FI86802B - Foerfarande foer framstaellning av en makromolekylbaerare belastad med biologiskt aktivt aemne. - Google Patents

Description

1 86802

Biologisesti aktiivisella aineella kuormitetun makromolekyy-likantaja-aineen valmistusmenetelmä

Kyseessä oleva menetelmä koskee menetelmää kantaja-aineen valmistamiseksi biologisesti aktiivista ainetta varten, jota tässä yhteydessä myöhemmin nimitetään lääkkeeksi, joka menetelmä perustuu LDLsn (Low Density Lipoprotein) rekonstruointiin .

Termiä biologisesti aktiivinen aine tai lääke käytetään kyseessä olevan hakemuksen yhteydessä laajemmassa merkityksessään ja sen piiriin sisältyy aineita, jotka ovat esimerkiksi farmaseuttisesti aktiivisia aineita, entsyymejä, myrkkyjä, radioherkistäjiä, radioaktiivisia aineita, jne.

On tehty monia yrityksiä biologisesti aktiivisen aineen, esimerkiksi kasvaimenvastaisen aineen, konsentraation lisäämiseksi tietyssä elimessä tai tietyissä kohdesoluissa hoidon tehon lisäämiseksi ja sivuvaikutusten vähentämiseksi.

Eräs tapa on kytkeä lääke kantaja-aineeseen, esimerkiksi makromolekyyliin. Perussyy on, että kohdesolun tulisi ottaa makromolekyyli tehokkaasti tai että kantaja-aineen ja lääkkeen välinen kytkentä muuten antaisi paremman tehon kuin vapaa lääkeaine.

Kantaja-aineena tapahtuvan käytön suhteen on tutkittu useita makromolekyylejä, kuten esimerkiksi DNA:a, liposomeja, punasolujen kuoria, lektiinejä, erilaisia proteiineja, kuten esimerkiksi vasta-aineita, peptidihormoneja sekä glukoproteiine-ja. On kokeiltu myös muita molekyylejä, kuten esimerkiksi estrogeeneja.

2 86802 Lääkkeeseen kytketyn kantaja-aineen tulisi täyttää seuraavat kriteerit: 1. Sen tulisi läpäistä anatomiset esteet, jotka erottavat annostelukohdan ja kohdesolun, 2. kantaja-aineen ja lääkkeen välisen sidoksen tulisi olla veressä riittävän kestävä, 3. maksan ja pernan retikuloendoteelijärjestelmän ei tulisi viedä sitä nopeasti pois verenkierrosta, 4. se ei saisi läpäistä solumembraaneja diffuusion avulla, jotta estetään epäspesifinen otto soluihin, jotka eivät ole kohdesoluja, 5. sillä tulisi olla mahdollisimman selektiivistä vuorovaikutusta kohdesolun pinnan reseptoreiden kanssa, 6. kantaja-aine siirtää soluun aineita, jotka ovat inaktiivisesta kytketyt kantaja-aineeseen, mutta jotka ovat aktiivisia solussa, jossa sidoksen tulisi katketa, 7. kantaja-aine ei saisi olla immunogeeni.

Monet ehdotetut kantaja-aineet, kuten esimerkiksi liposomit, eivät täytä yllä esitettyä kolmatta kriteeriä, esimerkiksi maksa ja perna vievät ne nopeasti pois verestä, ja sen tähden ne eivät säily riittävää aikaa tarvittavan vaikutuksen aikaansaamiseksi.

LDL, Low Density Lipoprotein, on makromolekyyli, jolla on useita attrahoivia ominaisuuksia. Tämä lipoproteiini on pallomainen partikkeli, jonka läpimitta on noin 220 Ä, tiheys on 1,019 - 1,063 ja molekyylipaino on noin 3 megadaltonia ja se pysyy ihmisen verenkierrossa 2-3 päivää. Kukin LDL-partik-keli sisältää polaarittoman ytimen, joka koostuu noin 1500 kolesterolimolekyylistä, jotka ovat esteröityneet pitkäket-juisiin rasvahappoihin. Ydin on kolesterolin, fosfolipidin ja apolipoproteiini B:n, apo B:n, muodostaman polaarisen kuoren ympäröimä. LDL on pääasiallinen kolesterolin kuljettaja ihmisen plasmassa, ja se sisältää noin 70 % plasman kolesterolista .

