KR100354944B1 - 제약조성물 - Google Patents

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Abstract

분자당 5개 이상의 시알산 잔기를 포함하는 폴리사카라이드는 생체 내에서 제약학적으로 활성화합물의 순환시간을 증가시키기 위해, 면역원성을 감소시키기 위해 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 사용한다. 제약학적으로 활성화합물은 폴리사카라이드에 공유적으로 결합된 외래 단백질일 수 있다. 또한 활성 화합물은 예를들면 리포솜과 같은 거대분자 DDS 또는 입자성 DDS인 약제 전달계(DDS)와 회합될 수 있다. 폴리사카라이드는 예를들면 당지질과 같은 박테리아성 폴리사카라이드 또는 예를들면E. coliK1,N. meningitidis, Moraxella nonliquifaciens및Pasteurella aeroginosis의 폴리사카라이드 B 또는E. coliK92의 K92 등의 그것의 유도체이다.

Description

제약 조성물
제 1도는 정맥 주사후 폴리사카라이드 B의 반감기를 나타낸 그래프이고,
제 2도는 혈액 순환계로부터 플루오레신에 접합된 온전한(intact) 저분자량 PSB의 소거를 나타낸 그래프이고,
제 3도는 혈액으로부터 플루오레신에 접합된 탈아실화된 저 분자량 폴리사카라이드 B (N. meningitidis)의 소거를 나타낸 그래프이고
제 4도는 정맥 주사후 순환계로부터 폴리사카라이드 C (PSC) (N. meninggitidis)의 소거를 나타낸 그래프이고,
제 5도는 정맥내 주사후 순환계로부터 폴리사카라이드 K92의 소거를 나타낸 그래프이고,
제 6도는 정맥 주사후 순환계로부터 콜로민산과 콜로민산-FITC 접합체의 소멸을 나타낸 그래프이고,
제 7도는 콜로민산과 SUV (적용 전에 혼합된)의 용출 프로파일을 나타낸 그래프이고,
제 8도는 리포솜성 D6의 용출 프로파일을 나타낸 그래프이고,
제 9도는 콜로민산 유도체 D11의 용출 프로파일을 나타낸 그래프이고,
제 10도는 주사후 시간 간격을 두고 채취된 혈액중 리포솜성 CF의 농도를 나타낸 그래프이고,
제 11도는 콜로민산과 1-브로모옥타데칸의 커플링 반응의 개략도이고,
제 12도는 콜로민산 크라운 에테르와 N-테트라데실-(2-브로모헥사데실카르복사미드의 커플링 반응의 개략도이다.
실시 예 1
정맥 주사 후 폴리사카라이드 B의 반감기
25 내지 30g 체중의 T.O. 이계교배 마우스들에게 응집된 또는 탈응집된 형태로N. meningitidis그룹 B 폴리사카라이드 1.4 내지 2.8mg을 함유하는 pH7.4 인산염 완충된 염수 0.2mℓ를 정맥(꼬리 정맥) 주사하였다. 동물들을 주사직전 및 주사후 시간 간격으로 꼬리 정맥으로부터 채혈하였고, 혈액 혈청 샘플들을 그룹 B 폴리사카라이드에 대해 분석(assay)하였다. 분석은 시알산을 또한 함유하는 (그렇지 않으면 방법을 방해한다) 다수의 혈청 단백질의 침전 후 비색법에 의한 시알산의 측정을 포함한다. 혈청중 그룹 B 폴리사카라이드 값은 로그 그래프로 나타내었고, 응집된 또는 탈응집된 상태로 주입된 폴리머의 반감기들이 유도되었다. 그 결과는 다음 표 1에 나타냈고 제1도에 그래프로 예시하였다.
표 1
* 5개의 개별 실험들에서 T.O. 마우스들의 쌍에게 각기 온전한 또는 탈아실화된 PSB 1.4 내지 2.8mg을 함유하는 PBS중 1% NaCl의 0.2mℓ를 정맥 주사하였다. 마우스들을 꼬리 정맥으로부터 시간 간격으로 채혈하였고, 혈액 혈장을 폴리사카라이드 B에 대해 분석하였다. 결과는 총 마우스 혈액당 주사된 용량의 %로 나타냈다. 표 1에서 수치 결과는 주사된 폴리사카라이드의 40.0 내지 57.8%가 주사후 2 내지 4분내에 순환계에 남아있고, 즉 응집된 폴리사카라이드의 주사된 투여량의 42.2 내지 60%가 주사후 2 내지 4분내에 순환계로부터 제거됨을 보인다. 그런 후, 제거 속도는 약 20시간의 반감기를 느리게 나타낸다. 폴리사카라이드의 초기의 신속 제거는 아마도 폐 또는 1차 경로 상의 RES에 의해 채집된 형성된 입자와 응집된 형태로 되기 때문이다. 대조적으로, 탈응집된 폴리사카라이드의 단지 10 내지 19%만이 주사 후 처음 2 내지 4분 동안 조직에 의해 제거되었다. 투여량의 잔여물은 약 30시간의 반감기로 서서히 제거되었다.
긴 반감기(30시간) 및 탈응집된 그룹 B 폴리사카라이드의 주사된 거의 모든 양을 혈액 순환으로부터의 소거의 1차 속도 (로그 눈금으로)는 폴리머 (탈응집된 형태로)가 그것에 공유적으로 부착되는 제약, 펩티드 및 단백질의 순환을 연장하는 수단으로 소용되기 위한 훌륭한 후보자라는 것을 제시한다.
폴리머는 순환에서 그들의 반감기를 연장시키기 위해 약제를 함유하는 또는 약제에 연결된 DDS 또는 PDDS를 위한 코팅 물질로 또한 소용될 수 있다. 또한 응집된 (당지질) 형태는 인지질-소포 PDDS의 반감기를 증가시키는 것에 유용할 것이다.
실시예 2
혈액 순환로부터 플루오레신에 접합된 온전한 저분자량 PSB의 소거: 투여량의 효과
T.O. 마우스들을125I로 연속적으로 방사성 표지된 플루오레신에 접합된 "저" 분자량 폴리사카라이드 B를 함유하는 인산염 완충 염수(PBS) 0.2 내지 0.25mℓ를 정맥내로 주사하였다. 동물을 시간 간격을 두고 채혈하였고, 혈장에서의125I 방사성을 측정하였다. 값들은 개개의 동물로부터 얻었고, 총 혈액 (체중의 7.5%로 평가)에 주입된 방사능의 %를 나타낸다. 투여량 컬럼은 주사 전에 혼합된 콜드(cold; 비-방사성요오드화된) 및 핫(hot; 방사성요오드화된) FITC-폴리사카라이드-B 접합체의 총량을 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 혼합물에 접합된 방사성요오드화된 양(㎍)을 나타낸다.
결과를 다음의 표 2에 나타냈고, 제2도에 그래프로 예시하였다.
표 2
결과는 접합된 플루오레신이 비-접합된 플루오레신의 공지된 소거 속도에 비교하여 상대적으로 서서히 순환으로부터 소거된다는 것으로 나타낸다. 저-분자량 폴리사카라이드 접합은 주사로부터 30분 이내에 순환으로부터 FITC 접합체의 약 70%가 소거되는 것을 야기한다. 계속해서 반감기는 약 6시간이고 투여량에 비의존적이다. 이 후자의 사실은 폴리사카라이드가 상대적으로 많은 투여량으로 투여시키는 것이 필요한 (즉, 폴리사카라이드의 투여량이 많을 경우) 몇몇 활성성분을 위한 순환 시간을 연장시키기에 효과적임을 방해할 수 있는 "포화 농도"가 없다는 것을 나타낸다. 또 다른 장점은 매우 적은 폴리사카라이드가 활성성분의 순환을 연장시키기 위해 사용될 수 있다는 것이다. 게다가, 속도가 총 FITC에 대한 핫 FITC의 비에 의해 영향받지 않기 때문에, 우리는 콜드 FITC의 소거 속도와는 다를 핫 FITC의 소거 속도를 단순히 측정하지는 않는다.
실시예 3
혈액으로부터 플루오레신에 접합된 탈아실화된 저 분자량 폴리사카라이드 B( N. meningitidis ) 소거: 투여량 효과
T.O 마우스들을125I로 계속해서 방사성 표시된 FITC에 접합된 가수분해된 (탈아실화된) "저" 분자량 폴리사카라이드 B를 함유하는 PBS 0.2 내지 0.25mℓ를 정맥내로 주사하였다. 인지질의 아실기를 제거하기 위해 가수분해(PH8.0, 37℃에서 4시간)는 방사성요오드화된 접합체와 혼합된 FITC-폴리사카라이드 B 접합체를 사용하여 실행하였다.
결과를 다음 표3 및 제3도에 나타내었다.
표 3
결과는 실시예 2의 결과와 유사하고, 실시예 2에 사용된 것과 유사하지만 가수분해에 의해 탈아실화된 인지질을 갖는 이 폴리사카라이드 화합물과의 접합은 주사 30분이내 또는 그 때 FITC-접합체의 단지 29.3 내지 70.2%가 순환에서 제거되어지게 하였으며, 연속적인 반감기는 약 5½시간이 되게 하였다. 인지질 부분의 탈아실화는 농도가 탈아실화된 폴리사카라이드에 상응하는 시간 동안(표 3) 더 높은 처음 몇분 간은 제외하고는, 순환 시간을 증가시키는 것에 관한한, 폴리사카라이드 화합물의 성질에 거의 효과를 갖지 않는 것으로 보이고, 이것은 아마도 더 짧은 사슬길이를 형성하기 위해 천연(native) 폴리사카라이드의 가수분해에 뒤이어서, 폴리사카라이드 분자들의 소수만이 부착된 인지질 사슬을 갖기 때문이다. 따라서, 인지질의 탈아실화는 소수 분자들게 영향을 미친다.
실시예 4
정맥 주사후 순환으로부터 폴리사카라이드 C (PSC) ( N. meningitidis )의 소거
N. meningitidis폴리사카라이드 C를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1의 방법을 따랐다. 온전한 폴리사카라이드와 인지질 기가 탈아실화된 가수분해된 형태를 비교하였다.
T.O 마우스들을 온전한 또는 인지질을 탈아실화 하기 위해 가수분해된 폴리사카라이드 C (PSC) 1250㎍을 정맥내로 주사하였다. 동물을 시간 간격으로 채혈하였고, 혈장 샘플을 N-아세틸 뉴라민산 (NaNa)(시알산)에 대해 분석하였다. 각 동물들의 결과는 총 혈액당 주사된 물질의 %이다.
결과를 다음 표 4에 나타냈고 제4도에 그래프화 하였다.
