CN104840432A - 一种紫杉烷类长循环纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种长循环紫杉烷类抗肿瘤药物的聚乙二醇化白蛋白纳米粒的制备方法及其应用。所述纳米粒的组成包括药物、白蛋白和聚乙二醇化白蛋白，其制备方法是将药物溶解于有机溶剂中，与溶解了白蛋白(含聚乙二醇化白蛋白)的水溶液混合，之后采用高压均质机在9000-30000psi压力下均质，低压下除去有机溶剂，冷冻干燥后制备得到。该纳米粒制备方法易于工业化，载药量大，溶血性小，毒性小，提高了药物静脉给药安全性，且具有长循环效应，降低纳米粒清除速度，提高肿瘤组织对载药纳米粒的摄取，提高其治疗效果。所述纳米粒为可以粉末形式储存，稳定性好，运输、给药方便安全。

Description

一种紫杉烷类长循环纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种药物制剂，具体是一种抗肿瘤药物的长循环纳米粒及其制备方法。

背景技术

难溶性药物的静脉给药一直是药剂学难题，因为常用的增溶辅料静脉安全性差，限制了制剂的发展。以紫杉醇为代表的紫杉烷类化合物的静脉给药一直是研究的热点。FDA批准的静脉注射用辅料，如聚氧乙烯蓖麻油、吐温80仍然具有很大的毒性，例如紫杉醇市售制剂中的聚氧乙烯蓖麻油在应用中，为了降低过敏反应，病人在使用前6小时必须口服地塞米松。

目前具有较好抗肿瘤活性的紫杉烷类药物包括紫杉醇、多西紫杉醇(docetaxel)、MTC220、阿齐他赛(Aziditaxel)、以及其他紫杉烷类衍生物。其中阿齐他赛是以一种天然来源的紫杉烷三尖杉宁碱为原料，通过结构改造得到的紫杉烷衍生物，对微管蛋白具有高亲和力。

人血清白蛋白是一种生物相容性良好的辅料，美国专利US5916596和US6096331保护了紫杉醇与白蛋白结合的白蛋白纳米粒，产品已在美国上市。纳米粒剂型不仅可解决药物的静脉注射问题，其纳米粒径会产生提高渗透治疗效应（EPR效应），提高药物对肿瘤组织的靶向性，从而提高治疗效果。

纳米给药系统由于其在肿瘤部位的提高组织渗透和滞留效应（EPR）的特性，在肿瘤靶向治疗应用过程中越来受到重视。普通的纳米剂型，如脂质体、纳米粒等在血浆中，会被人体网状内皮系统识别，使纳米制剂的血浆清除加快，降低了其治疗效果。科学家们将聚乙二醇（PEG）修饰到纳米制剂表面，聚乙二醇片段在纳米制剂表面形成亲水外核，降低了调理素作用，从而提高纳米制剂的血浆循环时间。聚乙二醇修饰的纳米制剂，常被称为长循环制剂，在脂质体、纳米粒中被广泛应用。

已被批准的US5916596A和US6096331A紫杉醇白蛋白纳米粒使用方便，无需使用溶剂，提高了病人的耐受剂量，输注时间短，可以降低与溶剂相关的过敏反应的潜在风险，但是其并未延长紫杉醇的半衰期。延长抗肿瘤纳米剂型的血浆滞留时间，有利于提高药物在肿瘤组织的分布，从而大大提高药效。已公开CN102772369多西紫杉醇长循环纳米粒制剂采用了聚乙二醇聚乳酸材料制备了胶束制剂，而本发明采用了内源性白蛋白为主要材料，本发明纳米粒生物相容性更好，且半衰期更长。已公开专利CN1582902A保护了阳离子化白蛋白脑靶向纳米粒，其采用化学修饰使白蛋白带有阳离子电荷，且修饰后的阳离子白蛋白作为靶向配体，纳米粒的主要材料为聚乙二醇聚乳酸类合成聚合物，与本发明不同。合肥工业大学硕士学位论文：聚乙二醇修饰人血清白蛋白及其纳米微球制备论文报道了荷载重组人生长激素的白蛋白纳米微球，其采用了制备方法采用溶剂-化学交联法，其原理是纳米沉淀-化学交联结合方法，沉淀过程中采用了表面活性剂Span85，为非静脉注射可用表面活性剂，制备工艺中除去较难，化学交联的原理为戊二醛交联氨基，将大大降低白蛋白的生物相容性，且交联会有纳米粒间的交联，导致粒径分布不均，而与本发明的高压均质的方法中白蛋白无明显变性，具有良好的生物相容性，且粒径均一度易控。