86802 3

Nisäkässolujen pinnalla on spesifisiä LDL-reseptoreita , jotka tunnistavat apo B:n ja sitovat LDL-partikkelin . LDL-partikke-lille tapahtuu sitten endosytoosi, ja se kuljetetaan lysoso-meihin, joissa se hajotetaan.

Jos biologisesti aktiivinen aine voisi olla kytketty tai sisällytetty LDL-partikkeliin sellaisella tavalla, että uudelleen muodostettu LDL käyttäytyy luonnonmukaisen LDL:n tavoin LDL-reseptorin suhteen, joka välittää soluunoton ja biologisen puoliintumisajan plasmassa, aine voisi käyttää maalitauluna soluja, joissa LDL-reseptoreiden taso on korkea. LDL:n pitkän puoliintumisajan johdosta järjestelmä yhtä hyvin voisi toimia sopivia aineita hitaasti luovuttavana järjestelmänä.

Krieger et ai. (J. Biol. Chem. 253 (1978) 4093-4101 sekä J. Biol. Chem. 254 (1979) 3843-3853) ovat kuvanneet uudelleen-muodostamismenetelmää. Heidän menetelmänsä on lyhyesti sanottuna se, että LDL lyofi1isoidaan liukenemattoman perunatärkkelyksen läsnäollessa ja neutraalit lipidit uutetaan orgaanisella 1iuottimel1 a, kuten esimerkiksi heptaanilla. Sisällytettävä aine liuotetaan orgaaniseen liuottimeen, ja näitä in-kuboidaan LDL:n kanssa, josta lipidit on poistettu. Orgaanisen liuottimen haihduttamisen jälkeen uudelleen muodostettu LDL liuotetaan puskurin vesiliuokseen.

Vaikkakin LDL-reseptori in vitro ottaa Krieger et al:n menetelmän mukaan uudelleen muodostetun LDL-partikkelin, sitä ei voida käyttää in vivo, koska maksan ja pernan retikuloendo-teelijärjestelmän solut ottavat nopeasti uudelleen muodostetut partikkelit. Kyseessä olevan patenttihakemuksen tekijät ovat kehittäneet muunnetun uudelleen muodostamismenetelmän, joka antaa uudelleen muodostetun LDL-partikkelin, jolla on sekä in vitro että in vivo melkein samat ominaisuudet kuin luonnonmukaisella LDL:llä.

4 86802

Kyseessä oleva keksintö koskee menetelmää biologisella, aktiivisella aineella kuormitetun kantaja-aineen valmistamiseksi, joka kantaja-aine perustuu uudelleen muodostettuun LDL:ään, jossa menetelmässä (1) LDL lyofilisoidaan suojaavan aineen läsnäollessa; (2) lyofilisoitua LDL:a uutetaan orgaanisella liuottimena; (3) biologisesti aktiivinen aine liuotetaan liuottimessa ja sitä inkuboidaan uutetun LDL:n kanssa; (4) liuotin haihdutetaan; (5) uudelleen muodostettu LDL liuotetaan puskurin vesiliuokseen ja (6) aine, joka ei sisälly LDL-kompleksiin, erotetaan siitä. Menetelmän vaiheessa (1) suojaava aine on monosakkaridi, di-sakkaridi, vesiliuokoinen polysakkaridi, sokerialkoholi tai näiden seos ja vaiheessa (3) uute, joka on saatu uuttamalla lyofilisoitua LDL:a, sekoitetaan lipofiilisen, biologisesti aktiivisen aineen kanssa, joka on liuotettu orgaaniseen liuottimeen, ja sitten tätä seosta inkuboidaan LDL:n kanssa.