표 4
결과는, 실시예 1의 결과들에 관해서, 온전한 및 가수분해된 (탈아실화된) FSC 둘 다에 대해서, 폴리사카라이드 화합물의 부분은 주사후 비교적 신속하게 순환으로부터 제거되나, 그 후 제거속도가 느린 것을 나타낸다. 온전한 폴리사카라이드의 제거 속도는 가수분해된 형태 (반감기가 20시간)보다 빠르고(반감기가 낮은 8시간), 가수분해된 형태는 안정한 활성성분의 순환 시간을 연장하기 위하여 사용하기 위한 우수한 후보이다.
실시예 5
정맥내 주사후 순환계로부터 폴리사카라이드 K92의 소거
폴리사카라이드 K92를 사용하는 것을 제외하고는, 그것의 온전한 및 가수 분해된 (인지질기를 탈아실화하기 위해) 형태로 실시예 1 내지 4의 과정을 반복하였다.
T.O. 마우스들을 온전한 또는 가수분해된 (탈아실화된) 폴리사카라이드 K92(PS K92) 1230㎍을 정맥내로 주사하였다. 동물들로부터 시간 간격으로 채혈하고, 혈장 샘플을 N-아세틸 뉴라민산(NaNa)에 대해 분석하였다. 각 동물들로부터의 결과는 총 혈액당 주사된 물질의 %이다.
결과는 다음 표5에 나타냈고, 제5도에서 그래프화 하였다.
표 5
얻어진 결과는 이들 폴리사카라이드 화합물 둘 다의 주사후 처음 몇 분에서 초기 손실은 비교적 낮다 (시험된 다른 폴리사카라이드 화합물과 비교해)는 것을 나타낸다. 게다가 순환으로부터 연속적인 제거 속도가 매우 낮고, 각 경우에 반감기가 약 40시간이었다. 따라서, 5일후 까지도 폴리사카라이드의 상당한 부분이 순환에 남아있다.
이 화합물에서 인지질 부분으로부터 아실기의 제거는 반감기에 상당한 차이를 만드는 것으로 나타나지 않고, 이것은 왜 그런지 충분히 이해되지 않았다. 화합물의 그 특이한 배치는 그것의 특성에 현저한 영향을 미쳐서 인지질의 존재는 거의효과를 갖지 않는다고 보인다. 이들 화합물은 약제의 순환시간 및 안정성을 증가시키기에 매우 유익할 것으로 기대되고 그리고 표적기에 의해 기관 또는 세포에 표적화의 최적화를 허용하는 우수한 연장된 방출 특성을 그들에게 제공할 것이다.
실시예 6
정맥 주사후 순환으로부터 콜로민산과 콜로민산-FITC 접합체의 소거
실시예 1의 방법을 온전한 콜로민산에 대해 반복하였다.125I로 표지된 FITC-콜로민산 접합체를 일련의 별개 실험들에서 투여하였고, 그 결과를 실시예 2에서와 같이 평가하였다.
T.O. 마우스들을 FITC-콜로민산 1600㎍과 온전한 콜로민산 1920㎍으로 주사하였다. 동물들로부터 시간 간격으로 채혈하였고, 혈장 샘플을 NaNa에 대해 분석하였다. 각 동물로부터의 결과는 총 혈액당 주사된 물질의 %이다.
결과를 다음의 표 6에 나타냈고 제 6도에 그래프화 하였다.
표 6
얻어진 결과는 FITC-콜로민산 접합체의 순환으로부터 제거 속도가 단독 콜로민산의 제거속도와 실질적으로 동일하는 것을 나타낸다. 폴리사카라이드가 FITC의 순환 시간을 증가하는 효과를 다소 갖지만, 더 긴 반감기를 갖는 더 고 분자량 폴리사카라이드에 비해 개선이 양호하지는 못하다.
실시예 7
콜로민산-지질 유도체의 제조
물질 및 방법
계란 레시틴을 Lipid Products, Nuthill, Surrey로부터 구입하였다. 콜레스테롤, 디클로로메탄(DCM), 디메틸포름아미드 (DMF), 클로로포름 및 메탄올을 사(Merk, 독일)로부터 구입하여, 더 이상 정제하지 않고 사용하였다.E. coli로부터의 콜로민산나트륨염 (폴리-2,8-N-아세틸뉴라민산) 및 세파덱스 G-2000 (굵은)을 시그마 케미칼사(Sigma Chemicals)로부터 얻었다. 18-크라운-6, 2-브로모헥사데카노산, 1-테트라데실아민, 1-브로모옥타데칸 및 2,4,6 트리클로로페놀을 알드리치 케미칼사(Aldrid Chemical Company)로부터 구입하여 더 이상 정제하지 않고 사용하였다.
실시예 7.1
옥타데칸과의 콜로민산 접합체의 합성 (제 11도)
(a) 콜로민산 크라운 에테르의 제조
콜로민산 (나트륨염) (50mg)을 증류수 20mℓ에 용해하고, 18-크라운-6 (30mg)을 20℃에서 30분동안 교반하면서 첨가하였다. 물을 냉동건조로 증발시켰다.
(b) 1-브로모옥타데칸과 콜로민산 크라운 에테르와의 커플링 (생성물 D6):
콜로민산 크라운 에테르 (35mg)를 DMF 1.5mℓ중에 용해시켰고, 1-브로모옥타데칸 (6mg)을 24시간동안 20℃에서 교반하면서 첨가하였다. 용제를 증발시키고, 생성물을 증류수 1mℓ중에 재용해하였다. 물의 제거는 냉동건조로 실시하였다.
실시예 7.2
N-테트라데실헥사데실카르복사미드와 콜로민산 접합체의 합성 (제 12도)
N-테트라데실-(2-브로모헥사데실 카르복사미드)의 합성
(a) 2-브로모헥사데카노산 페닐에스테르의 제조
2-브로모헥사데카노산(1g)을 무수 클로로포름(20mℓ)에 용해하였다. 2,4,6 트리클로로페놀(0.558g)의 첨가 후, 반응혼합물을 얼음 욕조에 위치시켰다. 무수클로로포름(2mℓ) 중에 용해된 디시클로헥실카르보디이미드(0.736g)을 용액에 첨가하였다. 얼음 욕조에서 15분간 용액을 교반 후, 온도를 20℃르 맞추었다. 생성물의 형성을 용매로 디클로로메탄/메탄올 (10:0.1 v/v) 혼합물을 사용하여 규산 플레이트 상에 박층 크로마토그래피하여 확인하였다. 용액을 24시간동안 20℃에서 교반하였고, 침전된 우레아를 여과로 제거하였다. 여과액을 중탄산나트륨 용액(0.05M)과 물로 두번씩 세척하였다. 조(crude) 반응 생성물을 용리액으로 상기와 동일한 용매 시스템을 사용하여 실리카겔 상에서 액체 크로마토그래피하여 정제하였다.
(b) N-테트라데실-(2-브로모헥사데실카르복사미드)의 제조:
1-테트라데실아민(0.591g)을 무수 클로로포름중 2-브로모헥사데카노산 페닐 에스테르(1.425g)의 용액에 교반하면서 20℃에서 24시간 동안 첨가하였다. 펩티드 결합의 형성을 용매로 디클로로메탄/메탄올 (10:0.1 v/v) 혼합물을 사용하여 규산 플레이트 상에서 박층 크로마토그래피하여 확인하였다. 반응 혼합물을 시트르산 용액(10%, w/v), 중탄산나트륨 용액(0.05M) 및 물(x 3)로 세척하였다.
(c) 콜로민산 크라운 에테르와 N-테트라데실0(2-브로모헥사데실 카르복사미드)의 커플링 (생성물 D11)
콜로민산 크라운 에테르(80mg)를 건조 디메틸포름아미드(DMF) 4mℓ중에 용해하였다. N-테트라데실-(2-브로모헥사데실 카르복사미드) 60mg의 첨가 후, 용액을 24시간 동안 20℃에서 교반하였다. 그리고 나서 용액을 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 물(2mℓ)에 용해하고, 이어서 냉동건조로 물을 제거하였다.
실시예 7.3
리포솜내로 콜로민산-지질 유도체들의 병합
유도체들을 병합시키는 작은 균일박막층(unilamellar) 리포솜(SUV)를 제조하기 위해, 클로로포름에 계란 포스타티딜콜린(PC)(32μmol)과 콜레스테롤(32μmol)을 1:1의 몰비로 혼합하였다. 상기와 같이 합성된 콜로민산-지질 유도체(총 리포솜성 지질의 10% w/w)를 클로로포름/메탄올(1:1 v/v)중에 용해하고, 지질 혼합물에 첨가하였다. 용매를 진공하에 로터리 증발기를 사용하여 건조하고, 건조된 지질을 완만한 세이킹에 의해 인산칼륨 완충액(pH7.4, 0.1M) 2mℓ중에 현탁하였다. 밀크성 현탁액을 30초 간격으로 10분 동안씩 얼음 욕조에서 초음파분쇄 하였다. 초음파분쇄 후, 샘플을 2시간동안 20℃온도에서 방치하였다. 비-병합된 물질을 인산칼륨 완충액 (pH7.4, 0.1M)으로 예비-평형된 세파덱스 G-200 상에서 컬럼 크로마토그래피하여 리포솜으로부터 분리하였다.
콜로민산의 측정
콜로민산을 상기에 기재된 일반적인 방법을 사용하여 크로마토그래피에 의해 얻어진 분획 0.1mℓ에서 분광광도법으로 측정하였다. 리포솜내로 콜로민산 병합의 범위 (사용된 총 %)는 리포솜 피크와 실질적으로 수집된 이들(비-병합된 물질의 2차피크)에 대한 분획에 회수된 총량을 기초로 평가하였다.
결과
N-테트라데실-(2-브로모헥사데실카르복사미드)의 특성:
1-테트라데실아민과 2-브로모헥사테카노산의 접합(제 12(b))은 질량 분석으로 평가하였다. 커플링 전에 2-브로모헥사데카노산의 활성 에스테르를 합성하였다(제 12(a)). 생성물의 질량 스펙트럼에서, 514m/z에서 피크의 존재는 2-브로모헥사데카노산 및 2,4,6 트리클로로페놀 사이의 결합형성을 나타낸다. 그리고 나서, 이들 두 화합물의 접합의 완성을 암시하는 530m/z에서 피크를 나타내는 얻어진 물질의 질량스펙트럼을 갖는, 생성물을 1-테트라데실아민과 접합시켰다.
리포솜 특성화:
실험을 통하여, 작은 균일박막층 소포(SUV)를 PC와 콜레스테롤을 몰비 1:1로 하여 제조하였고, 콜로민산-지질 유도체를 필요한 경우 지질 혼합물에 첨가 (총 지질 중량의 10%)하였다. SUV를 세파덱스 G-200을 사용하여 분자체 크로마토그래피하여 비-병합된 물질로부터 분리하였다.
