吉西他滨药物有机溶液。称取450mg的人血清白蛋白溶解在20mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将吉西他滨药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。设置平流泵油相流速为2mL/min，水相流速为4mL/min，将吉西他滨有机溶液和白蛋白水溶液经微流控装置生成白蛋白纳米粒。将该溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到吉西他滨蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到吉西他滨白蛋白纳米粒。
实施例14
称取达沙替尼50mg溶解在20mL的二氯甲烷溶液中，制备成5mg/mL的达沙替尼有机溶液。称取450mg的牛血清白蛋白溶解在20mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将达沙替尼药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。设置平流泵油相流速为4mL/min，水相流速为4mL/min，将达沙替尼有机溶液和白蛋白水溶液经微流控装置生成白蛋白纳米粒。将该溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到达沙替尼白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到达沙替尼白蛋白纳米粒。
实施例15
称取卡铂50mg溶解在10mL的三氯甲烷溶液中，制备成5mg/mL的卡铂有机溶液。称取450mg的人血清白蛋白溶解在20mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将卡铂药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。设置平流泵油相流速为2mL/min，水相流速为4mL/min，将卡铂有机溶液和白蛋白水溶液经微流控装置生成白蛋白纳米粒。将该溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到卡铂白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到卡铂白蛋白纳米粒。
实施例16
称取阿霉素50mg溶解在50mL的三氯甲烷溶液中，制备成5mg/mL的阿霉素有机溶液。称取450mg的人血清白蛋白溶解在20mL的20mM Tris buffer中，制备体积质量浓度为22.5mg/mL的白蛋白水溶液。将达沙替尼药物有机溶液和白蛋白水溶液放置于65℃恒温水浴锅中预热5min。设置平流泵油相流速为5mL/min，水相流速为2mL/min，将阿霉素有机溶液和白蛋白水溶液经微流控装置生成白蛋白纳米粒。将该溶液置于65℃恒温水浴锅中，孵育3min后在200rpm/min搅拌下全部加入300mL的50mM葡萄糖酸钠溶液中。随后立刻将溶液置于冰水浴中静置5min。通过超滤离心法，去除未包封的药物，得到阿霉素白蛋白纳米粒溶液，再通过冷冻干燥、喷雾干燥的方法进行脱水处理，得到阿霉素白蛋白纳米粒。
10～16实施例处方对比表
Figure BDA0002810162960000091
实施例17
采用Zetasizer Nano电位/粒度测量仪测定纳米粒粒径及其分布。测定实施例1～16得到的白蛋白纳米粒用蒸馏水稀释，取三次测量值得平均值最为最终粒径和电位测量结果。具体结果如下：
实施例 粒径(平均值nm)
1 158.3
2 111.5
3 233.5
4 129.3
5 39.4
6 171.8
7 115.6
8 126.6
9 118.6
10 140.0
11 113.8
12 82.6
13 115.8
14 120.4
15 126.5
16 140.5
实施例1～3考察了白蛋白的浓度对于白蛋白纳米粒形成的影响。结果表明，采用不同浓度的牛血清白蛋白作为载体，测得的白蛋白纳米粒粒径并不相同，浓度过大或者过小都会造成纳米粒粒径偏大。实验结果表明牛血清白蛋白浓度在22.5mg/mL的情况下，粒径可控制在120nm左右，平均粒径为111.5nm。
实施例4和实施例5考察了白蛋白和多西他赛的孵育温度对白蛋白纳米粒形成的影响，实验结果表明，孵育温度在60～65℃的情况下粒径可控制在120nm左右，若提高温度至70℃，粒径为39.4nm，未形成完整的白蛋白纳米粒。温度显著影响白蛋白纳米粒成型和粒径大小。
