DK168785B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af en bærer ladet med lipofilt biologisk aktivt stof på basis af rekonstitueret LDL - Google Patents

Description

i DK 168785 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en bærer ladet med lipofilt biologisk aktivt stof, i det følgende kaldet medikament, på basis af rekonstitueret LDL (lavdensitetslipopro-tein).

5 Udtrykket biologisk aktivit stof eller medikament anvendes i den foreliggende sammenhæng i sin bredest mulige betydning og indbefatter sådanne stoffer som farmaceutisk aktive stoffer, enzymer, toxiner, radiosensibiliseringsmidler, radioaktive stoffer etc.

Mange forsøg er blevet gjort på at øge koncentrationen af et biolo-10 gi sk aktivt stof, for eksempel et antitumormedikament, i et vist organ eller i visse målceller for at øge behandlingens effektivitet og reducere dens bivirkninger.

En måde at opnå dette på er at binde medikamentet til en bærer, for eksempel et makromolekyle. Den logiske begrundelse er, at målcellens op-15 tagel se af makromolekylet skal være stor, eller at bærer/medikamentbind-ingen i andre henseender vil give en bedre effektivitet, end det ville være tilfældet med det frie medikament.

En række makromolekyler er blevet undersøgt med hensyn til deres brug som bærere, såsom DNA, liposomer, røde bl odlegeme-"ghost"-cel ler, 20 det vil sige røde blodlegemer, der har mistet deres hæmoglobinindhold, lecitiner, forskellige proteiner, såsom antistoffer, peptidhormoner og glucoproteiner. Andre molekyler, såsom østrogener har også været forsøgt.

En ideel bærer bundet til et medikament bør opfylde følgende krite- 25 rier: 1. Den bør permeere gennem de anatomiske barrierer, som adskiller administreringsstedet og målcellen; 2. Bindingen mellem bæreren og medikamentet bør være tilstrækkeligt stabil i blod; 30 3. Den bør ikke fjernes hurtigt fra blodcirkulationen af det re- tikuloendoteliale system i lever og milt; 4. Den bør være ude af stand til at krydse cellemembranerne ved diffusion for at hindre uspecifik optagelse i ikke-målceller; 5. Den bør vekselvirke så selektivt som muligt med 35 receptorer på mål celleoverfladen; 6. Stoffer, som bindes inaktivt til bæreren, men er biologisk aktive i cellen, skal føres ind i cellen af bæreren, hvor bindingen bør spaltes; og DK 168785 B1 2 7. Den bør være ikke-immunogen.

Adskillige foreslåede bærere, såsom liposomer opfylder ikke det tredie af ovenstående kriterier, det vil sige, at de hurtigt fjernes fra blodet af leveren og milten og derfor ikke bliver tilbage i tilstrække-5 lig tid til at give den krævede effekt.

LDL, Low Density Lipoprotein eller lavdensitetslipoprotein, er et makromolekyle, som har adskillige attraktive egenskaber. Dette lipoprotein er en kugleformet partikel med en diameter på ca. 220 Å, en densitet mellem 1,019 og 1,063 og en molekylvægt på ca. 3 megadalton og for-10 bliver i kredsløbet i 2-3 dage hos mennesker. Hver LDL-partikel indeholder en ikke-polær kerne opbygget af ca. 1500 cholesterolmolekyler, som er forestret med langkædede fedtsyrer. Kernen er omgivet af et polært overtræk af cholesterol, phospholipid og apoprotein B, apo B. LDL er den væsentligste cholesterol transportør i human plasma, idet det indeholder 15 ca. 70% plasmacholesterol. Pattedyrsceller har specifike LDL-receptorer på overfladen, som genkender apo B og binder LDL-partiklen. LDL-partik-len endocytoseres derefter og transporteres til lysosomerne, hvor den nedbrydes.

Hvis et biologisk aktivt stof kunne kobles til eller inkorporeres i 20 LDL-partiklen på en sådan måde, at det rekonstituerede LDL opførte sig lige som nativt LDL med hensyn til LDL-receptorformidlet optagelse og biologisk halveringstid i plasma, kunne stoffet rettes mod celler, der udtrykker høje niveauer af LDL-receptorer. På grund af LDL's lange halveringstid kunne systemet ligeledes virke som et system til langsom af-25 givelse af passende stoffer.

