CN113952317A - 一种血小板-dfo脂质体纳米颗粒、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血小板‑DFO脂质体纳米颗粒，其制备方法和应用。所述血小板‑DFO脂质体纳米颗粒为三层结构，中间层为脂质体，由大豆卵磷脂：胆固醇：mPEG‑DSPE‑2000按质量比(3‑4):2:1制备而成，用以包裹最内层铁螯合剂DFO，最外层包裹血小板膜，脂质体DFO与血小板的比例为1mL:1.0‑2.0×109个血小板的膜。本发明的血小板‑DFO脂质体纳米颗粒理化性质稳定、分散均一，具备长期保存稳定性和缓控释能力，能够穿越血脑屏障，具有靶向血管损伤区域的能力。其作为治疗缺血溶栓后的一种药物进行应用，制备成静脉注射液、胶囊、口服液、滴丸、喷鼻剂等剂型，可用于治疗各种器官血管堵塞疏通后对周围组织造成损伤的治疗。

Description

一种血小板-DFO脂质体纳米颗粒、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种血小板-DFO脂质体纳米颗粒，制备方法及其在靶向治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
缺血性脑中风是一种由于脑部血管栓塞引起的神经系统疾病，因其高致残率、高复发率和高致死率成为全球范围内引起人类死亡的第二大病因。目前针对缺血性脑中风最有效的治疗方法是药物或机械溶栓。但溶栓后脑血流的瞬间恢复又会引起钙离子内流、炎症反应以及自由基积累，造成不可避免的、更为严重的二次损伤，即脑缺血再灌注损伤(Ischemic reperfusion, I/R)。由于难以透过血脑屏障(blood brain barrier, BBB)等原因，目前针对I/R损伤的药物还十分有限。因此，开发并制备能有效穿越BBB并靶向缺血损伤区的溶栓后治疗用药迫在眉睫。I/R损伤的病理机制较复杂，其中最重要的原因之一是大量活性氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)在脑内过度积累,引起神经细胞的死亡，而脑铁过载是造成氧化应激损伤的关键因素。
铁是人体必不可少的微量元素，特别是脑作为高耗氧、高代谢活性的器官，有较高的铁含量。铁参与了脑内能量代谢、递质合成、突触构建、髓鞘形成等多种过程，是维持正常脑功能必不可少的成分。但是，脑铁过量时则会产生毒性作用。一方面铁可以通过芬顿反应促进自由基的形成；另一方面，铁可以作为酶的辅基催化脂质过氧化反应，促进脂质自由基的形成。随着研究的深入，越来越多的证据表明，铁依赖的ROS在缺血损伤区过量积累，使大量神经细胞发生铁死亡，是造成I/R脑内神经元丢失的重要原因。临床数据分析也发现，缺血性脑中风患者血清中铁蛋白含量与患者的损伤程度呈正相关。小鼠模型中，缺血损伤区的铁水平显著升高，且高铁饲养的小鼠在I/R损伤后表现出更严重的细胞死亡和运动功能障碍。因此，及时祛除I/R脑损伤区内过量的铁即可有效缓解脑损伤，改善治疗效果。
去铁胺(DFO)是一种临床上常用的铁螯合剂，与铁具有高亲和性，能治疗铁过载相关疾病，但由于其是亲水性药物，半衰期短，难以透过BBB，外周毒性大等特点，限制了其在治疗缺血性中风中的应用。如何将DFO有效递送至缺血损伤区抑制铁依赖的神经损伤，同时不影响正常脑区的铁水平成为临床上脑中风溶栓后治疗药物制备的重点与难点。因此，如何构建一种具有靶向性、高载药量、低毒、易穿越BBB的祛铁药物，用于有效治疗缺血性脑中风溶栓后，血流再灌注引起的二次神经损伤，成为亟需解决的课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种血小板-DFO脂质体纳米颗粒，将DFO、大豆卵磷脂、胆固醇、mPEG-DSPE-2000和血小板按照一定比例制备而成，用于缺血性脑中风溶栓后神经损伤的治疗药物。