实施例6考察了形成白蛋白纳米粒后的孵育时间对白蛋白纳米粒形成的影响，延长孵育时间至10min。实验结果表明，白蛋白纳米粒的粒径为171.8nm，粒径明显增大。孵育时间显著影响白蛋白纳米粒成型和粒径大小。
实施例2、实施例7和实施例8考察了溶液类型对白蛋白纳米粒形成的影响，分别将白蛋白溶解在Tris、PBS和12％磷酸氢二钠溶液中。实验结果表明当白蛋白溶解在Tris溶液中，白蛋白纳米粒的粒径为111.5nm，当白蛋白溶解在PBS中，白蛋白纳米粒的粒径为115.6nm，当白蛋白溶解在12％磷酸氢二钠溶液中，白蛋白纳米粒的粒径为126.6nm，粒径稍稍偏大，可结合包封率查看其对白蛋白纳米粒形成的影响。
实施例9考察了白蛋白的种类对白蛋白纳米粒形成的影响，采用人血清白蛋白制备白蛋白纳米粒。实验结果表明当使用人血清白蛋白作为包裹药物的材料，形成的白蛋白纳米粒的粒径为118.6nm，粒径与牛血清白蛋白作为包裹材料制备的白蛋白纳米粒粒径结果基本一致。
实施例10～12考察了微流控装置制备白蛋白纳米粒时，水相和油相的流速对于白蛋白纳米粒形成的影响。实验结果表明当平流泵的油相和水相的流速越大，白蛋白纳米粒的粒径越小。当油相流速设置为1mL/min，水相流速设置为2mL/min，白蛋白纳米粒的粒径为140nm，当油相流速设置为2mL/min，水相流速设置为4mL/min，白蛋白纳米粒的粒径为113.8nm，当油相流速设置为4mL/min，水相流速设置为8mL/min，白蛋白纳米粒的粒径为82.6nm。
实施例13考察了吉西他滨作为药物，牛血清白蛋白作为包裹材料制备白蛋白纳米粒，所得纳米粒平均粒径为115.8nm。
实施例14考察了达沙替尼作为药物，牛血清白蛋白作为包裹材料制备白蛋白纳米粒，所得纳米粒平均粒径为120.4nm。
实施例15考察了卡铂作为药物，牛血清白蛋白作为包裹材料制备白蛋白纳米粒，所得纳米粒平均粒径为126.5nm。
实施例16考察了阿霉素作为药物，牛血清白蛋白作为包裹材料制备白蛋白纳米粒，所得白蛋白纳米粒平均粒径为140.5nm。
实施例18
将制备好的白蛋白纳米粒转入截留分子量为30kDa的超滤离心管中，3500×g离心15min，得到白蛋白纳米粒的浓缩液和下槽滤液。取1mL白蛋白纳米粒的浓缩液，加入1mL的乙腈破乳，超声15min后通过12000g离心15min，取上清经过0.22μm的滤膜过滤，通过高效液相色谱进行含量分析，HPLC流速以1mL/min注入C18柱(4.6毫米×250毫米，5μm，安捷伦)，以乙腈/水(60/40，v/v)为流动相，用紫外检测器检测230nm处的药物吸收峰。得到药物总浓度。下槽滤液同样经过0.22μm的滤膜过滤，通过HPLC进行含量分析，通过计算得到游离药物浓度，计算包封率。
按下式计算包封率:包封率(％)＝(药物总浓度-游离药物浓度)/药物总浓度×100％
采用实施例18中高效液相色谱法测定实施例1～16白蛋白纳米粒的包封率，结果如下。
实施例 包封率
1 66.42
2 76.81
3 71.93
4 71.78
5 62.46
6 87.90
7 73.54
8 72.71
9 79.22
10 87.62
11 86.51
12 79.80
13 65.82
14 72.53
15 65.33
16 68.12
实施例1～3考察了白蛋白的浓度对于白蛋白纳米粒形成的影响。根据实施例1～3的实验结果，采用不同浓度的牛血清白蛋白作为载体，实验结果表明牛血清白蛋白浓度对白蛋白包封率的影响比较显著，白蛋白浓度过大或者过小都会影响包封率，白蛋白浓度为22.5mg/mL时包封率最高，可达到76.81％。
实施例4和实施例5考察了白蛋白和多西他赛的孵育温度对白蛋白纳米粒形成的影响，实验结果表明，孵育温度对包封率的影响比较显著。当孵育温度60℃时，包封率达到71.78％，当孵育温度65℃时，包封率达到76.81％，当孵育温度70℃时，包封率达到62.46％。因此，孵育温度选择65℃为最佳条件。
实施例6考察了形成白蛋白纳米粒后的孵育时间对白蛋白纳米粒形成的影响，延长孵育时间至10min。实验结果表明，白蛋白纳米粒的包封率高达87.90％。但结合白蛋白纳米粒的粒径测量结果，粒径171.8nm，孵育时间延长虽然提高包封率但粒径明显增大，因此孵育温度10min过长。