제 7도는 콜로민산과 SUV (적용 전에 혼합된)의 용출 프로파일을 나타낸다. 리포솜 (분획 14-22) 및 콜로민산 (분획 22-44)를 나타내는 두개의 명백한 피크를 볼 수 있다. D6또는 D11(제11도 및 제12도)을 병합하는 SUV를 세파덱스 G-200 컬럼에 적용하였다. 제 8도는 리포솜성 D6의 용출 프로파일을 나타낸다. 콜로민산 유도체 (D6)의 약 51%를 리포솜 (즉, 이중층으로 병합된)으로 회수하였다. 콜로민산 유도체 D11의 유사 비율 (52.14%)(제9도)을 SUV에 병합하였다.
실시예 8
리포솜 내로 폴리사카라이드 B의 병합
실험은 폴리사카라이드 B(PSB)가 작은 균일박막층 리포솜(SUV)의 이중층내로 그것의 인지질 부분을 삽입할 수 있는지, 리포솜성 표면을 친수성으로 만들어서 혈액 순환에서 소포의 반감기를 연장하는지를 확인하기 위해 실행되었다.
방법론
계란 포스파티딜콜린 (PC) 또는 디스테아로일 포스파티딜콜린 (DSPC) 및 등몰의 콜레스테롤 (25mg 인지질 및 12.5mg 콜레스테롤)을 클로로포름 중에 녹였다. 로터리 증발기로 용매를 제거한 후, 또한 폴리사카라이드 1.2mg을 함유하는 0.06M 카르복시플루오레신(CF) 2mℓ를 첨가하였다. 지질 필름을 파괴하도록 용기를 격렬하게 흔들고, 현탁액을 4℃ (PC) 및 60℃ (DSPC, SUV)에서 3분동안 욕조 초음파처리하였다. 그리고 나서, 현탁액을 1분 후 30초 휴식으로 6분 동안 동일한 온도에서 탐침(probe) 초음파분해 하였다. 그리고 나서, SUV를 함유하는 맑은 현탁액을 유리 물질들로부터 리포솜-병합된 CF 및 PSB를 분리하기 위하여 세파로스 CL-4B 컬럼을 통해 통과시켰다. 전형적인 실험으로부터 분리 패턴은 PSB의 19.2%가 SUV 분획에 의해 회수된 것을 나타났다. 8개의 실험으로부터 PC 또는 DSPC SUV중 PSB 병합의 결과를 표 7에 나타냈다.
표 7
실시예 10
정맥내 주사후 마우스들의 순환으로부터 소포 소거에의 SUV중 PSB의 효과
T.O. 마우스들을 두개의 두 군으로 나누었고, PC 및 콜레스테롤(몰비 1:1)로 이루어지고 병합된 PSB를 갖는 또는 갖지않는 CF를 함유하는 SUV를 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 그들을 CF-함유 SUV 또는 PSB 118㎍으로 코팅된 CF-함유 SUV로 정맥내로 주사하였다. 동물들로부터 주사 후 시간 간격을 두고 채혈하였고, 총 CF을 위한 혈액 혈장 샘플을 Kirby, Clarke 및 Gregoriadis (Biochem. Journal 186, 591(1980))의 방법으로 채취하였다. 값들은 각각의 동물들로부터 얻은 것이고, 총 혈액당 주사된 리포솜성 CF의 %를 표시한다.
표 8과 제 10도의 결과는 주사후 시간 간격을 두고 그들의 혈액중 리포솜성 CF의 농도를 나타낸다. 두 군들로부터의 값들의 비교는 리포솜성 표면 상의 PSB 존재가 소거의 더 느린 속도를 유발한다는 것을 나타낸다. 유사한 결과들을 상기와 같은 DSPC와 콜레스테롤로 만들어진 PSB-피복된 SUV에 의한 실험과 DSPC와 콜레스테롤로 만들어진 PSB-코팅된 SUV으로의 다른 하나의 실험에서 얻어졌다.
표 8
본 발명은 환자의 순환계에서 활성 화합물의 잔류시간을 연장하기 위한, 또는 환자의 체내에서 특별한 표적에 화합물을 전달하기 위한 제약학적으로 활성화합물과 회합된 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 유도체의 사용에 관한 것이다.
혈액 순환계에서 상승된 농도를 유지해야 하거나 또는 작용 부위에 직접적으로 전달해야할 필요가 있는 매우 여러가지의 제약학적 활성제들이 있다. 이러한 제제들은 암 및 항미생물 치료에서 그리고 효소 또는 호르몬 대체 요법에서 그리고 면역학에서 사용되는 통상적인 약제, 펩티드 및 단백질 및 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 많은 경우에 제제는 신장(賢臟)을 통해 신속하게 배설되거나 또는 세망내피계(reticuloendothelial system; RES) 및 다른 조직에 의해 흡수되어져 순환계에서 짧은 반감기를 나타낸다. 이러한 조기의(premature) 약제 손실을 보상하기 위하여, 처리가 요구되는 영역에 약제의 충분한 양이 농축될 수 있게 하기 위하여 더 많은 투여량이 요구된다. 그러나, 이것은 비용이 많이 들뿐만 아니라, 또한 독성 및 "외래 단백질(foreign protein)"에 대한 면역반응을 유발할 수 있다. 예를 들면, 인터페론(IFN-γ) 및 인터루킨-2 (IL-2)와 같은 사이토킨(cytokines)은, 순환계에서 그들의 존재가 연장될 수 있다면, 더 효과적이며, 독성이 덜하고, 또한 더욱 적은 양으로 사용될 수 있을 것이다.
재결합 DNA 기술에서 최근의 진전은 광범위한 생물학적으로 활성의 단백질들을 이용할 수 있게 하였다. 일부 경우에서, 예를 들면 결찰된 유전자 융합 또는 부위 지정 돌연변이에 의한 분자 리모델링(remoldelling)은 최적 활성도에 적합한 특성들을 그러한 단백질들에 부여하였을지라도, 이들 생성물의 효과적인 사용이 전달계를 통해서만 성취될 수 있는 것이 일반적인 경우이다. 표적화된 전달계없이 또는 표적화된 전달계와 함께 약제의 조기 손실을 억제하는 것이 바람직할 것이다.
약제 전달계(drug delivery system; DDS)는 그것과 회합된 약제의 운명 및 효과를 우리에게 유리하게 조절할 수 있는 분자 또는 입자성 물질(entity)이다. DDS는 두 가지의 일반적인 유형으로 분리될 수 있다. 첫번째 유형은 예를 들면 폴리(하이드록시프로필메트아크릴아미드), 폴리리신 및 중합된 알킬 시아노아크릴레이트와 같은 합성폴리머 뿐만아니라, 항체, 네오글리코프로테인 등의 거대분자(MDDS)를 포함한다. 약제를 요구되는 부위로 표적화하기 위해 모노클로날 항체를 포함하는 여러가지 타입의 거대분자 운반체와 약제의 회합은 예를들면, Gregoriadis에 의한 Nature 265, 407-411 (1977)에 기재 되어있다.
두번째 타입은 알부민과 같은 생분해성 물질 또는 덱스트린 및 알킬시아노 아크릴레이트 폴리머와 같은 준(semi)생분해성 물질, 또는 비이온성 계면활성제로 형성되는 소포체(小胞體) 또는 리포솜을 포함하는, 예를들면 나노구체(nanospheres) 또는 마이크로구체(microspheres)를 포함하는 입자성 DDS(PDDS)이다.
약제는 DDS에 공유적으로 연결되거나, 또는 DDS내에 수동적으로 포집(entrap)될 수 있다. 예를들면, 계면활성제 소포체 또는 리포솜을 포함하는 PDDS는 계면활성제 또는 지질 분자의 층들의 적절한 조합으로 형성됨에 의해서 친수성 또는 소수성의 제약학적으로 활성의 화합물을 포집할 수 있다. 제약학적으로 활성의 화합물은 예를 들면, 활성 화합물이 그것의 기능을 실행하기 이전 또는 이후에 체내에서 용해될 수 있거나 용해될 수 없는 결합에 의해 MDDS에 통상 공유적으로 연결된다. 리포솜은 Gregoriadis에 의한 NIPS, 4, 146-151(1989) 및 "Liposomes as Drug Carrier:Recent Trends and Progress" Ed Gregoriadis, 1988, Wiley에 기재되어 있다.
많은 MDDS는 표적 세포들 또는 조직들에 의해 후자의 표면상의 수용체를 통하여 인식될 내재성의(예를들면, 항체) 또는 후천성의(예를들면, 네오글리코프로테인) 능력을 갖는다. 전형적으로, 이러한 DDS는 주입시 표적에 의해 특이적으로 흡수된다. 그러나, 특이적 흡수는 다른, 부적절한(치료에) 조직에 비해 흡수적어지는 DDS의 용적에 의해 제한된다. 그 이유는 항체 및 다른 DDS 단백질 (표적에 대한 그들의 특이성에 관계없이)은, 다른 단백질들과 같이, 그들의 생물학적인 수명의 말기에 이화(異化)되어야만 하기 때문이다.
단백질 분자들은 고정된 수명을 갖지 못하고 그들은 불규칙하게 소멸한다. 따라서, 주입의 순간으로부터 단백질 분자들 (그들의 제약 부하(load)와 함께)은 선형 속도로 이화되기 시작하여 표적에 접촉하여 흡수될 수 있는 분자들은 단지 일부이다.
마우스 항체와 같은 DDS는 다른 종들(species)에 주입될 경우에 외래성이다. 숙주 종들은 차후의 주입된 이종 단백질을 처리하기 위하여 항체를 개발한다. 이와 같은 단백질은 불완전하게 밝혀진 메카니즘에 의해 일차 주입 후 순환계로부터 제거된다. 인조 폴리머와 같은 DDS는 옵소닌(opsonins)에 의해 인식되고, 세망내피계(RES), 주로 간 및 비장 대식세포에 의해 제거된다. 각 경우에서, 사건의 순서는 보통 숙주 유기체 단백질에 의해 DDS 성분을 인식하는 것으로 개시되어 숙주 유기체 단백질에 의해 DDS 성분에 결합하는 것을 포함한다. 인식 및/또는 결합 단계의 파괴는 성분 분자들의 이화를 방해한다.
거대분자 타입 MDDS에 사용된 합성 폴리머는 예를 들면, 폴리(히드록시프로필메트아크릴아미드)폴리신 및 중합된 알킬 시아노아크릴레이트이다. 이들은 적합한 리소솜성(lysosomal) 효소들에 의해 RES계에서 또는 다른 조직에서 이화될 수 있다. 몇몇 수단 예를 들면, RES 또는 다른 조직에 의해 DDS의 흡수를 감소시키거나, 또는 RES에 의해 일단 흡수된 리소솜성 효소들에 의한 분해를 감소시킴에 의해서, 그와 같은 생분해성 거대분자 타입 DDS의 이화 속도를 감소시키는 것이 바람직할 것이다.