为解决上述问题，实现本发明的目的，本发明首先采用薄膜水化法将大豆卵磷脂:胆固醇:mPEG-DSPE-2000按质量比(3-4):2:1的比例，制备了DFO脂质体（Liposome-DFO），DFO的含量为5-15mg/mL。脂质体是一种具备低毒性、长缓释性的药物载体，具有类似细胞膜的双分子层结构，无毒、无免疫原，可作为疏水性、亲水性或两性物质的载体，且纳米脂质体稳定性高，体外不易聚集，体内不易被巨噬细胞吞噬。根据脂质体的优势，制备的Liposome-DFO有效解决了DFO半衰期短、无法跨越BBB的问题。由于中风缺血区常伴有脑微血管损伤，而血小板能定向到受损血管并与之结合，因此血小板具有主动靶向缺血损伤区以及免疫逃逸的天然优势。利用血小板的这一优势，利用反复冻融法制备了血小板膜（PNV），随后按照1.0-2.0×109个血小板的膜与1 mL Liposome-DFO混合，用挤出器共挤出的方法，制备了Platesome-DFO，赋予了该纳米颗粒仿生化功能，解决了将纳米粒子准确靶向至脑中风缺血损伤区、提高药物浓度的问题。最后，以小鼠大脑中动脉内线栓阻断法MCAO模型为例，观察了Platesome-DFO纳米制剂对大脑缺血再灌注损伤的治疗作用，确证了本发明制得的Platesome-DFO纳米颗粒，显著降低了缺血再灌注脑区的铁水平，使脑梗死体积降低了2.5倍，为缺血性脑中风的溶栓后治疗提供了新策略。
具体的，本发明的血小板-DFO脂质体纳米颗粒，粒径位于100-200nm之间；所述血小板-DFO脂质体纳米颗粒为三层结构，最内层是铁螯合剂DFO，其中间层为脂质体，由大豆卵磷脂：胆固醇：mPEG-DSPE-2000按质量比(3-4):2:1制备而成，用以包裹最内层铁螯合剂DFO，最外层包裹血小板膜，DFO脂质体与血小板膜的比例为1 mL:1.0-2.0×109个血小板的膜。血小板-DFO脂质体纳米颗粒中，DFO含量为5-15mg/mL。
利用所述的血小板-DFO脂质体纳米颗粒，作为治疗缺血溶栓后的一种药物进行应用，用于治疗各种器官血管堵塞疏通后对周围组织造成损伤的治疗。如脑血管、心脏血管、肾脏血管等堵塞溶栓后的血液再灌注引起的铁水平增加，氧化应激增强造成的损伤。
所述的血小板-DFO脂质体纳米颗粒，作为治疗缺血溶栓后的一种药物进行应用，可制备成静脉注射液、胶囊、口服液、滴丸、喷鼻剂。
所述的血小板-DFO脂质体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、血小板膜的制备
试剂配制：
HEPE 缓冲液（HEPE buffer）：
按照质量比NaCl：KCl：HEPES：EGTA为1：（0.02-0.03）：（0.1-0.2）：（0.2-0.3）的比例溶解于水中，调节pH至7.0-8.0，制成HEPE 缓冲液；
洗涤缓冲液（wash buffer）：
按照质量比NaCl：EDTA：dextrose：柠檬酸钠为1：（0.03-0.04）：（1.0-1.2）：（0.3-0.4）的比例溶解于水中，调节pH至7.0-8.0，制成洗涤缓冲液；
台式缓冲液（Tyrode’s buffer）：
按照质量比NaCl：NaHCO3：KCl：Na2HPO4：MgCl2：HEPES为1：（0.1-0.2）：（0.02-0.04）：（0.005-0.007）：（0.01-0.02）：（0.3-0.4）的比例溶解于水中，之后按照体积比PEG：PMSF：水为1:1:10000的比例加入PEG和PMSF并调节pH至7.0-8.0，制成台式缓冲液，备用；
血小板膜的制备过程：
（1）选用成年大鼠或小鼠，通过心脏取血的方式取血，加入抗凝剂后将血液收集至管内；
（2）收集血液后0-4 h内处理并收集血小板，全血加HEPE buffer以10:1比例进一步抗凝；
（3）80-100 g离心，15-20 min，取上清得富含血小板的血浆；
（4）700-1000 g离心，15-20 min，取沉淀；
（5）加红细胞裂解液（5:1），低温裂解5-10 min，重复步骤（4）；
