CN103340883A - 基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，包括①神经酰胺，和②紫杉醇、多西他赛或多柔比星，或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，且任选的可以包括一种或多种可药用载体。本发明将神经酰胺和化疗药物联合应用，可增强抗肿瘤作用（乳腺癌、卵巢癌、肝癌或黑色素瘤）。本发明还公开了一类基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的纳米制剂，包括以下组分：①神经酰胺，②紫杉醇、多西他赛或多柔比星，③固体脂质或多聚物，④缓冲液，⑤乳化剂；或者还包括：⑥冻干保护剂。将神经酰胺和化疗药物应用到纳米载体中，可制得形态规则、粒径较小、粒度分布均匀的纳米粒子，有助于提高神经酰胺和化疗药物的递送效率。

Description

基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物

技术领域

本发明涉及用于治疗肿瘤的联合用药物，尤其涉及包含有神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，属于医药技术领域。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，全世界每年死于癌症的患者约500万，居所有疾病死亡率的第二位，其发病率和死亡率均呈现上升趋势，已成为威胁人类健康的头号杀手，因此癌症的预防与治疗任务十分艰巨。

尽管已存在许多抗肿瘤药物，如紫杉醇、多西他赛、多柔比星等，而且有更多的化合物已被发现具有抗肿瘤作用。但是，大多数抗肿瘤药物由于缺乏理想的选择性，在抑制或杀伤肿瘤细胞的同时，对人体正常组织和细胞也具有抑制和损伤作用，因而具有较多的副作用，如紫杉烷类抗肿瘤药物的骨髓抑制作用，多柔比星的心脏毒性等。另外，几乎所有的化疗药物在治疗过程中都会产生多药耐药现象，从而进一步降低了化疗疗效。因此如何在保证和提高抗肿瘤药物疗效的同时，减小使用剂量降低其毒性作用是抗肿瘤药物研发的重点。

神经酰胺（Ceramide,CE）是由鞘氨醇及不同长度脂肪酸（C2-C24）通过酰胺键形成的一种脂质。内源性神经酰胺作为神经鞘脂代谢的核心分子可以通过多种途径生成，已探究的经典的生成方式是“从头合成途径”及“鞘磷脂循环”。作为人体自身存在的一类复杂多样的脂质，神经酰胺不仅是维持细胞膜结构的重要组分，而且能够对细胞生长、分化、凋亡等多种生理活动进行调节，因此神经酰胺是一种潜在的抗肿瘤药物。内源性神经酰胺含量较低，且一经合成易在不同酶作用下转化为不同的代谢产物，失去其正常生理活性，因此外源性神经酰胺被应用于抗肿瘤研究中。据文献报道，在化疗药物、放射线、热休克、缺氧、高温等刺激因素诱导下，外源性神经酰胺可作用于应激活化的蛋白激酶SAPK/JNK(c-Jun N-terminalkinase)、神经酰胺激活的蛋白激酶(ceramide activated proteinkinase，cAPK)、神经酰胺激活的蛋白磷酸酶（CAPP）、调节蛋白激酶c家族，如蛋白激酶c(ProteinkinaseC，PKc)、半胱天冬酶家族如caspase-3、组织蛋白酶D等一系列靶点，通过一系列级联反应将细胞外信号传递至细胞内，诱导细胞凋亡。因此，神经酰胺作为一种细胞信号分子，能够促进化疗药物及其他治疗方式的抗肿瘤活性。神经酰胺与化疗药物联用，能够从不同的作用机理协同增强抗肿瘤作用，同时可减少一种或两种药物的用量，在保证抗肿瘤效果的前提下，降低毒性，在抗肿瘤领域具有巨大的应用潜力。

神经酰胺结构中疏水区域与亲水首基比例高，水溶性低不能直接作为注射剂使用，与此同时，外源性神经酰胺进入体内环境很容易被鞘磷脂循环途径中的酶所降解，失去其生理活性，严重限制了其体内应用。因此，寻找一种适宜的剂型将神经酰胺递送至体内便成了解决神经酰胺肿瘤治疗难题的关键。纳米载体能够显著提高药物的体内递送效率，实现缓释、控释作用，目前常用的纳米载体有脂质纳米混悬剂、固体脂质纳米粒、聚合物纳米粒等。

目前，国内尚未对神经酰胺与各种化疗药物联用对不同肿瘤疾病的作用进行较为全面的考察，同时尚未有神经酰胺脂质纳米混悬剂、神经酰胺固体脂质纳米粒、神经酰胺聚合物纳米粒、神经酰胺胶束的研究报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一类基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物。

