CN112826941A - 一种用于递送蛋白药物的磁性血小板复合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于递送蛋白药物的磁性血小板复合物的制备方法，以血小板细胞为载体，先在其表面偶联蛋白药物，再将四氧化三铁磁性纳米颗粒组装在血小板的表面。该方法制备的复合物具有生物相容性好、体内循环时间长、不易被清除系统清除等优点，用于治疗血栓或肿瘤等疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学工程方法，特别涉及一种用于递送蛋白药物的磁性血小板复合物的制备方法。
背景技术
血管阻塞性疾病会引起血管中血流异常，发生在不同的部位，会引发不同的疾病，例如：冠心病(心脏)、中风(脑组织)、肾血管疾病(肾)以及周围血管疾病(四肢)。2015年的调查报告显示，心血管疾病依然是全球首要的致死疾病，每年造成1730万例死亡，并预测在2030年达到2360万例。从经济角度分析，2010年全球心血管疾病的耗费为8630亿美元，预计在2030年会到达10440亿美元。
目前对于急性缺血性中风、冠状动脉梗塞、肺栓塞的治疗主要依靠静脉注射或通过导管(放置在阻塞血管处)输送溶栓药物。组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是目前唯一经FDA批准的溶栓药物，已经得到广泛临床运用。但是由于溶栓药物的靶向性差，通过全身给药的方式会产生脱靶效应，造成凝血异常及出血等并发症。同时，溶栓药物的半衰期及体内循环时间短，治疗时通常需要重复给药，产生更严重的副作用。因此，提高tPA体内循环时间及靶向性，进而改善tPA血栓部位的递送效率已成为血栓治疗的核心主题。
血小板(PLT)是人体内一种天然的血细胞，生物相容性好，体内循环时间长，同时具有靶向血栓及伤口部位的能力。本文公开的磁性血小板复合物可进一步借助磁导航提高tPA靶向递送效率，通过药物-磁热联合治疗加速溶栓。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供生物相容性好、体内循环时间长、不易被清除系统清除等优点的用于递送蛋白药物的磁性血小板复合物的制备方法。
技术方案：本发明提供一种用于递送蛋白药物的磁性血小板复合物的制备方法，以血小板细胞为载体，先在其表面偶联蛋白药物，再将四氧化三铁磁性纳米颗粒组装在血小板的表面。上述制得的磁性血小板复合物可通过磁场的磁靶向和血小板细胞的主动靶向将蛋白药物递送到血栓部位或伤口部位，通过药物治疗和磁热疗联合治疗对血栓或肿瘤等进行治疗。
进一步地，血小板的制备方法为：首先用PBS稀释全血，离心去除下沉的红细胞和白细胞，收集上清液中的血小板，用PBS重悬之后加入前列腺素E1抑制血小板活化，冷藏，即可。
进一步地，所述表面偶联蛋白药物的方法为：先将4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)和2-亚氨基硫烷盐酸盐(Traut′s Reagent)分别与蛋白药物和血小板进行共孵育，后将连接了Sulfo-SMCC的蛋白药物与连接了Traut′s Reagent的血小板共孵育，即可。
进一步地，所述组装的方法为：将四氧化三铁磁性纳米颗粒与连结了蛋白药物的血小板振荡条件下共孵育，即可。
进一步地，所述蛋白药物为免疫球蛋白(IgG)、细胞程序性死亡-配体1(aPDL1)、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)。
进一步地，装载aPDL1的磁性血小板复合物用于肿瘤的磁热和免疫联合治疗。
进一步地，装载aPDL1的磁性血小板复合物用于肿瘤的磁热和免疫联合治疗。
有益效果：本发明采用血小板细胞为载体，具有生物相容性好、体内循环时间长、不易被清除系统清除等优点，且血小板具有主动靶向血栓部位能力，结合磁场的磁靶向能很好地递送蛋白药物至血栓部位或伤口部位，用于治疗血栓或肿瘤等。
附图说明
图1为血小板在显微镜下的明场图；
图2为血小板的动态光散射(DLS)图，粒径在1μm左右；