Krieger et al (J. Biol. Chem. 253 (1978) 4093-4101 og J. Biol.

Chem. 254 (1979) 3843-3853) har beskrevet en rekonstitueringsprocedure. Deres metode går i korte træk ud på, at LDL lyofiliseres i nærvær af uopløseligt kartoffelstivelse, og de neutrale lipider ekstraheres med et 30 organisk opløsningsmiddel, såsom heptan. Stoffet, som skal inkorporeres, bringes i opløsning i et organisk opløsningsmiddel og inkuberes med det lipidbefriede LDL. Efter afdampning af det organiske opløsningsmiddel bringes det rekonstituerede LDL i opløsning i en vandig puffer.

De beskyttende virkning af glucose, saccharose og glycerol er kendt 35 fra artikler af Y.E. Lovelock, Proceedings of the Royal Society London, 147, 427-433 (1957) og A. Gustafson, Journal of Lipid Research, 6, 512-517 (1965). Ifølge Gustafson var opløseliggjort stivelse det foretrukne materiale, og Krieger et al. foretog uden tvivl denne udvælgelse i er- DK 168785 B1 3 kendelse af, at Gustafson rapporterede, at sådanne forbindelser som glucose og saccharose delvis ville beskytte 1ipidproteinkomplekser under frysetørring. Dette var baseret på anvisninger givet af Lovelock, som nævner, at bl.a. glucose og saccharose i varierende koncentrationer kan 5 beskytte beta-1ipoproteiner.

M.Y. Rudi i ng et al., Cancer Research, 43, 4600-4605 (1983) beskriver den terapeutiske anvendelse af medikamentladet LDL.

Selv hvis den rekonstituerede LDL-partikel ved metoden ifølge Krie-ger et al udviser LDL-receptorformidlet optagelse in vitro, kan den ikke 10 anvendes in vivo, da de rekonstituerede partikler hurtigt optages af cellerne i det retikuloendoteliale system i lever og milt.

Det har overraskende vist sig, at en modificeret rekonstitueringsprocedure giver en rekonstitueret LDL-partikel med næsten samme egenskaber som nativt LDL både in vitro og in vivo.

15 Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en bærer ladet med lipofilt biologisk aktivt stof på basis af rekonstitueret LDL (lavdensitetslipoprotein), hvor (1) LDL lyofiliseres i nærvær af et beskyttelsesmiddel i form af et monosaccharid, et disaccha-rid, et vandopløseligt polysaccharid, en sukkeralkohol eller en blanding 20 af disse, (2) det lyofili serede LDL eventuelt ekstraheres med et organisk opløsningsmiddel, (3) det biologisk aktive stof bragt i opløsning i et opløsningsmiddel inkuberes med det lyofiliserede og eventuelt ekstraherede LDL, idet den ved ekstraktion af det lyofiliserede LDL opnåede ekstrakt eventuelt blandes med det lipofile biologisk aktive stof, og 25 denne blanding derefter inkuberes med LDL, (4) opløsningsmidlet afdam-pes, og det rekonstituerede LDL bringes i opløsning i en vandig puffer, og (5) det ikke-inkorporerede biologisk aktive stof adskilles fra LDL-komplekset.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen adskiller sig i hovedsagen fra 30 fremgangsmåden ifølge Krieger et al ved brugen af det beskyttende stof.

I trin (1) anvender Krieger kartoffelstivelse som beskyttelsesmiddel. Kartoffelstivelse er et vanduopløseligt polysaccharid med høj molekylvægt. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes der som beskyttelsesmiddel et monosaccharid, et disaccharid, et vandopløseligt poly-35 saccharid, en sukkeralkohol eller en blanding af disse.

For at undersøge plasmaclearance injiceredes humant LDL intravenøst i mus (Balb/C), og den procentdel af den injicerede dosis, som var tilbage i plasmaet, bestemtes efter 90 minutter. Procentdelen af nativt DK 168785 B1 4 LDL, som er tilbage i plasmaet efter 90 minutter, er ca. 59. Den procentdel af LDL rekonstitueret ved fremgangsmåden ifølge Krieger et al, som er tilbage i plasma, er meget lav, mindre end 3. Den procentdel, der forbliver i plasma ifølge opfindelsen, har værdier 57 til 58, hvilket er 5 en meget overraskende og teknisk betydningsfuld udvikling.