本发明是通过以下技术方案实现的：

基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，包括①神经酰胺，和②紫杉醇（Paclitaxel，PTX）或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，且任选的可以包括一种或多种可药用载体。该联合用药物对乳腺癌、卵巢癌、肝癌具有显著的疗效。

所述神经酰胺与紫杉醇的摩尔配比为0.5～8：1，优选1：1。

基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，包括①神经酰胺，和②多西他赛(Docetaxel，DTX)或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，且任选的可以包括一种或多种可药用载体。该联合用药物对黑色素瘤、乳腺癌具有显著的疗效。

所述神经酰胺与多西他赛的摩尔配比为0.1～6：1，优选1：1或0.25～0.5：1。

基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，包括①神经酰胺，和②多柔比星（Doxorubicin，DOX）或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，且任选的可以包括一种或多种可药用载体。该联合用药物对肝癌具有显著的疗效。

所述神经酰胺与多柔比星的摩尔配比为1～6：1，优选1：1。

所述神经酰胺的结构式如下：

其中，n为0～22的整数（此时为C2-CE～C24-CE）；优选的，n为0～10的整数（此时为C2-CE～C12-CE）；最优选的，n=4，此时为C6-CE。

所述基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，给药时，有两种方式：（1）将神经酰胺及可联用的药物（紫杉醇、多西他赛或多柔比星）分别制成单独的制剂，两种制剂的剂型可以相同或不同，在使用时可以将这两种药物先后使用，也可以同时使用；若将两种药物先后使用，则建议神经酰胺的单独制剂首先使用；两种药物先后使用时，给予第二种药物（在后使用的药物）时第一种药物（在先使用的药物）应该还未丧失其在体内的有效作用，即：在1～24h内给予第二种药物；（2）将神经酰胺和可联用的药物（紫杉醇、多西他赛或多柔比星）制成单一制剂，同时给药。

基于上述第（2）种联合给药方式，本发明还提供了一类基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的纳米制剂，包括以下组分：①神经酰胺，②紫杉醇、多西他赛或多柔比星，③固体脂质或多聚物，④缓冲液，⑤乳化剂；或者还包括：⑥冻干保护剂；其中各组分的重量配比为：神经酰胺1～15份，紫杉醇、多西他赛或多柔比星10～60份，固体脂质或多聚物0～500份，缓冲液所用体积为20～500ml，乳化剂15～250份，冻干保护剂为0或0.5～10%（g/100ml）；纳米制剂的剂型包括脂质纳米混悬剂、固体脂质纳米粒、聚合物纳米粒、胶束，以及这些剂型的冻干制剂。

所述固体脂质选自硬脂酸、棕榈酸、胆固醇、单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、山榆酸甘油酯或三月桂酸甘油酯中的一种或任意几种。

所述多聚物选自聚乳酸、聚己内酯、多聚赖氨酸、聚氧乙烯聚乙二醇或聚乳酸乙醇酸共聚物中的一种或任意几种的组合或者嵌段共聚物。

所述乳化剂选自大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、羊脑卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂二棕榈酰磷脂酰胆碱、二豆蔻磷脂酰胆碱，波洛沙姆或泰洛沙姆的一种或任意几种。

所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.4）、碳酸盐缓冲液（0.5mol/L，pH9.0）、5%葡萄糖水溶液（即：浓度为0.05g/ml）或0.9%氯化钠溶液（即：浓度为0.009g/ml）。

所述冻干保护剂选自甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、海藻糖、麦芽糖、右旋糖酐、氨基酸或聚乙二醇中的一种或任意几种。

所述基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的纳米制剂的制备方法，选自以下四种方法之一：

方法一：薄膜分散法：将神经酰胺、疏水性药物（紫杉醇、多西他赛或多柔比星）、固体脂质或多聚物、乳化剂溶解于有机溶剂中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成一层脂质薄膜，加入缓冲液洗脱薄膜，后进行超声分散，即得；或：将神经酰胺、固体脂质或多聚物、乳化剂溶解于有机溶剂中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成一层脂质薄膜，加入缓冲液（缓冲液中溶解有亲水性药物，即：紫杉醇、多西他赛或多柔比星的盐酸盐）洗脱薄膜，后进行超声分散，即得。

方法二：溶剂扩散法：将神经酰胺、疏水药物（紫杉醇、多西他赛或多柔比星）、固体脂质或多聚物、乳化剂溶解于有机溶剂构成有机相，将有机相匀速滴加到由缓冲液（水相）中，搅拌下挥发有机溶剂获得纳米载体混悬液，即得；或：将神经酰胺、固体脂质或多聚物、乳化剂溶解于有机溶剂构成有机相，将有机相匀速滴加到由缓冲液构成的水相（缓冲液中溶解有亲水性药物，即：紫杉醇、多西他赛或多柔比星的盐酸盐），搅拌下挥发有机溶剂获得纳米载体混悬液，即得。