Kyseessä olevan keksinnön mukainen menetelmä eroaa Krieger et ai:n menetelmästä pääasiallisesti suojaavan aineen käytön suhteen. Vaiheessa (1) Krieger käyttää perunatärkkelystä suo-jaavana aineena. Perunatärkkelys on veteen liukenematon polysakkaridi, jolla on suuri molekyylipaino. Kyseessä olevaan hakemukseen sisältyvässä menetelmässä suojaavana aineena on monosakkaridi, disakkaridi, vesiliuokoinen polysakkaridi, sokerialkoholi tai niiden seos.

Plasman selvityskyvyn tutkimiseksi humaani-LDL:a ruiskutettiin hiirien (Balb/C) laskimoon ja ruiskutetun annoksen prosentuaalinen plasmaan jäänyt määrä määritettiin 90 minuutin kuluttua. Prosentuaalinen määrä luonnonmukaista LDL:a, joka jää plasmaan 90 minuutin kuluttua, on 59 %. Kriegerin et ai. menetelmän mukaisesti uudelleen muodostetun LDL:n prosentuaalinen määrä, joka jää plasmaan, on hyvin pieni, alle 3 %. Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti plasmaan jäljelle jäävä määrä on 57-58 %, joka merkitsee hyvin yllättävää ja teknisesti tärkeää kehitystä.

.1 s 86802

Plasman selvityskyky kaniineissa määritettiin radiomerkatun LDL:n, luonnonmukaisen LDL:n, Kriegrin et ai. menetelmän mukaisen, uudelleen muodostetun LDL:n ja kyseessä olevan keksinnön mukaisesti uudelleen muodostetun LDL:n plasmassa tapahtuvalle hajoamiselle laadituista käyristä. Kuten kuvasta 1 voidaan nähdä, luonnonmukaisella LDL:llä ja kyseessä olevan keksinnön mukaisesti uudelleen muodostetulla LDL:llä on saman suuruinen selvityskyky, kun taas LDL, joka on muodostettu uudelleen Krieger et al:n menetelmän mukaisesti, hävisi plasmasta nopeasti.

Puskuriin uudelleen liuotetun LDL:n erilaisten valmisteiden partikkelikoko määritettiin puolisähköisen valonhajonnan avulla. Havaittiin, että lyofilisoidun LDLrn, jolla ei ole mitään suojaavaa ainetta, näennäinen, keskimääräinen, hydrodynaaminen säde on noin 2,9 kertaa suurempi kuin luonnonmukaisella LDL:llä, ja LDL:llä, joka on lyofilisoitu siten, että läsnä on suojaavana aineena perunatärkkelystä, säde on noin 2,7 kertaa, kun taas sakkaroosin läsnäollessa lyofilisoidun LDL:n säde on noin 1,2 kertaa luonnonmukaisen LDL:n säteen suuruinen. Kriegerin menetelmän mukaisella lääke-LDL-kompleksilla näennäinen, keskimääräinen, hydrodynaaminen säde on noin 3,8 kertaa luonnonmukaisen LDL:n säteen suuruinen, kun taas kyseessä olevan menetelmän mukaisesti uudelleen muodostetun lääke-LDL-kompleksin säde on noin 1,3 kertaa luonnonmukaisen LDL:n säteen suuruinen.

Kriegerin et ai. mukainen uudelleenmuodostamismenetelmä perustuu A. Gustafsonin kehittämään menetelmään (J. Lipid Res. 1965, 6, 512-517) kolesteryyliestereiden LDL:n ytimestä. Tämän menetelmän avainvaihe on käyttää perunatärkkelystä stabiloimaan apoproteiineja, joista lipidi on poistettu, lyofi-lisoinnin aikana sekä uutettaessa heksaanilla neutraaleja lipidejä LDL:n ytimestä.