图3为FITC-IgG与Sulfo-SMCC的摩尔比分别为1∶40、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶800、1∶1200、1∶1600、1∶2000的情况下，测得血小板表面偶联的FITC-IgG表现的荧光强度图；
图4为改变Traut′s Reagent的浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/ml的情况下，测得血小板表面偶联的FITC-IgG表现的荧光强度；
图5为血小板偶联上FITC-IgG的共聚焦图；
图6为分别对投料的tPA和上清液中tPA进行定量，并做了归一化，通过差减法获得的血小板偶联tPA的效率；
图7为天然的血小板(左)和偶联了蛋白并组装了四氧化三铁磁性纳米颗粒的血小板(右)的SEM图；
图8为组装了磁性纳米颗粒后血小板的磁性响应图(右，左边为未组装)；
图9为血小板偶联了蛋白后与不同浓度四氧化三铁溶液进行共孵育后，血小板所组装的四氧化三铁的量；
图10为材料PLT-tPA-Fe3O4的磁热曲线；
图11为血小板、偶联了tPA的血小板、偶联了tPA并组装了四氧化三铁磁性纳米颗粒的血小板复合物的蛋白凝胶电泳图。
具体实施方式
实施例1
1.从SPF级小鼠中获得小鼠全血，将3ml全血加入含有3mlPBS的10ml离心管中，离心除去大量红细胞和白细胞，离心机设置转速为1600rpm，时间为10min。
2.取出上清液置于10ml离心管中，加入前列腺素E1，防止后续离心过程中血小板活化。再次离心去除残留的红细胞和白细胞，离心机设置转速为1600rpm，时间为10min。
3.继续取出上清液置于10ml离心管中，调整离心转速为4500rpm，离心时间为20min，获得血小板沉淀。最后用PBS重悬，控制浓度为1×109个/ml并加入前列腺素E1抑制活化。
4.将Sulfo-SMCC(0.2mg/ml)与tPA(100μg/ml)在4℃下共孵育2小时，并保持两者摩尔比为1200∶1。
5.将Traut′s Reagent(1mg/ml)和血小板溶液在室温下共孵育1小时，保持Traut′s Reagent在反应体系中浓度为0.6mg/ml。
6.将连结了Sulfo-SMCC的tPA和连结了Traut′s Reagent的血小板混合，在4℃下共孵育2小时。随后，置于1.5ml离心管，通过850g离心10min获得偶联了tPA的血小板。
7.将偶联了tPA的血小板与粒径为10nm的四氧化三铁磁性纳米颗粒在37℃、300rpm的条件下共孵育30min，保持四氧化三铁浓度为0.6mg/ml。随后，通过850g离心10min去除多余四氧化三铁，获得该磁性血小板复合物。
实施例2
1.从SPF级小鼠中获得小鼠全血，将3ml全血加入含有3mlPBS的10ml离心管中，离心除去大量红细胞和白细胞，离心机设置转速为1000rpm，时间为10min。
2.取出上清液置于10ml离心管中，加入前列腺素E1，防止后续离心过程中血小板活化。再次离心去除残留的红细胞和白细胞，离心机设置转速为1000rpm，时间为10min。
3.继续取出上清液置于10ml离心管中，调整离心转速为4500rpm，离心时间为20min，获得血小板沉淀。最后用PBS重悬，控制浓度为1×109个/ml并加入前列腺素E1抑制活化。
4.将Sulfo-SMCC(0.2mg/ml)与tPA(100μg/ml)在4℃下共孵育2小时，并保持两者摩尔比为1200∶1。
5.将Traut′s Reagent(1mg/ml)和血小板溶液在室温下共孵育1小时，保持Traut′s Reagent在反应体系中浓度为0.6mg/ml。
6.将连结了Sulfo-SMCC的tPA和连结了Traut′s Reagent的血小板混合，在4℃下共孵育2小时。随后，置于1.5ml离心管，通过850g离心10min获得偶联了tPA的血小板。
7.将偶联了tPA的血小板与粒径为10nm的四氧化三铁磁性纳米颗粒在37℃、300rpm的条件下共孵育30min，保持四氧化三铁浓度为0.6mg/ml。随后，通过850g离心10min去除多余四氧化三铁，获得该磁性血小板复合物。
实施例3
1.从SPF级小鼠中获得小鼠全血，将3ml全血加入含有3mlPBS的10ml离心管中，离心除去大量红细胞和白细胞，离心机设置转速为1600rpm，时间为10min。