方法三：溶剂乳化-挥发法：将神经酰胺、疏水药物（紫杉醇、多西他赛或多柔比星）、固体脂质或多聚物、乳化剂溶解于与水不相混溶的有机溶剂构成有机相，加入到由缓冲液构成的水相中，搅拌下挥发有机溶剂获得纳米载体混悬液，即得。

方法四：高压匀质法：将固体脂质、乳化剂充分分散于水溶液中形成分散介质，将神经酰胺、化疗药物（紫杉醇、多西他赛或多柔比星）加入到分散介质中，超声分散均匀形成粗混悬液，进行高速剪切形成初乳，最后经过高压匀质处理获得脂质纳米混悬剂，即得。

上述方法中，有机溶剂选自丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、乙醚中的一种或者任意几种的组合。

上述方法得到纳米制剂后，可加入冻干保护剂，进行冷冻干燥，得到相应的冻干制剂，可提高制剂的稳定性，延长了保质期。

本发明将神经酰胺和化疗药物（紫杉醇、多西他赛或多柔比星）联合应用，可增强抗肿瘤作用，可减少一种或两种药物的使用剂量，从而达到减毒的作用，有助于增强患者顺应性。本发明将神经酰胺和化疗药物应用到纳米载体中，可制得形态规则、粒径较小、粒度分布均匀的纳米粒子，有助于提高神经酰胺和化疗药物的递送效率。

附图说明

图1：神经酰胺联合紫杉醇对乳腺癌细胞的抗增殖作用。其中，横坐标为一系列浓度梯度的药物（自左至右依次为CE、PTX、CE+PTX）溶液，纵坐标为细胞生存率。

图2：神经酰胺联合多西他赛对小鼠黑色素瘤细胞的抗增殖作用。其中，横坐标为一系列浓度梯度的药物（自左至右依次为CE、DTX、CE+DTX）溶液，纵坐标为细胞生存率。

图3：神经酰胺联合多柔比星盐酸盐对肝癌细胞的抗增殖作用。其中，横坐标为一系列浓度梯度的药物（自左至右依次为CE、DOX、CE+DOX）溶液，纵坐标为细胞生存率。

图4：神经酰胺联合紫杉醇对卵巢癌细胞的抗增殖作用。其中，横坐标为一系列浓度梯度的药物（自左至右依次为CE、PTX、CE+PTX）溶液，纵坐标为细胞生存率。

图5：神经酰胺联合紫杉醇对肝癌细胞的抗增殖作用。其中，横坐标为一系列浓度梯度的药物（自左至右依次为CE、PTX、CE+PTX）溶液，纵坐标为细胞生存率。

图6：神经酰胺联合多西他赛对乳腺癌细胞的抗增殖作用其中，横坐标为一系列浓度梯度的药物（自左至右依次为CE、DTX、CE+DTX）溶液，纵坐标为细胞生存率。

图7：神经酰胺-多西他赛在B16细胞上联用比例的考察。其中，横坐标为神经酰胺和多西他赛不同的联用比例，纵坐标为细胞生存率。

图8：神经酰胺-多西他赛在B16细胞上的细胞凋亡实验，横坐标为FITC标记，纵坐标为PI标记。其中图8A为阴性对照组；图8B、C为不同浓度的神经酰胺溶液组；图8D、E为不同浓度的多西他赛溶液组；图8F为神经酰胺-多西他赛联合用药溶液组。

图9：神经酰胺-多西他赛在B16细胞上的细胞周期实验，横坐标为细胞周期的不同阶段，纵坐标为PI标记。其中，图9A为阴性对照组；图9B、C为不同浓度的神经酰胺溶液组；图9D、E为不同浓度的多西他赛溶液组；图9F为神经酰胺-多西他赛联合用药溶液组。

图10：脂质纳米混悬剂电镜形态及外观形态。其中，图10A、B、C分别为CE-LNS，DTX-LNS，CE/DTX-LNS的电镜形态，图10D、E、F分别为CE-LNS，DTX-LNS，CE/DTX-LNS的外观形态。

图11：神经酰胺-多西他赛脂质纳米混悬剂在人乳腺癌细胞上的细胞毒性，从左到右每个灰度条所代表的药物，即为图中右上角由上到下所罗列的药物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例中选用分子量为397.64的C6-CE。