86802 6

Kuten yllä on esitetty, Kriegerin et ai. menetelmä ei anna LDL:11 e riittävää suojaa. LDL-partikkelin uudelleen muodostamisen kannalta on tärkeää korvata sopiva määrä ytimen neutraali 1 i pi dei tä halutulla aineella tai lääkkeellä. Jos lääke LDL-kömpi eksi a tulisi käyttää LDL-reseptorien kautta tapahtuvaan hyökkäykseen ja liian paljon lääkettä on sisällytetty LDL-partikkeliin, on vaarana, että lääke vuotaa ulos LDL-partikkelin törmätessä eri soluihin veressä ja verisuonissa. Tämän tuloksena tapahtuu epäspesifistä lääkkeen soluunottoa, ja tässä tapauksessa yhdistetyn lääkkeen ja LDL:n muodostama kompleksi toimii hitaasti luovuttavana järjestelmänä. Sopivan suojaavan aineen tulisi estää LDL-partikkeleiden liittyminen yhteen tai muut vauriot, kuten esimerkiksi irtoaminen partikkelista, sekä estää lipidien syrjäytyrninen liian suuressa määrin LDL-partikkelista .

Jos käytetyn suoja-aineen määrä on liian pieni, silloin syntyvällä, uudelleen muodostetulla LDL-partikkelΐ11 a tulee olemaan nopea clearance plasmasta; tämä vaikutus ei ole lineaarinen, ja suojaavan aineen määrän tulisi olla ainakin 1 mg/mg LDL, jossa LDL on mitattu proteiinina. Toisaalta, jos suojaavan aineen määrä on liian korkea, liitetyn lääkkeen määrä tulee olemaan liian alhainen; tämä tarkoittaa, että on olemassa tietty alue käytetylle suojaavan aineen määrälle.

Suojaavat aineet, jotka täyttävät yllä esitetyt kriteerit, ovat vesiliukoisia sakkarideja, kuten esimerkiksi monosakka-rideja, disakkarideja, trisakkarideja, vesiliukoisia polysakkarideja, sokerialkoholeja tai niiden seoksia.

Esimerkkejä monosakkarideista, joita voidaan käyttää kyseessä olevan keksinnön mukaisesti, ovat: glukoosi, mannoosi, glyse-raldehydi, ksyloosi, lyksoosi, taloosi, sorboosi , ribuloosi, ksyluloosi, galaktoosi ja fruktoosi. Esimerkkejä disakkari-deista ovat sakkaroosi, trehaloosi, laktoosi ja maltoosi. Raffinoosi on esimerkki trisakkarideista . Vesiliukoisten po- 7 86802 lysakkaridi en joukosta voidaan mainita tiettyjä vesiliukoisia tärkkelyksiä sekä selluloosia. Glyseroli on esimerkki soke-riaikoholei sta .

Edullisia, suojaavia aineita kyseessä olevassa keksinnössä ovat sakkaroosi, glukoosi tai fruktoosi, joiden ansiosta LDL-kompleksi toimii luonnonmukaisen LDL:n tavoin.

Orgaaninen liuotin, jota käytetään vaiheessa (2) lyofilisoi-dun LDL:n uuttamiseen, on mieluummin ei-polaarinen liuotin, kuten esimerkiksi heptaani tai hiΐ1itetraklori di. Heptaani on edullinen liuotin.

Biologisesti aktiivisen aineen, joka sisällytetään lyofi1i-soituun LDLrään, tulee olla lipofiilinen aine. Esimerkkejä sellaisista biologisesti ak ti i vi si s ta aineista, joita voidaan sisällyttää LDL-partikkelin kyseessä olevan keksinnön mukaisesti, ovat kasvaimen vastaiset lääkkeet, lääkeaineet, jotka vaikuttavat kolesterolin synteesiin, sekä radioherkistäjät, entsyymit, entsyymi-inhibiittorit, radioaktiiviset aineet, myrkyt jne.

Ei-sisäl1ytetyn, biologisesti aktiivisen aineen erottaminen kompleksista, joka sisältää LDL:n ja biologisesti aktiivisen aineen, tapahtuu vettä sisältävään puskuriin suoritetun liuottamisen jälkeen tunnetuin menetelmin, kuten esimerkiksi sentrifugoimal1 a, suodattamalla jne.

Kyseessä olevaa keksintöä valaistaan seuraavin esimerkein, joissa 1ämpötila esitetään Celsius-asteina.