因此本专利旨在利用聚乙二醇化技术，制备一种安全、稳定、具有长循环效应的紫杉烷类抗肿瘤药物白蛋白纳米粒，从而提高紫杉烷类化疗药物的治疗效果，降低毒副作用。

因此本发明的优势为：使用内源性的白蛋白为主要材料，聚乙二醇修饰后的白蛋白无明显毒性，所以生物相容性好。聚乙二醇化修饰使纳米粒有利于延长药物血浆滞留时间，体内抗肿瘤实验显示聚乙二醇化修饰提高了药物的抗肿瘤活性及抗转移效果。

发明内容

本发明的主要目的是在不加入常规增溶剂的前提下，制备一种紫杉烷类抗肿瘤药物的长循环纳米颗粒，该纳米颗粒稳定、静脉给药安全，且具有长循环效应。

本发明的一个目的在于提供一种一种抗肿瘤药物的长循环纳米粒的制备方法，其采用含有聚乙二醇化白蛋白、白蛋白的白蛋白混合物溶液，与药物的有机相溶液混合，高压均质，制备载药纳米粒悬液，冷冻干燥，得到载药纳米粒的冻干粉末。

更特别地，所述制备方法包括：将抗肿瘤药物分布在有机相和含有蛋白质的水性介质中，有机相与水性介质的比例为1：19～1：49，优选比例为1：15-1：30，在9000-30000psi压力范围内高压均质，（优选压力范围为18000-25000psi,优选为7-10个循环时间），剪切成50-1000nm的颗粒，优选颗粒粒径范围为50-200nm,低压除去有机溶剂后，0.22μm无菌过滤，之后低温-40～-80摄氏度冷冻干燥24-48h，最终升温至20-40℃保持0.5-2小时，优选1小时，得到载药的纳米粒。

在本发明中，所述抗肿瘤药物为选自紫杉醇、多西紫杉醇、MTC220、阿齐他赛。

在本发明中，所述有机相是与水不溶性有机溶剂，或者是水不溶性有机溶剂与水溶性有机溶剂组成的混合物。所述水不溶性有机溶剂可以是氯仿、二氯甲烷、乙醚、正丁醇等、或其混合物，所述水溶性有机溶剂可以是乙醇、甲醇、丙二醇、甘油等、或其混合物。

在本发明中，所述蛋白质是白蛋白、聚乙二醇化白蛋白的混合物，其中聚乙二醇化白蛋白与白蛋白材料的重量比例是1:10至1:200。其中单独描述的“白蛋白”或“白蛋白材料”指纯的白蛋白，不含任何修饰物或其它任何杂质，即在没有特别指出的情况下，该“白蛋白”意味着不包含“聚乙二醇化白蛋白”。在本发明，优选地，白蛋白为人血白蛋白。

本发明的另一个目的涉及由所述药物、白蛋白、聚乙二醇化白蛋白制成的长循环纳米粒，其中药物占该纳米粒总量的1-20%重量，聚乙二醇化白蛋白与白蛋白的重量比例是1:10至1:200。在一个具体的方案中，

在一个具体方案中，本发明的抗肿瘤药物的长循环纳米粒的制备方法如下：将白蛋白、聚乙二醇化白蛋白溶解在水中形成白蛋白混合物0.5%-3%浓度（w/v）的水溶液，将药物溶解于有机溶剂中（浓度饱和浓度的50%-100%），将有机溶剂与白蛋白混合物水溶液按体积比为1：19～1：49，优选比例为1：15-1：30，，在9000-30000psi压力下均质（优选压力范围为18000-25000psi,优选为7-10个循环时间），剪切成50-1000nm的颗粒，优选颗粒粒径范围为50-200nm,低压除去有机溶剂后，0.22μm无菌过滤，之后低温-40～-80摄氏度冷冻干燥24-48h得到载药的纳米粒。减压除去有机溶剂，在-80℃至-40℃之间冷冻干燥,终升温至20-40℃保持0.5-2小时，优选1小时，得到紫杉烷类抗肿瘤药物的长循环纳米粒的冻干粉。优选地，其中白蛋白混合物的浓度选择为0.5-3%（w/v），在所述白蛋白混合物中，聚乙二醇化白蛋白的量为白蛋白（纯的白蛋白）的0.5%-10%，药物与总白蛋白（纯的白蛋白”与聚乙二醇化白蛋白的混合物）质量比为1：99～1：4，有机溶剂与白蛋白混合物溶液的体积比1:19-1:49。