实施例1  神经酰胺联合紫杉醇对乳腺癌细胞的抗增殖作用

采用MTT法考察神经酰胺联合紫杉醇对乳腺癌的抗增殖作用：将人乳腺癌细胞系MCF-7细胞接种于96孔培养板中，接种密度约为6×10³个/孔，过夜贴壁。实验分组：空白对照组（只加RPMI1640培养液），阴性对照组（DMSO终浓度为2‰的RPMI1640培养液）；神经酰胺组（终浓度依次为0.5,5,10,20,40μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），紫杉醇组（终浓度依次为0.5,5,10,20,40μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），神经酰胺组+紫杉醇组（神经酰胺与紫杉醇摩尔比例1:1混合，DMSO终浓度低于2‰），每组设5个复孔，48h后检测。检测前4h加入5mg/mlMTT20μl,继续培养4h后，水平离心弃去上清液，加入DMSO150μl震荡5min是结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm测定吸光度值（OD值），按下式计算细胞存活率，重复至少三次。

细胞存活率（%）=（A_样品-A_空白）/（A_对照-A_空白）×100%

其中，A_样品为加入不同药物溶液后细胞的吸光度；A_对照为阴性对照孔细胞的吸光度；A_{空 白}为空白对照孔细胞的吸光度。

结果如图1所示，神经酰胺、紫杉醇的细胞毒性具有剂量依赖性，随着横坐标中浓度增大，体外抗增殖效果增强；在0.5-5μmol/l浓度范围内，联合用药组的细胞生存率要显著低于单独用药组（P<0.05）。神经酰胺的IC50值为5.1μmol/l，紫杉醇的IC50值为11.6μmol/l，二者以摩尔比1:1联用后的IC50值为2.0μmol/l，根据公式CI=D₁/D_f1+D₂/D_f2+D₁D₂/D_f1D_f2计算在IC50值处的联用指数（combinationindex，CI）。其中D_f1是单独使用神经酰胺的IC50值，D₁是联合用药后神经酰胺的IC50值，D_f2是单独使用化疗药物的IC50值，D₂是联合用药后化疗药物的IC50值，CI＜1协同作用，CI=1为相加作用，CI＞1为拮抗作用。神经酰胺和紫杉醇在乳腺癌细胞上的CI值为0.63，小于1，具有良好的协同作用。

实施例2  神经酰胺联合多西他赛对小鼠黑色素瘤细胞的抗增殖作用

采用MTT法考察神经酰胺联合多西他赛对小鼠黑色素瘤细胞的抗增殖作用：将小鼠黑色素瘤细胞系B16细胞接种于96孔培养板中，接种密度约为8×10³个/孔，过夜贴壁。实验分组：空白对照组（只加DMEM培养液），阴性对照组（DMSO终浓度为2‰的DMEM培养液）；神经酰胺组（终浓度依次为0.5,5,10,20,40μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），多西他赛组（终浓度依次为0.5,5,10,20,40μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），神经酰胺组+多西他赛组（神经酰胺与多西他赛摩尔比例1:1混合，DMSO终浓度低于2‰），每组设5个复孔，48h后检测。检测前4h加入5mg/mlMTT20μl,继续培养4h后，水平离心弃去上清液，加入DMSO150μl震荡5min是结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm测定吸光度值（OD值），按下式计算细胞存活率，重复三次。

细胞存活率（%）=（A_样品-A_空白）/（A_对照-A_空白）×100%

其中，A_样品为加入不同药物溶液后细胞的吸光度；A_对照为阴性对照孔细胞的吸光度；A_{空 白}为空白对照孔细胞的吸光度。

结果如图2所示，神经酰胺的细胞毒性具有明显的剂量依赖性，随着浓度增大，体外抗增殖效果增强；在0.5-10μmol/l浓度范围内，联合用药组的细胞生存率要显著低于单独用药组（P<0.05）。神经酰胺的IC50值为6.6μmol/l，多西他赛的IC50值为43.0μmol/l，B16细胞对多西他赛敏感性相对较低；当二者以摩尔比1:1联用后的IC50值为2.6μmol/l，根据实施例1中的联用指数公式计算在IC50值处的联用指数为0.48，小于1，具有良好的协同作用，神经酰胺显著提高了多西他赛对B16细胞的抗增殖作用。

实施例3  神经酰胺联合多柔比星盐酸盐对肝癌细胞的抗增殖作用

采用MTT法考察神经酰胺联合多柔比星盐酸盐对肝癌细胞的抗增殖作用：将人肝癌细胞系HepG2细胞接种于96孔培养板中，接种密度约为8×10³个/孔，过夜贴壁。实验分组：空白对照组（只加DMEM培养液），阴性对照组（DMSO终浓度为2‰的DMEM培养液）；神经酰胺组（终浓度依次为0.5,5,10,20,40μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），多柔比星盐酸盐组（终浓度依次为0.5,5,10,20,40μmol/l），神经酰胺组+多柔比星盐酸盐组（神经酰胺与多柔比星盐酸盐摩尔比例1:1混合，DMSO终浓度低于2‰），每组设5个复孔，48h后检测。检测前4h加入5mg/mlMTT20μl,继续培养4h后，水平离心弃去上清液，加入DMSO150μl震荡5min是结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm测定吸光度值（OD值），按下式计算细胞存活率，重复三次。