입자성 DDS(PDDS)는, 대체로, RES에 의해 순환계로부터 제거된다. RES에 대한 그들의 성향 때문에, PDDS는 이들 조직들로 약제의 전달을 위해 종종 사용된다. 그러나, PDDS는 RES의 조직들과는 다른 조직에 향하는 것이 때로는 바람직하다. 이 목적를 성취하기 위하여, PDDS의 RES 차단을 방지 또는 지연시켜야만 한다.
이것은 상표명 Pluronic, Tetronic, Poloxamer 및 폴록사민으로 입수할 수있는 에틸렌 디아민으로 형성된 그러한 블록들을 포함하는, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 에틸렌옥사이드와 프로필렌옥사이드와 같은 친수성 거대분자로 PDDS 코팅함에 의해서 다소 성취되어 왔다. 이들 폴리머들는 인조이다. 그것들의 사용은 Illum에 의한 GB-A-2185397, Illum 및 Davis에 의한 FEBS Letts. (1984) 167, 79-82, Illum 등에 의한 Life Sciences (1987) 40, 367-374 Hunter 등에 의한 Scand. J. Immunol. 23, 287 (1986), Senior 등에 의한 Biochem. Biophys. Acta (1991) 1062, 77-82 및 WO-A-9004384에 기재 되어있다. PEG 및 에틸렌옥사이드의 블록 코폴리머는 매우 친수성인데, 이 성질은 (a) 그들을 조기 흡수하는 조직에 의한 PDDS(그러한 폴리머에 부착된)의 인식; (b) 조기 분비 또는 부적절한 조직에 의한 흡수를 통한 약제, 펩티드 및 단백질(그러한 폴리머에 부착된)의 손실을 방지 또는 지연시키는 그들의 능력을 발휘하게 한다.
Abuchowski 등에 의한 j. Biol. Chem. (1977) 252, 3282-86은 카탈라제에 두 분자량(1900 및 5000)의 PEG의 공유 부착을 기재하고 있는데, 이는 마우스의 순환계에서 이 단백질의 면역원성(immunogenicity)을 감소하고, 그것의 반감기를 증가시킨다. Abuchowski는 예를 들면 혈액 대사를 변경하기 위하여, 또는 저장병 (storage diseases)을 치료하기 위하여 효소 요법의 사용을 허용하는 방법을 제안하고 있다. 그러나, PEG가 할 수 있는 것보다도 훨씬 더 단백질 (펩티드 등)의 반감기를 증가시키는 것이 바람직할 것이다.
또한, Abuchowski 등은 덱스트란이 인간에서 면역원성인 것으로 알려져 있기 때문에, PEG 대신에 덱스트란 (폴리사카라이드)을 사용한다는 생각은 거부되었다고기재하고 있다. GB-A-2185397에서 폴리사카라이드, 크잔탄(xantan) 및 히알루론산 등은 콜로이드성 입자의 간(肝)에 의한 흡수를 억제하기 위하여 에틸렌 옥사이드-프로필렌 옥사이드 블록 코폴리머 대신에 사용될 수 있는 것을 제안되어 있다. 크산탄 검중 카르복실기의 존재는 원하는 효과를 위해 이익이 되는 것으로 언급되어 있다. 폴리사카라이드가 어떻게 콜로이드성 입자 표면에 연결되었는지에 관해 주어진 어떤 정보도 없었고, 폴리사카라이드도 실제로 시험되지 않았다.
Senior 등에 의한 인용문헌(상기의) 및 WO-A-9004384는 인지질에 모노 메톡시 PEG의 공유 커플링(coupling)에 의해서 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 리포솜(liposome)을 코팅하는 것을 기재하고 있다. 코팅은 혈액에서 리포솜의 소거(clearance) 시간을 30%까지 증가시키고, 리포솜이 혈장 성분을 더 서서히 흡수하게 한다. 두 가지 인자는 PEG에 의해 더욱 친수성으로 만들어진 소포(vesicles)의 표면으로부터 얻어지는 것으로 생각된다.
Allen과 Chonn에 의한 FEBS Letts.(1987) 283, 42-46에는 리포솜내로 강글리오사미드(gangliosides)와 그들의 아시아릴(asialyl) 유도체의 병합에 대해 기재하고 있다. 강글리오사이드는 2 지방산 사슬(주로 스테아린산) 스핑고신 및 갈락토스와 하나의 시알산 유니트를 포함하는 5개의 유니트를 포함하는 올리고사카라이드로 이루어지는 글리코스핑고리피드 성분이다. 리포솜의 순환시간을 증가시키고, 간에 비해 혈액중 나타난 리포솜의 비율의 증가를 야기한 강글리오사이드의 병합은 리포솜의 RES 흡수가 감소된다는 것을 나타난다. 효과는 저자에 의해 시알산 및 특히 리포솜 표면에서 그것의 음전하는 전달될 효과에 중요하다는 것을 나타내는 것으로서 해석되는 아시아릴강글리오사이드에 대해서는 덜 확고하다.
"Medical Application of Liposomes" (K. yogi, 1986)에서 "화학요법 및 면역요법에서 리포솜 (Liposomes in Chemotherapy and Immunotherapy ;p121-129)"의 명칭의 장(章)에서 Sunamoto는 특이적 조직 및 세포, 특히 폐로 리포솜을 표적화하기 위하여 델스트란, 풀루란, 아밀로펙틴, 아밀로스 및 만난을 고함하는 여러가지 폴리사카라이드에 의한 리포솜의 코팅을 기재하고 있다. 그 데이터는 폴리사카라이드-코팅된 리포솜에서 약제의 캡슐화는 유리 이눌린(inulin)과 비교할때 혈류 및 조직에서 약제(이눌린)의 순환 시간을 증가시킨다는 것을 보여준다. 혈류에서 코팅된 및 비코팅된 리포솜에서 약제의 안정성 및 소거을 비교하는 데이터는 없고; 리포솜에서 약제의 누출도 없고 그리고 이 사실들은 폴리사카라이드 코팅의 효과에 관한 결론의 타당성에 의구심을 던진다: 그러나, 이 문헌으로부터 폴리사카라이드 코팅에 의한 리포솜들의 폐 또는 다른 조직들로의 표적화는 리포솜들의 순환 시간을 감소시킨다는 것을 기대할 수 있을 것이다. 다른 연구자들은 리포솜 표적화를 위해 글리코프로테인 및 당지질의 사용에 대해 예를 들면 Gregoriadis에 의한 1989년, 1988년 및 1987년의 상기 인용문헌에 기재하고 있다.
Jennings 및 Lugowski의 J. Immunolog (1981) 127, 1011-1018에는 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)을 위한 백신을 제조하는 시도로폴리사카라이드의 면역원성을 증가시키기 위하여 파상풍 독소(toxoid)와 메닌고코칼(meningococcal) 그룹 A, B 및 C 폴리사카라이드의 접합체가 기재되어 있다. 그룹 B 폴리사카라이드의 면역원성은 크게 증가하지 않지만, 접합체는 파상풍 독소에 대한 항체를 여전히 유발한다.
본 발명에 따르면, 환자의 순환에서 활성성분의 유용성을 연장하고, 생체내에서 활성성분의 면역원성을 감소시키고 그리고/또는 활성성분의 안정성을 증가시키기에 충분한 양으로 폴리사카라이드가 존재하며 활성성분을 포함하는 제약학적 조성물의 제조 방법에서 폴리사카라이드 화합물의 신규한 용도를 제공하고, 여기서 폴리사카라이드 성분은 분자당 5개 이상의 시알산 유니트를 함유한다.
또한, 본 발명에 있어서, 환자의 순환계에서 활성성분의 유용성을 연장하고, 생체내에서 활성성분의 면역원성을 감소시키고 그리고/또는 활성성분의 안정성을 증가시키기에 충분한 양의 분자당 5개 이상의 시알산 유니트를 함유하는 폴리사카라이드 화합물과 회합된 활성성분으로 이루어진 신규한 제약학적인 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 관점에 있어서, 환자의 순환계에서 제약학적인 활성성분의 유용성을 연장하고, 생체내에서 활성성분의 면역원성을 감소시키고 그리고/또는 활성성분의 안정성을 증가시키기 위한 분자당 5개 이상의 시알산 유니트를 함유하는 폴리사카라이드 화합물의 신규한 용도를 제공한다.
본 발명에 있어서, 환자의 순환계에서 활성성분의 유용성의 연장은 제약학적인 활성성분 또는 그것을 함유하는 복합체의 조직에 의한 인식을 억제 또는 지연시킴에 의해서 (그렇지 않으면 약제 또는 약제 복합체를 흡수할 것이다). 또는 조기 분비 또는 특이적 인식 이외의 다른 수단에 의한 치료학적으로 관련이 없는 조직에 의해 또는 흡수에 의해 제약학적인 성분의 손실을 억제 또는 지연시킴에 의해서 성취될 수 있다. 또한, 이 효과는 활성성분의 안정성을 증가시킨다. 폴리사카라이드 화합물은 부가적으로 또는 선택적으로 면역 반응을 억제하는데, 그렇지 않으면 제약학적 활성성분 또는 그것을 함유하는 복합체에 의해서, 면역 반응의 초기 인식 단계를 방해함에 의해서 부정하게 된다. 본 발명은 비경구 투여용 제약학적인 조성물으로 우선 사용된다.
본 발명에 있어서, 폴리사카라이드 화합물은 자연발생 폴리사카라이드, 자연발생 폴리사카라이드의 유도체일 수 있고, 예를 들면 폴리사카라이드는 사카라이드 잔기들(residues) 상에 하나 또는 그 이상의 활성기의 반응에 의해 유도되어진, 또는 폴리사카라이드 사슬의 끝이나, 사슬 중간의 활성기에 의한 유도화(derivatising) 기에 공유적으로 연결되어진 것이고, 자연발생 폴리사카라이드의 유도체는 예를 들면 인지질 또는 단백질이 부착된 것으로 이루어지는 자연발생 폴리사카라이드 유도체이고, 또는 가수분해 또는 그렇지 않으면 화학적으로 반응된 유도체와 같은 화학적으로 유도된 화합물의 자연 발생 폴리사카라이드 유도체의 유도체일 수 있다. 화합물의 폴리사카라드 부분은 폴리머의 사슬에 5개 이상, 바람직하기로는 10개 이상, 더욱 바람직하기로는 20개 이상 또는 50개 이상의 시알산 잔기를 갖는다. 쉽게 입수할 수 있는 폴리사카라이드 화합물은 총 500개까지의 사카라이드 잔기를 가질 수 있지만, 통상 폴리머 사슬에 300개 이하의 잔기를 갖는다. 바람직하기로는 화합물에서 사카라이드 잔기의 대부분 또는 모두는 시알산 잔기이다.
