JPS62502549A - 生物学的活性物質を担持する巨大分子担体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的活性物質を付加した 巨大分子の担体の生成方法 本発明は低密度リポたん白質（以下ＬＤＬという。）の再構成を基礎とした、ド ラッグと呼ばれる、生物学的活性物質のための担体の調製方法に関する。

学術用語としての生物学的活性物質乃至ドラッグは、現在の論文においては非常 に広い意味に用いられており、薬学的な活性物質、酵素、毎素、放射線増感剤、 放射性物質等を含むものである。

生物学的活性物質、例えば、ある器官或いはある目標とする細胞において処置の 効能を増し、副作用を減らすための、制ガン性ドラッグの濃度を増すために多く の試みがなされてきている。

これを実現する一方法はドラッグを担体、例えば巨大分子につなぐことである。

その論理的根拠は、巨大分子が目標とする細胞によく吸収されるものだからであ シ、或いは別の面で連鎖担体／ドラッグが独立ドラッグでの場合よりも良好な効 能を示すからである。

たくさんの巨大分子が、ＤＮＡ、！Ｊプソーム、赤血球ゴースト細胞、レクチン 、抗体のような別のタンパク質、ペプチドホルモン、及び糖たん白質のような担 体としての使用に関して研究されてきている。

ドラッグと連鎖した理想的な担体は以下の基準を充たすものである。

１、　投与位置と目標細胞とを分ける解剖学的隔壁を透過すること。

２、　担体とドラッグとの連鎖が血液中で充分に安定していること。

五　肝臓とひ、蔵内の細網内皮組織系によって血液循環から急速に取り除かれな いこと。

４、　目標としない細胞によって不特定な吸収を防ぐために拡散によって細胞膜 を通過しないこと。

５、　目標とする細胞表面上の受容体とできるだけ選択的に相互作用すること。

＆　担体とは活発に結合しないけれども細胞内で生　′勧学的活性物質が担体に よって細胞内へ運ばれ、そこで結合が引き離されること。

ｌ　非免疫原であること。

リプソームのようないくつかの担体は、上記第３の基準を充たさない。即ち、肝 臓やひ臓によって急速に血液から取や除かれ、それ故に必要な効果を与えるのに 充分な時間留まらないこととなる。

ＬＤＬ、即ち低密度リポたん白質は、種々の親和性属性を有した巨大分子である 。このリポたん白質量的３００万ダルトンの球状粒子でちって、人体を２〜３日 循環する。各Ｔ、ＤＬ粒子は、長鎖脂肪酸にエステル化したコレステロール分子 約１５００個から成る無極コアを含んでいる。当該コアはコレステロ−１し、リ ン脂質、及びアポたん白質Ｂ１アポＢのコア膜に囲まれている。ＬＤＬは人の血 しよう中における約７０％の血しようコレステロールから成る主コレ７テロール 搬送体である。は乳動物の細胞は、アポＢを認識しＬＤＬ粒子を結んでいる表面 上の特有ＬＤＬ受容体を有している。ＬＤＬ粒子はりゾゾームに対してエンドン トーシス作用し搬送して、そこで退化する。

生物学的活性物質が、血しよう内での生物学的な半減期と吸収とを取り次ぐＬＤ Ｌ受容体に関して再構成のＬＤＬが天然のＬＤＬのように作用するように、ＬＤ Ｌ粒子に混合されるか結合されるならば、当該物質はＬＤＬ受容体の高水準を示 す細胞を目標とすることができる。ＬＤＬの長い半減期のために系は適切な物質 にとって緩い解放系としても行動する。

クリーガー等は再構成方法を記載している（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５３　（１９７８年）　４０ｑ　５〜４１０１頁及び同 ２５４（１９７９年）３８４３〜３８５ヘプトンのような有機溶媒で抽出すると いうものである。再構成されるべき物質を有機溶媒で溶解し、脂質の低下したＬ ＤＬで培養する。有ｔａ溶媒を蒸発させた後、再構成ＬＤＬを含水バッファ中で 溶解する。

クリーガー等の提案する方法に依る再構成ＬＤＬ粒子が試＠管内で吸収を取シ次 ぐＬＤＬ受容体を示したとしても、再構成粒子が肝臓やひ臓内の細網系皮糸の細 胞によって急速に吸収されてしまうので生体に用いるこをができない。我々：は 思いもよらず試験管内においても生体内においても天然ＴＪＤＬとほぼ同じ属性 を有する再構成ＬＤＬ粒子を与えるような、再構成方法を改良することを見出し だ。