Plasmaclearance i kaniner bestemtes ud fra plasmahenfaldskurver for radiomærket LDL: for nativt LDL, for LDL rekonstitueret ved fremgangsmåden ifølge Krieger et al og LDL rekonstitueret ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Som det fremgår af fig. 1, havde nativt LDL og det rekon-10 stituerede LDL ifølge opfindelsen samme clearance, mens det rekonstituerede LDL ifølge Krieger et al forsvandt hurtigt fra plasmaet.

Partikelstørrelserne af forskellige præparater af LDL, som er bragt i opløsning igen i puffer, er blevet bestemt ved hjælp af kvasielektrisk lysspredning. Det fandtes, at den tilsyneladende middelværdi af hydrody-15 namisk radius af lyofiliseret LDL uden noget beskyttende stof var ca.

2,9 gange større end værdien for nativt LDL, og at LDL lyofiliseret i nærvær af kartoffelstivelse som beskyttelsesstof havde en radius på ca.

2,7 gange det native LDL's, mens LDL lyofiliseret i nærvær af saccharose havde en radius på ca. 1,2 gange nativt LDL's. Medikament-LDL-komplekset 20 fremstillet ved fremgangsmåden ifølge Krieger havde en tilsyneladende middelværdi af hydrodynamisk radius på ca. 3,8 gange værdien for nativt LDL, mens det rekonstituerede medikament-LDL-kompleks ifølge opfindelsen havde en radius på ca. 1,3 gange det native LDL's.

Rekonstitueringsmetoden ifølge Krieger et al er baseret på en frem-25 gangsmåde udviklet af A. Gufstafson (J. Lipid Res. 1965, 6, 512-517) til ekstraktion af cholesterylestrene fra LDL's kerne. Nøgletrinnet i denne procedure er anvendelsen af kartoffelstivelse til stabilisering af de lipidbefriede apoproteiner under lyofi1 i seringen og heptanekstraktionen af de neutrale lipider fra LDL's kerne.

30 Som vist ovenfor vil fremgangsmåden ifølge Krieger et al ikke give tilstrækkelig beskyttelse af LDL. En vigtig ting ved rekonstitueringen af LDL-partiklen er erstatning af en passende mængde af de neutrale lipider i kernen med det ønskede stof eller medikament. Hvis medikament-LDL-komplekset skal anvendes til målsøgning via LDL-receptorbanen, og 35 der indføres for meget af medikamentet i LDL-partiklen, er der en risiko for, at medikamentet siver ud, når LDL-partiklen kolliderer med forskellige celler i blodet og blodkarrene. Dette giver en uspecifik optagelse af medikamentet, og i dette tilfælde fungerer det inkorporerede medika- DK 168785 B1 5 ment-LDL-kompleks som et system til langsom afgivelse. Et passende beskyttelsesstof bør hindre aggregering af LDL-partiklerne eller anden beskadigelse, såsom at partiklen går i stykker, og hindre for stor udskiftning af lipiderne for LDL-partiklen.

5 Hvis mængden af anvendt beskyttelsesstof er for lille, vil den re sulterende rekonstituerede LDL-partikel have en hurtig clearance fra plasma; denne effekt er ikke lineær, og mængden af beskyttelsesstof bør være mindst 1 mg/mg LDL, hvor LDL måles som protein. Hvis på den anden side mængden af beskyttelsesstof er for høj, vil mængden af inkorporeret 10 medikament være for lav, hvilket betyder, at der er et vist område for den anvendte mængde af beskyttelsesstof.

Beskyttelsesstoffer der opfylder ovenstående kriterier er vandopløselige saccharider såsom monosaccharider, disaccharider, trisaccharider, vandopløselige polysaccharider, sukkeralkoholer eller blandinger af dis-15 se.

Som eksempler på monosaccharider der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan nævnes: glucose, mannose, glyceraldehyd, xylose, lyxose, talose, sorbose, ribulose, xylulose, galactose og fructose. Som eksempler på disaccharider kan nævnes saccharose, trehalose, 20 lactose og maltose. Som eksempel på trisaccharider kan nævnes raff i nose. Blandt vandopløselige polysaccharider kan nævnes visse vandopløselige stivelser og celluloser. Som eksempel på sukkeralkoholer kan nævnes glycerol .