（6）加入wash buffer重悬沉淀，重复步骤（4）；
（7）用Tyrode’s buffer或水重悬沉淀，用计数仪对收集的血小板计数；
（8）反复冻融3次，-80℃-常温循环，超声破碎处理后得到血小板膜（PNV）；
步骤二、Platesome-DFO的制备
（1）将大豆卵磷脂：胆固醇：mPEG-DSPE-2000按质量比（3-4）:2:1溶解在装有3-5mL无水乙醇的茄形瓶中，45-50 ℃水浴，转速60-70 r/min，旋蒸10-20 min，直至无水乙醇全部蒸出，且烧瓶底为均匀的薄膜；
（2）向茄形瓶内加入浓度20-50 mg/mL的 DFO生理盐水溶液1-2mL进行水化，同时加入3-6个玻璃珠，在超声清洗仪的帮助下水化2-5 min，直至瓶壁上的膜全部洗脱在溶液中，得到DFO脂质体（Liposome-DFO）；
（3）将制备的脂质体用挤出器挤出后超滤，条件3000g，30min，加生理盐水再离心30min，再加盐水，离心50min，取出脂质体，加入步骤1制备的PNV（约含有1.0-2.0×109个血小板），用生理盐水重悬沉淀，之后用挤出器进行共挤出，挤出时依次通过400 nm、200 nm的滤膜，反复挤出后得到Platesome-DFO。
血小板-DFO脂质体纳米制颗粒的应用实验。
利用所述的血小板-DFO脂质体纳米颗粒，作为治疗缺血溶栓后的一种药物进行应用，用于治疗各种器官血管堵塞疏通后对周围组织造成损伤的治疗进行实验研究。将Platesome-DFO制备成静脉注射液、胶囊、口服液、滴丸、喷鼻剂任一剂型进行对比实验研究。
通过大脑中动脉内线栓阻断法 (Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO) 使小鼠脑缺血60min，之后拔出线栓，血流再灌注24h，建立小鼠I/R模型，模拟缺血性脑中风的溶栓治疗。设置Saline、DFO、Liposome-DFO、PNV和Platesome-DFO共5组制剂，在再灌注开始时，按照给药量15-25 mg DFO/kg体重的相对剂量，通过尾静脉注射对中风小鼠进行治疗。给药24h后，将小鼠麻醉，取脑，通过TTC（2，3，5-三苯基氯化四氮唑）染色计算不同组小鼠脑梗死体积。与对照组（Saline）相比，Platesome-DFO治疗后小鼠脑梗死体积显著下降，由35%-40%下降至15%-25%，而DFO、Liposome-DFO和PNV治疗并未明显改善I/R诱导的小鼠脑损伤。实验证实，用所述的血小板-DFO脂质体纳米颗粒，可以作为治疗缺血溶栓后的一种药物进行应用，用于治疗各种器官血管堵塞疏通后对周围组织造成损伤的治疗。
本发明取得的有益效果：
本发明通过将DFO脂质体与血小板膜共挤出，制备了Platesome-DFO纳米颗粒。对Platesome-DFO进行表征，证实其粒径均值在140nm左右，电位约-20.3 mV，透射电子显微镜分析发现Platesome-DFO粒子规整、分散均一稳定；对Platesome-DFO进行长期保存实验，验证了Platesome-DFO具有长期保存稳定性；体外药物释放实验，表明Platesome-DFO具有缓控释能力；蛋白免疫印迹验证Platesome-DFO含有血小板膜蛋白，保留了血小板膜的特性。利用小鼠的MACO模型，模拟缺血性脑中风的溶栓过程，通过尾静脉注射给药治疗后，利用体内成像技术，证实Platesome-DFO具有显著的缺血区靶向能力；利用电感耦合等离子体质谱技术，检测缺血再灌注脑区铁水平，发现与对照组（Saline组）、DFO溶液组（DFO组）、DFO脂质体组（Liposome-DFO组）、血小板膜组（PNV组）相比，Platesome-DFO能有效螯合缺血损伤区过量的铁。TTC染色实验表明Platesome-DFO能显著改善小鼠脑损伤。
附图说明
图1：Platesome-DFO粒径。