폴리사카라이드 화합물의 적어도 폴리시알산 부분 및 바람직하기로는 전체화합물은 매우 친수성이다. 높은 친수성은 조직에 의해 인식되거나 흡수되어지고, 이화되어지는 폴리사카라이드 화합물의 가능성을 감소하는 것으로 믿겨진다. 폴리사카라이드의 친수성은 히드록실기와 시알산 유니트의 부속 카르복실기에 의해서 우선적으로 부여된다. 아민, 히드록실 또는 황산염 기와 같은 다른 사카라이드 유니트 상의 기들 또는 기들의 조합이 사카라이드 유니트에 존재할 수 있다. 그 기들은 천연 폴리사카라이드 화합물에 존재할 수 있고, 또는 (덜 바람직하기로는) 천연 기들의 화학적인 반응에 의해서 도입될 수 있다. 바람직하기로는 폴리사카라이드는 주입시에 순환계에서 나타나는 조건에서 음 전하를 띄는 것이다. 폴리사카라이드는 여러가지의 다른 사카라이드의 유니트를 포함할 수 있다.
본 발명에서 특별히 사용되는 폴리사카라이드 화합물은 박테리아로 제조된 폴리사카라이드 화합물이다. 천연 화합물은 종종 당지질이고, 인지질에 인간염 에스테르 결합을 경유하여 연결된 폴리사카라이드 성분을 포함하는 화합물이다. 이와 같은 당지질은 본 발명에서 그들의 천연 형태로 사용될 수 있고, 또는 일부 경우에서는 폴리사카라이드를 가수분해된 지방산 사슬 유도체가 바람직할 수 있다.
시알산 폴리사카라이드들은 T-세포 독립 항원일 수 있기 때문에, 그들은 주로 IgM 항체를 생성하도록 직접적으로 B-세포들을 활성화한다 (주입시). 이 항체들은 단지 며칠동안 지속하고, 따라서 폴리사카라이드들은 미약한 면역원이다. 이것이 본 발명에서 그들의 사용에 관한 장점이다.
폴리사카라이드 화합물은 실질적으로 말단 갈락토스가 없는 것이 바람직한데, 그 이유는 말단 갈락토스 유니트들은 간세포 및 쿠퍼세포 (Kuppfer cell)상의갈락토스 수용체에 의해 인식될 수 있어, 더욱 빠르게 순환계에서 소거될 수 있기 때문이다.
시알산 (또한, 노눌로손산(nonulosonic acids)으로 알려진)은 9 또는 그 이상의 탄소원자를 포함하는 아미노 함유 당의 패밀리의 일원이다. 시알산의 가장 중요성은 다음식을 갖는 N-아세닐뉴라민산 (또한, 5-(아세틸아미노)-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토-노눌로손산, 락타민산 및 O-시알산으로 알려진)이다:
폴리시알산은 보통, α-배치로, 2→8 및/또는 2→9로 연결될 수 있다.
폴리시알산은 일반적으로 비-독성 및 실질적으로 비-면역원성으로 확인된다. 더우기, 생분해 유니트인 시알산은 독성인 것으로 알려져 있지 않고, 실제 시알산은 혈액 세포들을 포함하는 동물 세포에서 광범위하게 확인된다.
많은 시알산 유니트를 포함하는 폴리사카라이드 화합물은E. coli,모락셀라 논리퀴파시안(Moraxella nonliquifacien) 파스퇴렐라 에러지니시스(Pasteurella aeroginosis) 또는 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 의해 생산된 폴리사카라이드 또는 그들의 유도체이다.
예를 들면,E. coliK1으로부터 유도된 (가수분해에 의해 사슬길이를 짧게한) 콜로민간 (colominic acid)은 2→8 α-연결된 시알산 유니트로 이루어지고, 약16개 유니트의 평균 사슬길이를 갖는다.E. coliK92 균주 유래의 폴리사카라이드는 교대로 2→8과 2→9로 연결된 시알산 유니트로 이루어지고, 약 78개 유니트의 평균 사슬길이를 갖는다.N. meningitidis그룹 C의 폴리사카라이드 C는 2→9연결된 시알산 유니트를 갖고, 약 316개 유니트의 평균 사슬길이를 갖는다. 마지막에 언급된 화합물의 탈아세틸화된 변형체는 약 172개 유니트와 평균 사슬길이를 갖는다.
본 발명에서 특히 유용성으로 확인된 폴리사카라이드 화합물의 그룹 중 하나는 그룹 B 폴리사카라이드이다. 이 화합물들은Neisseria menigitidis, Moraxella nonliquifaciens, Pasteurella aeroginosisA2 및E. coliK1에 의해 생성된다. 이 화합물들은 시알산 잔기들과 인지질 성분으로 이루어진 폴리사카라이드 성분을 포함한다. 시알산 잔기들은 (2→8)-α연결되고, 약 200개 잔기들로 이루어진 자연발생 폴리머이다. 당지질은 폴리사카라이드 성분의 환원하는 말단에 공유적으로 부착된 인지질을 갖는 것으로 나타난다.
폴리사카라이드 화합물이 제조시 편의를 위해 비-병원성으로 유도되는 박테리아가 바람직하다 그러므로E. coliK92와 같은E. coli비-병원성 균주으로부터 유도되어진 폴리사카라이드가 특히 적합하다.E. coliK92 단리체는 잘알려져 있고, 그러한 균주의 어떤 타입도 적합한 폴리사카라이드 공급원으로 사용될 수 있다.
당지질인 폴리사카라이드 화합물은 자연발생 당지질의 형태로, 또는 유도체 형태로 사용될 수 있다. 따라서, 특히 적합한 유도체는 지방산 사슬이 글리세로포스페이트 기로 가수분해되어 폴리시알산 글리세로포스페이트 에스테르를 방출하는 것이다. 가수분해는 통상 묽은 알카리 처리에 의한다. 이 처리는 당지질 분자 응집을 예방하는 데, 만약 그렇지 않으면 분자의 지방산 사슬 간에 소수성 상호작용에 의해 수성 매개물(medium)에서 응집이 발생한다.N. meningitidis폴리사카라이드 B의 탈응집은 Lifely 등에 의한 "Gomococci and Meningococci" (1988) pp 147-152에 기재되어 있다.
천연 폴리사카라이드는 예를들면, Lifely 등에 의한 Carbohydrate Res(1986) 156, P123에 기재된 바와 같이, 더 짧은 사슬길이를 형성하도록 가수분해될 수 있다. 가수분해 반응에서 조건 (예를 들면 시간 및 온도)은 생성물의 선택된 평균분자량을 달성하기 위하여 선택될 수 있다.
상기 언급된 폴리사카라이드는 시알산 유니트의 5-N-아세틸기의 N-탈아세틸화된 일부 또는 전부를 탈아세틸화함에 의해 더 유도될 수 있다. 얻어진 5-아민기는 예를 들면, 아미노산 또는 펩티드 또는 지방산을 포함하는 아세트산과 다른 산에 의해 부분 N-재아세틸화, N-아실화에 의해 더 유도될 수 있다.
폴리사카라이드 유도의 다른 방법은 폴리시알산 사슬의 비-환원 말단에 알데히드기를 형성하는 소듐 과요오드산염 (sodium periodate)에 의한 산화이다. 그러면, 스키프(Schiff) 염기 반응은 약제의 아미노기 (단백질 부사슬 또는 말단기등)에 의해 일어날 수 있다.
이 시알산을 함유하는 폴리사카라이드 화합물이 환자의 혈류 내로 투여될 때, 일부는 혈류로부터 신속히 흡수되고, 잔여분은 통상적으로 고정 속도로 제거된다. 초기의 빠른 흡수 단계 다음의 화합물의 반감기는 본 발명에서 순환시간의 연장 및/또는 활성성분비 안정성 및/또는 그것의 면역원성을 감소시키기 위한 폴리사카라이드 화합물의 적합성의 우수한 지시자이며, 긴-반감기를 갖는 화합물들이 특히 적합하다. 또한, 일차 신속 단계에서 제거되는 화합물의 비율은 잠재적 유용성의 지시자이며, 일차 단계에서 순환으로부터 제거된 화합물이 없거나 또는 단지 적은 비율인 화합물이 유용하다.
본 발명에서 사용되는 폴리사카라이드 화합물은 정맥투여 다음, 예를 들면 주사후 약 5분내에 약 50%이하, 바람직하기로는 25%이하, 더욱 바람직하기로는 약 20%이하로 제거되는 것이 바람직하다. 적합한 폴리사카라이드 화합물은 최적 효과를 위해 신속 제거 단계 다음에 10시간이상, 바람직하게는 20시간이상, 예를 들면 30시간이상 또는 그 이상의 반감기(조성물로 처리되는 동물에서)를 갖는 것이 바람직하다. 폴리사카라이드에서 시알산 유니트의 수와 화합물의 신속 제거 및 반감기 사이에는 상호관계가 있는 것으로 나타났고, 평균 약 20개 이상, 바람직하기로는 50개 이상, 더욱 바람직하기로는 100개 이상의 유니트를 갖는 화합물이 특히 양호한 성질을 갖는다. 따라서, 일부 사용을 위해서 예를들면 리포솜을 피복하기 위하여 또는 단백질과 접합하기 위하여 짧은 사슬길이로 가수분해될 천연 폴리사카라이드 화합물이 유리하게 될 수 있지만, 최대 사슬길이의 폴리시알산 화합물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 제약학적으로 활성 화합물은 폴리사카라이드 화합물에 직접 공유적으로 연결될 수 있다. 활성 화합물은 폴리사카라이드 화합물과 화학랑양론 양으로 연결될 수 있고, 즉 활성성분의 한 분자가 폴리사카라이드 화합물의 한 분자에 연결될 수 있다. 또한, 폴리사카라이드 화합물 한 분자에 활성 성분이 2 또는 그 이상의 분자가 공유적으로 연결되는 것, 또는 활성성분의 한 분자에 폴리사카라이드 화합물이 2 또는 그 이상의 분자 연결되는 것이 편리할 수 있다.