Foretrukne beskyttelsesmidler ifølge opfindelsen er saccharose, 25 glucose eller fructose, som giver et LDL-kompleks, der opfører sig ligesom nativt LDL.

Det organiske opløsningsmiddel, der anvendes i trin (2) til ekstraktion af det lyofiliserede LDL, er fortrinsvis et ikke-polært opløsningsmiddel såsom heptan eller carbontetrachlorid. Heptan er det fore-30 trukne opløsningmiddel.

Det biologisk aktive stof, der inkorporeres i det lyofiliserede LDL, skal være et lipofilt stof. Som eksempler på sådanne biologisk aktive stoffer, der kan inkorporeres i LDL-partiklen ifølge opfindelsen, kan nævnes antitumormedikamenter, medikamenter der påvirker cholesterol -35 syntesen samt radiosensibiliseringsmidler, enzymer, enzyminhibitorer, radioaktive stoffer, toxiner etc.

Adskillelsen af det ikke-inkorporerede biologisk aktive stof fra komplekset bestående af LDL og det biologisk aktive stof udføres efter DK 168785 B1 6 opløsning i vandig puffer ved kendte procedurer såsom centrifugering, filtrering etc.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler, hvori temperaturer er angivet i grader celcius. Det i eksemplerne anvendte LDL var 5 humant LDL (densitet 1,019 - 1,063) opnået ved ultracentrifugering af plasma fra raske, frivillige mennesker. Alle LDL-mængder refererer til protein i henhold til fremgangsmåden ifølge Lowry et al, J. Biol. Chem.

193 (1951) 265-275, hvor bovinserumalbumin anvendes som standard. Det anvendte biologisk aktive stof er antitumormedikamentet AD-32, N-tri-10 fluoracetyladriamycin-14-valerat. In vivo testene udførtes på Balb/C-mus.

Eksempel 1 2 mg LDL (400 mikroliter væske) overførtes efter dialyse mod 0,3 mM 15 Na EDTA til et silikonebehandlet glasrør, og 100 mg saccharose tilsattes. Opløsningen blev hurtigt frosset ved -50°C i ethanol og lyofilise-ret i 5-6 timer. Det tørrede præparat ekstraheredes 3 gange med 5 ml heptan. Heptanfaserne sammenblandedes og inddampedes. 2 mg AD-32 i 0,5 ml vandfri di ethyl ether sattes derefter til de tørrede ekstrakter. Op-20 løsningen blandedes med det ekstraherede LDL ved forsigtig omrøring og inkuberedes ved 4°C i 15 minutter. Opløsningsmidlet afdampedes under nitrogen, medikament-LDL-komplekset bragtes i opløsning ved tilsætning af 1 ml 10 mM "Tricine", pH 8,4. Uopløseligt, ikke-inkorporeret medikament fraskiltes ved centrifugering i 5 minutter i en "Beckman" mikrocen-25 trifuge. Dette gav en rekonstitueret LDL-partikel indeholdende 110-130 molekyler AD-32 pr. LDL-partikel. Den procentdel der blev tilbage i plasma i Balb/C-mus var ca. 58 efter 90 minutter.

Eksempel 2 30 Som eksempel 1, men det lyofili serede LDL ekstraheredes ikke med heptan, i stedet tilsattes AD-32 opløst i ether direkte. Dette gav ca.

35 - 43 molekyler AD-32 pr. LDL-partikel og en restprocent i plasma på ca. 55.

35 Eksempel 3

Som eksempel 1, men i stedet for saccharose anvendtes 80 mikroliter glycerol som beskyttelsesmiddel. Dette gav ca. 50 molekyler AD-32 pr.

LDL, og restprocenten i plasma var ca. 55.

DK 168785 B1 7

Eksempel 4 - sammen!igningsforsøq I

Som eksempel 1, men i stedet for saccharose anvendtes 25 mg kartoffelstivelse. Den efter ekstraktionen af LDL opnåede ekstrakt kasseredes, 5 og AD-32 i vandfri ether sattes direkte til det ekstraherede LDL. (Fremgangsmåde ifølge Krieger et al). Dette gav ca. 400 molekyler AD-32 pr.