Platesome-DFO的粒径采用动态光散射技术测定。如图1所示，同时制备了PNV、Liposome-DFO和Platesome-DFO，其平均水合粒径为203.5±4.54 nm、166.9±2.02 nm和136.6±1.65 nm。Platesome-DFO相比于其他两组载体材料粒径更小，更有利于透过BBB。
图2：Platesome-DFO的zeta电位。
Zeta电位是表征分散系稳定性的重要指标。如图2所示，三种载体材料的平均电位分别为-21±1.66 mV、-10.2±1.08 mV和-20.3±1.46 mV。Platesome-DFO和PNV的电位接近，表明血小板膜成功包被了DFO脂质体。
图3：Platesome-DFO透射电镜图。
图3表明，本发明制备的Platesome-DFO纳米载体形貌为规整的球形囊泡，粒径大小均匀。
图4：Platesome-DFO长期保存稳定性检测。
纳米药物的长期保存在临床应用中十分重要，为验证Platesome-DFO是否能长期保持稳定，将制备好的Liposome-DFO和Platesome-DFO放置于4 ℃ PBS中保存，每隔1天用动态光散射仪检测载体材料的粒径。如图4所示，两组载体材料保存7天后粒径分别为162nm和135 nm左右，无明显变化。表明Platesome-DFO在7天内保存相对稳定。
图5：Platesome-DFO的体外释药曲线。
Liposome-DFO、Platesome-DFO制备完成后，分别设置pH=5.0和pH=7.4的PBS溶液模拟溶酶体环境和正常生理条件的pH。如图5所示，Liposome-DFO和Platesome-DFO在pH=7.4的PBS溶液中，4 h时分别累计释放了45.6 %和49.4 %，相应的在pH=5的PBS溶液中，分别累计释放了70.7 %和67.8 %，表明两组纳米载体在正常生理条件下，释放药物较缓慢，而在溶酶体酸性环境中能快速释放药物，具有调控释药速率的作用。
图6：Platesome-DFO血小板膜蛋白成分分析。
血小板膜表面含多种膜蛋白，膜蛋白的保持是决定Platesome-DFO能够靶向缺血区和免疫逃逸作用的关键。通过蛋白免疫印迹实验分别检测了血小板（PLT）、PNV、Liposome-DFO以及Platesome-DFO四组载体材料的膜蛋白。如图6所示，本方法合成的Platesome-DFO表面具有血小板膜特异的CD36、CD41、CD47蛋白，表明Platesome-DFO具备与血小板膜类似的生理功能。
图7：Platesome-Dir在体内靶向缺血损伤区。
为验证血小板膜制备的纳米体系能跨越BBB并靶向缺血区。分别用以上体系包被荧光染料Dir，制备了Liposome-Dir和Platesome-Dir，同时以Saline组为对照，将相同荧光含量的纳米材料经尾静脉注射至缺血性脑中风模型小鼠，24 h后取材，并用体内成像系统观察脑内荧光分布。如图7所示，Platesome-Dir在缺血区大量富集，且显著优于Liposome-Dir组，表明Platesome-Dir较Liposome-Dir具有更强的靶向能力。
图8：Platesome-DFO降低了脑梗死区铁水平。
铁过载是造成脑缺血再灌注损伤的主要原因之一。用Saline、DFO、Liposome-DFO、PNV和Platesome-DFO，对脑中风小鼠进行治疗后，用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）检测小鼠对照侧脑组织（Con）及缺血损伤区脑组织（I/R）铁水平的变化。如图8所示，Saline组中，与对照侧相比，I/R损伤侧铁含量显著升高，DFO、PNV及Liposome-DFO处理并未显著影响缺血损伤区铁含量，而Platesome-DFO处理使I/R侧铁含量恢复至与对照侧相当的水平。
图9：Platesome-DFO显著改善I/R诱导的小鼠脑损伤。