细胞存活率（%）=（A_样品-A_空白）/（A_对照-A_空白）×100%

其中，A_样品为加入不同药物溶液后细胞的吸光度；A_对照为阴性对照孔细胞的吸光度；A_{空 白}为空白对照孔细胞的吸光度。

结果如图3所示，神经酰胺、多柔比星盐酸盐的细胞毒性具有剂量依赖性，随着浓度增大，体外抗增殖效果增强；在5-20μmol/l浓度范围内，联合用药组的细胞生存率要显著低于单独用药组（P<0.05）。神经酰胺的IC50值为5.3μmol/l，多柔比星盐酸盐的IC50值为5.5μmol/l，二者以摩尔比1:1联用后的IC50值为2.1μmol/l，根据实施例1中的联用指数公式计算在IC50值处的联用指数为0.92，小于1，神经酰胺与多柔比星盐酸盐在肝癌治疗中具有较好的协同作用。

实施例4  神经酰胺联合紫杉醇对卵巢癌细胞的抗增殖作用

采用MTT法考察神经酰胺联合紫杉醇对人卵巢癌细胞的抗增殖作用：将人卵巢癌细胞系SKOV3细胞接种于96孔培养板中，接种密度约为8×10³个/孔，过夜贴壁。实验分组：空白对照组（只加RPMI1640培养液），阴性对照组（DMSO终浓度为2‰的RPMI1640培养液）；神经酰胺组（终浓度依次为0.5,5,10,20,40μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），紫杉醇组（终浓度依次为0.5,5,10,20,40μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），神经酰胺组+紫杉醇组（神经酰胺与紫杉醇摩尔比例1:1混合，DMSO终浓度低于2‰），每组设5个复孔，48h后检测。检测前4h加入5mg/mlMTT20μl,继续培养4h后，水平离心弃去上清液，加入DMSO150μl震荡5min是结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm测定吸光度值（OD值），按下式计算细胞存活率，重复三次。

细胞存活率（%）=（A_样品-A_空白）/（A_对照-A_空白）×100%

其中，A_样品为加入不同药物溶液后细胞的吸光度；A_对照为阴性对照孔细胞的吸光度；A_{空 白}为空白对照孔细胞的吸光度。

结果如附图4所示，神经酰胺、紫杉醇的细胞毒性具有剂量依赖性，随着浓度增大，体外抗增殖效果增强；在20-40μmol/l浓度范围内，联合用药组的细胞生存率要显著低于单独用药组（P<0.05）。神经酰胺的IC50值为5.8μmo4l/l，紫杉醇的IC50值为12.6μmol/l，二者以摩尔比1:1联用后的IC50值为3.3μmol/l，根据实施例1中的联用指数公式计算在IC50值处的联用指数为0.98，小于1，神经酰胺与紫杉醇在卵巢癌治疗中具有初步的协同作用。

实施例5  神经酰胺联合紫杉醇对肝癌细胞的抗增殖作用

采用MTT法考察神经酰胺联合紫杉醇对人肝癌细胞的抗增殖作用：将人肝癌细胞系HepG2细胞接种于96孔培养板中，接种密度约为8×10³个/孔，过夜贴壁。实验分组：空白对照组（只加DMEM培养液），阴性对照组（DMSO终浓度为2‰的DMEM培养液）；神经酰胺组（终浓度依次为0.5,5,10,20,40μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），紫杉醇组（终浓度依次为0.5,5,10,20,40μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），神经酰胺组+紫杉醇组（神经酰胺与紫杉醇摩尔比例1:1混合，DMSO终浓度低于2‰），每组设5个复孔，48h后检测。检测前4h加入5mg/mlMTT20μl,继续培养4h后，水平离心弃去上清液，加入DMSO150μl震荡5min是结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm测定吸光度值（OD值），按下式计算细胞存活率，重复三次。

细胞存活率（%）=（A_样品-A_空白）/（A_对照-A_空白）×100%

其中，A_样品为加入不同药物溶液后细胞的吸光度；A_对照为阴性对照孔细胞的吸光度；A_{空 白}为空白对照孔细胞的吸光度。

结果如附图5所示，神经酰胺、神经酰胺/紫杉醇的细胞毒性具有剂量依赖性，随着浓度增大，体外抗增殖效果增强；在20-40μmol/l浓度范围内，联合用药组的细胞生存率要显著低于单独用药组（P<0.01）。神经酰胺的IC50值为5.3μmo4l/l，紫杉醇的IC50值为3.4μmol/l，二者以摩尔比1:1联用后的IC50值为1.0μmol/l，根据实施例1中的联用指数公式计算在IC50值处的联用指数为0.53，小于1，神经酰胺与紫杉醇在肝癌治疗中具有良好的协同作用。