2.取出上清液置于10ml离心管中，加入前列腺素E1，防止后续离心过程中血小板活化。再次离心去除残留的红细胞和白细胞，离心机设置转速为1600rpm，时间为10min。
3.继续取出上清液置于10ml离心管中，调整离心转速为3500rpm，离心时间为20min，获得血小板沉淀。最后用PBS重悬，控制浓度为1×109个/ml并加入前列腺素E1抑制活化。
4.将Sulfo-SMCC(0.2mg/ml)与tPA(100μg/ml)在4℃下共孵育2小时，并保持两者摩尔比为1200∶1。
5.将Traut′s Reagent(1mg/ml)和血小板溶液在室温下共孵育1小时，保持Traut′s Reagent在反应体系中浓度为0.6mg/ml。
6.将连结了Sulfo-SMCC的tPA和连结了Traut′s Reagent的血小板混合，在4℃下共孵育2小时。随后，置于1.5ml离心管，通过850g离心10min获得偶联了tPA的血小板。
7.将偶联了tPA的血小板与粒径为10nm的四氧化三铁磁性纳米颗粒在37℃、300rpm的条件下共孵育30min，保持四氧化三铁浓度为0.6mg/ml。随后，通过850g离心10min去除多余四氧化三铁，获得该磁性血小板复合物。
实施例4
1.从SPF级小鼠中获得小鼠全血，将3ml全血加入含有3mlPBS的10ml离心管中，离心除去大量红细胞和白细胞，离心机设置转速为1600rpm，时间为10min。
2.取出上清液置于10ml离心管中，加入前列腺素E1，防止后续离心过程中血小板活化。再次离心去除残留的红细胞和白细胞，离心机设置转速为1600rpm，时间为10min。
3.继续取出上清液置于10ml离心管中，调整离心转速为4500rpm，离心时间为20min，获得血小板沉淀。最后用PBS重悬，控制浓度为1×109个/ml并加入前列腺素E1抑制活化。
4.将Sulfo-SMCC(0.2mg/ml)与tPA(100μg/ml)在4℃下共孵育2小时，并保持两者摩尔比为40∶1。
5.将Traut′s Reagent(1mg/ml)和血小板溶液在室温下共孵育1小时，保持Traut′s Reagent在反应体系中浓度为0.6mg/ml。
6.将连结了Sulfo-SMCC的tPA和连结了Traut′s Reagent的血小板混合，在4℃下共孵育2小时。随后，置于1.5ml离心管，通过850g离心10min获得偶联了tPA的血小板。
7.将偶联了tPA的血小板与粒径为10nm的四氧化三铁磁性纳米颗粒在37℃、300rpm的条件下共孵育30min，保持四氧化三铁浓度为0.6mg/ml。随后，通过850g离心10min去除多余四氧化三铁，获得该磁性血小板复合物。
实施例5
1.从SPF级小鼠中获得小鼠全血，将3ml全血加入含有3mlPBS的10ml离心管中，离心除去大量红细胞和白细胞，离心机设置转速为1600rpm，时间为10min。
2.取出上清液置于10ml离心管中，加入前列腺素E1，防止后续离心过程中血小板活化。再次离心去除残留的红细胞和白细胞，离心机设置转速为1600rpm，时间为10min。
3.继续取出上清液置于10ml离心管中，调整离心转速为4500rpm，离心时间为20min，获得血小板沉淀。最后用PBS重悬，控制浓度为1×109个/ml并加入前列腺素E1抑制活化。
4.将Sulfo-SMCC(0.2mg/ml)与tPA(100μg/ml)在4℃下共孵育2小时，并保持两者摩尔比为1200∶1。
5.将Traut′s Reagent(1mg/ml)和血小板溶液在室温下共孵育1小时，保持Traut′s Reagent在反应体系中浓度为0.2mg/ml。
6.将连结了Sulfo-SMCC的tPA和连结了Traut′s Reagent的血小板混合，在4℃下共孵育2小时。随后，置于1.5ml离心管，通过850g离心10min获得偶联了tPA的血小板。
7.将偶联了tPA的血小板与粒径为10nm的四氧化三铁磁性纳米颗粒在37℃、300rpm的条件下共孵育30min，保持四氧化三铁浓度为0.6mg/ml。随后，通过850g离心10min去除多余四氧化三铁，获得该磁性血小板复合物。
如各实施例中1、2、3，通过梯度离心获得血小板溶液。由此，获得的血小板在二维上呈圆形(图1)，且其直径在1.219±0.031μm(图2)。