Esimerkeissä käytetty LDL oli humaani-LDL (tiheys 1,019- 1,063 ), joka saatiin sentrifugoimal1 a terveiden vapaaehtoisten luovuttajien plasmasta. Kaikki LDL-määrät tarkoittavat proteiinia, joka on määritetty Lowryn et ai. menetelmän mukaisesti, J. Bio!. Chem. 193 (1951) 265-275, jossa menetel- 8 86802 massa käytettiin standardina häränseerumin albumiinia. Käytetty, biologisesti aktiivinen kasvaimen vastainen lääkeaine on AD-32, N - trif1uoria setyy1iadriamysiini-14-va1eraatti. In vivo-kokeet suoritettiin Balb/C-hiirillä.

Esimerkki 1 2 mg LDL:a (400 mikrolitraa nestettä), jota oli dialysoitu 0,3-molaarista Na-EDTA:a vastaan, siirrettiin si1ikonoituun lasiputkeen ja siihen lisättiin 100 mg sakkaroosia. Liuos o jäädytettiin nopeasti -50 C:ssa, etanolissa, ja sitä lyofi- lisoitiin 5-6 tunnin ajan. Kuivattua valmistetta uutettiin kolme kertaa 5 ml:n suuruisella erällä heptaania. Heptaanija- keet yhdistettiin ja haihdutettiin. Kuivattuihin uutteisiin lisättiin sitten 2 mg AD-32:a, joka oli 0,5 ml:ssa vedetöntä dietyylieetteriä. Liuos sekoitettiin uutetun LDL:n kanssa va- o rovaisesti ravistellen, ja seosta inkuboitiin 4 C:ssa 15 minuutin ajan. Liuotin haihdutettiin typen alla, lääkeaine-LDL-kömpieksi liuotettiin lisäämällä 1 ml 10-mi 11imolaarista trisiiniä, pH 8,4. Liukenematon lääkeaine, joka ei mennyt kompleksiin, erotettiin sentrifugoimal1 a 5 minuutin ajan Beckman-mikrofugissa. Tämä antoi uudelleen muodostetun LDL-partikkelin, joka sisälsi 110-130 molekyyliä AD-32:a LDL-partikkelia kohti. Prosentuaalinen määrä, joka jäi plasmaan Balb/C-hiiri11ä, oli 58, 90 minuutin kuluttua.

Esimerkki 2

Esimerkki 2 suoritettiin, kuten esimerkki 1, mutta lyofili-soitua LDL:a ei uutettu heptaanilla, sen sijaan AD-32, joka oli liuotettu eetteriin, lisättiin suoraan. Tämä antoi 35-43 molekyyliä AD-32:a LDL-partikkelia kohti, ja plasmaan jäävä määrä oli 55 %.

Esimerkki 3

Esimerkki 3 suoritettiin, kuten esimerkki 1, mutta suojaavana aineena käytettiin sakkaroosin tilalla 80 mikrolitraa glyserolia. Tämä antoi noin 50 molekyyliä AD-32:a LDL:a kohti, ja plasmaan jäi noin 55 %.

9 86802

Esimerkki 4 - Vertaileva koe I

Esimerkki suoritettiin, kuten esimerkki 1, mutta sakkaroosin tilalla käytettiin 25 mg perunatärkkelystä. LDL:n uuttamisen jälkeen saatu uute heitettiin pois, ja AD-32, joka oli vedettömässä eetterissä, lisättiin suoraan uutettuun LDL:ään. (Krieger et a1:n menetelmä). Tämä antoi noin 400 molekyyliä AD-32:a LDL:a kohti, mutta injektoidun annoksen jäänne plasmassa oli alle 3 %:n.

Esimerkki 5 - Vertaileva koe II

Esimerkki suoritettiin, kuten esimerkki 1, mutta sakkaroosin tilalla käytettiin 25 mg perunatärkkelystä ja 80 mg glyserolia. Tämä antoi noin 50 molekyyliä AD-32:a LDL-partikkelia kohti, ja jäänne plasmassa oli 50 %.