공유결합은 예를 들면 분자중 하나에 카르복실기 및 다른 분자에 아민기 사이에 펩티드 결합을 통해서, 또는 한 화합물에서 카르복실기 및 다른 화합물에서 히드록실기 사이에서 에스테르 결합을 경유하여 될 수 있다. 때때로, 결합은 체내에서 예를 들면, 활성성분이 그것의 효과를 갖는 조직내에서 용해될 수 있는 것이다. 그러나, 이런 용해는 폴리사카라이드가 활성성분의 활성에 커다란 영향을 미치지 않으므로 흔히 불필요하다. 폴리사카라이드 화합물에 공유적으로 결합될 수 있는 활성성분에 의한 다른 결합은 화합물의 하나에 아미노기와 다른 화합물에 알데히드기 사이에서 스키프 염기(Schiff base)를 경유하는 것이다.
제약학적으로 활성화합물은 시알산을 함유하는 폴리사카라이드 또는 그들의 유도체에, 예를 들면 과요오드산염 산화에 의해 플리머의 비-환원 말단에 형성된 알데히드기와 반응되어질 활성성분 상의 유리 아미노기 간에 스키프 염기의 형성에 의해서 공유적으로 결합될 수 있다. 또한, 제약학적으로 활성화합물 상의 유리 아미노기는 시알산 잔기의 1-카르복실기와 반응되어 펩티드성 결합을 형성할 수 있다. 또한, 에스테르 결합이 활성성분 상의 카르복실산기와 히드록실 또는 다른 적합한 활성기 사이에 형성될 수 있다. 또한, 제약학적으로 활성 화합물 상의 카르복실기는 탈아세틸화된 5-아미노기와 펩티드 결합을 형성할 수 있다. 또한 제약학적으로 활성화합물의 분자의 알데히드기는 시알산 잔기의 N-탈아세틸화된 5-아미노기와 스키프 염기를 형성할 수 있다. 2가의 연결 화합물은 예들들면, 아민 및 치올기를 연결하기 위해 또는 두 히드록실기를 연결하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 폴리사카라이드 화합물은 제약학적으로 활성화합물에 의한 비-공유 방식으로 회합될 수 있다. 예를들면, 폴리사카라이드 화합물과 제약학적으로 활성화합물은 소수성(蔬水性) 상호작용을 경유하여 연결될 수 있고, 예를 들면 소수성 제약학적으로 활성화합물과 폴리사카라이드 화합물의 지질성분을 경유하여 연결될 수 있다. 다른 비-공유 회합은 서로 끌어당기는 반대전하를 띠는 이온에 의한 정전기 상호작용을 경유할 수 있다. 예를 들면, 사급 암모늄이온을 포함하는, 양전하를 띤 활성성분은 폴리사카라이드 상의 카르복실레이트기와 이온적으로 연결될 수 있다. 한 실시예는 폴리사카라이드 B의 카르복실레이트기에 이온적으로 연결된 항생 독소루비신(doxorubicin)일 것이다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 폴리사카라이드 화합물은 제약학적으로 활성화합물과 약제 전달계를 경유하여 상호작용할 수 있다. 예를들면, 폴리사카라이드 화합물은 상기 기재된 타입의, DDS의 통상적인 분자 또는 입자성 성분의 인식 및 흡수에 영향을 미쳐서 순환에서 활성성분의 유용성에 영향을 주기 위하여 사용될 수 있다. 이 구현예에 있어서, 폴리사카라이드 화합물은 약제 전달계의 입자성 또는 분자성 실체와 공유적으로 결합 또는 비-공유적으로 회합될 수 있다. 예를 들면, 폴리사카라이드 화합물은 상기한 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 플루로닉(pluronic) 코폴리머 타입 물질의 작용에 유사한 방식으로 작용할 수 있다.
폴리사카라이드 화합물과 리포솜 간에 공유 상호작용의 예는 인지질의 글리세로포스페이트 헤드(head)기 간의 포스페이트 에스테르 결합을 경유할 수 있다. 공유결합은 소포내로 인지질의 형성 이전 또는 이후에 형성될 수 있다. 또한 폴리사카라이드는 시알산의 1-카르복실산기, 폴리사카라이드 상의 히드록실기 또는 탈아세틸화에 의해 생성된 아민기와 소수성 사슬을 포함하는 분자상의 반응기 간의 상호작용을 경유하여 지질성분에 연결될 수 있다. 예를 들면 소수성 분자는 지질, 특히 포스파피딜 에탄올아민 유도체일 수 있고, 이 아민기에 공유결합이 형성될 수 있다. 마찬가지로, 비이온성 합성 계면활성 소포와 폴리사카라이드 화합물 간의 공유 상호작용은 소포의 형성 이전 또는 이후에 형성된 분자의 친수성 부분 상으로 에스테르, 아미드 또는 에테르 결합을 경유할 수 있다.
또한, 폴리사카라이드 화합물은 PDDS 성분에 비-공유적으로 연결될 수 있다. 비-공유 결합은 PDDS 성분의 소수성 부분과 소수성기(당지질 등)로 이루어지거나 또는 소수성기에 공유적으로 연결되어진 폴리사카라이드 화합물 간의 수소결합 상호작용일 수 있다. 이와 같은 폴리사카라이드 화합물의 소수성 유도체는 폴리사카라이드 화합물에서 시알산 잔기의 1-카르복실산기 또는 폴리사카라이드 화합물의 히드록실기 또는 폴리사카라이드 분자의 알데히드 유도체를 예를들면, 히드록실기, 카르복실산기, 할로겐원자 또는 아민기와 반응시킴에 의해서 형성될 수 있다. 예를 들면, 당지질 화합물은 지질 또는 계면활성제의 소수성 부분과 그것의 지방산 소수성 사슬 부분의 상호작용하면서, 리포솜의 셀(shell) 또는 계면활성 소포 내로 병합될 수 있다. 예를들면 폴리사카라이드 B, K92는 본 발명에 사용하기에 적합할 것이다. 당지질은 계면활성제 또는 인지질과 편리하게 병합될 수 있는 반면에, 소포는 형성되어지거나 또는 예비성된 리포솜과 당지질의 평형에 의해 소포체의 형성 이후에 형성된다.
DDS가 항체, 네오글리코프로테인 또는 합성 폴리머와 같은 거대분자 성분을 포함할 경우, 폴리사카라이드 성분은 거대분자 성분과 공유적으로 또는 비공유적으로 회합될 수 있다. 공유결합은 제약학적으로 활성화합물과 폴리사카라이드 화합물 간의 결합을 위해 상기한 타입의 에스테르, 펩티드 또는 다른 결합을 경유할 수 있고, 그리고 가장 편리하게 거대분자의 펩티드 부분 상의 카르복실 또는 아민기와 펩티드 결합을 경유한다.
폴리사카라이드와 단백질, 펩티드 또는 지질과 같은 다른 화합물 간의 공유 결합을 생성하기 위한 방법의 많은 실시예가 공지되어 있고, 상기 제안된 공유 결합을 달성하기 위하여 사용될 수 있다. 예들 들면 환원 당은, 이급 암모늄을 형성하기 위한 Borch R. F 등에 의한 J. Am. Chem. Soc 93, 2891(1971)에 기재된 바와 같이 시아노히드리도보레이트 음이온에 의한 엔아민 중간체의 선택적인 환원에 의해 이어지는 Gray G에 의한 Arch. Biochem. Biophys, 163 426(1974)에 기재된 바와 같이 반응성 아미노화 절차에 의해, 예를들면 펩티드의 N-말단, 리신을 함유하는 펩티드의 부-사슬의 또는 지질의 에탄올 아민기의 아민기에 연결될 수 있다. 시알산 잔기를 포함하는 비-환원 당은 반응성 아민화 절차에서 커플링되기 전에 알데히드기를 형성하도록 Jennings H. J 등에 의한 J. Immunol. 127, 1011(1981)에 기재된 바와 같이, 과요오드산염을 사용하는 선택적인 산화에 의해 일차 유도될 수 있다.
다른 반응은 Weissing V. 등에 의한 FEBS Letts. 202, 86(1986)에 기개된 방법에 기초해 카르보디이미드의 존재하에서, 예를 들면, 팹티드의 N-말단 또는 리신 잔기의 부사슬의 아민기에 시알산과 같은 사카라이드 유니트의 카르복실산 기를 커플링한다. 물론 이 방법은 예를들면 단백질 부사슬 또는 C-말단에서 카르복실산기에 시알산 유니트의 5-탈아세틸화된 아민기를 커플링하기 위해 또한 사용될 수 있다.
다른 반응은 예를들어 카르복실산기 상으로 반응된 파라-페닐렌디아민을 사용하여 폴리사카라이드 상으로 도입되고, Snyder S L 등에 의한 Biochem Biophys. Acta, 772, 288(1984)에 의해 개발되고 및 Senior 등에 의한 BBA 1003, 58(1989)에 의해 변형된 기술과 유사한 단백질의 페닐알라닌 또는 티로신 잔기의 부 사슬과의 반응함이 이어지는 방향족 아민기의 디아조화 반응을 포함한다.
폴리사카라이드 화합물 상의 유리 히드록실기는 예를들면 이염기산 또는 산 유도체를 사용하는 에스테르화 반응에 의해 단백질 또는 지질에 유리 히드록실기 또는 치올기에 연결될 수 있다.
카르보하이드레이트 부분에 커플링될 화합물이 이소치오시아네이트기를 함유하는 경우(또는 함유하기 위해 예를들어 아릴기를 경유하여 유도될 수 있는), 이것은 예를들어 메틸 설폭사이드에 반응에 의해 폴리사카라이드의 유리 히드록실기에 커플링될 수 있고, Belder 등에 의한 Carbohydrate Res.(1973) 30. 375-378에 기재된 방법에 의해, 디부틸 틴 디라우레이트에 의해 촉매될 수 있다. 이 생성물은 치오카르바모일 유도체이다. 예를 들면, 플루오레시인 이소치오시아네이트는 O-(플루오레시닐치오카르바모일) 시알산 유도체를 형성하도록 반응시킬 수 있다.
시알산을 함유하는 폴리사카라이드의 다른 반응은 몇몇 N-아세틸기를 제거하여 유리 아민기를 드러내게 하는 부분 탈아세틸화 포함하고, 상기 기재된 바의 공유 커플링 반응에 의해 이들 아민기의 반응이 뒤따른다. 이 예비 탈아세틸화 반응에 의해 가능하게된 추가 반응은 Wolff 및 Gregoriadis에 의한 Biochim. Biophys, Acta(1984) 802, 259-273 및 Barbet 등에 의한 J. Supramal. Struct. Cell Biochem. (1981) 16, 243-258에 기재된것 처럼, 요오드아세트산의 N-히드록시숙신이미드 에스테르, N-숙신이미딜-4-(2-브로모아세틸아미노)벤조에이트 또는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디디치오)프로피오네이트와 같은 헤테로-2가 반응물과의 반응이며 펩티드 또는 단백질의 치올기에 커플링이 뒤따른다.