分别用Saline、DFO、Liposome-DFO、PNV和Platesome-DFO纳米药物治疗中风模型小鼠，24 h后用TTC染色检测脑梗死体积，如图9所示，TTC染料能将正常脑组织染成红色，梗死组织染成白色。Platesome-DFO与其他治疗组相比，能显著降低脑梗死区体积，说明Platesome-DFO对脑缺血再灌注的损伤具有明显的神经保护作用。
具体实施方式
以下实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1 Platesome-DFO纳米颗粒（包封率为12%）的制备
步骤一、血小板膜的制备
试剂配制：
HEPE 缓冲液（HEPE buffer）：
按照质量比NaCl：KCl：HEPES：EGTA为1：（0.02-0.03）：（0.1-0.2）：（0.2-0.3）的比例溶解于水中，调节pH至7.0-8.0，制成HEPE 缓冲液；
洗涤缓冲液（wash buffer）：
按照质量比NaCl：EDTA：dextrose：柠檬酸钠为1：（0.03-0.04）：（1.0-1.2）：（0.3-0.4）的比例溶解于水中，调节pH至7.0-8.0，制成洗涤缓冲液；
台式缓冲液（Tyrode’s buffer）：
按照质量比NaCl：NaHCO3：KCl：Na2HPO4：MgCl2：HEPES为1：（0.1-0.2）：（0.02-0.04）：（0.005-0.007）：（0.01-0.02）：（0.3-0.4）的比例溶解于水中，之后按照体积比PEG：PMSF：水为1:1:10000的比例加入PEG和PMSF并调节pH至7.0-8.0，制成台式缓冲液；
制备过程：
（1）选用成年大鼠或小鼠，通过心脏取血的方式取血，加入抗凝剂后将血液收集至管内；
（2）收集血液后0-4 h内处理并收集血小板，全血加HEPE buffer以10:1比例进一步抗凝；
（3）80-100 g离心，15-20 min，取上清得富含血小板的血浆；
（4）700-1000 g离心，15-20 min，取沉淀；
（5）加红细胞裂解液（5:1），低温裂解5-10 min，重复步骤（4）；
（6）加入wash buffer重悬沉淀，重复步骤（4）；
（7）用Tyrode’s buffer或水重悬沉淀，用计数仪对收集的血小板计数；
（8）反复冻融3次，-80℃-常温循环，超声破碎处理后得到血小板膜（PNV）；
步骤二、Platesome-DFO的制备
（1）将大豆卵磷脂：胆固醇：mPEG-DSPE-2000按质量比3.8:2:1溶解在装有4 mL无水乙醇的茄形瓶中，45℃水浴，转速60r/min，旋蒸15 min，直至无水乙醇全部蒸出，且烧瓶底为均匀的薄膜。
（2）向茄形瓶内加入浓度50 mg/mL的 DFO生理盐水溶液2mL进行水化，同时加入5个玻璃珠，在超声清洗仪的帮助下水化5 min，直至瓶壁上的膜全部洗脱在溶液中，得到DFO脂质体（Liposome-DFO）。
（3）将制备的脂质体用挤出器挤出后超滤，条件3000g，30min，加生理盐水再离心30min，再加盐水，离心50min，取出脂质体，加入PNV（约含有2.0×109个血小板），用生理盐水重悬沉淀，之后用挤出器进行共挤出，挤出时依次通过400 nm、200 nm的滤膜，反复挤出后得到Platesome-DFO。所得Platesome-DFO包封率为12%。
实施例2 一种血小板-DFO脂质体纳米颗粒（包封率为11%）的制备
步骤一、血小板膜的制备
制备方法与实施例1相同。
步骤二、Platesome-DFO的制备
（1）将大豆卵磷脂：胆固醇：mPEG-DSPE-2000按质量比4:2:1溶解在装有4 mL无水乙醇的茄形瓶中，45℃水浴，转速60r/min，旋蒸15 min，直至无水乙醇全部蒸出，且烧瓶底为均匀的薄膜。
（2）向茄形瓶内加入浓度50 mg/mL的 DFO生理盐水溶液2mL进行水化，同时加入5个玻璃珠，在超声清洗仪的帮助下水化5 min，直至瓶壁上的膜全部洗脱在溶液中，得到DFO脂质体（Liposome-DFO）。
（3）将制备的脂质体用挤出器挤出后超滤，条件3000g，30min，加