在一个具体方案中，本发明涉及通过按照前述方式制备得到的紫杉烷类药物的长循环纳米粒颗粒粉末。

本发明所用试剂和原料均市售可得，对于本发明中没有具体描述的装置、条件(温度、时间等)、物质、用量、方法等，均可采用本领域已知的或本领域技术人员按照常规技术可确定的。

聚乙二醇化白蛋白为聚乙二醇修饰的白蛋白，可以按照已有方法制备，例如中国专利CN200910229546.3，也可按照本发明实施例中1的方法制备，此方法的特点是修饰得率高，制备方法温和无毒易控。

附图说明

图1是用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析技术来分析利用不同分子量的活化聚乙二醇修饰人血蛋白，获得的聚乙二醇化白蛋白的电泳图谱

其中：

1.凝胶带分子量（200KD，116.3KD，66.3KD，55.5KD，36.5KD，31.0KD，21.5KD，14.4KD，6.0KD）标记蛋白。

2.未经聚乙二醇化的人血白蛋白标准品

3.经活化聚乙二醇5KD修饰后的白蛋白。

4.经活化聚乙二醇10KD修饰的人血白蛋白。

5.经活化聚乙二醇20KD修饰的人血白蛋白。

图2实施例2中阿齐他赛聚乙二醇化白蛋白纳米粒的粒径图

图3实施例4中MTC20聚乙二醇化白蛋白纳米粒的粒径图

图4阿齐他赛聚乙二醇化白蛋白纳米粒的电镜图

具体实施方式

为了阐述本发明的特征，现在描述其一些非限制性的实施例。其中白蛋白混合物指纯的白蛋白和聚乙二醇化白蛋白的混合物。

实施例1聚乙二醇化白蛋白材料的制备

人血白蛋白溶解于PBS，在4℃下加入具有活化基团的甲氧基聚乙二醇10KD，反应12h后，加入甘氨酸终止反应。采用凝胶过滤色谱纯化聚乙二醇化白蛋白。

实施例2阿齐他赛长循环纳米粒的制备

配制1%白蛋白混合物水溶液（其中聚乙二醇10KD白蛋白的浓度为0.05%）50mL。称取50mg阿齐他赛置于1mL氯仿中溶解，将氯仿溶液分散于白蛋白溶液中，10000转/分钟高速分散1min，迅速置于高压均质机内，25000psi压力下均质10个循环，得到具有乳光的纳米乳剂，25℃下旋转蒸发除去氯仿，过0.22μm滤膜，在无菌条件下冷冻干燥48h。

得到的阿齐他赛白蛋白纳米粒的载药量为8.92%，测得粒径为90nm。

实施例3阿齐他赛白蛋白纳米粒的制备

配制2%白蛋白混合物水溶液（其中聚乙二醇20KD白蛋白的浓度为0.05%）50mL。称取75mg阿齐他赛置于1mL氯仿中溶解，将氯仿溶液分散于白蛋白溶液中，10000转/分钟高速分散2min，迅速置于高压均质机内，10000psi压力下均质10个循环，25℃下旋转蒸发除去氯仿，在无菌条件下冷冻干燥48h。

得到的阿齐他赛白蛋白纳米粒的载药量为6.25%，用纯水配制成2mg/mL，测得粒径为500.1nm。

实施例4MTC20长循环纳米粒的制备

配制1.5%白蛋白混合物水溶液（其中聚乙二醇5000白蛋白的浓度为0.015%）50mL。称取50mg MTC20置于1mL氯仿中溶解，将氯仿溶液分散于白蛋白水溶液中，15000转/分钟，高速分散1分钟，迅速转移至高压均质机内，20000psi压力下均质8个循环，得到有乳光的纳米乳剂，常温下旋转蒸发除去氯仿，在无菌条件下冷冻干燥48h。