폴리사카라이드 화합물이 리포솜을 코팅하기 위해 사용될 경우, 그것은 예를들면 고정된(anchored) 폴리사카라이드 화합물을 혼합함에 의해서 리포솜이 형성되므로, 즉 리포솜을 형성하는 지질을 갖는 소수성 고정 부분이 제공되어 병합될(incorporated) 것이다. 또한, 폴리사카라이드 화합물은 리포솜 표면 상의 아민기, 방향족 아민기, 카르복실산기 또는 산 염화물 기와 같은 유도체와 같은 활성기와 반응에 의해 미리 형성된 리포솜의 표면 상에 후-반응될 수 있다. 예를 들면 Weissig V 등에 의한 상기 인용문헌에는 포스파티딜 에탄올아민의 N-글루타릴 유도체인 고정자(anchor)가 기재되어 있다. 카르복실산 기는 예를들면 카르보디이미드의 존재하에서 탈아세틸화된 또는 부분적으로 탈아세틸화된 폴리시알산 화합물의 폴리사카라이드 화합물 상의 아민기와 반응될 수 있다. 또한, 팔미토일(palmitoyl) 또는 다른 지방산 염화물은 폴리사카라이드 화합물 상의 아민기와 반응시키기 위해 사용될 수 있다. 시알산 잔기의 1-카르복실산 기는 카르복실산의 나트륨염의 크라운 에테르를 형성하고 뒤이어 할로-탄화수소와의 반응에 의해, 하이드로카르빌-할로겐 원자를 갖는 소수성기를 함유하는 화합물과 에스테르 결합을 형성하기 위하여 사용될 수 있다. 폴리사카라이드의 결합에 용이하게 적용될 수 있는, 단백질을 리포솜 및 지질에 결합시키는 다수의 다른 방법들은 Gregoridadis, G 출판 "Liposomes as drug carriers" John Wiley & Sons (1988), Heath. T 등에 의한 Chem. Phys. Lipids 40, 347(1986) 및 Machy P. 등에 의한 "Liposmes in Cell Biology and Pharmacology" Les Editions Inserms, Paris (1987)에 기재되어 있다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 분자당 5개 이상의 시알산 유니트를 포함하는 폴리사카라이드 부분이 외부표면에 결합된 신규한 리포솜을 제공한다. 리포솜은 치료 또는 진단 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 리포솜-형성 지질과 분자당 5개 이상의 시알산 유니트 및 소수성 부분을 함유하는 폴리사카라이드 성분을 포함하는 폴리사카라이드 화합물의 혼합물로부터 리포솜을 생성하는 신규한 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 관점에서, 폴리사카라이드는 상기 기재된 어떤 방법에 의해서 리포솜내로 병합될 수 있다. 리포솜을 만들기 위하여 사용되는 폴리사카라이드화합물이 자연발생 당지질과 다를 경우, 화합물은 예를 들면 1-위치 또는 질소원자를 통해 폴리사카라이드 성분의 시알산 유니트에 공유적으로 결합된 소수성 부분을 갖는 것이 바람직하다. 1-위치를 통한 연결은 예를 들면 에스테르 결합으로 이루어질 수 있다. 이들 폴리사카라이드 화합물은 신규한 것으로 여겨지고, 본 발명의 다른 관점을 형성하게 된다.
1-위치에서 에스테르 결합은 신규한 방법에 의해서 형성될 수 있는데, 이 방법은 크라운 에테르를 알카리금속 또는 암모늄염의 형태로 분자당 5개 이상의 시알산 잔기를 포함하는 폴리사카라이드 부분을 포함하는 화합물과 반응시키는 제1단계와, 제1단계의 생성물을 일반식 X-R1의 화합물 (여기서 R1는 임의로 치환된 C8-30-알킬 또는 -알케닐기이고, X는 할로겐 원자이고, X는 바람직하게는 브롬이다.)과 반응시키는 제2단계로 이루어진다. 반응의 제1단계는 18-크라운-6와 같은 크라운 에테르의 존재하에서, 예를 들면 폴리사카라이드의 (즉, 시알산의 카르복실기의)의 나트륨염의 수용액중에서 실행될 수 있다. 예를들면 반응이 완결될 때까지 (예를들어 몇분 내지 몇시간, 약 5분 내지 5시간 동안) 주위 온도에서의 반응에 이어서, 물을 예를 들면 증발 또는 바람직하기로는 냉동 건조에 의해서 제거한다. 그리고 나서, 크라운 에테르를 예를들면 통상 디메틸포름아미드인 유기 용매 중에 재용해시키고, 할로탄화수소 또는 치환된 화합물을 첨가하고, 상승된 또는 바람직하게는 주위 온도에서 몇시간 또는 몇일, 예를 들면 5시간 내지 5일동안 반응이 완결될때 까지 교반한다. 화합물 XR1의 알킬 또는 알케닐기는 임의로 알킬 또는-알케닐기, 알카노일옥시 또는 알킬카르복스아미도와 같은 치환체를 포함할 수 있는 통상 C12-24, 바람직하게는 C11-22-알킬 또는 -알케닐이고, 알킬 또는 알케닐 기의 각각은 6 내지 30개의 탄소 원자를 갖는다.
본 발명의 넓은 관점에서, 폴리사카라이드가 공유결합을 경유하여 활성성분의 분자에 직접 연결될 경우, 예를 들면 활성 화합물이 작은 분자이거나 또는 비교적 짧은 폴리펩티트인 경우, 활성성분의 각 분자에 부착된 단일 분자가 있을 수 있다. 폴리사카라이드의 단일 분자가 연결되는 경우, 50개 이상의 시알산 유니트 및 바람직하게는 약 100개의 시알산 유니트 또는 그 이상이 형성되는 분자가 특히 유용하다. 폴리사카라이드가 DDS를 통하여 또는 직접적으로 예를 들면, 단백질 또는 폴리펩티드의 비교적 큰 분자인 활성성분에 공유결합을 통하여 활성성분에 연결되는 경우, 한 분자 이상의 폴리사카라이드는 사정에 따라서 DDS 유니트 또는 활성성분의 각 분자와 더욱 유리하게 회합될 수 있다. 폴리사카라이드가 예를 들면 50개 이하 또는 20개 이하의 비교적 적은 수의 시알산 유니트를 포함할 경우, 몇몇 분자들이 각 DDS 유니트 또는 활성성분의 분자와 회합되는 것이 바람직하다. 때로 예를 들면 50개 이상 또는 약 100개 또는 그 이상의 비교적 많은 수의 갖는 시알산 유니트를 갖는 몇몇 분자는 각 DDS 유니트 또는 활성성분 분자와 회합시키게 되는 것이 유익하다. 각 DDS 유니트 또는 활성성분 분자와 회합된 시알산 유니트의 총 수는 활성성분에 전달되는 전체 친수성에 영향을 준다. 비교적 높은 분자량의 폴리사카라이드 분자들을 사용함에 의해서, 순환계에서 반감기를 증가시키고, 안정성을 증가시기고, 활성성분의 면역원성을 감소시키는 것으로 생각되는 활성성분 또는 DDS로부터 증가된 거리에서 입체 효과(steric effect)가 있다. 높은 분자량의 폴리사카라이드 화합물이 사용되는 경우, 한 분자 이상의 활성성분이, 특히 활성성분이 예를들면 펩티드일 경우의 비교적 낮은 분자량을 갖는 경우, 폴리사카라이드 화합물의 각 분자와 회합될 수 있다.
본 발명은 제약학적인 활성 화합물이 연장된 기간동안 환자의 순환계에서 유효해야만 하는 경우 특히 가치가 있다. 특히, 조직에 의해 신속하게 흡수되어 제약학적 활성이 나타나지 않는 경향이 있는 재결합 DNA 기술로부터 형성되는 단백질을 포함하는 제약학적으로 활성성분에 유용하다. 본 발명에 의해 순환계에서 그 유용성이 유익하게 연장될 수 있는 제약학적으로 활성 화합물은 예를들면 Abuchowski 등에 의한 상기 인용문헌에 기재된 것처럼 효소치료에서 사용하기 위한 효소뿐만 아니라, 인터루킨 예를들면 IL-2, IL-6 또는 IL-1 인터페론, 종양괴사인자(TNF) 등이다. 본 발명에서 유익하게 사용될 수 있는 화합물의 다른 종류는 혈류에서 세포 상에 존재하는 어떤 수용체들과 상호작용을 위한 예를들면, HIV 등의 바이러스들과 경쟁하는 화합물이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 활성 화합물의 타입중 하나는 임상연구에서 사용할 수 있는 형광성 제제이다. 예를들면, 플루오레신(fluorescein) 유도체는 폴리사카라이드 화합물에 직접 커플링될 수 있거나, 폴리사카라이드 화합물로 코팅된 리포솜 내로 병합될 수 있다. 리포솜 또는 다른 DDS 내로 유용하게 병합될 활성 성분은 사이토스테틱스(cytostatics), 사이토킨(cytokines), 항생제, 헤모글로빈, 효소, 호르몬, 스테로이드 등을 포함한다.
이하, 실시예는 모든 포유동물을 위한 모델로 사용되는, 마우스에서 활성성분을 위한 모델로 사용된 분자의 증가된 순환시간을 예시한다. 이것은 활성성분이 폴리사카라이드 화합물과 결합되고, 인간에 투여될 경우 동일한 효과가 관측되는 것이 기대된다.
실시예
폴리사카라이드 화합물
그룹 B 폴리사카라이드
N. meningitidis의 그룹 B 폴리사카라이드 화합물은 약 200개의 잔기(시알산 유니트)의 사슬길이를 갖는 (2→8) α-연결된 시알산 잔기 및 폴리머의 환원 말단에 인지질의 말단 유니트로 구성된 폴리머이다. 폴리사카라이드는Neisseria meningitidis박테리아의 세포 벽으로부터 추출된다. 수용액 중에서, 폴리머는 응집체 (응집되거나 완전 형태)를 형성한다. 37℃에서 4시간 동안 0.1M NaOH 용액의 처리는 인지질과 폴리머 사슬 탈응집체 (탈응집된 형태)의 아실 사슬을 제거한다.
E. coliK1으로부터의 폴리사카라이드 B는 2→8 연결된 약 190개의 시알산 유니트를 갖는 시알산의 호모폴리머 (homopolymer)이다.E. coliK1은 약간 병원성이다. 이것은 다음 실시예들에서 "K1"으로 언급된다.
폴리사카라이드 B는 바람직하게는 80개이하 유니트인 사슬길이를 갖는 저분자량 폴리머를 형성하기 위하여 1 내지 9시간 동안 100℃, pH 7.0에서 처리함에 의해서 자동가수분해될 수 있다. 이 폴리사카라이드는 다음의 실시예들에서 "저분자량(mw) 폴리사카라이드"로 언급된다.