实施例6  神经酰胺联合多西他赛对乳腺癌细胞的抗增殖作用

采用MTT法考察神经酰胺联合多西他赛对人乳腺癌细胞的抗增殖作用：将人乳腺癌细胞系MCF-7细胞接种于96孔培养板中，接种密度约为6×10³个/孔，过夜贴壁。实验分组：空白对照组（只加RPMI1640培养液），阴性对照组（DMSO终浓度为2‰的RPMI1640培养液）；神经酰胺组（终浓度依次为0.5,5,10,20,40μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），多西他赛组（终浓度依次为0.5,5,10,20,40μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），神经酰胺组+多西他赛组（神经酰胺与多西他赛摩尔比例1:1混合，DMSO终浓度低于2‰），每组设5个复孔，48h后检测。检测前4h加入5mg/mlMTT20μl,继续培养4h后，水平离心弃去上清液，加入DMSO150μl震荡5min是结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm测定吸光度值（OD值），按下式计算细胞存活率，重复三次。

细胞存活率（%）=（A_样品-A_空白）/（A_对照-A_空白）×100%

其中，A_样品为加入不同药物溶液后细胞的吸光度；A_对照为阴性对照孔细胞的吸光度；A_{空 白}为空白对照孔细胞的吸光度。

结果如附图6所示，神经酰胺、神经酰胺/多西他赛的细胞毒性具有剂量依赖性，随着浓度增大，体外抗增殖效果增强；在0.5-10μmol/l浓度范围内，联合用药组的细胞生存率低于单独用药组。神经酰胺的IC50值为5.1μmol/l，多西他赛的IC50值为51.4μmol/l，二者以摩尔比1:1联用后的IC50值为3.6μmol/l，根据实施例1中的联用指数公式计算在IC50值处的联用指数为0.82，小于1，神经酰胺与多西他赛在乳腺癌治疗中具有良好的协同作用。

实施例7  神经酰胺-多西他赛在B16细胞上的联用比例

采用MTT法考察神经酰胺-多西他赛在B16细胞上的联用比例：将小鼠黑色素瘤细胞系B16细胞接种于96孔培养板中，接种密度约为8×10³个/孔，过夜贴壁。实验分组：空白对照组（只加DMEM培养液），阴性对照组（DMSO终浓度为2‰的DMEM培养液）；神经酰胺组（终浓度依次为1.25,2.5,5,10，20μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），多西他赛组（终浓度为5μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），神经酰胺组+多西他赛组（将上述神经酰胺与多西他赛依次对应配伍，使得神经酰胺与多西他赛的摩尔配比依次为0.25,0.5,1,2,4，DMSO终浓度低于2‰），每组设5个复孔，48h后检测。检测前4h加入5mg/mlMTT20μl,继续培养4h后，水平离心弃去上清液，加入DMSO150μl震荡5min是结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm测定吸光度值（OD值），按下式计算细胞存活率，重复三次。

细胞存活率（%）=（A_样品-A_空白）/（A_对照-A_空白）×100%

其中，A_样品为加入不同药物溶液后细胞的吸光度；A_对照为阴性对照孔细胞的吸光度；A_{空 白}为空白对照孔细胞的吸光度。

实验结果表明（图7），多西他赛单独用药（5μmol/l）的细胞生存率维持在78%左右；在所考察摩尔浓度配比范围内，随着神经酰胺浓度的升高，细胞生存率降低，联合用药组的细胞生存率受神经酰胺浓度影响较大；联合用药组细胞生存率均低于单独用药组，当神经酰胺与多西他赛摩尔浓度配比为0.25-0.5时，联合用药组与单独用药组细胞生存率出现显著差异（P＜0.05）。

实施例8  神经酰胺-多西他赛对B16的细胞凋亡实验

采用流式法测定联合用药组诱导肿瘤细胞凋亡的作用：将B16细胞接种于12孔培养板中，接种密度约为2×10⁵个/孔，过夜贴壁。实验分组：空白对照组（只加DMEM培养液），阴性对照组（DMSO终浓度为2‰的DMEM培养液）；神经酰胺组（终浓度分别为10，20μmol/l，DMSO终浓度低于2‰），多西他赛组（终浓度为20，40μmol/l，DMSO终浓度低于2‰），神经酰胺组+多西他赛组（神经酰胺终浓度为10μmol/l，多西他赛终浓度为20μmol/l，DMSO终浓度低于2‰），作用24h。作用完毕，将细胞培养液收集到流式管中，用PBS缓冲液清洗细胞，添加不含EDTA的胰酶消化细胞，并将分散开的细胞悬液收集到流式管中，650g离心6min。离心完毕后弃去上清液，PBS清洗细胞沉淀，PBS混悬再次离心。按照贝博凋亡试剂盒要求对细胞进行标记染色，进行流式细胞仪检测。