LDL, men den procentdel af den injicerede dosis, som var tilbage i plasmaet, var under 3.

10 Eksempel 5 - sammen!igningsforsøq II

Som eksempel 1, men 25 mg kartoffelstivelse og 80 mi kroliter glycerol anvendtes i stedet for saccharose. Dette gav ca. 50 molekyler AD-32 pr. LDL-partikel, og restprocenten i plasma var ca. 50.

15 Terapeutisk forsøg 1

Til dette forsøg anvendtes medikamentet AD-32. Mængden af AD-32, som administredes ved dette forsøg, var godt under det toxiske niveau for mus, og resultatet anføres her for at give et eksempel på mål effekten af medikament-LDL-komplekset i sammenligning med det frie medika- 20 ment. Balb/C-mus injiceredes intraperitonealt (i.p.) med 1,0 million WEHI-3B celler, en monomyelocytisk musecellelinie. Der fandtes ingen forskel (2%) i overlevelse (ILS, Increased Life Span) mellem kontrolgruppen og gruppen behandlet med 1,9 mg AD-32/kg/dag i fem dage. AD-32 administreredes i.p. opløst i en blanding af ethanol og ricinusolie.

25 Musene, som fik samme dosis AD-32 inkorporeret i LDL ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1 administreret i.p. i fem dage, fik en 26% forøgelse i levetid.

Terapeutisk forsøg 2 30 Balb/C-mus injiceredes i.p. med 1,0 million WEHI-3B celler, og et al kyleri ngsmiddel, 4-ami no-N,N-bi s-(chlorethyl)-2-methyl-naphtalen inkorporeredes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Dyrene behandledes i.p. i fire på hinanden følgende dage, og resultatet vises i fig. 2. Kontrolgruppen døde i løbet af dag 12-18, mens musene i den behandlede 35 gruppe døde fra dag 25, idet 50% fortsat var i live på dag 42 og 40% fortsat i live på dag 50.

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en bærer ladet med lipofilt biologisk aktivt stof på basis af rekonstitueret LDL (lavdensitetslipo- 5 protein), KENDETEGNET ved, AT (1) LDL lyofiliseres i nærvær af et beskyttelsesmiddel i form af et monosaccharid, et disaccharid, et vandopløseligt polysaccharid, en sukkeralkohol eller en blanding af disse, (2) det lyofiliserede LDL eventuelt ekstraheres med et organisk opløsningsmiddel, (3) det biologisk aktive stof bragt i opløsning i et opløsnings- 10 middel inkuberes med det lyofiliserede og eventuelt ekstraherede LDL, idet den ved ekstraktion af det lyofiliserede LDL opnåede ekstrakt eventuelt blandes med det lipofile biologisk aktive stof, og denne blanding derefter inkuberes med LDL, (4) opløsningsmidlet afdampes, og det rekonstituerede LDL bringes i opløsning i en vandig puffer, og (5) det ikke- 15 inkorporerede biologisk aktive stof adskilles fra LDL-komplekset.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT beskyttelsesmidlet er glyceraldehyd, xylose, lyxose, raffinose, glucose, mannose, galactose, talose, ribulose, xylulose, trehalose, fructose, sorbose, 20 maltose, lactose, saccharose, glycerol eller en blanding af vilkårlige af disse.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, AT beskyttelsesmidlet er saccharose. 25

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, AT beskyttelsesmidlet er glucose.

5 LDL er målt som protein.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, AT be- 30 skyttelsesmidlet er fructose.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, KENDETEGNET ved, AT det i trin (2) anvendte organiske opløsningsmiddel er n-heptan. 35

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, KENDETEGNET ved, AT opløsningsmidlet, der anvendes i trin (3) til opløsning af det biologisk aktive stof, er ethylether, heptan, carbontetra- DK 168785 B1 chlorid eller benzen.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til 7, KENDETEGNET ved, AT mængden af beskyttelsesmiddel er i intervallet fra 0,5 til 100 mg/mg LDL, hvor

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 8, KENDETEGNET ved, AT det biologisk aktive stof er 4-amino-N,N-bis-(chlor-ethyl)-2-methyl-naphthalen.

10 15 20