得到的MTC20白蛋白纳米粒的载药量为6.24%，用纯水配制成2mg/mL，测得粒径为296.6nm。

实施例5阿齐他赛长循环纳米粒的制备

配制3%白蛋白混合物水溶液（其中聚乙二醇化白蛋白的浓度为0.15%）50mL。称取175mg阿齐他赛置于1mL氯仿中溶解，将氯仿溶液分散于白蛋白水溶液中，15000转/分钟，高速分散1分钟，迅速转移至高压均质机内，20000psi压力下均质8个循环，得到有乳光的纳米乳剂，常温下旋转蒸发除去氯仿，过0.22μm滤膜，在无菌条件下冷冻干燥48h。

得到的阿齐他赛白蛋白纳米粒的载药量为10.2%，用纯水配制成2mg/mL，测得粒径为138nm。

实施例6多西紫杉醇长循环纳米粒的制备

配制1%白蛋白混合物水溶液（其中聚乙二醇化白蛋白的浓度是其5%）50ml。称取55mg多西紫杉醇置于1ml氯仿：乙醇（9:1）中溶解，将药物溶液分散于白蛋白水溶液中，转移至高压均质机内，先5000psi压力下均质5个循环，然后升至20000psi压力下均质8个循环，得到含有乳光的纳米混悬液，25°旋转蒸发除去有机溶液，过0.22μm滤膜，无菌条件下冷冻干燥48h。得到多西紫杉醇的长循环纳米粒。得到的多西紫杉醇纳米粒的载药量为8.1%，粒径为150nm。

实施例7MTC20长循环纳米粒的制备

配制1.5%白蛋白混合物水溶液（其中聚乙二醇化白蛋白的浓度占1%）50ml。称取50mgMTC20置于1ml氯仿：丙二醇（19:2）中溶解，将药物溶液分散于白蛋白水溶液中，高速分散2min，迅速转移至高压均质机内，22000psi压力下均质6个循环，得到MTC20长循环纳米粒，经测定载药量为6.1％，粒径为140ｎｍ

实施例8紫杉醇长循环纳米粒的制备

配制2%白蛋白混合物水溶液（其中聚乙二醇10KD白蛋白浓度占2.5%）20ml。称取50mg紫杉醇置于1ml氯仿中溶解，将药物溶液快速分散于白蛋白水溶液中，10000psi压力下均质2min，在25000psi压力下均质6个循环，过0.22μm滤膜，减压除去氯仿，无菌条件下干燥24h。得到紫杉醇的长循环纳米粒。

测得紫杉醇长循环纳米粒的粒径为110.8nm，载药量为11.02%。

Claims (6)

1.一种抗肿瘤药物的长循环纳米粒的制备方法，其包括：将抗肿瘤药物分布在有机相和含有蛋白质的水性介质中，有机相与水性介质的比例为1：19～1：49，优选比例为1：15-1：30，在9000-30000psi压力范围内高压均质，（优选压力范围为18000-25000psi,优选为7-10个循环时间），剪切成50-1000nm的颗粒，优选颗粒粒径范围为50-200nm,低压除去有机溶剂后，0.22μm无菌过滤，之后低温-40～-80摄氏度冷冻干燥24-48h，最终升温至20-40℃保持0.5-2小时，优选1小时，得到载药的纳米粒。

2.根据权利要求1的制备方法，所述抗肿瘤药物选自紫杉醇、多西紫杉醇、MTC220、阿齐他赛。

3.根据权利要求1的制备方法，所述的有机相是与水不溶性有机溶剂或者水不溶性有机溶剂与水溶性有机溶剂组成的混合物。

4.根据权利要求1的制备方法，所述的蛋白质是白蛋白、聚乙二醇化白蛋白的混合物，其中聚乙二醇化白蛋白与白蛋白材料的重量比例是1:10至1:200。优选范围是1:10-100之间。

5.根据权利要求3的制备方法，所述水不溶性有机溶剂是氯仿、二氯甲烷、乙醚、正丁醇，所述水溶性有机溶剂是乙醇、甲醇、丙二醇、甘油。

6.根据权利要求1-5中任一项的方法制备得到的抗肿瘤药物的长循环纳米粒。