生理盐水再离心30min，再加盐水，离心50min，取出脂质体，加入PNV（约含有1.5×109个血小板），用生理盐水重悬沉淀，之后用挤出器进行共挤出，挤出时依次通过400 nm、200 nm的滤膜，反复挤出后得到Platesome-DFO。所得Platesome-DFO包封率为11%。
实施例3 一种血小板-DFO脂质体纳米颗粒（包封率为9.5%）的制备
步骤一、血小板膜的制备
制备方法与实施例1相同。
步骤二、Platesome-DFO的制备
（1）将大豆卵磷脂：胆固醇：mPEG-DSPE-2000按质量比3:2:1溶解在装有4 mL无水乙醇的茄形瓶中，45℃水浴，转速70r/min，旋蒸15 min，直至无水乙醇全部蒸出，且烧瓶底为均匀的薄膜。
（2）向茄形瓶内加入浓度20 mg/mL的 DFO生理盐水溶液2mL进行水化，同时加入5个玻璃珠，在超声清洗仪的帮助下水化5 min，直至瓶壁上的膜全部洗脱在溶液中，得到DFO脂质体（Liposome-DFO）。
（3）将制备的脂质体用挤出器挤出后超滤，条件3000g，30min，加生理盐水再离心30min，再加盐水，离心50min，取出脂质体，加入PNV（约含有1.5×109个血小板），用生理盐水重悬沉淀，之后用挤出器进行共挤出，挤出时依次通过400 nm、200 nm的滤膜，反复挤出后得到Platesome-DFO。所得Platesome-DFO包封率为9.5%。
实施例4 Platesome-DFO对缺血性脑中风溶栓后损伤的治疗作用
方案1：与对照组相比，Platesome-DFO治疗使小鼠脑梗死体积减少2.5倍
（1） 按照实施例1中的方法制备Platesome-DFO。
（2） 通过大脑中动脉内线栓阻断法 (Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO) 使小鼠脑缺血60min，之后拔出线栓，血流再灌注24h，建立小鼠I/R模型，模拟人类缺血性脑中风溶栓后的血液再灌注。
（3）设置Saline、DFO、Liposome-DFO、PNV和Platesome-DFO共5组制剂，在脑缺血再灌注时，通过尾静脉注射各组药物，按药量为25 mg DFO/kg体重的相对剂量进行治疗。
（4）再灌注24 h后，用5 %水合氯醛麻醉，断头取脑，脑槽内将鼠脑切片后置于2 %TTC染液中，在37 ℃恒温培养箱中避光染色7 min。
（5）拍照并计算梗死体积，梗死体积百分比=（对侧半球体积-同侧半球未梗死区域体积）/对侧梗死区半球体积×100 %。Saline、DFO、Liposome-DFO、PNV和Platesome-DFO组小鼠脑梗死体积分别为：40%，38%，32%，38%，16%，与对照组相比Platesome-DFO治疗后使梗死体积减小2.5倍。
方案2：与对照组相比，Platesome-DFO治疗使小鼠脑梗死体积减少1.65倍
（1）按照实施例1中的方法制备Platesome-DFO。
（2）通过大脑中动脉内线栓阻断法 (Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO)使小鼠脑缺血60min，之后拔出线栓，血流再灌注24h，建立小鼠I/R模型。
（3）设置Saline、DFO、Liposome-DFO、PNV和Platesome-DFO共5组纳米药物治疗中风小鼠，再灌注时，通过尾静脉注射各组药物，按药量为15 mg DFO/kg体重的相对剂量进行治疗。
（4）再灌注24 h后，用5 %水合氯醛麻醉，断头取脑，脑槽内将鼠脑切片后置于2 %TTC染液中，在37 ℃恒温培养箱中避光染色7 min。
（5）拍照并计算梗死体积，梗死体积百分比=（对侧半球体积-同侧半球未梗死区域体积）/对侧梗死区半球体积×100 %。Saline、DFO、Liposome-DFO、PNV和Platesome-DFO组小鼠脑梗死体积分别为：38%，36%，30%，36%，23%，与对照组相比Platesome-DFO治疗后使梗死体积减小1.65倍。