本発明は、再構成ＬＤＬを基礎とする生物学的活性物質を付加した担体の調製方 法にして、（１）ＬＤＬを保護作用物の存在下に凍結乾燥させ、（２）凍結乾燥 したＬＤＬを有機溶媒で抽出し、（３）生物学的活性物質を溶媒内で溶解し抽出 ＬＤＬで培養し、（４）溶媒を蒸発させ、（５）再構成ＬＤＬを含水バッファ中 で溶解し、（６）混合していない物質をＬＤＬ−錯体から分離する方法に関する 。第（１）段階の手順において保護作用物とは単糖類、二糖類、水溶性多糖類、 糖アルコール或いはこれらの混合物であり、第（３）段階において凍結乾燥した ＬＤＬの抽出で得られる抽出物を有機溶媒に溶けている親脂性の生物学的活性物 質と適宜混合して、この混合物をＬＤＬで培養する。

本発明に依る方法はクリーガー法と主に保護物質の使用に２いて異なる。第（１ ）段階でクリーガーは保護作用物としてジャガイモでんぷんを使用している。

ジャガイモでんぷんは非水溶性の扁分子量多糖類である。我々の方法においては 保護作用物として、単糖類、三糖類、水溶性多糖類、糖アルコール或いはこれら の混合物を使用している。

血しようの浄化を調べるために、人ＬＤＬをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の静脈内に 注入し、９０分後血しよう内に残っている注入量の割合を測定する。９０分後に 血しよう内に残っている天然ＩＬＤＬのパーセンテージは５９である８クリーガ ー法に依シ再構成されたＬＤＬの血しよう内に残っているパーセンテージは非常 に低く、３より小さい。本発明に依る血しよう内に残っているパーセンテージは ５７〜５８の値であって、これは非常に驚くべき且つ技術的に重要な発展である 。

マウスにおける血しようの浄化は、放射性分類されたＬＤＬ用血しよう分解曲線 、即ち入熱ＬＤＬ用血しよう分解曲線、クリーゴー法に依る再構成ＬＤＬ用血し よう分解曲線及び本発明に依る再構成ＬＤＬ用血しよう分解曲線から定められる 。第１図から明らかなように天然ＬＤＬと本発明に依る再構成ＬＤＬは同じ浄化 状態であって、クリーゴー法に依る再構成ＬＤＬは血しよう中から急速に消滅す る。

バッファ内に溶解している種々に調製されたＬＤＬの粒径は、疑似的電気光を散 乱することで測定される。いかなる保護物質も伴わない凍結乾燥のＬＤＬの外見 上の平均流体的半径は天然ＬＤＬの約２．９倍の大きさであシ、保護物質として のジャガイモでんぷんの存在下に凍結乾燥しているＬＤＬは約２．７倍の半径を 有する一方で、蔗糖の存在下に凍結乾燥しているＬＤＬは天然ＬＤＬの約１．２ 倍の半径を有見上平均流体的半径を有し、本発明に依る再構成ドラッグ−ＬＤＬ 錯体は天然ＬＤＬでの約１．３倍の半径を有している。

クリーガーの再構成方法は、ＬＤＬのコアからコシ７　Ｔ　Ｏ−）Ｌｔエステｉ ’を抽出ｆル、Ａ、ガスタフソン（Ａ、　Ｃ）ｕｓｔａｆｓｏｎ　）によって開 発された方法（Ｊ。

Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、１９６５年、６，５１２〜５１７頁）に基づいている。こ の方法でのカギは凍結乾燥しＬＤＬのコアから中性、脂質のへブタン抽出を打う 間、脂質の少ないアポたん白質を安定させるのにジャガイモでんぷんを用いるこ とである。

上記のようにクリーゴー法はＬＤＬを充分には保護しない。所望の物質乃至ドラ ッグを有したコア内に適当な量の中性脂質を戻すことが５０５粒子の再構成にと って重要である。ドラッグ−ＬＤＬ錯体がＬＤＬ受容体通路を通って目標に達し 、あまりに多（のドラッグがＬＤＬ粒子内に挿入すると、５０５粒子が血液や血 管内の異なる細胞に衝突した際ドラッグ漏出の危険がある。これによりドラッグ の不特定の吸収が起こり、この場合に混合したドラッグ−ＬＤＬ錯体は緩慢な解 放系として機能する。適当な保護物質は５０５粒子の凝集や粒子が砕けるような 他のダメージを予防し、５０５粒子から脂質が戻シすぎないように予防する。

用いられる保護物質の量が少なすぎるならば、結果的に再構成される５０５粒子 が血しようから急速に浄化されるようになる。この効果は比例せず、保護物質の 量は少（ともＬＤＬ　１■当り（ＬＤＬをたん白質として測る）１■にならねば ならない。他方、保護物質の量が多すぎるならば、混合されるドラッグ量が少な くなる。これは用いられる保護物質の量においである範囲が存在していることを 意味している。