如图8所示，神经酰胺作为一种信号分子，能够激活caspase-3活性，明显的诱导细胞凋亡，随着剂量的增加细胞凋亡比例增加，多西他赛单独用药组细胞凋亡比例要低于神经酰胺单独用药组。联合用药组与单独用药组相比能够显著提高细胞凋亡的比例（P<0.05）。当单独用药组药物浓度加倍，即神经酰胺浓度为20μmol/l，多西他赛浓度为40μmol/l时，联合用药组（10μmol/LCE+20μmol/lDTX）在诱导细胞凋亡能力上仍具有显著优势，结果表明，联合用药能够在保证良好抗肿瘤作用的的基础上降低给药剂量，为以后肿瘤治疗中降低临床给药剂量、减少药物毒副作用，增强患者顺应性提供实验依据。

实施例9  神经酰胺-多西他赛对B16细胞的细胞周期实验

采用流式法测定联合用药组对肿瘤细胞有丝分裂的影响：将B16细胞接种于6孔培养板中，接种密度约为4×10⁵个/孔，过夜贴壁。实验分组：空白对照组（只加DMEM培养液），阴性对照组（DMSO终浓度为2‰的DMEM培养液）；神经酰胺组（终浓度分别为10，20μmol/l，DMSO终浓度低于2‰），多西他赛组（终浓度为20，40μmol/l，DMSO终浓度低于2‰），神经酰胺组+多西他赛组（神经酰胺终浓度为10μmol/l，多西他赛终浓度为20μmol/l，DMSO终浓度低于2‰），作用12h。作用完毕，弃去上层细胞培养液，用4℃PBS缓冲液清洗细胞，添加胰酶消化细胞，收集细胞悬液，650g离心6min。离心完毕后弃去上清液，加入-20℃的75%酒精固定细胞，4℃放置过夜。按照贝博细胞周期试剂盒进行染色标记，进行流式细胞仪检测。

实验结果如图9所示，神经酰胺与多西他赛能够将细胞阻断在有丝分裂的不同阶段。神经酰胺将细胞的有丝分裂阻滞在G1期，多西他赛能够将细胞的有丝分裂阻滞在G2/M期，二者联用能够将肿瘤细胞阻滞在不同的细胞周期，神经酰胺能够显著提高多西他赛G2/M期的比例（P<0.05），进而更加有效的抑制肿瘤的增殖。

实施例10  神经酰胺-多西他赛脂质纳米混悬剂的制备

精密称取单硬脂酸甘油酯300mg，大豆磷脂300mg，加至50mlPBS缓冲液（0.01mol/L，pH7.4）中充分分散形成分散介质。加入多西他赛50mg，神经酰胺10mg，超声分散均匀获得粗混悬液。采用高速剪切机2000r/min高速剪切1～3min,获得初乳。将初乳采用高压匀质法分别在200bar循环10次，500bar循环10次，1000bar循环20次，制得乳光明显的神经酰胺-多西他赛脂质纳米混悬液。

根据上述方法，再分别制备神经酰胺脂质纳米混悬液和多西他赛脂质纳米混悬液。

实施例11  脂质纳米混悬剂冻干制剂的制备

在实施例10中制得的纳米混悬液中添加5%（即：0.05g/ml）的冻干保护剂（如甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖等），置于-80℃超低温冰箱中预冻24h，再置于冷冻干燥机中，-40℃、0.5mbar冻干48h，最终得到白色疏松状的脂质纳米混悬剂冻干制剂。

实施例12  脂质纳米混悬剂理化性质评价

将实施例11中的脂质纳米混悬剂进行复溶处理，滴至铺有碳膜的铜网上，静置2min，用滤纸吸干混悬液，再滴加质量浓度为2%的磷钨酸负染2min，于透射电镜下观察纳米粒的形态并拍照。另取适量脂质纳米混悬液，经适当稀释后采用粒度测定仪测定其平均粒径、分散系数，Zeta电位测定仪测定其电位。