如各实施例中4、5、6，首先以FITC-IgG为模型对血小板偶联蛋白的条件进行优化，确定Sulfo-SMCC与蛋白药物的摩尔比为1200∶1时，血小板偶联蛋白药物的效率最高(图3)。并且保持Sulfo-SMCC与tPA摩尔比为1200∶1，确定当Traut′s Reagent共孵育的浓度为0.6mg/ml时(图4)，此时血小板偶联蛋白药物的效率最优(图5)。由此，获得血小板偶联蛋白的最佳条件为Sulfo-SMCC与蛋白药物的摩尔比为1200∶1，且Traut′s Reagent共孵育的浓度为0.6mg/ml。然后，按照最佳条件进行血小板偶联tPA。通过酶标仪对tPA溶液和上清液中的tPA进行定量，上清液中含有投入tPA的46.5％。通过差减法获得血小板偶联tPA的效率为53.5％(图6)。
如各实施例中7，通过共孵育进行血小板表面磁性纳米颗粒的组装。通过850g离心10min分离与不同浓度四氧化三铁纳米颗粒溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml)共孵育的血小板，得到磁性血小板复合物溶液，通过电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定所得血小板复合物上Fe的含量。在不破坏血小板结构的前提下，选择四氧化三铁浓度为0.6mg/ml(如图9)，获得最终的磁性血小板复合物。从天然的血小板和磁性血小板复合物的SEM图的中看出(图7)，10nm的四氧化三铁磁性纳米颗粒在血小板表面成功组装。
通过测试，组装了磁颗粒的血小板表现出了明显的磁响应能力。在磁场作用1小时后，磁性血小板复合物向磁铁方向富集，血小板溶液由浑浊变澄清，表明磁性血小板复合物具有磁响应性(图8)。并且组装了磁颗粒的血小板还表现出了明显的磁热性能，PLT-tPA-Fe3O4在交变磁场(764.85kHz、28000A/m)作用20min之后升温达4℃(图10)。此外，蛋白凝胶电泳图显示，经过tPA的偶联和磁性纳米颗粒的组装之后，血小板表面蛋白无明显变化(图11)。
因此，本发明所制得的磁性血小板复合物可通过磁场的磁靶向和血小板细胞的主动靶向将蛋白药物递送到血栓部位，通过tPA药物治疗和磁热疗联合治疗对血栓进行治疗。
Claims (7)
1.一种用于递送蛋白药物的磁性血小板复合物的制备方法，其特征在于：以血小板细胞为载体，先在其表面偶联蛋白药物，再将四氧化三铁磁性纳米颗粒组装在血小板的表面。
2.根据权利要求1所述的用于递送蛋白药物的磁性血小板复合物的制备方法，其特征在于：血小板的制备方法为：首先用PBS稀释全血，离心去除下沉的红细胞和白细胞，收集上清液中的血小板，用PBS重悬之后加入前列腺素E1抑制血小板活化，冷藏，即可。
3.根据权利要求1所述的用于递送蛋白药物的磁性血小板复合物的制备方法，其特征在于：所述表面偶联蛋白药物的方法为：先将4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)和2-亚氨基硫烷盐酸盐(Traut′s Reagent)分别与蛋白药物和血小板进行共孵育，后将连接了Sulfo-SMCC的蛋白药物与连接了Traut′s Reagent的血小板共孵育，即可。
4.根据权利要求1所述的用于递送蛋白药物的磁性血小板复合物的制备方法，其特征在于：所述组装的方法为：将四氧化三铁磁性纳米颗粒与连结了蛋白药物的血小板振荡条件下共孵育，即可。
5.根据权利要求1所述的用于递送蛋白药物的磁性血小板复合物的制备方法，其特征在于：所述蛋白药物为免疫球蛋白(IgG)、细胞程序性死亡-配体1(aPDL1)、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)。
6.根据权利要求5所述的用于递送蛋白药物的磁性血小板复合物的制备方法，其特征在于：装载aPDL1的磁性血小板复合物用于肿瘤的磁热和免疫联合治疗。
7.根据权利要求5所述的用于递送蛋白药物的磁性血小板复合物的制备方法，其特征在于：装载tPA的磁性血小板复合物用于血栓的磁热和药物联合治疗。
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