E. coliK1으로부터의 폴리사카라이드 B는 약 15 내지 30개 유니트의 평균 사슬 길이를 갖는콜로민산으로 알려진 생성물을 형성하도록 더 짧은 사슬길이로 가수분해될 수 있다. 이것은 상업적으로 유용하다. 이 실험에서 사용된 콜로민산은 시그마 케미칼사 (Sigma Chemical Co.)로부터 얻었다.
E. coliK92로부터의폴리사카라이드 K92는 약 80 내지 100개 유니트의 사슬길이를 갖는 교대로 시알산 2→8, 2→9결합의 호모폴리머이다. 이것은 다음의 실시예들에서 "Kk92"로 언급된다.E. coliK92는 실질적으로 비-병원성이다. 인지질 부분은N. meningitidis폴리사카라이드 B에서는 가수분해로 제거될 수 있다.
Neisseria meningitides그룹 C로부터의폴리사카라이드 C는 2→9 연결된 시알산 유니트의 호모폴리머이고, 약 120 유니트의 사슬길이를 갖는다. 당지질과 인지질 부분은N. meningitides폴리사카라이드 B에서는 제거될 수 있다.
플루오레신 접합(conjugation)
플루오레신은 임상학적 시험에서 제제로 사용되고, 생체내에서 투과성 및 미세순환 등을 조사하기 위한 제약학적인 화합물로 사용된다. 플루오레신 이소치오시아테이트(FITC)는 순환계로부터 (마우스의) 플루오레신의 소거 속도에 대한 폴리사카라이드의 접합의 효과를 조사하기 위한 이들 일부 실험에서 사용된다. 플루오레신은 잘 알려진 기술에 의해125I를 사용하여 방사성 표지될 수 있다 "핫(hot)" 플루오레신125I는125I 방사성 표지의 존재를 검출함에 의해서 계속해서 분석될 수 있다. FITC는 폴리사카라이드의 테트라부틸아미노염을 형성함에 의해서 폴리시알산 폴리사카라이드 화합물에 연결된다. 그리고 나서, 이 염은 원래 A.N. de Belder 등에 의한 Carbohydrate Res. 30, 375(1973)에 기재된 기술을 사용하여 실온에서 24시간동안 교반하면서 DMSO/피리딘 중의 용액에서 FITC와 반응시킨게 된다. 염기성 반응은 다음과 같다:
B 폴리사카라이드의 50,000달톤 당 FITC, 0.93nmol을 함유하는 접합체는 투석(透析), 이어서 접합체의 에탄올 침전 및 겔 여과, 및 다시 에탄올중 생성물을 최종적으로 재침전함에 의해서 비결합된 FITC의 추출에 의해 회수된다.125I-표지화는 접합 후 수행된다.
비-접합된 플루오레신은 약 5분내 순환으로부터 실질적으로 소거되는 것이 기술로부터 알려져 있다.
폴리시알산에 대한 분석
혈액 샘플에서 그룹 B 폴리사카라이드(PSB)를 포함하는 폴리시알산을 분석하기 위해, 혈장 샘플을 트리클로로아세트산 (10% 최종농도)으로 일차 처리하여 단백질의 말단기로 시알산을 또한 함유하는 많은 혈청단백질을 침전시켰다. 그리고 나서, 처리된 혈청을 Svennerholm의 Biochim. Biophys. Acta, vol. 24, p. 604-611(1957)에 기재된 방법을 약간 변형하여 분석하였다. 이 방법은 다음과 같이 폴리머성 시알산 또는 다른 시알산을 측정한다: 폴리사카라이드를 함유하는 샘플 (0.5mℓ)을 레솔시놀 시약 (0.5mℓ)과 혼합하고, 30분동안 격렬하게 끓는 물중에서 가열하였다. 샘플을 냉각하고, 570mm에서 직접 읽거나 또는 아밀 알콜(1mℓ)로 색 추출하거나 590mm에서 읽었다. 표준 곡선을 혈청에 적합한 폴리사카라이드의 공지된 양을 첨가하여 만들었고, 그렇지 않으면 상기한 혈청 단백질들을 침전시키는 동일한 방법으로 처리하였고, 상기 기재된 비색법(colorimetric method)으로 그것들을 분석하였다.

Claims (30)

  1. 생체 내에서 활성성분의 면역원성을 감소시키고/또는 활성 성분의 안정성을 향상시키도록 환자의 순환계에서 활성성분의 유용성을 연장시키기에 충분한 양의 폴리사카라이드 화합물과 회합된 활성성분으로 이루어지는 제약학적 조성물로,
    상기 폴리사카라이드 화합물은 폴리사카라이드 분자당 5개 이상의 시알산 유니트를 함유하고, 실질적으로 말단 갈락토스, 프코스 및 만노스 유니트가 없고, 그리고N. meningitidis, E. coliK1,Moraxella nonliquifaciens및Pasteurella aeroginosis의그룹 B 폴리사카라이드,N. meningitidis, E. coliK92 폴리사카라이드 및E. coliK1으로부터 유도된 콜로민산의 그룹 C 폴리사카라이드로부터 선택되고,
    상기 5개 이상의 시알산 유니트는 폴리사카라이드 폴리머 분자의 사슬에서 서로 2→8 또는 2→9 결합에 의해 연결되어 있는 것인 제약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 활성성분과 상기 폴리사카라이드는 공유결합 또는 소수성 결합에 의해서 서로 직접적으로 회합되는 것인 제약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 활성성분과 상기 폴리사카라이드는 약제 전달계의 매개물을 통해 서로 회합되는 것인 제약학적 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 화합물은 공유 또는 비-공유 결합에 의해서 약제 전달계와 회합되는 것인 제약학적 조성물.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 약제 전달계는 그 표면 상에 폴리사카라이드 화합물의 폴리사카라이드 성분을 포함하는 리포솜으로 이루어지는 것인 제약학적 조성물.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 약제 전달게는 거대분자 DDS이고, 상기 폴리사카라이드 화합물에 공유적으로 결합된 펩티드 또는 단백질 성분으로 이루어지는 것인 제약학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 화합물은 순환계에서 화합물의 반감기가 10시간 이상인 것인 제약학적 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 화합물은 박테리아성 폴리사카라이드 또는 그 유도체 또는 그러한 폴리사카라이드 또는 유도체의 합성 유사체인 것인 제약학적 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 폴리사카라이드는 폴리사카라이드 성분에서 분자당 20개 이상의 시알산 잔기를 갖는 것인 제약학적 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 화합물은 지방산 사슬을 제거하기 위하여 알카리 가수분해 처리되어진 당지질의 유도체인 것인 제약학적 조성물.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 활성 성분은 폴리사카라이드 화합물에 공유적으로 결합되는 펩티드 또는 단백질로 이루어지는 것인 제약학적 조성물.
  12. 외부 표면에 결합되어 있는, 분자 당 5개 이상의 시알산 유니트를 함유하는 폴리사카라이드 부분을 갖는 리포솜으로,
    상기 5개 이상의 시알산 유니트는 폴리사카라이드 폴리머 분자의 사슬에서 서로 2→8 또는 2→9 결합에 의해 연결되어 있고,
    상기 폴리사카라이드 부분은 실질적으로 말단 갈락토스, 프코스 및 만노스 유니트가 없고,N. meningitidis, E. coliK1,Moraxella nonliquifaciens및Pasteurella aeroginosis의 그룹 B 폴리사카라이드,N. meningitidis, E. coliK92 폴리사카라이드 및E. coliK1으로부터 유도된 콜로민산의 그룹 C 폴리사카라이드로부터 선택되는 것인 리포솜.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 부분은 또한 리포솜의 지질층으로 병합되는 소수성 부분을 포함하는 폴리사카라이드 화합물의 일부를 형성하는 것인 리포솜.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 화합물은 자연 발생 지질기를 포함하는 자연 발생 당지질 또는 그 유도체인 것인 리포솜.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 화합물은 소수성 부분이 공유적으로 결합되어진, 자연 발생 폴리사카라이드의 유도체로 이루어지는 것인 리포솜.
  16. 치료용 또는 진단용 약제의 제조에 사용하기 위한 제 12항에 따른 리포솜.
  17. 리포솜 형성 지질과 분자 당 5개 이상의 시알산 유니트를 함유하는 폴리사카라이드 성분 및 소수성 부분으로 이루어지는 폴리사카라이드 화합물의 혼합물로부터 리포솜의 제조 방법으로,
    상기 폴리사카라이드 화합물은 실질적으로 말단의 갈락토스, 프코스 및 만노스 유니트가 없고,N. meningitidis, E. coliK1,Moraxella nonliquifaciens및Pasteurella aeroginosis의 그룹 B 폴리사카라이드,N. meningitidis, E. coliK92 폴리사카라이드 및E. coliK1으로부터 유도된 콜로민산의 그룹 C 폴리사카라이드로부터 선택되는 것인 제조 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 화합물은 자연 발생 지질기를 포함하는 자연 발생 당지질 또는 그 유도체인 것인 제조 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 화합물은 소수성 부분이 공유적으로 결합되어진, 자연 발생 폴리사카라이드의 유도체로 이루어지는 것인 제조 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 화합물은 시알산 잔기의 1-위치에 공유 결합에 의해서 연결된 소수성 기로 이루어지는 것인 제조 방법.
  21. 제 3항에 있어서, 상기 약제 전달계는 거대분자 약제 전달계인 것인 제약학적 조성물.
  22. 제 3항에 있어서, 약제 전달계는 특유의 약제 전달계인 것인 제약학적 조성물.
  23. 제 4항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 화합물은 소수성 결합인 비-공유 결합에 의해 약제 전달계와 회합되는 것인 제약학적 조성물.
  24. 제 7항에 있어서, 상기 반감기는 적어도 20시간인 것인 제약학적 조성물.
  25. 제 9항에 있어서, 상기 폴리사카라이드는 폴리사카라이드 성분에서 분자당 적어도 50개 이상의 시알산을 갖는 것인 제약학적 조성물..
  26. 제 11항에 있어서, 상기 펩티드 또는 단백질은 폴리사카라이드 화합물에 공유 결합되는 것인 제약학적 조성물.
  27. 제 15항에 있어서, 상기 소수성 부분은 폴리사카라이드 부분의 시알산 유니트에 공유 결합되는 것인 리포솜.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 공유 결합은 시알산의 1번 위치 또는 질소 원자를 통하는 것인 리포솜.
  29. 제 19항에 있어서, 상기 소수성 부분은 폴리사카라이드 부분의 시알산 유니트에 공유 결합되는 것인 제조 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 결합은 시알산 유니트의 1번 위치 또는 질소 원자를 통하는 것인 제조 방법.
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