实施例2、实施例7和实施例8考察了白蛋白的溶液类型对白蛋白纳米粒形成的影响，分别将白蛋白溶解在Tris、PBS和12％磷酸氢二钠溶液中。实验结果表明当白蛋白溶解在Tris溶液中，白蛋白纳米粒的包封率76.81％，当白蛋白溶解在PBS中，白蛋白纳米粒的包封率73.54％，当白蛋白溶解在12％磷酸氢二钠溶液中，白蛋白纳米粒的包封率72.71％。因此白蛋白溶解在Tris溶液中，包封率最高。
实施例9考察了白蛋白的种类对白蛋白纳米粒形成的影响，采用人血清白蛋白制备白蛋白纳米粒。实验结果表明当使用人血清白蛋白作为包裹药物的材料，形成的白蛋白纳米粒的包封率79.22％。
实施例10～12考察了微流控装置制备白蛋白纳米粒时，水相和油相的流速对于白蛋白纳米粒形成的影响。实验结果表明当平流泵的油相和水相的流速越大，白蛋白纳米粒的包封率越小。当油相流速设置为1mL/min，水相流速设置为2mL/min，白蛋白纳米粒的包封率高达87.62％，当油相流速设置为2mL/min，水相流速设置为4mL/min，白蛋白纳米粒的包封率86.51％，当油相流速设置为4mL/min，水相流速设置为8mL/min，白蛋白纳米粒的包封率为79.80％。与实施例2制备的白蛋白纳米粒包封率相比，实施例13中的包封率提高9.7％，结果表明微流控装置有助于提高白蛋白纳米粒的包封率。
实施例13考察了吉西他滨作为药物，牛血清白蛋白作为包裹材料制备白蛋白纳米粒，实验结果测得吉西他滨白蛋白纳米粒的包封率为65.82％。
实施例14考察了达沙替尼作为药物，牛血清白蛋白作为包裹材料制备白蛋白纳米粒，实验结果测得达沙替尼白蛋白纳米粒的包封率为72.53％。
实施例15考察了卡铂作为药物，牛血清白蛋白作为包裹材料制备白蛋白纳米粒，实验结果测得卡铂白蛋白纳米粒的包封率为65.33％。
实施例16考察了阿霉素作为药物，牛血清白蛋白作为包裹材料制备白蛋白纳米粒，实验结果测得阿霉素白蛋白纳米粒的包封率为68.12％。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备药物有机溶液，将药物有机溶液置于60～70℃预热；
S2、制备白蛋白水溶液，将白蛋白水溶液置于60～70℃预热；
S3、将S1步骤的药物有机溶液和S2步骤的白蛋白水溶液分别经平流泵的油相和水相泵入微流控装置，得到含有白蛋白纳米粒的溶液，将含有白蛋白纳米粒的溶液在60～70℃孵育3～10min；
S4、将S3孵育后的溶液在搅拌下加入到保护剂溶液中，并置于0～4℃静置5～10min；
S5、将S4步骤静置后的溶液超滤离心，去除未包封的药物和溶剂，超滤离心后干燥得到所述的白蛋白纳米粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的药物为紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、阿霉素、表阿霉素、铂及铂的类似物、吉西他滨、依马替尼或其它替尼类药物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇、甘油、二甲基亚砜和聚乙二醇中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的药物有机溶液中药物的质量浓度为1～10mg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的白蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵白蛋白、重组人血清白蛋白中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的白蛋白水溶液中白蛋白的质量浓度为5～45mg/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S3步骤中，油相和水相的流速为1～50mL/min；油相和水相的体积比为1:1～1:10。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的保护剂为葡萄糖酸钠、甘露醇、蔗糖、酒石酸钠、辛酸钠、乙酰色氨酸钠中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的保护剂溶液的浓度为1～100mM；且含有白蛋白纳米粒的溶液与保护剂溶液的体积比为1:8～1:10。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微流控装置的微孔通道的孔径为50～500μm，长度为0.5～10cm。
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