Hoitokoe 1 Tässä kokeessa käytettiin lääkeainetta AD-32. Tässä kokeessa annostellun AD-32:n määrä oli selvästi yhdisteen hiirelle myrkyllisen tason alapuolella, ja tulos esitetään tässä yhteydessä 1ääke-LDL-kömpieksin kohdevaikutuksesta vapaaseen lääkkeeseen verrattuna. Balb/C-hi i rille ruiskutettiin vatsaonteloosi sä i sesti (i.p) 1,0 miljoonaa WEHI-3B-soiua, hiiren mo-nomyelosyyttistä solupolvea. Mitään eroa (2 %) ei havaittu elinajassa (ILS, lisääntynyt elinaika, Increased Life Span) kontrollien ja ryhmän välillä, jota oli käsitelty 1,9 mg:lla AD-32:a kg:aa kohti viiden päivän ajan. AD-32:a annosteltiin i.p. etanolin ja risiiniöljyn seokseen liuotettuna. Hiirillä, jotka saivat saman annoksen AD-32:a, joka oli sisällytetty LDL:ään esimerkin 1 mukaisesti ja jota annettiin i.p. viiden päivän ajan, elinikä oli lisääntynyt 26 %.

Hoitokoe 2

Balb/C-hiiriin ruiskutettiin i.p. 1,0 miljoonaa WEHI-3B-solua sekä alkyloivaa ainetta, 4-N,N-bis(kloorietyy1i)-2-me- 10 86802 tyyli-naftaleenia, sisällytettiin kyseessä olevan menetelmän mukaisesti. Eläimiä käsiteltiin neljänä peräkkäisenä päivänä i.p., ja tulokset esitetään kuviossa 2. Kontrolliryhmä kuoli 12. - 18. päivien kuluessa, kun taas käsitelty ryhmä kuoli 25. päivästä lähtien, 50 %:n vielä eläessä 42. päivänä ja 40 %:n jäädessä vielä eloon (50. päivänä).

Claims (9)

11 86802

1. Menetelmä kantaja-aineen valmistamiseksi, joka kantaja-aine on kuormitettu lipofiilisellä, biologisesti aktiivisella aineella, ja joka menetelmä perustuu uudelleen muodostettuun LDLrään (Low Density Lipoprotein; pientiheyslipo-proteiini) jossa menetelmässä (1) LDL lyofilisoidaan suojaavan aineen läsnäollessa; (2) lyofilisoitu LDL uutetaan orgaanisella liuottimena; (3) biologisesti aktiivista ainetta, joka on liuotettu liuottimeen, inkuboidaan uutetun LDL:n kanssa; (4) liuotin haihdutetaan ja uudelleen muodostettu LDL liuotetaan puskurin vesiliuokseen; (5) biologisesti aktiivinen aine, joka ei ole mennyt kompleksiin, erotetaan LDL-kompleksista, tunnettu siitä, että vaiheessa (1) suojaava aine on mono-sakkaridi, disakkaridi, vesiliukoinen polysakkaridi, soke-rialkoholi tai näiden seos ja vaiheessa (3) uute, joka on saatu uuttamalla lyofilisoitua LDL:a, valinnaisesti sekoitetaan lipofiilisen, biologisesti aktiivisen aineen kanssa ja tätä seosta sitten inkuboidaan LDL:n kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suojaava aine on glyseraldehydi, ksyloosi, lyk-soosi, raffinoosi, glukoosi, mannoosi, galaktoosi, taloosi, ribuloosi, ksyluloosi, trehaloosi, fruktoosi, sorboosi, maltoosi, laktoosi, sakkaroosi, glyseroli tai näiden seos.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suojaava aine on sakkaroosi.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suojaava aine on glukoosi.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suojaava aine on fruktoosi.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologisesti aktiivinen aine on 4-amino-N,N-bis(kloorietyyli)-2-metyylinäftaleeni. 12 86802

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologisesti aktiivisen aineen liuottamiseen käytetty liuotin vaiheessa (3) on etyylieetteri, heptaani, hiilitetrakloridi tai bentseeni.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suojaavaa ainetta on 0,5 - 100 mg/mg LDL: a, jolloin LDI, on mitattu proteiinina.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukaisesti saadun tuotteen käyttö diagnostisiin tarkoituksiin ihmisillä ja eläimillä.