上述の基準を満たす保護物質は慴糖類、二別類、三糖類、水溶性多糖類、糖アル コール或いはこれらの混合物のような水溶性の糖類でちる。本発明に用いられる 単糖類の例としては、グルコース、マンノス、タローヌ、ソルボース、リブロー ス、キシルロース、ガラクトース及びフルクトースがある。三糖類の例としては 、蔗糖、テレハロース、ラクトース及び麦芽糖がある。三糖類の例としてはラフ ィノースがある。水溶性多糖類の間では一定の水溶性でんぷんとセルロースを挙 げることができる。糖アルコ−／しの例はグリセリンである。

本発明における保護作用物は好ましくはＬ’ＤＬ錯体が天然Ｌ’ＤＬのように動 （こととなるフルクトース、グルコース或いは蔗糖である。

凍結乾燥したＬＤＬの抽出を行う第（２）段階に用いられる有機溶媒は、好まし くはへブタンや四塩化炭素のような無極溶媒である。ヘプタンが好ましい溶媒で ある。

凍結乾燥したＬＤＬに混合される生物学的活性物質は、親脂惟物貿でなければな らない。本発明に依１）　Ｌ　ＤＬ粒子に混合されうる生物学的活性物質として は、非腫瘍ドラッグ、コシステロール組織に作用するドラッグ、並びに放射線に 対して増感作用のある物質、酵素、酵素抑制物、放射性物質、毒素等である。

ＬＤＬと生物学的活性物質とから成る錯体から混合していない生物学的活性物質 の分離は、含水緩衝物への溶解の後、遠心分離やろ過等の公知方法によって行わ れる。

本発明を、以下の例において示すが、ここでは温度全セ氏で与えである。

当該例に用いられるＬＤＬは、健康なボランティアからの血しようを超遠心分離 して得られた人ＬＤＬ（密度１．０１９〜１．０６３　）でちる。ＬＴ）Ｌ全量 はローリ法（Ｊ、Ｂｉ−ｏｌ、ｃｈｅｍ、　１９３　（１９５１年）２６５〜２ ７５頁、ここではウシ属の血清アルブミンが標準とし１用いられている）に依る たん白質に関連する。用いられる生物学的活性物質は非腫瘍ドラッグＡＤ−３２ ，Ｎ−）リフルオルアセチルアドリアマイシン−１４−吉草酸エステルである。

生体試験はＢＡＬＢ／ｃマウヌを用いて行われる。

例１ ２■のＬＤＬ　（液体として４００μりをα３　ｍＭのナトリウム、ＥＤＴＡで の透析後にシリコンガラスチューブに移し、蔗糖１００■を加える。溶液をエタ ノール中−５０℃で急速凍結し、５〜６時間凍結乾燥する。この乾燥調製物を５ ｆｎｔのへブタンで３回抽出する。ヘプタン相かた′まって濃縮される。５−の 無水ジエチルエーテル中の２■のＡＤ−３２をその際乾燥抽出物に加える。溶液 をゆつくシとしたかく拌により抽出ＬＤＬと混合し、４℃で１５分間培養する。

溶媒を窒素で濃縮し、ドラッグ−ＬＤＬ錯体をｐＨａ　４．１０ｍＭ）リシン１ ７！の添加で溶解する。

非混合の不溶性薬剤はペックマン式微細除去機（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｍｉｃｒｏｆ ｕｇｅ　）で５分間遠心分離することにより分離される。これによってＩ　ＬＤ Ｌ粒子当シＡＤ−３２を１１０〜１３０分子含んだ再構成ＬＤＬ粒子が作られる 。ＢＡＬＢ／Ｃマウス内の血しよう中に残存しているパーセンテージは９Ｄ分後 において約′５８でちる。

例２ 凍結乾燥したＬＤＬをヘプトンで抽出するのではな（、代わシにエーテル内に溶 けたＡＤ−１２を直接添加するようにした以外は例１と同様にする。これによっ てＩ　ＬＤＬ粒子当りＡＤ−３２を約３５〜４３分子含むようになシ、血しよう 中の残存パーセンテージが約５５となる。

例３ 保護作用物としての蔗糖の代わりに８０−のグリセリンを用いる以外は例１と同 様にする。これてよってＩＬ’ＤＬ粒子当りＡＤ　−５２を約５０分子含むよう 洸なシ、血しよう中の残存パーセンテージは約蔗糖の代わシに２５ｍｑのジャガ イモでんぷんを用いる以外は例１と同様にする。ＬＤＬの抽出後に得られる抽出 物を廃果し、無水エーテル内のＡＤ−３２を直接抽出ＬＤＬに扉える（クリーゴ ー法）。これによってＩＬＤＬ粒子当υＡ　Ｄ　−−３２を約４００分子含むよ うになるが、血しよう中に残存する注入量のパーセンテージは６以下となる。