透射电镜下观察纳米粒形态为球形或类球形颗粒，分布均匀，无聚集粘联现象（图10）。制得神经酰胺脂质纳米混悬剂平均粒径为98.7nm，电位为-22.16mv；制得多西他赛脂质纳米混悬剂平均粒径为151.9nm，电位为-23.13mv；制得神经酰胺/多西脂质纳米混悬剂平均粒径为180.7nm，电位为-20.70mv；冻干制剂稳定，粒径、电位均符合注射要求，重现性良好。

实施例13  脂质纳米混悬剂体外细胞毒性考察

采用MTT法考察神经酰胺-多西他赛脂质纳米混悬剂在MCF-7细胞上的细胞毒性：将人乳腺癌细胞系MCF-7细胞接种于96孔培养板中，接种密度为6×10³个/孔，过夜贴壁。实验分组：空白对照组（只加RPMI1640培养液），阴性对照组1（DMSO终浓度为2‰的RPMI1640培养液）；阴性对照组2（空白脂质纳米混悬剂）神经酰胺溶液组（终浓度依次为1.25,2.5,5,10，20μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），多西他赛溶液组（终浓度依次为1.25,2.5,5,10，20μmol/l,DMSO终浓度低于2‰），神经酰胺组+多西他赛溶液组（神经酰胺与多西他赛摩尔比例1:1混合，DMSO终浓度低于2‰），神经酰胺脂质纳米混悬剂组，多西他赛脂质纳米混悬剂组，神经酰胺-多西他赛脂质纳米混悬剂组（制剂组给药浓度与溶液组相对应），每组设5个复孔，48h后检测。检测前4h加入5mg/mlMTT20μl,继续培养4h后，水平离心弃去上清液，加入DMSO150μl震荡5min是结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm测定吸光度值（OD值），按下式计算细胞存活率，重复三次。

细胞存活率（%）=（A_样品-A_空白）/（A_对照-A_空白）×100%

其中，A_样品为加入不同药物溶液后细胞的吸光度；A_对照为阴性对照孔细胞的吸光度；A_{空 白}为空白对照孔细胞的吸光度。

实验结果（如图11所示）表明，制剂组的细胞毒性要显著高于原料药组，证明脂质纳米混悬剂能够显著提高药物的递送效率（P＜0.05）。在0.5-20μmol/l浓度范围内，原料药组与脂质纳米混悬剂组中，联合用药组细胞生存率要显著低于单独用药组（P＜0.05）。脂质纳米混悬剂不影响药物之间的协同作用，在保证药物之间协同作用的基础上提高了药物的抗肿瘤作用。

Claims (10)

1.基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，其特征在于：包括①神经酰胺，和②紫杉醇或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，且任选的可以包括一种或多种可药用载体。

2.根据权利要求1所述的基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，其特征在于：所述肿瘤为乳腺癌、卵巢癌或肝癌。

3.基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，其特征在于：包括①神经酰胺，和②多西他赛或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，且任选的可以包括一种或多种可药用载体。

4.根据权利要求3所述的基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，其特征在于：所述肿瘤为黑色素瘤或乳腺癌。

5.基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，其特征在于：基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，包括①神经酰胺，和②多柔比星或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，且任选的可以包括一种或多种可药用载体。

6.根据权利要求5所述的基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，其特征在于：所述肿瘤为肝癌。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的联合用药物，其特征在于：所述神经酰胺的结构式如下：

其中，n为0～22的整数。

8.一类基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的纳米制剂，其特征在于：包括以下组分：①神经酰胺，②紫杉醇、多西他赛或多柔比星，③固体脂质或多聚物，④缓冲液，⑤乳化剂；或者还包括：⑥冻干保护剂；其中各组分的重量配比为：神经酰胺1～15份，紫杉醇、多西他赛或多柔比星10～60份，固体脂质或多聚物0～500份，缓冲液20～500ml，乳化剂15～250份，冻干保护剂为0或0.5～10%；纳米制剂的剂型选自脂质纳米混悬剂、固体脂质纳米粒、聚合物纳米粒、胶束，以及这些剂型的冻干制剂。

9.根据权利要求8所述的基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的纳米制剂，其特征在于：所述固体脂质选自硬脂酸、棕榈酸、胆固醇、单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、山榆酸甘油酯或三月桂酸甘油酯中的一种或任意几种；

所述多聚物选自聚乳酸、聚己内酯、多聚赖氨酸、聚氧乙烯聚乙二醇或聚乳酸乙醇酸共聚物中的一种或任意几种的组合或者嵌段共聚物。

10.根据权利要求8所述的基于神经酰胺的用于治疗肿瘤的纳米制剂，其特征在于：所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、5%葡萄糖水溶液或0.9%氯化钠溶液；

所述乳化剂选自大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、羊脑卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂二棕榈酰磷脂酰胆碱、二豆蔻磷脂酰胆碱，波洛沙姆或泰洛沙姆的一种或任意几种。

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