Claims (4)

1.一种血小板-DFO脂质体纳米颗粒，其特征在于：其为三层结构，最内层是铁螯合剂DFO，其中间层为脂质体，由大豆卵磷脂：胆固醇：mPEG-DSPE-2000按质量比(3-4):2:1制备而成，用以包裹最内层铁螯合剂DFO，最外层包裹血小板膜，DFO脂质体与血小板膜的比例为1 mL:1.0-2.0×109个血小板的膜，血小板-DFO脂质体纳米颗粒中，DFO含量为5-15mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种血小板-DFO脂质体纳米颗粒，其特征在于：粒径100~200nm。
3.一种如权利要求1或2所说的血小板-DFO脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、血小板膜的制备
试剂配制：
HEPE 缓冲液（HEPE buffer）：
按照质量比NaCl：KCl：HEPES：EGTA为1:(0.02-0.03):(0.1-0.2):(0.2-0.3) 的比例溶解于水中，调节pH至7.0-8.0，制成HEPE 缓冲液；
洗涤缓冲液（wash buffer）：
按照质量比NaCl:EDTA:dextrose:柠檬酸钠为1:(0.03-0.04):(1.0-1.2):(0.3-0.4)的比例溶解于水中，调节pH至7.0-8.0，制成洗涤缓冲液；
台式缓冲液（Tyrode’s buffer）：
按照质量比NaCl:NaHCO3:KCl:Na2HPO4:MgCl2:HEPES为1:(0.1-0.2):(0.02-0.04):(0.005-0.007):(0.01-0.02):(0.3-0.4)的比例溶解于水中，之后按照体积比PEG:PMSF:水为1:1:10000的 比例加入PEG和PMSF并调节pH至7.0-8.0，制成台式缓冲液，备用；
制备过程：
（1）选用成年大鼠或小鼠，通过心脏取血的方式取血，加入抗凝剂后将血液收集至管内；
（2）收集血液后0-4 h内处理并收集血小板，全血加HEPE buffer以10:1比例进一步抗凝；
（3）80-100 g离心，15-20 min，取上清得富含血小板的血浆；
（4）700-1000 g离心，15-20 min，取沉淀；
（5）加红细胞裂解液（5:1），低温裂解5-10 min，重复步骤（4）；
（6）加入wash buffer重悬沉淀，重复步骤（4）；
（7）用Tyrode’s buffer或水重悬沉淀，用计数仪对收集的血小板计数；
（8）反复冻融3次，-80℃-常温循环，超声破碎处理后得到血小板膜（PNV）；
步骤二、Platesome-DFO的制备
（1）将大豆卵磷脂：胆固醇：mPEG-DSPE-2000按质量比（3-4）:2:1溶解在装有3-5 mL无水乙醇的茄形瓶中，45-50 ℃水浴，转速60-70 r/min，旋蒸10-20 min，直至无水乙醇全部蒸出，且烧瓶底为均匀的薄膜；
（2）向茄形瓶内加入浓度20-50 mg/mL的 DFO生理盐水溶液1-2mL进行水化，同时加入3-6个玻璃珠，在超声清洗仪的帮助下水化2-5 min，直至瓶壁上的膜全部洗脱在溶液中，得到DFO脂质体（Liposome-DFO）；
（3）将制备的脂质体用挤出器挤出后超滤，条件3000g，30min，加生理盐水再离心30min，再加盐水，离心50min，取出脂质体，加入步骤一制备的PNV（约含有1.0-2.0×109个血小板），用生理盐水重悬沉淀，之后用挤出器进行共挤出，挤出时依次通过400 nm、200 nm的滤膜，反复挤出后得到Platesome-DFO成品。
4.一种如权利要求1或2所述的的血小板-DFO脂质体纳米颗粒的应用，其特征在于，制备成静脉注射液、胶囊、口服液、滴丸、喷鼻剂任意一种，作为治疗缺血溶栓后的一种药物应用。
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