蔗糖の代わりに２５１Ｎｉのジャガイモでんぷんと８０−のグリセリンを用いる 。これによってＩ　ＬＤＬ粒子当ｐＡＤ−ｓ２を約５０分子含むようになり、血 しよう中の残存パーセンテージは約５０となる。

臨床試験１ この試験においてはドラッグｋＤ−５２を用いる。

この試験に供されたＡＤ−３２の量はマウスにとっての中毒レベルよシも充分に 低いものであり、ドラッグ−ＬＤＬ錯体の目的とする効果を独立ドラッグのそれ とを比較した例を示すためにその結果をここに表わす。ＢＡＬ；Ｂ／ｃマウスに １．　ＯＸ　Ｉ　０６個のＷＥＨＩ−３Ｂ細胞、ネズミ類の単髄球の細胞列が腹 膜を通して注入される。制御された叫と１．９ｍｑＡＤ−３２／ｋｇ７／ｄａｙ で５日間処理された群との間で残存（増大した寿命）において違い（２Ｘ）はな かった。ＡＤ−３２をエタノールとひまし油の混合物に溶かし腹膜を通して供与 する。例１の処理に従ってＬＤＬに混合されたＡＤ−３２を腹膜を通して５日間 供され同量を与えられたマウスは寿命が２６％増加した。

臨床試験２ Ｂ　ＡＬ　Ｂ／ｃマウスに１．　ＯＸ　１０’個のＷＥＨＩ−３Ｂ細胞が腹膜を 通して注入され、アルキル基を導入した作用物、４−７ミノＮ、Ｎ−ビア、（ク ロロエチＩｖ）−２−メチル−ナフタリンが、本方法に従って混合される。当該 マウスは４日連続して腹膜を通して処理され、その結果を第２図に示す。制御群 は１２〜１８日の間に死に、一方処理された群においては、２５日目で死に始め 、４２日目でまだ５０％生きていて、４０％はなお残存した（５０日目）。

血しょう放射能　（多　注入量に対する）−マウスの残存数 手続補正書（方創 昭和６２年２月２３日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．再構成ＬＤＬを基礎とする生物学的活性物質を付加した担体の調製方法にし て、（１）ＬＤＬを保護作用物の存在下に凍結乾燥させ、（２）凍結乾燥したＬ ＤＬを有機溶媒で抽出し、（３）溶媒内て溶解した生物学的活性物質を抽出ＬＤ Ｌで培養し、（４）溶媒を蒸発させ再構成ＬＤＬを含水バツフア中で溶解し、（ ５）混合していない生物学的活性物質をＬＤＬ一錯体から分離する方法において 、 第（１）段階での保護作用物が単糖類、二糖類、水溶性多糖類、糖アルコール或 いはこれらの混合物であり、第（３）段階では凍結乾燥したＬＤＬの抽出で得ら れる抽出物を有機溶媒に溶けている親脂性の生物学的活性物質と適宜混合し、こ の混合物をＬＤＬで培養することを特徴とする方法。
2. ２．保護作用物がグリセルアルデヒド、キシロース、リキソース、ラフイノース 、グルコース、マンノース、ガラクトース、タロース、リブロース、キシルロー ス、テレハノース、フルクトース、ソルボース、麦芽糖、ラクトース、庶糖、グ リセリン或いはこれらのうちでの混合物であることを特徴とする請求の範囲第１ 項に記載の方法。
3. ３．保護作用物が庶糖であることを特徴とする請求の範囲第１項と第２項に記載 の方法。
4. ４．保護作用物がグルコースであることを特徴とする請求の範囲第１項と第２項 に記載の方法。
5. ５．保護作用物がフルクトースであることを特徴とする請求の範囲第１項と第２ 項に記載の方法。
6. ６．第（２）段階での有機溶媒がｎ−ヘプタンであることを特徴とする請求の範 囲第１〜５項のいずれかに記載の方法。
7. ７．第（３）段階で生物学的活性物質の溶解に用いられる溶媒がエチルエーテル 、ヘプタン、四塩化炭素或いはベンゼンであることを特徴とする請求の範囲第１ 〜６項のいずれかに記載の方法。
8. ８．保護作用物の量がＬＤＬをたん白質として測つて、ＬＤＬ１ｍｇ当り０．５ 〜１００ｍｇの範囲であることを特徴とする請求の範囲第１〜７項に記載の方法 。
9. ９．請求の範囲第１〜８項の方法により得られた生成物を人及び動物の診断上及 び治療上の目的、好ましくは人のガン治療へ使用すること。
10. １０．請求の範囲第１〜８項の方法により得られた生成物。